JPS63137685A - ｌ−メント−ルの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は微生物菌体あるいは菌体破砕液などを用いて文
−メントンをρ−メントールに不斉還元する方法に関す
るものである。通常用いられる化学的な方法で文−メン
トンを還元した場合、２種類のく香料及び医薬品として
極めて重要な物質であるが、と−ネオメントールは現在
のところ価値的に乏しい。したがって水沫は父−メント
ンを選択的に不斉還元して工業的に有用な夕、−メント
ールを製造する際に利用できる。

［従来の技術］ 従来、又−メントールの製造法として■天然ハツカ油か
ら抽出する方法、■不斉還元試薬を用いてピネンやシト
ロネラールから合成する方法、■改−１又−メンチルア
セテートを不斉加水分解によりジ−メントールを選択的
に得る方法等が知られている。

一方、生化学的な手法では従来、ハツカ属のメンタ・ビ
ペリタの葉内酵素が１．Ｑ−メントンを還元することで
知られている（Ｒ，にｊｏｎａａｓ、　　ＰＩａｎｔＰ
ｈｙ−ｓｉｏＬ６９巻、　　１０１３頁、　　１０８２
年）。

［発明が解決しようとする問題点コ 現在、有機合成的な方法で化学物質を不斉還元するのに
種々の不斉還元試薬を用いろ方法が提案されている。ｌ
、ｉＶ：Ｊ、）シ、この試薬を合成するために多くの行
程を要すること、またその試薬を用いる還元反応の多く
は一１００℃という超低温で行う必要があること、さら
に溶媒の種類も限られることが多いなどの点で種々の障
害がある。一方、微生物菌体あるいはその菌体破砕液な
どを利用する生化学的な不斉還元方法はパン酵母におい
て多くの実例がある。この方法によれば常温、常圧で溶
媒に水という温和な条件下で反応が進む点、さらには適
当な菌種を選択することによって１００％近く不斉還元
を行うことも可能である点で優れている。

しかしパン酵母はρ−メントンを還元する能力はなく、
また従来技術のハツカ属による方法は生産性が必ずしも
優れているとは言えないという問題点があった。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者等は上記の課題を解決すべく生化学的に又−メ
ントンを不斉還元してリーメントールに変換する微生物
を見つけるために、土壌等から広範等と全メントンを接
触させることによって丈メントンは全メントールに不斉
還元されることを見いだした。すなわち本発明の第１の
発明によれば（１）セルロモナス属に属する菌株を全メ
ントン存在下に培養してρ−メントールを製造すること
を特徴とするｌ−メントールの製造法が提供される。ま
た本発明の第２の発明によれば（２）セルロモナス属に
属し、λ−メントール生産能を有する菌体の菌体破砕物
あるいはそれから得られる活性画分と２−メントンとを
接触せしめてρ−メントールを製造することを特徴とす
るｌ−メントールの製造法が提供される。

［発明の詳細な説明］ 本発明に係わるλ−メントールの製造法では、セルロモ
ナス属に属する菌株あるいは該菌株の内Ｉメントール生
産能を有する菌株の培養によって得られる菌体の菌体破
砕物またはそれから得られる活性画分が使用される。

本発明の％：’、’ｌの発明方法では、使用されるセル
ロモナス属に属する菌株としては、培養に使用する前か
らρ−メントール生産能を有している菌株を用いること
が好ましいが、この他にも培養の初めの内は見かけ上又
−メントール生産能を有していない菌株も用いることが
できる。ここで見かけ上ρ−メントール生産能を有しな
い菌株とは、培養前の菌株の履歴として、ρ−メントン
を含まない環境で生育を受けて来たために全メントンを
取り込んで還元して文−メントールにする性質が培養の
初めの段階では備わっていないものの、ρ−メントンの
存在する環境に置かれていると、環境の変化に適応して
次第に１−メントンを少メントールに変換できるような
菌株を意味している。本発明に係わる又−メントールの
製造法ではセルロモナス属に属する菌株が用いられるが
、該菌株のうち特に好ましいものとしては今回新しく土
壌より分離したＫＥ３１株を代表菌として例示すること
ができる。本菌株の菌学的性質は表１および２に示すと
おりである。

表１　セルロモナス・ツルバ火：ｊ　ＩにＥ３１の菌学
的性質形態的性質 肉汁寒天培地上（３０℃） ５ｈｒ　　　　　　　　長稈（１〜２ｕｍ）４８ｈｒ　
　　　　　　　短稈（０，５〜ｌ　ｌｔ　ＩＩ＋）運動
性　　　　　　　十 胞子形成　　　　　　− ダラム染色　　　　　十 培養的性質 肉汁寒天培地上（３０℃、４８ｈｒ） 直径１ａ＋ｗの円形で黄色コロニーを形成するゼラチン
液化　　　　＋（弱い） 生理的性質 カタラーゼ　　　　　＋ オキシダーゼ　　　　＋（弱い） カゼイン分解　　　　十 セルロース分解性　　十 キサンチンの分解　　− 食塩耐性　〜７％　　生育 ’、１ｊｊ＃　！　１ τニコ　１０％〜　　生育しない Ｃ−゛ クエン−酸の利用　　　− 色素の菌体外生成　　− 細胞壁分析　　　　　リジンを含む 生育の温度範囲　　　３３℃付近く２０〜４５°Ｃ）が
良好 生育のｐＨ範囲　　　７．２付近（６，５〜８．５）酵
素に対する態度　　通性嫌気性 ０−Ｆテスト　　　　　発酵性（クールコース）表２　
炭素源の資化性 グリセリン　　　＋　　　酢酸　　　　　　＋７ラビノ
ース　　＋　　　グルコン酸　　　十リボース　　　　
＋　　　乳酸　　　　　　十グルコース　　　＋　　　
プロピオン酸　　十ガラクトース　　＋　　　クエン酸
　　　　−フルクトース　　＋　　　セロビオース　　
＋以上の菌学的性質から益（籟学上木菌株は、ｒ　Ｅ、
５ｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔら、　　Ｚｂｌ、１ａｋｔ、
　　）ｌｙｇ、、　　１．　　Ａｂｔ。

０ｒｉ３　Ｃ３，４０１−４０９頁、１９８２年」に記
載されているセルロモナス・ツルバタの性状に類似する
。従って本菌株はセルロモナス・ツルバタであると判断
し、セルロモナス・ツルバタ・エスピー・ＫＥ３１と命
名し、微工研菌寄第９ｂ６”７　　号として寄託されて
いる。

本発明に係る菌を増殖させるにあたっては、炭素源とし
て０．１〜５％のローアラビノース、Ｌ−アラビノース
、マルトース、ガラクトース、グルコン酸ナトリウムの
うち少なくとも１種類を用いるのが好ましく、さらにイ
ーストエキスまたはコーンスチーブリカー等を添加した
液体培地を用いることができる。上記成分の他に各種ビ
タミン、Ｗ、機質や適当な有機物を加えることにより増
殖率を高めることもできる。培養は通常２５〜３６℃で
通気撹拌培養によってにメントンを０．０１〜０．１％
（エタノール：又−メントン＝１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ
））ずつ逐次添加しなからｌ〜４日閏行う。又−メント
ンは菌の生育を阻害する加時期は培養開始時と以後、６
〜２４時間ことが好ましい。培養に伴って生育してくる
セルロモナス属の菌体の作用によってｌ−メントンはρ
−メントールに変換され、培養液中に蓄積される。

全、メントールは上記のような発酵法により生産できる
が、本発明に係わる第２の発明方法によれば以下に述べ
るように培養で得た又−メントール生産能を有する菌体
の菌体破砕物（液状または固形状であってもよい）ある
いはそれを精製した活性画分を用いることによっても、
同様にあるいは更に効率的に生産することができる。前
記した見かけ上皇−メントール生産能を有しない菌株を
用いた発酵法による又−メントールの生産では、原料の
又−メントンを高濃度に添加することはできなかったが
、ルメントール生産能を有する培養菌体、または該菌体
の菌体破砕液あるいは′これから精製された活性画分を
用いれば、生育阻害に注意を払うことなく高濃度に添加
することができ、より効率養菌体を調製するための培養
には、ｐ−メントンの添加（発酵法と同様の方法）は必
須である。ρ−メントンを無添加で培養した菌体にはル
メントンを２−メントールに変換する能力はないので又
−メントール生産能を有する菌体は得られず、従ってこ
の場合には本発明の第２の発明において用いられる菌体
破砕物や活性画分は得られない。本発明では又−メント
ール生産能を有する菌体を得る場合、０−アラビノース
等の炭素源（発酵法と同様の炭素源）を添加すると１−
メントンの変換能が１．５〜ｌＯ倍高められるので特に
好ましい。そして本発明の第１の発明方法に係わる又−
メントール生産能を有する菌株を用いて又−メントール
を製造する具体例として、このようにして調製された又
−メントール生産能を有する培養菌体を適当な濃度、た
とえば５〜ｔｏｏ３１Ｌ（この菌体濃度は菌が緩衝液に
懸濁される状態であれば濃淡は問わない）で緩衝液中に
懸濁したものと任意のｔメントン（好ましくは０．００
１〜１００容）とを接触させて、’１ｊＮｏ〜３５℃で
１時間〜４日間振とうしながら反応キセる方法を例示で
きる。反応の際に適当な界面活性剤（ツイーン２０、ス
パン８５、エーロゾルＯＴ、ブリーシュ３５等）を用い
て反応の進行を早めることもできろ。またこの反応系に
、ＮＡＤＨのような補酵素（好ましくは終濃度０．１〜
４０ｍＭ）および／またはグルコースのような炭素源（
好ましくは！？濃度１０〜４００ｍＭ）を添加してρ−
メントールの収量を高めることもできる。

一方、菌体破砕液あるいはそれから精製された活性画分
を用いて２−メントンを又−メントールに変換する場合
、燐酸緩衝液等（ｐＨ６〜８）に懸濁した０、５〜４０
ｍＭＮＡＤＨと麦−メントンとを任意の割合でよく攪拌
しながら反応を行うことができる。

ここて本発明で用いられる活性画分とは又−メントンを
又−メントールに変換する作用を有する酵素あるいは該
酵素を含む画分てあって、ρ−メントール生産能を有す
る菌体の破砕物を例えば硫安分画した後、ＤＥＡＥセフ
ァロースゲルによって精製し、次に０．２Ｍ　ＫＣＩで
溶出させることによって活性画分では、既述したような
界面活性剤を添加してもよい。反応温度は２０〜３５℃
が適当であり、また反応時間は用いる菌体破砕液や活性
画分の量に依存するので反応物の蓄積が最大になる時間
を任意に設定することができる。また高濃度のＮＡＤＨ
を添加する代わりに０．１ｍＭ程度の希薄なＮＡＤＨと
、アルコール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、グルコース
脱水素酵素あるいはグルコース−６−燐酸脱水素酵素な
どのＮＡＤＨ再生系酵素を添加した系においても、十分
に反応を行うことができる。反応終了後の液から文−メ
ントールを分離精製するには有機溶媒による抽出、液体
クロマト、蒸留などの公知の方法を鞘み合わせて利用す
る。

［発明の効果］ 本発明の方法によればλ−メントンを選択的に不斉還元
して工業的に有用な又−メントールを効率良く製造する
ことができる。

［実施例コ 以下、実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。なお生
産物の確認は薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマ
トグラフィーによって行い、定量は主としてガスクロマ
トグラフィーを用いて打つた。

実施例１゜ ５００慣り寝泊化フラスコに滅菌した表３に示す組成の
培地５０ｎ＋Ｌを入れ、セルロモナス・ツルバタ・ＫＥ
３１　（微工研菌寄第ソｂ、ｆ９　　号）を１白金耳植
菌し、３０℃で？２ｈｒ振とう培養した。なお培養部始
時と以後１２時間おきに又−メントンとエタノールの混
合液（１：１（ｖ／ｖ））を５０μＬずつ（総量３００
μＬ）および２５％トアラビノースをＩ　ｎ＋Ｌずつ（
総ｆ１１．５ｇ）添加して？２ｈｒ培養した。培養中、
ＩＮ水酸化ナトリウムによってｐＨ６，７付近になるよ
うに１日２回調整した。７２ｈ「後、菌体を除いた培養
液中の又−メントールを分析した結果、３５Ｂの１−メ
ントールが生産されると共に１ｍｇの改−ネオメントー
ルが検出された。

呂表３　　　培地の組成 １ゴで、′” クールコース　−　　　１−Ｏｇ　　　　Ｎａ２ＨＰＯ
ａ　　　　　　　　　　　Ｏ，６ＢＮＨａＮ１ｈ　　　
　１．Ｏｚ　　Ｍｎ５Ｏａ・４〜６８２０　　０．６ｍ
ｇＭｇ５Ｏａ・７Ｎ２０　０．２　ｇ　　Ｎａ２ＨＰＯ
ａ・１２Ｈ２１）　　　４．５３ＣａＣ１２１１２Ｈ２
００，０５３Ｋ）１２ＰＯ４０，４５８ＦｅＳＯａ・７
Ｈ２００，０１ｇ　　　　イースト１１ス（テ゛イノ］
社）　　１０．０　　ｇこれらを水道水ＩＬに溶解する
（ｐｌ−１７，２）実施例２゜ 実施例！、と同様にして、？２ｈｒ培養した培養液１．
５ｍＬ相当の菌体に、４７０μＬの１５ｎ＋Ｍ　ＮＡＤ
　Ｈ（０，１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，２）中）、２５μ
Ｌ０２Ｍグルコースおよび５μＬのメントンを加えて３
０℃で４８ｈｒ振とうしながら反応させた。反応終了後
、反応液を０．１ｗＬのヘキサンで抽出し、ヘキサン層
をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表４に示す
ように１．５ｗ＋ｇのターメントールおよび０．０８５
ｍｇの１ネオメントールが検出′された。ρ−メントン
の転化率は６１％、ｐ−メントールの収率は３８％であ
った。

′１゛・：ｉ！ｊｌ； 表４　培養菌体によるｉ−、Ｑ：、’：ノトールの生産
メントン　　　　メントン　　　　ρ−メントー１１　
　．１−ネオメジトール添加量　残量　　生成量　生成
量 ４．０ｍｇ　　１．５５ｎ＋ｇ　　１．５０ｍ８０．０
８５市ｇ（８，０）　　（３，１）　　（３，０）　　
　（０，１７）（）内数値は反応液中の濃度、単位は３
／Ｌ実施例３゜ 実施例１．と同様にして７２ｈ「フラスコ培養した液（
５０＋ｓＬＸ　２本）をミニジャーファーメンタ−（大
官ＩＬ）に植菌し、１ｍＬの又−メントンおよび２０ｍ
Ｌの２５％トアラビノースを１２ｈｒごとに逐次添加し
ながら、３３℃、０．０５ＶＶＭ、４００ｒｐｎ＋で４
８ｈｒ培養した。　培養終了後、ビブロゲンセルミルで
１５分間菌体を破砕し、その破砕液５０＋＊Ｌを硫安分
画（２０〜８０％飽和）した後、ＤＥＡＥ−セファ０−
スゲルによって精製した。

０．２ＭにＣ１で溶出されてくるｐ−メントール生成能
を持った両分を集め、３０ｍＬの活性画分を得た。この
活性画分の０　、２ｍＬと１μｎ＋ｏｌのＮ　Ａ　Ｄ　
ＨｌＩＯＵのＬ−乳酸脱水素酵素（ヘ−リンカ−社製）
および２０μｍｏｌのし一乳加えて２５℃で２４ｈｒ反
応させた。反応終了後、反応液を高速液体クロマトグラ
フおよびガスクロマトグラフで分析した結果、１２．８
μｓｏｌのρ＝メントール・０．４μｓａｇのとネオメ
ントールおよび１２．　Ｉ　ｕ＋ｎｏｌのピルビン酸が
生成していた。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）セルロモナス属に属する菌株をｌ−メントン存在
   下に培養して、ｌ−メントールを製造することを特徴と
   するｌ−メントールの製造法。
2. （２）セルロモナス属に属し、ｌ−メントール生産能を
   有する菌体の菌体破砕物あるいはそれから得られる活性
   画分とｌ−メントンとを接触せしめてｌ−メントールを
   製造することを特徴とするｌ−メントールの製造法。