JP4179760B2 - 不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を用いる不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造法に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
不飽和脂肪酸又はその誘導体は、香料、薬剤、塗料、界面活性剤、化粧品等として、或いはこれらの合成原料として広く利用されている。
微生物を利用した不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造には、これまでエキノスポラジウム(Echinosporangium)属細菌(特許第2710344号公報)、モルテイエレラ(Mortierella)属細菌(特開昭60−259192号公報)を用いる発酵法等が知られているが、何れも収量が低く、反応時間も長く、また菌体内に不飽和脂肪酸を蓄積するため回収が困難であるという問題があった。
【0003】
また、ロドコッカス(Rhodococcus)属細菌により、不飽和脂肪酸又はその誘導体が菌体外に生産されることも報告されているが(特公平2−6516号公報、特公平4−12718号公報)、その生産性及び純度は十分であるとはいえなかった。
【0004】
本発明は、微生物により不飽和脂肪酸又はその誘導体を生産する方法であって、菌体外生産ができ、その生産量がより高く、且つ高純度で生産できる方法及びこれに用いる不飽和脂肪酸生産菌を提供することを目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、不飽和脂肪酸又はその誘導体を効率よく生産する微生物及び生産条件を種々検討したところ、ロドコッカス属に属する不飽和脂肪酸生産菌が特定の濃度及びpHをもつリン酸緩衝液の存在下で増殖と連動して不飽和脂肪酸又はその誘導体を高濃度且つ高純度で培地中に生産することを見出した。
【0006】
すなわち本発明は、ロドコッカス・エスピー(Rhodococcus sp.)KSM T645株(FERM P−18182)を用い、濃度0.3M以上0.5M以下でpH7.25〜7.5のリン酸緩衝液の存在下、パルミチン酸又はパルミチン酸イソプロピルを該菌体に作用させるシス−6−ヘキサデセン酸又はシス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの製造法を提供するものである。
【0007】
【発明の実施の形態】
本発明の製造法において用いられる不飽和脂肪酸生産菌としては、ロドコッカス(Rhodococcus)属に属し、飽和脂肪酸から不飽和脂肪酸を生産する能力を有するものであればよく、例えばロドコッカス・エスピー(Rhodococcus sp.)KSM−B−3M株(FERM BP1531)や、ロドコッカス・エスピー(Rhodococcus sp.)KSM−T645株(FERM P−18182)等が挙げられる。このうち、不飽和脂肪酸の生産量の点からロドコッカス・エスピーKSM−T645株が特に好ましい。ロドコッカス・エスピーKSM−T645株は、ロドコッカス・エスピーKSM−B−3M株に紫外線を照射して得られた新規な変異株であり、以下の菌学的性質を有する。
【0008】
(A)形態
桿菌で、細胞は多形性で、若い培養では短桿状、古い培養では球状となる。大きさは0.5〜0.8μm×1.0〜5.0μmである。
【0009】
(B)生理学的性質
▲1▼生育範囲
温度:5〜37℃(最適25〜35℃)
pH: 5〜9.5(最適6〜8)
▲2▼グラム染色:陽性
▲3▼ゼラチンの液化(グルコース・ペプトン・ゼラチン培地):陰性
▲4▼スターチの加水分解(スターチ寒天培地):陰性
▲5▼脱脂牛乳凝固、ペプトン:共に陰性
▲6▼メラニン様色素の生成(チロシン培地、ペプトン・イースト・鉄培地):陰性
【0010】
(C)炭素源の資化性
▲1▼L−アラビノース +
▲2▼D−キシロース +
▲3▼D−グルコース +
▲4▼D−フラクトース +
▲5▼シュークロース +
▲6▼イノシトール +
▲7▼L−ラムノース +
▲8▼D−マンニトール +
【0011】
(E)化学的分類学的性質
▲1▼グルコリルテスト:グリコリル型
▲2▼メナキノン システム:MK−8(H2)
【0012】
以上の菌学的性質を、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology第9巻(1994年)に基づき検索した結果、ロドコッカス属に属する細菌と認められたため、本菌株をロドコッカス・エスピーKSM−T645と命名した。この菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−18182として寄託されている。
【0013】
本発明の製造法において、原料として用いられる脂肪酸としては、炭素数1〜22、好ましくは14〜20の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられ、その誘導体としては当該脂肪酸のアルキル(炭素数1〜10、好ましくは2〜4)若しくはアリールエステル、第1級若しくは2級アンモニウム塩又はアルカリ金属塩が挙げられる。
このうち、n−ヘキサデカン酸(パルミチン酸)、n−テトラデカン酸(ミリスチン酸)、オクタデカン酸(ステアリン酸)これら脂肪酸のメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル等の各エステル、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等が好ましい。
【0014】
斯かる脂肪酸又はその誘導体は、本発明の反応によれば、脂肪酸の炭化水素鎖の特定の位置に不飽和結合が導入された不飽和脂肪酸又はその誘導体に変換される。
例えば、パルミチン酸又はそのエステルを原料として用いれば、シス−6−ヘキサデセン酸を主生成物として得ることができる。
【0015】
本発明の製造法は、濃度0.25M以上でpH7.2〜9のリン酸緩衝液又は濃度0.3M以上でpH7.0〜9のリン酸緩衝液の存在下、脂肪酸又はその誘導体を微生物菌体に作用させ、不飽和脂肪酸又はその誘導体を反応液中に生成させるものである。
微生物菌体の取得は、通常の微生物の培養方法によればよく、培養に際して用いられる培地、pH、温度、培養時間等については当該菌株が十分に生育するものであればいずれの条件でもよい。好ましくは、30℃で1〜2日間、好気的に培養するのがよい。
【0016】
反応は、得られた培養液をそのまま、或いは培養液から菌体を遠心分離等の方法により回収後、濃度0.25M以上でpH7.2〜9のリン酸緩衝液又は濃度0.3M以上でpH7.0〜9のリン酸緩衝液に懸濁させ、これに脂肪酸又はその誘導体を添加して行われる。
【0017】
ここで、菌体培養液又は菌体は、反応液に対して0.1〜10%、特に0.5〜5%用いることが好ましく、脂肪酸又はその誘導体は、1〜30%、特に10〜25%であることが好ましい。
【0018】
本発明においては、濃度0.25M以上でpH7.2〜9のリン酸緩衝液又は濃度0.3M以上でpH7.0〜7.2のリン酸緩衝液が用いられる。
pH7.0未満或いは濃度が0.25未満であると、効率よく不飽和化することができず、pHが9を超えると微生物が増殖できない。斯かる効果の点から、濃度0.25M以上でpH7.2〜9であるものが好ましく、特に濃度0.3〜0.5Mで、pH7.2〜8であるものが好ましい。
【0019】
また、リン酸緩衝液としては、いずれの対イオンを有するものでもよいが、リン酸1ナトリウム−リン酸2カリウム又はリン酸1カリウム−リン酸2カリウムが好ましい。
【0020】
当該反応液中には、菌体の増殖を妨げない限り、更に硫酸マグネシウム塩、硫酸鉄塩、窒素源、ビタミン類等を添加することができる。尚、この場合、硫酸マグネシウム塩は0.005〜1%、好ましくは0.01〜0.5%、硫酸鉄塩は1〜100ppm、好ましくは5〜50ppmで添加することが好ましい。
【0021】
反応は20〜37℃、好ましくは25〜30℃の温度条件で、好気的条件下に48〜120時間、特に60〜96時間行うことが好ましい。
【0022】
かくして反応液中に生成した不飽和脂肪酸又はその誘導体は、天然有機化合物等で通常行われている抽出・単離方法により、容易に回収・分離できる。例えば反応液を遠心分離により菌体・油相・水相に分けて油相を分取したり、或いは反応液をそのまま有機溶剤で抽出することにより極めて簡便に目的物を回収できる。
また、この反応により高純度の目的物が回収できるが、さらに精製する必要のある場合は通常のカラムクロマトグラフィー、分配抽出、溶媒晶析等により精製単離が可能である。
【0023】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明する。
実施例1
SCD培地(日本製薬株式会社製)20mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、30℃にて1日間培養を行った。この培養液0.4mLを、MSG(グルタミン酸ナトリウム)20g、酵母エキス(Difco社製)4.5g、MgSO4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2O 1.2mgを、0.35M リン酸緩衝液(pH7.25)1Lに溶解した培地20mL及びパルミチン酸イソプロピル3.8mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、26℃にて4日間、210rpmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は51g/L、反応液中の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は80.5%であった(表1)。
【0024】
実施例2
SCD培地(日本製薬株式会社製)20mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、30℃にて1日間培養を行った。この培養液0.4mLを、MSG(グルタミン酸ナトリウム)20g、酵母エキス(Difco社製)3g、MgSO4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2O 1.2mgを、0.25Mリン酸緩衝液(pH7.25又は7.5)1Lに溶解した培地20mL及びパルミチン酸イソプロピル4.4mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、26℃にて4日間、210rpmにて振盪培養及び反応を行った。反応後、反応液に含まれる主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は48.5g/L、反応液中の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は70.9%であった(表1)。
【0025】
実施例3
SCD培地(日本製薬株式会社製)20mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、30℃にて1日間培養を行った。この培養液0.4mLを、MSG(グルタミン酸ナトリウム)20g、酵母エキス(アサヒビール社製)8.0g、MgSO4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2O 1.2mgを、0.35M リン酸緩衝液(pH7.25又は7.5)1Lに溶解した培地20mL及びパルミチン酸イソプロピル4.4mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、26℃にて4日間、210rpmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は各々のpHで58.7g/L、48.9g/L、反応液中の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は73.8%、79.3%であった(表1)。
【0026】
実施例4
SCD培地(日本製薬株式会社製)200mLを入れた2L容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、30℃にて1日間培養を行った後。この培養液すべてを、MSG(グルタミン酸ナトリウム)20g、酵母エキス(アサヒビール社製)7.5g、MgSO4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2O 1.2mgを、0.35M リン酸緩衝液(pH7.25)に溶解した培地12.5L及びパルミチン酸イソプロピル2.75Lを入れた30L容ジャーファーメンターに接種し、26℃にて4日間、350rpm、0.5vvmにて通気攪拌培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は45.0g/L、反応液中の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は75.0%であった(表1)。
【0027】
実施例5
SCD培地(日本製薬株式会社製)20mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-B-3Mを接種し、30℃にて1日間培養を行った。後、この培養液0.4mLを、MSG 20g、酵母エキス(Difco社製)3g、MgSO4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2O 1.2mgを、0.3M リン酸バッファー(pH7.5)1Lに溶解した培地20mL及びパルミチン酸イソプロピル4.4mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、26℃にて4日間、210rpmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は47.0g/L、反応液中の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は68.5%であった(表2)。
【0028】
実施例6
SCD培地(日本製薬株式会社製)2mLを入れたφ22×195mm試験管にRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、30℃にて1日間培養を行った。後、この培養液70μLを、MSG 20g、酵母エキス(Difco社製)3g、MgSO4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2O 1.2mgを、0.25M K,K2リン酸バッファー(pH7.0)1Lに溶解した培地1.5mL及びミリスチン酸イソプロピル0.35mLを入れたφ22×195mm試験管に接種し、27℃にて4日間210spmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物(シス−6−テトラデセン酸イソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は26.5g/L、反応液中の全油中のシス−6−テトラデセン酸イソプロピルの割合は36.7%であった(表3)。
【0029】
比較例1
SCD培地(日本製薬株式会社製)20mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、30℃にて1日間培養を行った後。この培養液0.4mLを、MSG(グルタミン酸ナトリウム)20g、酵母エキス(アサヒビール社製)4.5g、MgSO4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2O 1.2mgを0.25Mリン酸緩衝液(pH7.0)1Lに溶解した培地20mL及びパルミチン酸イソプロピル3.6mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、26℃にて4日間、210rpmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は34.9g/L、反応液中の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は41.1%であった(表1)。
【0030】
比較例2
SCD培地(日本製薬株式会社製)20mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、30℃にて1日間培養を行った。この培養液0.4mLを、MSG(グルタミン酸ナトリウム)20g、酵母エキス(アサヒビール社製)4.5g、MgSO4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2O 1.2mgを0.1M又は0.2Mリン酸緩衝液(pH7.25)1Lに溶解した培地20mL及びパルミチン酸イソプロピル3.6mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、26℃にて4日間、210rpmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は各々28.1、32.7g/L反応液中の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は37.6%、37.3%であった(表1)。
【0031】
比較例3
SCD培地(日本製薬株式会社製)20mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-B-3Mを接種し、30℃にて1日間培養を行った。後、この培養液0.4mLを、MSG 20g、酵母エキス(Difco社製)3g、MgSO4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2O 1.2mgを、0.3M リン酸バッファー(pH7.0)1Lに溶解した培地20mL及びパルミチン酸イソプロピル4.4mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラスコに接種し、26℃にて4日間、210rpmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は35.5g/L、反応液中の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は45.4%であった(表2)。
【0032】
比較例4
SCD培地(日本製薬株式会社製)2mLを入れたφ22×195mm試験管にRhodococcus sp. KSM-T645を接種し、30℃にて1日間培養を行った。後、この培養液70μLを、MSG 20g、酵母エキス(Difco社製)3g、MgSO4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2O 1.2mgを、0.35M K,K2リン酸バッファー(pH7.25)1Lに溶解した培地1.5mL及びミリスチン酸イソプロピル0.35mLを入れたφ22×195mm試験管に接種し、27℃にて4日間210spmにて振盪培養及び反応を行った。
反応後、反応液に含まれる主生成物(シス−6−テトラデセン酸イソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、生産性は10.5g/L、反応液中の全油中のシス−6−テトラデセン酸イソプロピルの割合は11.8%であった(表3)。
【0033】
【表1】
【0034】
【表2】
【0035】
【表3】
【0036】
【発明の効果】
本発明によれば、不飽和脂肪酸又はその誘導体を微生物菌体外に極めて効率よく且つ高純度で製造することができる。
Claims (2)
- ロドコッカス・エスピー(Rhodococcus sp.)KSM T645株(FERM P−18182)を用い、濃度0.3M以上0.5M以下でpH7.25〜7.5のリン酸緩衝液の存在下、パルミチン酸イソプロピルを該菌体に作用させるシス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの製造法。
- ロドコッカス・エスピー(Rhodococcus sp.)KSM T645株(FERM P−18182)。
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