JP2002262895A - 不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造法 - Google Patents
不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造法Info
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Abstract
る不飽和脂肪酸生産菌を用い、濃度0.25M以上でp
H7.2〜9のリン酸緩衝液又は濃度0.3M以上でp
H7.0〜9のリン酸緩衝液の存在下、脂肪酸又はその
誘導体を該菌体に作用させる不飽和脂肪酸又はその誘導
体の製造法、該不飽和脂肪酸生産菌。 【効果】 不飽和脂肪酸又はその誘導体を微生物菌体外
に極めて効率よく且つ高純度で製造することができる。
Description
飽和脂肪酸又はその誘導体の製造法に関する。
脂肪酸又はその誘導体は、香料、薬剤、塗料、界面活性
剤、化粧品等として、或いはこれらの合成原料として広
く利用されている。微生物を利用した不飽和脂肪酸又は
その誘導体の製造には、これまでエキノスポラジウム
(Echinosporangium)属細菌(特許第2710344号
公報)、モルテイエレラ(Mortierella)属細菌(特開
昭60−259192号公報)を用いる発酵法等が知ら
れているが、何れも収量が低く、反応時間も長く、また
菌体内に不飽和脂肪酸を蓄積するため回収が困難である
という問題があった。
菌により、不飽和脂肪酸又はその誘導体が菌体外に生産
されることも報告されているが(特公平2−6516号
公報、特公平4−12718号公報)、その生産性及び
純度は十分であるとはいえなかった。
その誘導体を生産する方法であって、菌体外生産がで
き、その生産量がより高く、且つ高純度で生産できる方
法及びこれに用いる不飽和脂肪酸生産菌を提供すること
を目的とする。
肪酸又はその誘導体を効率よく生産する微生物及び生産
条件を種々検討したところ、ロドコッカス属に属する不
飽和脂肪酸生産菌が特定の濃度及びpHをもつリン酸緩
衝液の存在下で増殖と連動して不飽和脂肪酸又はその誘
導体を高濃度且つ高純度で培地中に生産することを見出
した。
occus)属に属する不飽和脂肪酸生産菌を用い、濃度
0.25M以上でpH7.2〜9のリン酸緩衝液又は濃
度0.3M以上でpH7.0〜9のリン酸緩衝液の存在
下、脂肪酸又はその誘導体を該菌体に作用させる不飽和
脂肪酸又はその誘導体の製造法及び該不飽和脂肪酸生産
菌を提供するものである。
る不飽和脂肪酸生産菌としては、ロドコッカス(Rhodoc
occus)属に属し、飽和脂肪酸から不飽和脂肪酸を生産
する能力を有するものであればよく、例えばロドコッカ
ス・エスピー(Rhodococcus sp.)KSM−B−3M株
(FERM BP1531)や、ロドコッカス・エスピ
ー(Rhodococcus sp.)KSM−T645株(FERM
P−18182)等が挙げられる。このうち、不飽和
脂肪酸の生産量の点からロドコッカス・エスピーKSM
−T645株が特に好ましい。ロドコッカス・エスピー
KSM−T645株は、ロドコッカス・エスピーKSM
−B−3M株に紫外線を照射して得られた新規な変異株
であり、以下の菌学的性質を有する。
養では球状となる。大きさは0.5〜0.8μm×1.
0〜5.0μmである。
地):陰性 スターチの加水分解(スターチ寒天培地):陰性 脱脂牛乳凝固、ペプトン:共に陰性 メラニン様色素の生成(チロシン培地、ペプトン・イ
ースト・鉄培地):陰性
Systematic Bacteriology第9巻(1994年)に基づ
き検索した結果、ロドコッカス属に属する細菌と認めら
れたため、本菌株をロドコッカス・エスピーKSM−T
645と命名した。この菌株は、工業技術院生命工学工
業技術研究所にFERM P−18182として寄託さ
れている。
られる脂肪酸としては、炭素数1〜22、好ましくは1
4〜20の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられ、その誘
導体としては当該脂肪酸のアルキル(炭素数1〜10、
好ましくは2〜4)若しくはアリールエステル、第1級
若しくは2級アンモニウム塩又はアルカリ金属塩が挙げ
られる。このうち、n−ヘキサデカン酸(パルミチン
酸)、n−テトラデカン酸(ミリスチン酸)、オクタデ
カン酸(ステアリン酸)これら脂肪酸のメチル、エチ
ル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブ
チル、tert−ブチル等の各エステル、アンモニウム
塩、ナトリウム塩、カリウム塩等が好ましい。
反応によれば、脂肪酸の炭化水素鎖の特定の位置に不飽
和結合が導入された不飽和脂肪酸又はその誘導体に変換
される。例えば、パルミチン酸又はそのエステルを原料
として用いれば、シス−6−ヘキサデセン酸を主生成物
として得ることができる。
pH7.2〜9のリン酸緩衝液又は濃度0.3M以上で
pH7.0〜9のリン酸緩衝液の存在下、脂肪酸又はそ
の誘導体を微生物菌体に作用させ、不飽和脂肪酸又はそ
の誘導体を反応液中に生成させるものである。微生物菌
体の取得は、通常の微生物の培養方法によればよく、培
養に際して用いられる培地、pH、温度、培養時間等に
ついては当該菌株が十分に生育するものであればいずれ
の条件でもよい。好ましくは、30℃で1〜2日間、好
気的に培養するのがよい。
は培養液から菌体を遠心分離等の方法により回収後、濃
度0.25M以上でpH7.2〜9のリン酸緩衝液又は
濃度0.3M以上でpH7.0〜9のリン酸緩衝液に懸
濁させ、これに脂肪酸又はその誘導体を添加して行われ
る。
対して0.1〜10%、特に0.5〜5%用いることが
好ましく、脂肪酸又はその誘導体は、1〜30%、特に
10〜25%であることが好ましい。
pH7.2〜9のリン酸緩衝液又は濃度0.3M以上で
pH7.0〜7.2のリン酸緩衝液が用いられる。pH
7.0未満或いは濃度が0.25未満であると、効率よ
く不飽和化することができず、pHが9を超えると微生
物が増殖できない。斯かる効果の点から、濃度0.25
M以上でpH7.2〜9であるものが好ましく、特に濃
度0.3〜0.5Mで、pH7.2〜8であるものが好
ましい。
イオンを有するものでもよいが、リン酸1ナトリウム−
リン酸2カリウム又はリン酸1カリウム−リン酸2カリ
ウムが好ましい。
限り、更に硫酸マグネシウム塩、硫酸鉄塩、窒素源、ビ
タミン類等を添加することができる。尚、この場合、硫
酸マグネシウム塩は0.005〜1%、好ましくは0.
01〜0.5%、硫酸鉄塩は1〜100ppm、好ましく
は5〜50ppmで添加することが好ましい。
0℃の温度条件で、好気的条件下に48〜120時間、
特に60〜96時間行うことが好ましい。
又はその誘導体は、天然有機化合物等で通常行われてい
る抽出・単離方法により、容易に回収・分離できる。例
えば反応液を遠心分離により菌体・油相・水相に分けて
油相を分取したり、或いは反応液をそのまま有機溶剤で
抽出することにより極めて簡便に目的物を回収できる。
また、この反応により高純度の目的物が回収できるが、
さらに精製する必要のある場合は通常のカラムクロマト
グラフィー、分配抽出、溶媒晶析等により精製単離が可
能である。
明する。 実施例1 SCD培地(日本製薬株式会社製)20mLを入れた50
0mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T6
45を接種し、30℃にて1日間培養を行った。この培養
液0.4mLを、MSG(グルタミン酸ナトリウム)20
g、酵母エキス(Difco社製)4.5g、MgSO
4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15m
g、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2
O 1.2mgを、0.35M リン酸緩衝液(pH7.2
5)1Lに溶解した培地20mL及びパルミチン酸イソプ
ロピル3.8mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラス
コに接種し、26℃にて4日間、210rpmにて振盪培
養及び反応を行った。反応後、反応液に含まれる主生成
物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピル)を酢酸エ
チルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行
ったところ、生産性は51g/L、反応液中の全油中の
シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は80.
5%であった(表1)。
0mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T6
45を接種し、30℃にて1日間培養を行った。この培養
液0.4mLを、MSG(グルタミン酸ナトリウム)20
g、酵母エキス(Difco社製)3g、MgSO4・
7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15mg、
MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2O
1.2mgを、0.25Mリン酸緩衝液(pH7.25又
は7.5)1Lに溶解した培地20mL及びパルミチン酸
イソプロピル4.4mLを入れた500mL容ひだ付き三角
フラスコに接種し、26℃にて4日間、210rpmにて
振盪培養及び反応を行った。反応後、反応液に含まれる
主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピル)を
酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分
析を行ったところ、生産性は48.5g/L、反応液中
の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの割
合は70.9%であった(表1)。
0mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T6
45を接種し、30℃にて1日間培養を行った。この培養
液0.4mLを、MSG(グルタミン酸ナトリウム)20
g、酵母エキス(アサヒビール社製)8.0g、MgS
O4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15
mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2
O 1.2mgを、0.35M リン酸緩衝液(pH7.
25又は7.5)1Lに溶解した培地20mL及びパルミ
チン酸イソプロピル4.4mLを入れた500mL容ひだ付
き三角フラスコに接種し、26℃にて4日間、210rp
mにて振盪培養及び反応を行った。反応後、反応液に含
まれる主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピ
ル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーに
よる分析を行ったところ、生産性は各々のpHで58.7
g/L、48.9g/L、反応液中の全油中のシス−6
−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は73.8%、7
9.3%であった(表1)。
L容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T645
を接種し、30℃にて1日間培養を行った後。この培養
液すべてを、MSG(グルタミン酸ナトリウム)20
g、酵母エキス(アサヒビール社製)7.5g、MgS
O4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15
mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2
O 1.2mgを、0.35M リン酸緩衝液(pH7.
25)に溶解した培地12.5L及びパルミチン酸イソ
プロピル2.75Lを入れた30L容ジャーファーメン
ターに接種し、26℃にて4日間、350rpm、0.5v
vmにて通気攪拌培養及び反応を行った。反応後、反応液
に含まれる主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプ
ロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィ
ーによる分析を行ったところ、生産性は45.0g/
L、反応液中の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イソ
プロピルの割合は75.0%であった(表1)。
0mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-B-
3Mを接種し、30℃にて1日間培養を行った。後、この
培養液0.4mLを、MSG 20g、酵母エキス(Difc
o社製)3g、MgSO4・7H2O 0.05g、Fe
SO4・7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6
mg、CuSO4・5H2O 1.2mgを、0.3M リン
酸バッファー(pH7.5)1Lに溶解した培地20mL及
びパルミチン酸イソプロピル4.4mLを入れた500mL
容ひだ付き三角フラスコに接種し、26℃にて4日間、
210rpmにて振盪培養及び反応を行った。反応後、反
応液に含まれる主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イ
ソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラ
フィーによる分析を行ったところ、生産性は47.0g
/L、反応液中の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イ
ソプロピルの割合は68.5%であった(表2)。
×195mm試験管にRhodococcus sp. KSM-T645を接種
し、30℃にて1日間培養を行った。後、この培養液7
0μLを、MSG 20g、酵母エキス(Difco社製)
3g、MgSO4・7H2O 0.05g、FeSO4・
7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、C
uSO4・5H2O 1.2mgを、0.25M K,K2
リン酸バッファー(pH7.0)1Lに溶解した培地1.
5mL及びミリスチン酸イソプロピル0.35mLを入れた
φ22×195mm試験管に接種し、27℃にて4日間2
10spmにて振盪培養及び反応を行った。反応後、反応
液に含まれる主生成物(シス−6−テトラデセン酸イソ
プロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフ
ィーによる分析を行ったところ、生産性は26.5g/
L、反応液中の全油中のシス−6−テトラデセン酸イソ
プロピルの割合は36.7%であった(表3)。
0mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T6
45を接種し、30℃にて1日間培養を行った後。この培
養液0.4mLを、MSG(グルタミン酸ナトリウム)2
0g、酵母エキス(アサヒビール社製)4.5g、Mg
SO4・7H2O 0.05g、FeSO 4・7H2O 1
5mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5
H2O 1.2mgを0.25Mリン酸緩衝液(pH7.
0)1Lに溶解した培地20mL及びパルミチン酸イソプ
ロピル3.6mLを入れた500mL容ひだ付き三角フラス
コに接種し、26℃にて4日間、210rpmにて振盪培
養及び反応を行った。反応後、反応液に含まれる主生成
物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピル)を酢酸エ
チルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行
ったところ、生産性は34.9g/L、反応液中の全油
中のシス−6−ヘキサデセン酸イソプロピルの割合は4
1.1%であった(表1)。
0mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-T6
45を接種し、30℃にて1日間培養を行った。この培養
液0.4mLを、MSG(グルタミン酸ナトリウム)20
g、酵母エキス(アサヒビール社製)4.5g、MgS
O4・7H2O 0.05g、FeSO4・7H2O 15
mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、CuSO4・5H2
O 1.2mgを0.1M又は0.2Mリン酸緩衝液(p
H7.25)1Lに溶解した培地20mL及びパルミチン
酸イソプロピル3.6mLを入れた500mL容ひだ付き三
角フラスコに接種し、26℃にて4日間、210rpmに
て振盪培養及び反応を行った。反応後、反応液に含まれ
る主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イソプロピル)
を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラフィーによる
分析を行ったところ、生産性は各々28.1、32.7
g/L反応液中の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イ
ソプロピルの割合は37.6%、37.3%であった
(表1)。
0mL容ひだ付き三角フラスコにRhodococcus sp. KSM-B-
3Mを接種し、30℃にて1日間培養を行った。後、この
培養液0.4mLを、MSG 20g、酵母エキス(Difc
o社製)3g、MgSO4・7H2O 0.05g、Fe
SO4・7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6
mg、CuSO4・5H2O 1.2mgを、0.3M リン
酸バッファー(pH7.0)1Lに溶解した培地20mL及
びパルミチン酸イソプロピル4.4mLを入れた500mL
容ひだ付き三角フラスコに接種し、26℃にて4日間、
210rpmにて振盪培養及び反応を行った。反応後、反
応液に含まれる主生成物(シス−6−ヘキサデセン酸イ
ソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグラ
フィーによる分析を行ったところ、生産性は35.5g
/L、反応液中の全油中のシス−6−ヘキサデセン酸イ
ソプロピルの割合は45.4%であった(表2)。
×195mm試験管にRhodococcus sp. KSM-T645を接種
し、30℃にて1日間培養を行った。後、この培養液7
0μLを、MSG 20g、酵母エキス(Difco社製)
3g、MgSO4・7H2O 0.05g、FeSO4・
7H2O 15mg、MnSO4・6H2O 0.6mg、C
uSO4・5H2O 1.2mgを、0.35M K,K2
リン酸バッファー(pH7.25)1Lに溶解した培地
1.5mL及びミリスチン酸イソプロピル0.35mLを入
れたφ22×195mm試験管に接種し、27℃にて4日
間210spmにて振盪培養及び反応を行った。反応後、
反応液に含まれる主生成物(シス−6−テトラデセン酸
イソプロピル)を酢酸エチルで抽出し、ガスクロマトグ
ラフィーによる分析を行ったところ、生産性は10.5
g/L、反応液中の全油中のシス−6−テトラデセン酸
イソプロピルの割合は11.8%であった(表3)。
誘導体を微生物菌体外に極めて効率よく且つ高純度で製
造することができる。
Claims (3)
- 【請求項1】 ロドコッカス(Rhodococcus)属に属す
る不飽和脂肪酸生産菌を用い、濃度0.25M以上でp
H7.2〜9のリン酸緩衝液又は濃度0.3M以上でp
H7.0〜9のリン酸緩衝液の存在下、脂肪酸又はその
誘導体を該菌体に作用させる不飽和脂肪酸又はその誘導
体の製造法。 - 【請求項2】 不飽和脂肪酸生産菌が、ロドコッカス・
エスピー(Rhodococcus sp.)KSM T645株(F
ERM P−18182)である請求項1項記載の製造
法。 - 【請求項3】 ロドコッカス・エスピー(Rhodococcus
sp.)KSM T645株(FERM P−1818
2)。
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