JPS58224692A - Ｄ（−）−β−ヒドロキシ脂肪酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物によるＤ←）−β−ヒドロキシ脂肪酸
の製造法に関する、更に詳しくはキャンデイダ属に属し
、炭素数６あるいは７の飽和脂肪酸あるいはα、β−不
飽和脂肪酸を炭素数６あるいは７のＤ←）−β−ヒドロ
キシ脂肪酸に変換する能力を有する微生物を炭素数６あ
るいは７の飽和脂肪酸捷たはα、β−不飽和脂肪酸に変
換しうる基質と作用させ、生成する炭素数６あるいは７
のＤ←）−β−ヒドロキシ脂肪酸を採取することを特徴
とするＤ←）−β−ヒ１−′ロキシ脂肪酸の製造法に関
するものである。

光学活性なり←）−β−ヒドロキシ脂肪酸は２種の異な
る官能基をもつ化合物であるところから、医薬、農薬、
香料等の合成原料として好都合な物質である。炭素数６
あるいは７のβ−ヒドロキシ脂肪酸の製法に関して、Ｌ
　（＋→型のそれらに関しては川原等によってムコール
（Ｍｕ、ｃｏｒ　）属微生物を用いトランス−α、β−
不飽和脂肪酸から製造する方法が報告されている〔川原
；アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミスト　　
リ　−　　（Ａｇｒｊ、ｃｕｌｔｕｒａ］　　　Ｂｊ−
ｏコｏｇｊ−ｃａｌ　　　ｃｈｅｍｊ−８しｒ、ｙ　）
４２巻、８７９頁、１９７Ｂ）が、その対掌体のＤ←）
型については、その製法について今だ報告がなく、得ら
れたことが々い。

そこで木発明者等は、安価で、かつ効率的なり←）−β
−ヒドロキシカプロン酸およびＤ←）−β−ヒドロキシ
へブタン酸の製造法を開発スヘく研究を重ねだ結果、炭
素数６あるいは７の脂肪酸あるいはα、β−不飽和脂肪
酸をＤ（−）−β−ヒドロキシ脂肪酸に変換する能力を
有する微生物の存在を見い出しだ。例えばキャンデイダ
・ルゴーザ（Ｃａｎｄｊ−ｄａ　ｒｕｇｏｓａ　）　Ｉ
ＦＯ０７５０がその能力を有することを見い出しだ。更
に本発明の意図するところを最大限に発揮するだめには
、炭素数６あるいは７の飽和脂肪酸あるいはα。

β−不飽和脂肪酸をＤ（−）−β−ヒドロキシ脂肪酸に
変換する能力を有する微生物を変異し、Ｄ←）−β−ヒ
ドロキシ脂肪酸の資化性を低下、もしくは欠損せしめた
変異株を用いて実施するのが好ましいことも見い出した
。まだＤ←）−β−ヒドロキシ脂肪酸製造の原料として
はカプロン酸あるいはへブタン酸の飽和脂肪酸、２−ヘ
キセン酸、あるいは２−ヘプテン酸の不飽和脂肪酸の外
にｎ−ヘキシルアルコール、ｎ−へ７”　チルアルコー
ル等の当該微生物が容易に飽和脂肪酸に変換しうる基質
も使用しうろことを見い出しだ。

本発明に使用しうる微生物としてキャンディダ・ルゴー
ザ（Ｃａ、ｎｃＬ５−＋：ｌａ　ｒｕｇｏｓａ　）工Ｆ
Ｏ０７５０あるいはキャンデイダ・パヲプシロシス（Ｃ
ａｎｄ３、ｄａ　ｐａｒａｐｓｊ−］　ｏｓｊ、ｓ　）
工ＦＯ０７０８，があるが、′炭素数６あるいは７の飽
和脂肪酸あるいはσ、β−不飽和脂肪酸をそれぞれに対
応するＤ←）−β−ヒドロキシ脂肪酸に変換しうる能力
をもつキャンデイダ属の微生物であれば同様に使用でき
る。

微生物と基質とを作用させてＤ（→−β−ヒドロキシ脂
肪酸へ変換させる方法として、微生物を栄養培地で培養
し、得だ培養液に、あるいは培養液から微生物を分離し
て菌体懸濁液を調製し、それに基質を作用させる方法、
あるいは基質を添加した培地で微生物を培養することに
より、微生物を基質と作用させる方法等がある。

また分離菌体は菌体懸濁液あるいは水不溶性ポリマー等
で固定化した状態でも使用しうる。

微生物と基質との接触反応時に、当該微生物が利用しう
るエネルギー源を補給すればＩ）←）−β−ヒドロキシ
脂肪酸の生産性は向」ニする。この際の好ましいエネル
ギー源としてはタルコース、エタノール、グリセロール
、酢酸等がアル。

積させるだめには、先にも述べたとおり、Ｄ（→−β−
ヒドロギシ脂肪酸の資化性の低いか、もしくは欠損した
変異株を使用することが有利である。この様な菌株をう
るには人工変異あるいは自然変異を利用するが、効率的
に行うには通常人工変異が用いられる。人工変異の方法
としてはＸ線照射、紫外線照射、およびＮ−メチル−Ｎ
−ニトロ＝Ｎ′−二トロンクアニジン（ＮＴＧ）などの
変異誘起剤による処理が用いられる。

例えば具体的に例として本発明者等がＤ　（−）−β−
ヒドロギシ脂肪酸資化能の欠損した変異株を得るために
行なったＮＴＧによる変異方法の１例を示すと次のとお
シである。ただし、目的とする変異株が得られれば良い
のであって、この方法に限定されるものではない。

保存用スラント（キャンディダ・ルゴーザエＦ０　０７
５０）よシ１白金耳をグルコース４０ｇ。

（ＮＨ４）２ＨＰＯ４，１３／ｌ　、　　ＫＨ２ＰＯ４
７ｆ、　　Ｍｆ／ＳＯ４・７Ｈ２００，８１ｉＪ、　　
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０６０ｍ９．　　ＦｅＳＯ４７Ｈ２
０９０”！ｔ’ｓＣｕ、ＢＯ４”５Ｈ２０５”Ｌ　　Ｍ
ｎＳＯ４−４Ｈ２ｏ　　１０ｍ９．、ＮａＣ１０１！、
ビニｔｆン１ｍ？、　−Ｆ−７ミニ１２ｒｎ９．水１１
゜ｐＨ７，２の組成からなるＳ培地３ｏｍｌをｓ　ｏ　
ｏ　ｍｅ容フラヌコに入れ接種し、６０℃、２０時時間
表う培養した。

その培養液１．５　ｍｌを０．５　Ｍ　！Ｊン酸緩衝液
（ｐＨｚｏ）で洗浄後、ｏ５ｍ９／ｍｅ　Ｎ　Ｔ　ａ溶
液３　ｍｌに懸濁し、４　’Ｃ５６０分間放置した。そ
の後、同じ緩衝液で６回洗浄し、次の組成から成る固形
平板培地Ｃ培地（グルコーヌ２０ｇ、イーストエキス５
１、肉エギヌ１０ｇ５ペプトン１ｏｆｓ寒天２０ｇ、水
１　ｌ、ｐＨ７０）に塗布し、コロニーを出現させた。

このコロニーをＳ培地のグルコースの代りに酪酸１’Ｏ
ｇ、寒天２０ｆ！を加えたｐＨ７，０のＳ培地にレプリ
カした。このＳ培地上で生育不良な菌株（酪酸非資化性
性）を選んだ。このようにして選んだ酪酸非資化性性を
実施例１と同様な条件で基質として醋酸を用いＤ←）−
β−ヒドロキシ酪酸高濃度蓄積菌を選んだ。この様にし
て選んだ変異株はＤ←）−β−ヒドロキシ醋酸と同様に
Ｄ（−）−β−ヒドロギシカプロン酸、およびＤ←）−
β−ヒドロキシへブタン酸の資化性が共通して著しく低
下しており、本発明に利用できる。

本発明を実施するために上記の方法で得た変異株の例と
してキャンデイダ・ルゴーザ　ＫＴ８２０２株がある。

この変異株の菌学的性質として表１に示すごとく、親株
と殆んど差は認められないが、β−ヒドロキシ脂肪酸の
資化性において著しい差が認められる。

表　　１ 米Ｓ培地において、それぞれの化合物をｎ（ｆ、−の炭
素源として０５％添加して培養した。

なおキャンディダ脅ルコ８−ザ（Ｃａｎｄｊ、ｃｌａ　
ｒｕｇｏｓａ）ＫＴ８２０２株は工業技術院微生物工業
研究所に徽工研条寄第１１１号（ＦＫＲＭ　ＢＰ−１１
１）として寄託しである。

本発明に利用する培地はクルコーヌ、クリセリン等の炭
素源、アンモニア、硫安、ベラ０トン、カザミノ酸等の
無機有機の含窒化合物の窒素源、リン酸カリウム、硫酸
マクネシウム、等生育ニ必要な無機塩類、更にビオチン
等のビタミン類、その他必要に応じて通常の微生物の培
養に用いられる種々の栄養源を適宜配合して用いること
ができる。培養には殺菌した培地に菌を接種し、２０〜
４５℃の温度でｐＨ６〜９に保ちつつ１〜１０日間通気
攪拌、振とう培養等好気的に行なう。培養の初期は菌体
の生育があり、その後Ｄ（−）−β−ヒドロキシ脂肪酸
の生産が行なわれる。またＤ←）−β−ヒドロキシ脂肪
酸生産時に、エネルギー源としてグルコース等を補給す
ることにより効率良く多量にＤ（−）−β−ヒドロキシ
脂肪酸の生産が行なわれる。基質は培養の初期から培地
に加えても、菌体生育後添加してもいづれでも良い。

培養液、あるいは菌体反応液から生成したＤ←）−β−
ヒドロキシ脂肪酸を回収するには通常のβ−ヒドロキシ
脂肪酸の回収に用いられる手段を用いることができる。

例えば菌体を除去後、Ｄ←）−β−ヒドロキシ脂肪酸含
有液を濃縮し、硫酸等の酸でｐＨを２５以下にし、これ
よりエーテル、酢酸エチル等で抽出し、溶剤を除去後・
減圧蒸留すれば容易ＫＤ←）−β−ヒドロキシ脂肪酸を
うるととができる。

以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明
はこれら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ グルコース４０４．イーストエキス５ｇ、（ＮＨ４）２
ＨＰＯ４１３Ｑ　、　　ＫＨ２ＰＯ４７ｇ、　　ＮゾＳ
０４・７Ｈ２００，８ｆ　、　　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０
６０ｍ９．　　ＦｅＳＯ４”７Ｈ２０９０ｍ９゜Ｏｕ、
ＳＯ４・５Ｈ２０５ｍＪｉ、　　ＭｎＳＯ４’４Ｈ２０
１０ｍ９．　　Ｎａ、Ｃｌ０１ｇ、カプロン酸あるいは
へブタン酸５　ｍｌ（１１当り）の組成から々る培地を
ＮａＯＨでｐＨ７，２となし、この”ｒＯｍｌをｓ　ｏ
　ｏ　ｍｅ容フラヌコに入れ殺菌後、キャンデイダ・ル
ゴーザＫＴ８２０２株を接種し、３０′Ｃで６日間培養
した。

ｐＨは７０に保ち、かつ毎日グルコースを２％づつ添加
した。培養終了後、生成したＤ←）−β−ヒドロキシ脂
肪酸をガスクロマトグラフィー［長谷用等、ジャーナル
・オプ・ファーメンティジョン・テクノロジー誌（、Ｔ
ｏｕ、ｒｎａ］、、　ｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｊ−ｏｎ
　　　Ｔｅｃｈｎｏコｏｇｙ）５９　　巻、　　　　２
　５　７１１゜１９８１］で定量した結果、表２の如く
Ｄ←）−β−ヒドロキシカプロン酸およびＤ←）−β−
ヒドロキシへブタン酸の蓄積が認められた。

表２ 」二記条件で培養した培養液を２４集め除菌後、清澄液
を減圧下５００ｍＪまで濃縮し、次に硫酸でｐＨ２，３
としだ。これを酢酸エチル７００ｍ１で６回抽出し、溶
剤を除去後、黄色油状物を、・　カプロン酸を基質とし
たものからは２３，９、ヘプタン酸を基質としたものか
らは２１ｙをそれぞれ得た。これを減圧蒸留により精製
し、無色油状のβ−ヒドロキシ酸を表３の如く得だ。Ｎ
ＭＲ分析、工Ｒ、ガスクロ分析および比旋光度測定等よ
りそれぞれＤ←）−β−ヒドロキシカプロン酸およびＤ
←）−β−ヒドロキシへブタン酸であると同定された。

表　　６ 実施例２ 実施例１に示しだ培地から脂肪酸を除去した培地ｓｏｍ
ｅをｓ　ｏ　ｏ　ｍｌ容フラスコに入れ、殺菌後、キャ
ンデイダ・ルゴーザＫＴ８２０２を植菌し、３０′ｃで
２３時時間表う培養した。この培養液者々に、２−ヘキ
セン酸、あるいは２−ヘプテン酸、するいＩｆＪｎ−ヘ
プチルアルコール、アルいＩｄ、ｎ−ヘプチルアルコー
ルを０５％づつ添加し、ｐＨを７０に保ちつつ、培養中
毎日２％グルコースを添加し、３０　’Ｃで更に２日間
振とう培養した。培養終了後、生成したＤ←）−β−ヒ
ドロキシ脂肪ｅ　ヲガヌクロマ１−クラフィーで分析し
た結果、表４の如くの蓄積が認められた。

表　　４ 実施例ろ 実施例１と同様に変異株ＫＴ８２０２株を培養し、培養
開始後、２４．４８時間目エネルギー源としてグルコー
ヌ６ｏｏｍｔｉ、またはクリセロール６００ｍ９、まだ
は２４．３．６．４８．６０時間目にエタノール０．３
　ｍｌまだは酢酸０．３　ｍｅづつ添加し、かつｐＨを
７０に保ちつつ′７２時間培養した。培養終了後の培養
液中のＤ（−）−β−ヒドロキシ脂肪酸の生成量は表５
の如くであった。

表　　５

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ギャンデイダ属に属し、炭素数６あるいは７
   の飽和脂肪酸あるいはα、β−不飽和脂肪酸を炭素数６
   あるいは７のＤ←）−β−ヒドロキシ脂肪酸に変換する
   能力を有する微生物に炭素数６あるいは７の飽和脂肪酸
   丑たはα。 β−不飽和脂肪酸あるいは、当該微生物が炭素数６ある
   いは７の飽和脂肪酸に変換しうる基質を作用させ、生成
   する炭素数６あるいは７のＤ←）−β−ヒドロキシ脂肪
   酸を採取することを特徴とするＤ←）−β−ヒドロキシ
   脂肪酸の製造法。
2. （２）微生物がキャンディダ・ルゴーザでアル特許請求
   の範囲第１項記載の製造法。
3. （３）微生物が製造を目的とするＤ←）−β−ヒドロキ
   シ脂肪酸の資化能を低下、もしくは欠損せしめた変異株
   である特許請求の範囲第１項記載の製造法。
4. （４）変異株がキャンデイダ・Ｊレコ゛−ザから誘導さ
   れた微生物である特許請求の範囲第６項記載の製造法。
5. （５）飽和脂肪酸がカプロン酸あるいはへブタン酸、α
   、β−不飽和脂肪酸が、２−ヘキセン酸、あるいは２−
   ヘプテン酸、当該微生物が飽和脂肪酸に変換しうる基質
   がｎ−ヘキシルアルコールアルいはｎ−へブチルアルコ
   ールであり、製造目的物がそれぞれに対応するＤ←）−
   β−ヒドロキシカプロン酸あるいはＤ←）−β−ヒドロ
   キシへブタン酸である特許請求の範囲第１項記載の製造
   法。
6. （６）微生物を栄養培地で培養し、得た培養液に基質を
   作用させる特許請求の範囲第１項あるいは第３項記載の
   製造法。
7. （７）基質を添加した培地で微生物を培養し、基質と微
   生物を作用させる特許請求の範囲第１項あるいは第６項
   記載の製造法。
8. （８）？ＩＪ１．生物を栄養培地で培養し、得られた培
   養液から、微生物菌体を公庫１して菌体懸濁液を調製し
   、それに基質を作用させる特許請求の範囲第１項あるい
   は第６項記載の製造法。
9. （９）微生物と基質を作用させる際に、当該微生物が利
   用しうるエネルギー源を補給することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項ｆ−７−：Ｊｆ−第ろ項記載の製造法
   。 ０１微生物が利用しうるエネルギー源がクルコース、ク
   リセロール、エタノールｉ　ｒｃ　ｌｄ　酢酸である特
   許請求の範囲第９項記載の製造法。