DE2915106A1 - Verfahren zur enzymatischen umwandlung organischer substrate in ketone - Google Patents
Verfahren zur enzymatischen umwandlung organischer substrate in ketoneInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf die Umwandlung von C^-C^-Alkanen
oder see.-Alkoholen in Methy!ketone, d.h. Aceton oder 2-Butanon,
insbesondere auf die Bildung von C,-C,-Methylketonen aus
CU-Cg-Alkanen oder C3-Cg-SeC.-Alkoholen durch Einwirkung
von Sauerstoff und Mikrobenzellen induzierter methylotropher Mikroorganismen oder daraus stammenden Enzympräparaten.
Methan ist eine der billigsten Kohlenstoffquellen für das
Mikrobenwachstum. Bekanntlich gibt es viele Mikroorganismen, die auf einem Kulturmedium in Gegenwart von Methan als Hauptkohlenstoffquelle
wachsen können. Nicht alle dieser Mikroorganismen haben jedoch gute Wachstumseigenschaften. Bekannt
ist auch, da3 mit Methan gezüchtete Mikroorganismen zur Umwandlung
von Methan in Methanol unter aeroben Bedingungen
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verwendet werden können.
Diese Methan-verwertenden Mikroorganismen sind im allgemeinen
als "Methylotrophe" bekannt. Das von IU Whittenbury et al.
lJ. of Gen. Microbiology, 6±, 205-218 (1970)) vorgeschlagene
iKlassifikationssystem für Methylotrophe hat die breiteste
Anerkennung gefunden. In diesem System sind die morphologischen
Eigenschaften Methan oxydierender Bakterien in fünf Gruppen unterteilt: Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas,
Methylobacter und Methylococcus.
Kürzlich offenbarten Patt, CoIe und Hanson (International J.
Systematic Bacteriology, 2(5, (2) 226-229 (1976)), daß methylotrophe Bakterien solche Bakterien sind, die nicht-■autotrqph
unter Verwendung von Kohlenstoffverbindungen mit einem oder mehreren Kohlenstoffatomen, aber ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen,
wachsen können. Patt et al. haben vorgeschlagen, daß Methylotrophe als "obligat oder zwingend"
angesehen werden sollten, wenn sie nur Kohlenstoffverbindungen ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen Iz.B. Methan,
Methanol, Dimethyläther, Methylamine usw.) als einzige Quellen
für xiohlenstoff und Energie verwerten können, während "fakultative"Methylotrophe solche Organismen sind, die sowohl
Verbindungen ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen als
auch Verbindungen mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen als Quellen für Kohlenstoff und Energie verwerten können.
In ihrer Veröffentlichung offenbarten Patt et al. ein Methan oxydierendes Bakterium, das sie als Methylobacterium organophilum
sp. nov. (ATCC 27 886) identifizierten. Dieses Bakterium unterscheidet sich vermutlich von allen zuvor beschriebenen
Gattungen und Arten Methan-oxydierender Baktesrien aufgrund
der Fähigkeit zur Verwertung einer Vielzahl organischer Substrate mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen als Quellen
für Kohlenstoff und Energie.
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Es ist jetzt anerkannt, daß es zwei Arten methylotropher Mikroorganismen gibt, und zwar auf der Grundlage ihres
Wachstumsvermögens auf kohlenstoffhaltigen Substraten. Eine Art wurde als "Methan-Verwerter11 und die andere als
"Methanol-Verwerter" bezeichnet. Die Methanol-Verwerter sind
inicht in der Lage, in Gegenwart von Methan als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle ?,u wachsen, wachsen aber in
Gegenwart von Methanol, Methylamin usw. Die Methan-Verwerter vermögen auf zahlreichen C--Verbindungen, einschließlich Methan,
Methanol, Dimethylather usv/. zu wachsen. Innerhalb der Gruppe
der Methan-verwertenden Methylotrophe und der Methanolverwertenden
Methylotrophe gibt es obligate und fakultative Arten methylotropher Mikroorganismen. Die obligaten Methan- ,.
verwertenden methylotrophen Mikroorganismen wachsen nur auf Verbindungen des C--Typs, z.B. Methan, Methanol, Dimethyläther,
Methylformiat, Methylcarbonat usv/. Die fakultativen
Methan-verwertenden methylotrophen liikroorganismen wachsen
nicht nur auf den vorgenannten Verbindungen des C.-Typs, sondern auch auf anderen organischen Verbindungen, wie Glucose. Die obligaten Methanol-verwertenden Methylotrophen
Mikroorganismen wachsen auf C.,-Verbindungen, z.B, Methanol,
Methylamin, nicht aber auf Methan oder auf organischen Verbindungen,
wie Glucose. Die fakultativen Methanol-verwertenden methylotrophen Mikroorganismen wachsen auf den oben erwähnten
Verbindungen des C1-TyPS (nicht aber auf Methan) und
verschiedenen anderen organischen Verbindungen, wie Glucose.
Leadbetter und Foster, (Arch. Microbiology, _3£, 81-118 (1959)
"Studies on Some Methane-utilizing Bacteria") berichteten,
daß aus Pseudomonas methanica (derzeit als Methylomonas methanica bezeichnet) stammende Mikrobenzellen n-Propan und
η-Butan zu den entsprechenden Alkoholen, Ketonen und Carbonsäuren
oxydieren, wenn sie gleichzeitig in Methan als Wachstumssubstrat enthaltenden Wachstümskulturen vorhanden sind.
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Leadbetter et al. stellen auf Seite 103 fest "Propan oder η-Butan wurde nicht durch gewaschene Zellen oxydiert. Sie
wurden jedoch oxydiert, wenn sie gleichzeitig in Wachstumskulturen mit Methan als Wachstumssubstrat vorlagen".
Auf Seite 102 mutmaßen Leadbetter et al./ daß der secfAlkohol ein Zwischenprodukt bei der Umwandlung von Propan
in Aceton ist.
Die Art des von Leadbetter et al. beschriebenen Verfahrens wurde als "Cooxydationstechnik" bezeichnet, da nicht dem
■Wachstum dienende Kohlenwasserstoffe oxydiert werden, wam
isie als Cosubstrate in einem Medium vorliegen, in dem ein oder iinehrere verschiedene Kohlenwasserstoffe für das Wachstum vorliegen.
Wie oben erörtert, wandten Leadbetter et al. diese Technik an, wonach Pseudomonas methanica auf Kosten von Methan
gezüchtet wurde, und eine Reihe homologer Oxydationsprodukte wurde aus den Cosubstratgasen erhalten, z.B. entstand aus
Äthan Äthanol, Acetaldehyd und Essigsäure; aus Propan n-Propanol, Propionsäure und Aceton; aus η-Butan n-Butanol,
η-Buttersäure und 2-Butanon.
Mehrere Veröffentlichungen bezogen sich auf die Veröffentlichung
von Leadbetter et al. bezüglich der Produktion von Ketonen aus Alkanen in verschiedenen Versuchen zum Verständnis
des Umwandlungsmechanismus (d.h., läuft die Umwandlung über eine see.-Alkohol-Zwischenstufe?).
Dieser Stand der Technik beschreibt kein Verfahren, bei dem "ruhende" Mikrobenzellen oder aus methylotrophen, aerob
auf C1-Verbindungen (z.B. Methan, Methanol, Methylamin usw.)
gezüchteten Mikroorganismen stammende Enzympräparate C3-Cg-Alkane
oder C3-Cg-SeC.-Alkohole in die entsprechenden
Methylketone überführen. Bekanntlich sind "ruhende" Mikrobenzellen
von "wachsenden" Mikrobenzellen dadurch unterscheid-
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bar, daß erstere nicht in einem Wachstumsmedium gehalten werden,
d.h. in einem Medium mit einer Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff, während letztere in einem Wachstumsmedium
gehalten werden, wo sie aktiv wachsen und sich vermehren können.
Während A.W. Thompson, J. G. O'Neill und J. F. Wilkinson (Arch. Microbiol., IJ)JJ, 243-246 (1976) "Acetone Production
by Methylobacteria") offenbarten, daß Aceton während des
Stoffwechsels von Äthan und Produkten der Äthanoxydation
durch gewaschene Suspensionen von methylotrophen Mikroorganismen, wie Methylosinus trichosporium OB3b und Methylomonas
albus BG8/ beobachtet wurde, offenbaren Thompson et al. nicht
die Produktion von Ketonen aus C--C^-Alkanen oder Co-Cc-
Jb Jo
see.-Alkoholen.
Hutchinson, Whittenbury und Dalton (J. Theor. Biol., 58,
325-335 (1976) "A Possible Role of Free Radicals in the Oxidation of Methane by Methylococcus capsulatus") und
Colby und Dalton (J. Biochem., JJ57, 495-497 (1976) "Some
Properties of a Soluble Methane Mono-Oxygenase From Methylococcus capsulatus, Stamm Bath") berichteten, daß Äthylen
durch die lösliche Methan-Monooxygenäse aus Methylococcus
capsulatus, Stamm Bath,oxydiert wird. Diese letzteren Forscher berichteten, daß die "teilchenförmigen Membranpräparate"
von Methylococcus capsulatus, Stamm Bath, keine Methan-Oxygenase-Aktivität hatten, bestimmt nach dem Test
des Brominethan-Verschwindens.
Cerniglia, Blevins und Perry, (Applied and Environmental Microbiology, 32^ (6) 764-768 (1976) "Microbial Oxidation
and Assimilation of Propylene") beschrieben die Oxydation von Propylen durch Mikroorganismen zu den entsprechenden
Alkoholen und Carbonsäuren.
In jüngster Zeit offenbarten Colby, Stirling und Dalton,
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(J. Biochem., _1j>5_, 395-402 (August 1977) "The Soluble Methane
Mono-Oxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath)Its Ability to Oxygenate n-Alkanes, n-Alkenes, Ethers and Alicyclic,
Aromatic and Heterocyclic Compounds"), daß die lösliche Fraktion von Methylococcus capsulatus, Stamm Bath, eine sehr
unspezifische Oxygenase ist, da sie Alkane zu Alkoholen, Alkene zu 1,2-Epoxiden, Diäthyläther zu Äthanol und Äthanal,
Styrol zu Styrolepoxid und Pyridin zu Pyridin-N-oxid oxydiert.
18 18
Auf der Grundlage des O -Einbaus aus O~ in die Zellbestandteile
von Pseudomonas methanica vermuteten Leadbetter und Foster (Nature, 184, 1428-1429 (1959) "Incorporation of
Molecular Oxygen in Bacterial Cells utilizing Hydrocarbons For Growth"), daß am anfänglichen oxydativen Angriff auf Methan
eine Oxygenase beteiligt sei. Higgins und Quayle (J. Biochem.,
118, 201-208 (1970) "Oxygenation of Methane by Methane-Grown
Pseudomonas methanica and Methanomonas methanooxidans")
18
isolierten CH3 OH als das Produkt der Methanoxydation, wenn Suspensionen von Pseudomonas methanica oder Methanomonas
isolierten CH3 OH als das Produkt der Methanoxydation, wenn Suspensionen von Pseudomonas methanica oder Methanomonas
18
methanooxidans Methan in an O- angereichterten Atmosphären oxydieren konnten. Die Folgebeobachtung einer Methan-stimulierten NADH-Oxydation, katalysiert durch Extrakte von Methylococcus capsulatus, durch Ribbons (J. Bacteriol., 122, 1351-1363 (1975) "Oxidation of Cj-Compounds by Particulate Fractions From Methylococcus capsulatus: Distribution and Properties of Methane-Dependent Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide Oxidase (methane hydroxyläse)") und Ribbons und Michalover, FEBS Lett. Y\_, 41-44 (1970) "Methane Oxidation by Cell-Free Extracts of Methylococcus capsulatus"oderMethylomonas Methanica Ferenci (FEBS Lett. £[, 94-98 (1974) "Carbon Monoxide-Stimulated Respiration in Methane-Utilizing Bacteria") vermuteten, daß das für diese Oxydation verantwortliche Enzym eine Monooxygenase ist. Diese Forscher stützten sich auf indirekte Enzymtests, in dem spektrophotometrisch Methanstimuliertes NADH-Verschwinden oder polarographisch Methanstimuliertes O2-Verschwinden gemessen wurde. In jüngerer Zeit
methanooxidans Methan in an O- angereichterten Atmosphären oxydieren konnten. Die Folgebeobachtung einer Methan-stimulierten NADH-Oxydation, katalysiert durch Extrakte von Methylococcus capsulatus, durch Ribbons (J. Bacteriol., 122, 1351-1363 (1975) "Oxidation of Cj-Compounds by Particulate Fractions From Methylococcus capsulatus: Distribution and Properties of Methane-Dependent Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide Oxidase (methane hydroxyläse)") und Ribbons und Michalover, FEBS Lett. Y\_, 41-44 (1970) "Methane Oxidation by Cell-Free Extracts of Methylococcus capsulatus"oderMethylomonas Methanica Ferenci (FEBS Lett. £[, 94-98 (1974) "Carbon Monoxide-Stimulated Respiration in Methane-Utilizing Bacteria") vermuteten, daß das für diese Oxydation verantwortliche Enzym eine Monooxygenase ist. Diese Forscher stützten sich auf indirekte Enzymtests, in dem spektrophotometrisch Methanstimuliertes NADH-Verschwinden oder polarographisch Methanstimuliertes O2-Verschwinden gemessen wurde. In jüngerer Zeit
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wurden Methan-Monooxygenase-Systeme teilweise gereinigt aus ί Methylosinus trichosporium OB3b (Tonge, Harrison und
j Higgins, J. Biochem., ϊβχ, 333-344 (1977) "Purification
and Properties of the Methane-Monooxygenase Enzyme System
From Methylosinus trichosporium OB3b") und Tonge, Harrison, Knowles und Higgins, FEBS Lett., 5J7 293-299 (1975)
"Properties and Partial Purification of the Methane-Oxidizing Enzyme System From Methylosinus trichosporium") und aus
Methylococcus capsulatus (Bath) (Colby und Dalton, J. \-,_ Biochem., 171, 461-468 (1978) "Resolution of the Methane
- Mono-Oxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath) Into Three Components" und Colby, Stirling und Dalton, J.
Biochem., 165_, 395-402 (1977) "The Soluble Methane Mono-Oxygenase
of Methylococcus capsulatus (Bath), "Its Ability to Oxygenate n-Alkanes, n-Alkenes, Ethers and Alicyclic,
Aromatic and Heterocyclic Compounds").
Die mikrobiologische Bildung von Methylketonen in Säugetieren, Bakterien und Fungi ist gut bekannt. Das Keton bildet
sich jedoch durch Decarboxylierung einer ß-Ketosäure und hat daher ein Kohlenstoffatom weniger als die Vorstufe.
Andererseits stellt die bakterielle Bildung von Methylketonen aus n-Alkanen, zuerst von Leadbetter und Foster
(Arch. Mikrobiol., 3J>, 92-104 (1960)), eine einzigartige
α-Oxydation dar, ohne Veränderung des KohlenstoffSkeletts.
In diesem letzteren Bericht wurde jedoch festgestellt, daß die Ketonbildung eine Cooxydation in Gegenwart des Wachstumssubstrats war, und gaben an, daß bei den ruhenden Zellen
keine Aktivität gefunden wurde.
Phenazxnmethosulfat-(PMS)-abhängige Methanol-Dehydrogenase aus vielen methylotrophen Bakterien ist eingehend beschrieben
worden. Dieses Enzym oxydiert primäre Alkohole von Cj-C.Q, oxydiert aber nicht sekundäre Alkohole. Nicotinamid-adenin-dinucleotid
(NAD)-abhängige Alkohol-Dehydro-
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genasen aus Leber and Hefe sind beschrieben worden. Diese Alkoholdehydrogenasen oxydieren primäre Alkohole und Acetaldehyd,
zeigen aber bei Methanol keine Aktivität. Außerdem oxydieren die Alkoholdehydrogenasen aus Hefe und Leber
auch einige sekundäre Alkohole mit sehr geringer Geschwindigkeit ( < 1 % der Äthanolaktivität). NAD(P)-abhängige
Alkoholdehydrogenasen wurden auch in Pseudomonas, E. coli und Leuconostoc beschrieben. Diese Enzyme waren jedoch
nur gegenüber langkettigen primären Alkoholen oder Hydroxy- Jj _ fettsäuren aktiv. In jüngerer Zeit wurde ein NAD-gebundenes,
f ,—-.-'- - Methyl-oxydierendes Enzym in einem Heferohextrakt beschrieben
(Mehta, R.J., J. Bacteriol. , J_24, 1165-1167 Π975).
~f , Soweit bekannt, gibt es in der Literatur keinen Bericht
-; - über ein see.-Alkohol-spezifisches Alkoholdehydrogenase-'
' , (SADH)-Enzym.
■f :
;f j " Da Ogata et al. (J. Ferm. Technol., _4i$, 389-396 (1970))
·' zuerst von der Assimilierung von Methanol durch eine Hefe
^ ■, berichteten, sind zahlreiche Methanol-verwertende Stämme
av.s natürlichen Quellen isoliert oder in Ausgangskultur-
,-', Sammlungen gefunden worden. Interesse an der Kultivierung
' von Mikroorganismen auf billigen und reichlich zur Verfügung
■ stehenden Verbindungen, wie Methanol, ist als Folge der
'f möglichen Bedeutung mikrobiellen Proteins als Nahrungsmittel
oder Futtermaterial stark gestiegen. Die Produktion j'f ,von Einzell-Protein (SCP) aus Methanol-gezüchteten Hefen
I ist in verschiedenen Veröffentlichungen erörtert worden.
I Es wurde gezeigt, daß die Oxydation von Methanol und ande-
I ren primären Alkoholen in Hefen durch eine Alkoholoxydase
f. .,. katalysiert wird. Alkoholoxydase enthielt Flavin-adenin-
ij Idinucleotid (FAD) als prcsthetische Gruppe. Sekundäre
\ Alkohole wurden durch diese Alkoholoxydase nicht oxydiert.
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• » i t t i
* P 4 I « ·
Es wurde nun gefunden, daß Cg-Cg-Methylketone, z.B. Aceton
und 2-Butanon, nach einem Verfahren hergestellt werden können, wonach ein C,-Cg-Alkan oder ein C3-Cg-SeC.-Alkohol
unter aeroben Bedingungen in einem Nicht-Nährmedium mit ruhenden Mikrobenzellen obligater oder fakultativer
methylotropher Mikroorganismen oder aus solchen Zellen stammenden Enzympräparaten in Berührung gebracht wird, wobei
die Mikroorganismen zuvor unter aeroben Bedingungen in einem mineralischen Nährmedium kultiviert worden sind,
das einen Oxygenase- und/oder Dehydrogenase-Enzym-Inducer als Wachstums- und Energiequelle enthält. Beispiele für
solche Inducer oder Auslöser sind Methan (im Falle Methanverwertender methylotropher Mikroorganismen), Methanol,
Dimethylather, Methylamin, Methylformiat, Methylcarbonat,
Äthanol, Propanol, Butanol usw.
Die Mikrobenzellen oder Enzympräparate, die aus den Zellen
stammen, die bei der umwandlung der C-j-Cg-Alkane in die
entsprechenden Ketone verwendet werden sollen, können aus obligaten oder fakultativen Methan-verwertenden methylotrophen
Mikroorganismen stairarien, nicht aber aus den methyiotrophen
Mikroorganismen des Methanol-verwertenden Typs. Die Mikrobenzellen öder Enzympräparate, die aus den bei
der Umwandlung von C3-Cg-SeC-Alkoholen in die entsprechenden
Ketone zu verwendenden Zellen stammen, können entweder aus den obligaten oder fakultativen Methan- oder Methanolverwertenden
methylotrophen Mikroorganismen stammen *
Es wurde auch gefunden, daß methylotrophe Hefestämme
aerob auf einer Vielzahl von Methylreste liefernden kohlenstoffhaltigen
Verbindungen, wie Methanol, Methylamin, Methylformiat, Methylcarbonat, Dimethyläther usw., gezüchtet
werden können, um Mikrobenzellen oder daraus stammende Enzympräparate hervorzubringen, und sie vermögen lineare
C3-Cg-SeC-Alkohole in die entsprechenden Methylketone
aerob zu üJ-»eirfuhren.
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Außerdem wurde eine Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD+)-abhängige
sec.-Alkohol-Dehydrogenase in zellfreien Extrakten
verschiedener Kohlenwasserstoff-verwertender Mikroben, einschließlich Bakterien und Hefen, gefunden. Dieses Enzym
findet sich auch in mit Methanol gezüchteten Zeilen. Es
% oxydiert spezifisch und stöchiometrisch sec.-C3-C6-AIkOhOIe
zu ihren entsprechenden Methylketonen. Dieses Enzym wurde
?2600-fach gereinigt und zeigt eine einzelne Proteinbande bei der Acrylamidgel-Elektrophorese. Es hat ein Molekular-ίgewicht
von 95.000 + 3.000 Dalton. Diese bakterielle SADH besteht aus zwei Untereinheiten von 48.000 Dalton und zwei
Zinkatomen pro Molekül des Enzymproteins. Sie oxydiert see.-Alkohole, insbesondere 2-Propanol und 2-Butanol. Primäre
Alkohole werden durch SADH nicht oxydiert.
Wie oben erörtert, vermögen die obligaten Methan-verwertenden methylotrophen Mikroorganismen auf Methan, Methanol
und zahlreichen Methylreste liefernden Verbindungen, z.B. Dimethyläther, MethyIformiat, Methylcarbonat usw., zu wachsen.
Die fakultativen Methan-verwertenden methylotrophen Mikroorganismen wachsen nicht nur auf Methan, Methanol und
verschiedenen Methylreste liefernden Verbindungen, wie oben erwähnt, sondern sie vermögen auch auf verschiedenen anderen
organischen Verbindungen, wie Glucose, zu wachsen.
Die obligaten Methanol-verwertenden methylotrophen Mikroorganismen
können mit Methan nicht wachsen, aber mit Methanol und anderen Methylreste liefernden Verbindungen, wie Methylamin,
MethyIformiat, Methylcarbonat usw. Die fakultativen
Methanol—verwertenden methylotrophen Mikroorganismen, wie
die obligaten Methanol-verwertenden methylotrophen Mikroorganismen, vermögen mit Methan nicht zu. wachsen, aber mit
Methanol, den oben erwähnten methylhaltigen und anderen organischen
Verbindungen, wie C^-Cg-Alkoholen und Glukose. Für
die erfindungsgemaßen Zwecke jedoch sind die obligaten oder
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» I I I I J. ·- Il i / Jt
fakultativen Methanol-verwertenden Mikroorganismen auf dem Alkoholdehydrogenasa-induzierenden Substrat zu züchten, d.h.
Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Methylamin und Methylformiat usw.
Der Ausdruck "Mikroorganismus" wird hier in seinem breitesten Sinne verwendet und umfaßt nicht nur Bakterien, sondern auch
Hefen, fadenförmige Fungi, Actinomyceten und Protozoen. Vorzugsweise umfassen die Mikroorganismen Bakterien und insbesondere
bevorzugt die Bakterien, die Methan und Methylreste liefernde kohlenstoffhaltige Verbindungen zu oxydieren
vermögen.
,Der Begriff "Enzympräparat" wird hier als jede stoffliche
Masse umfassend verwendet, die die gewünschte Oxygenase- oder Dehydrogenase-Enzymaktivität zeigt. Der Begriff bezieht sich
z.B. auf lebende ganze Zellen, getrocknete Zellen, Zellextrakte und raffinierte konzentrierte, aus den Zellen stammende
Präparate, insbesondere gereinigte sec.-Alkoholdehydrogenase
und deren NAD -Cofaktor und Metallbedarf. Enzympräparate können entweder in trockener oder flüssiger Form
vorliegen. Der Begriff umfaßt auch die immobilisierte Form des Enzyms, z.B. die ganzen Zellen der mit Methan oder Methylresten
gezüchteten Mikroorganismen oder Enzymextrakte, die an eine unlösliche Matrix durch kovalente chemische Bindungen,
Absorption und Einschluß des Enzyms in ein Gelgitter mit genügend großen Poren für freien Durchgang der Substratmoleküle
und des Produkts, aber hinreichend kleinen Poren zum Zurückhalten des Enzyms unbeweglich gemacht oder gebunden worden
sind. Der Begriff "Enzympräparat" umfaßt auch Enzyme, die in Hohlfasermembranen zurückgehalten werden, z.B. wie von
Rony, Biotechnology and Bioengineering (1971) offenbart.
Der Begriff "Teilchenfraktion'1 bezieht sich auf die Enzymaktivität
in dem ausgefällten oder sedimentierten Material, wenn die überstehende Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren
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zerbrochener Zellen bei 10.000 g für 30 min 1 h bei 10.000 g
oder mehr zentrifugiert wird.
Das von R. Whittenbury, K. C. Philips und J. F. Wilkinson (J. Gen. Microbiology, 6J_, 205-218 (1970) (nachfolgend
Whittenbury et al.)) vorgeschlagene Klassifikationssystem
Methan-oxydierender Bakterien ist das am breiu<;ste^ anerkannte,
heute verwendete System. In diesem Klassifikafcionssystem
sind Methan-verwertende Bakterien auf der Grundlage morphologischer Eigenschaften in fünf Gruppen unterteilt,
Diese sind: Methylosinus, Methylocystis, Methyiomonas ,
Methylobacter und Methylococcus. Bakterien dieser von
Whittenbury et al. angegebenen fünf Gruppen verwerten Methan, Dimethyläther und Methanol für die Wachstumsenergie und
wurden alle als strikt aerob und gram-negativ geschildert.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung wurde
gefunden, daß C3-Cg-Methylketone gebildet werden, indem
die entsprechenden CU-Cg-Alkane oder C3-Cg-SeC-Alkohole
unter aeroben Bedingungen mit ruhenden Mikrobenzeilen obligater oder fakultativer methylotropher Mikroorganismen
oder aus solchen Zellen stammenden Enzympräparaten in Berührung gebracht werden, wobei die Mikroorganismen zuvor
unter aeroben Bedingungen in einem methanhaltigen Nährmedium gezüchtet worden sind. Bei diesem Verfahren werden auch
see.-Alkohole aus den C-j-Cg-Alkanen gebildet.
Gemäß einer weiteren speziellen Ausführungsform der Erfindung
wurde gefunden, daß C3-C6-Methylketone gebildet werden
können, indem die entsprechenden C3-Cg-SeC-Alkohole
unter aeroben Bedingungen mit Mikrobenzellen (vorzugsweise ruhenden Mikrobenzellen) aus obligaten oder fakultativen
methylotrophen Mikroorganismen oder aus solchen Zellen stam-
909844/07>
menden Enzympräparaten in Berührung gebracht werden, wobei
die Mikroorganismen zuvor unter aeroben Bedingungen in einem methanolhaltigen Nährmedium gezüchtet worden sind.
überraschenderweise wurde gefunden, daß die Mikrobenzellen
oder ihre Enzympräparate, worin die Zellen zuvor mit Methanol als hauptsächlicher Kohlenstoff- und Energiequelle gezüchtet
worden sind, C3-C6-SeC.-Alkohole in die entsprechenden
Methylketone zu überführen vermögen, nicht aber die C3-C6-Alkane
in die entsprechenden Methylketone. Die mit Methan '
gezüchteten Mikrobenzellen oder deren Enzympräparate vermögen sowohl C3-Cg-Alkane als auch C3-Cg-SeC.-Alkohole in die entsprechenden
Methylketone zu überführen.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten C3-Cg-Alkane
sind vorzugsweise lineare n-Alkane, z.B. Propan, η-Butan, n-Pentan und η-Hexan, am meisten bevorzugt sind
die Alkane entweder Propan oder η-Butan. Die C3-Cg-SeC-Alkohole
stammen vorzugsweise von linearen C3-Cg-Alkanen,
insbesondere bevorzugt sind 2-Propanol und 2-Butanol. 'T
Zu einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform I
der Erfindung gehört ein Verfahren zur Umwandlung von linearen |
C3-Cg-SeC.-Alkoholen in die. entsprechenden Methylketone, J
indem ein linearer Cj-C^-sec.-Alkohol unter aeroben Bedin- |
gungen mit einem Enzympräparat in Berührung gebracht wird, |
das das neue C3-Cg-SeC.-Alkoholdehydrogenase(SADH)-Enzym |
(in Form eines Rohextrakts, gereinigter oder immobilisierter P
Form) in Kombination mit Nicotinamid-adenin-dinucleotid |
(NAD+) enthält. I,
Il Zur Erfindung gehören folgende Merkmale: I,
Suspensionen ruhender Zellen der neuen C1-verwertenden \
Mikroben oxydieren (dehydrieren) C3-Cg-see.-Alkohole zu
909844/0750
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ihren entsprechenden Methylketonen. Die Produkt-Methylketone
sammeln sich extrazellulär an. Von den see.-Alkoholen wurde
2-Butanol mit der höchsten Geschwindigkeit oxydiert.
Mit Succinat gezüchtete Zellen der neuen fakultativen methylotrophen Isolate wandeln see.-Alkohole nicht in
Methylketone um.
Ein gewisser enzymatischer Abbau von 2-Butanon wurde beobachtet.
Das Produkt, 2-Butanon, hemmte die Umwandlung von 2-Butanol- y
zum entsprechenden 2-Butanon nicht. Die Produktionsgeschwindig- | keit für 2-Butanon war für die ersten vier Stunden Inkubation
bei den getesteten Kulturen linear.
Eine Hefekultur hatte die höchste Produktionsgeschwindigkeit und ein höheres Temperaturoptimum (400C), und bei 45°C lag
eine vernünftig hohe 2-Butanon-Produktionsgeschwindigkeit vor (die Bakterien hatten ein Temperaturoptimum von 350C).
Metallchelatisierende Mittel hemmen die Produktion von 2-Butanon,
was die Beteiligung von Metall(en) nahelegt.
Die sec.-Alkoholdehydrogenase-Aktivität fand sich in dem
zellfreien löslichen Extrakt der durch Schall aufgebrochenen Zellen
mit C- gezüchteter Isolate. Das zellfreie System braucht
einen Cofaktor, insbesondere NAD , für seine Aktivität. Die neue sec.-Alkoholdehydrogenase oxydiert spezifisch
und stöchiometrisch C^-Cg-sec.-Alkohole zu den entsprechenden
Methylketonen. Das Enzym wurde 2.600-fach gereinigt und zeigt eine einzelne Proteinbande bei der Acrylamidgel-Elektrophorese.
Es hat ein Molekulargewicht von 95.000 Dalton. Die bakterielle SADH besteht aus zwei Untereinheiten von
48.000 Dalton und zwei Zinkatomen pro Molekül des Enzymproteins. Primäre Alkohole werden durch die SADH nicht in
Ketone überführt. Die pH- und Temperaturoptimalwerte für SADH sind 8 bis 9 bzw. 30 bis 350C. Die berechnete Aktivie-
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rungsenergie beträgt 19,8 kcal. Arcylamidgel-Elektrophorese der gereinigten SADH-Fraktion, mit Coomassie-Brilliantblau
und Aktivitätsfarbe verfärbt, sowie die rohen, löslichen, zexlfreien Extrakte aus verschiedenen Arten von mit Methanol
gezüchteten Mikroben, mit Aktivitätsfarbe verfärbt, wurden verglichen. Sowohl der Proteinfleck als auch der Enzymaktivitätsfleck
der gereinigten SADH zeigte eine einzelne Proteinbande. Die Beweglichkeit bei der Gelelektrophorese
der SADH aus den verschiedenen Arten von mit Methanol ge- -"--züchteten Bakterienzellen war identisch. Hefe-SADH hatte
eine größere Mobilität gegenüber der Anode bei der Gelelektrophorese. Der Zusatz von Substraten bei der SADH-Reaktion
verlangt keine obligatorische Folge. Die SADH-Aktivität wird durch metallchelatisierende Mittel, durch starke Thioireagentien
und durch das Produkt 2-Butanon inhibiert.
Zellsuspensionen von auf Methylreste liefernden Verbindungen (z.B. Methanol, Methylamin, Methylformiat usw.) gezüchteten
Hefen katalysieren die Umwandlung von see.-Alkoholen in
die entsprechenden Methylketone.
Zellsuspensionen von auf Methylreste liefernden Verbindungen (z.B. Methanol, Methylamin, Methylfonaiat usw.) gezüchteten
erfindungsgemäßen Hefen katalysieren die Umwandlung von see.-Alkoholen in die entsprechenden Methylketone.
Zellfreie Extrakte, die aus mit Methylresten (z.B. Methanol)
gezüchteten Hefen gemäß der Erfindung stammen, katalysierten eine NAD -abhängige Oxydation von C3-C6-SeC.-Alkoholen zu
den entsprechenden Methylketonen. Die gereinigte NAD -spezifische sec.-Alkoholdehydrogenase aus mit Methanol gezüchteter
Hefe gemäß der Erfindung ist nach der PolyacrylamidgelrElektrophorese homogen. Das gereinigte Enzym katalysiert die
Umwandlung von sekundären Alkoholen in die entsprechenden
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?, ^S""T1V?Γ gehemmt.
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Methylketone in Gegenwart von NAD+ als Elektronenakzeptor.
Primäre Alkohole wurden durch das gereinigte Enzym nicht oxydiert. Der optimale pH-Wert für die Umwandlung von
see.-Alkoholen durch das gereinigte, aus Hefe stammende Enzym ist 8. Das Molekulargewicht der gereinigten, aus
Hefe stammenden SADH, durch Gelfiltration bestimmt, ist 98.000 + 3.000, und die Größe einer Untereinheit, bestimmt
nach der Natriumdodecylsulfatgelelektrophorese, ist 48.000. Die Aktivität der gereinigten, aus Hefe stammenden SADH
^ wurde durch Sulfhydrylinhibitoren und Metall-bindende Mittel
j,
ϋ f"^'*/ '■' C.-Cc-n-Alkane werden in C,-C^-sec.-Alkohole durch Zellsus-"
""""' ,ρ ^/ "I' pensionen der mit Methan gezüchteten Methylotrophe umge-
f » i'J?" wandelt, und die see.-Alkohole sammeln sich extrazellulär
C n/„ Γ an. Andere Mikroorganismen, z.B. Hefen, Actinomyceten und
l} ,·' " Fungi, mit C^Verbindungen gezüchtet, oxydieren die C3-C6-,^
4 ' n-Alkane zu den entsprechenden see.-Alkoholen.
ΐ'
C3-C6-n-Alkane werden in C3-C6-SeC.-Alkohole durch zell-
| -, freie Teilchenfraktionen umgewandelt, die aus den erfindungsgemäßen
methylotrophen Mikroorganismen stammen. Die Reaktion . erfordert Sauerstoff und reduziertes Nicotinamid-adenin-I
ρ '' dinucleotid (NADH) als Elektronendonor. Die Umwandlung der
"* n-Alkane in die see.-Alkohole wird durch schwefelhaltige
(- Verbindungen und metallbindende Mitte L, wie o^a-Bipyridyl,
J Thiosemicarbazid, Thioharnstoff, 1,10-Phenanthrolin und
h 8-Hydroxychinolin, gehemmt (dies läßt die Beteiligung von
I MeiaLlionen an der Oxydation von C3-Cß-n-Alkanen zu see-
» Alkoholen vermuten). Die Hydroxylierung von C3-Cg-n-
& .;■" Alkanen zu den entsprechenden see,-Alkoholen wird durch die
sf Gegenwart von Propylen gehemmt. Dies läßt vermuten, daß
I / das Propylen und n-Alkane (z.B. Propan) um dasselbe Enzymsystem
(e) konkurrieren. Ascorbat und reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat
(NADPH) könnten auch als Elektronendonoren anstelle von NADH für die Hydroxylierung
9098U/07S0
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von n-Alkanen zu den entsprechenden sec.-Alkoholen verwendet
werden.
Zu einer bevorzugten Gruppe von Methan-verwertenden methylotrophen Mikroorganismen gehören solche Mikroorganismen,
die aus den Gattungen MethylosinuS/ MethylocystiS/ Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus und Methylobacterium
stammen.
Zu einer bevorzugten Gruppe von Methanol-verwertenden methylotrophen Mikroorganismen gehören solche Mikroorganismen,
die aus Gattungen Methanomonas, Pseudomonas, Bacterium, Hyphomicrobium, Achromabacter/ Protaminobacter,
Vibrio, Rhodopseudomonas, Bacillus, Brevibacterium, Candida
und Hansenula stammen.
Das von R. Whittenbury, K. C. Phillips und J« F = Wilkinson
(J. Gen. Microbiology, 6±, 205-218, (1970), nachfolgend
Whittenbury et al.) vorgeschlagene Klassifikationssystem Methan-oxydierender Bakterien ist das am breitesten anerkannte,
derzeit verwendete System. Bei diesem Klassifikationssystem werden auf der Grundlage morphologischer Eigenschaften
Methan-verwertende Bakterien in fünf Gruppen unterteilt. Diese sind: Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas,
Methylobacter und Methylococcus. Bakterien dieser fünf von Whittenbury et al. berichteten Gruppen verwerten Methan, Dimethyläther,
Methanol, Methylformiat und Methylcarbonat zur Wachsturnsenergie, und von allen wurde berichtet, daß sie
strikt aerob und gram-negativ seien. Sie zeichnen sich auch dadurch aus, daß sie nicht-endosporen-bildend sind, d.h., die
Fähigkeit zur Bildung von Zysten und Exosporen mit komplexer Feinstruktur und komplexer Innenstruktur haben.
Die von Whittenbury et al. (deren Offenbarung hiermit einbezogen wird) geschilderten methylotrophen Mikroorganismen
kommen für die praktische Durchführung der Erfindung in Betracht. Insbesondere kann man die in Tabelle 4, Seite 214
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der Veröffentlichung von Whittenbury et al. aufgeführten Methan-verwertenden methylotrophen Mikroorganismen verwenden,
d.h. Mikroorganismen, die wie folgt identifiziert sind: Methylosinus trichosporium, Methylosinus sporium,
Methylocystis parvus, Methylomonas methanica, Methylomonas albus, Methylomonas streptobacterium, Methylomonas
agile, Methylomonas rubrum, Methylomonas rosaceus, Methylobacter
chrooccum, Methylobacter bovis, Methylobacter capsulatus, Methylobacter vinelandii, Methylococcus capsulatus
(einschließlich Methylococcus capsulatus, Stamm Bath, erwähnt von J. Colby and H. Dalton, J. Biochem., 157,
^495-497 (1976)) und Methylococcus capsulatus, Stamm Texas, erwähnt von D. W. Ribbons, J. Bacteriol., 122, 1351-1363
/(1975)) und Methylococcus minimus. Diese methylotrophen Mikroorganismen können in Form ihrer ganzen Zellen, ihrer
Enzymextrakte oder immobilisierter Präparate solcher ganzer Zellen oder Enzymextrakte, z.B. durch Verwendung von DEAE-Cellulose
oder Ionenaustauscherharz oder poröser Aluminiumoxidträger, verwendet werden. In den Fällen, in denen sich
das oxydative Enzymsystem ansammelt oder mit der Zellmembran eng assoziiert, wird manchmal das Enzym in einer
zellgebundenen Form bevorzugt verwendet.
Subkulturen mancher methylotropher Mikroorganismen, von Whittenbury et al. beschrieben, sind bei der amtlichen Hinterlegungsstelle
des United States Department of Agriculture, Agriculture Research Service, Northern Regional
Research Laboratory, Peoria, Illinois, 61604, hinterlegt worden und haben die nachfolgend angegebenen einzelnen NRRL-Stammbezeichnungen
von der Hinterlegungsstelle erhalten. Diese Subkulturen sind nach den Vorschriften des Department
of Agriculture ohne jede Beschränkung hinterlegt worden, so daß vermehrungsfähiges Material dieser Stämme der Öffentlichkeit
zur Verfügung steht, auch, aber nicht nur, für Bürger der Vereinigten Staaten und der Bundesrepublik
Deutschland. Hinterlegte Stämme methylotropher Mikroorganismen
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5 1
0 )
1 J ■
- 19 -
2315106
sind nachfolgend angegeben:
Kultur
Bezeichnung des USDA Agricultural Research Service
Methylosinus trichosporium OB3b Methylosinus sporium
Methylocystis parvus Methylomonas methanica Methylomonas albus
Methylobacter capsulatus
Methylobacter capsulatus
5 OBBP
S1 BG8
NRRL B-11.196 NRRL B-11.197
NRRL B-11.198 NRRL B-11.199 NRRL B-11.200
NRRL B-11.201
Vermehrungsfähiges Material dieser Stämme ist jedermann auff'
Verlangen ohne Beschränkung der Verfügbarkeit zugänglich. Subkulturen der vorgenannten Stämme wurden ursprünglich
von R. Whittenbury, Department of Biological Science, university of Warwick, Warwickshire, Coventry, England, erhalten.
Die morphologischen und taxonomisehen Merkmale und Eigenschaften
der vorerwähnten methylotrophen Stämme sind wie folgt:
Methylosinus trichosporium OB3b NRRL B-11.196
Bildet weiße Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind beweglich, stabellenförmig,
gram-negativ und aerob. Kaufig werden Rosetten
gebildet. Besitzt eine Membranstruktur des Typs II.
Methylosinus sporium 5 NRRL B-11.197
Bildet weiße Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind beweglich, stäbchenförmig,
gram-negativ und aerob. Häufig werden Rosetten gebildet. Organismen bilden Exosporen, die wärmebeständig sind;
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2815106
Sporen keimen von den keine Flagellen tragenden Polen der Organismen weg, die Vibrio-Form annahmen. Andere organische
Verbindungen als Methan und Methanol unterhalten das Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur des Typs
Methylocystis parvus OBBP NRRL B-11.198
Bildet schleimige weiße Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sj-^d
unbeweglich, von der Gestalt einesCoccoH3acillus, gramnegativ
und aerob. Organismen bilden Zysten, die austrocknungsbeständig, aber nicht wärmebeständig sind.
Wächst auf Kosten von Methan oder Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol unterhalten das
Wachstum nicht. Hat eine Membranstruktur des Typs II.
Methylomonas methanica S- KRRL B-11.199
Bildet rosa-farbene Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind beweglich,
stäbchenförmig, gram-negativ und aerob. Bildet schleimige Kapseln. Sie wachsen auf Kosten von Methan and
Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol unterhalten das Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur
des Typs I.
Methylomonas albus BG8 NRRL B-11.200
Bildet weiße Kolonien auf Salsajarplatten in Gegenwart
von Methan oder Methanol. Die Organismen sind beweglich, stäbchenförmig, gram-negativ und aerob. Bildet schleimige
Kapseln. Wächst auf Kosten von Methan und Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol unterhalten
das Wachstum nicht. Hat eine Membranstruktur des Typs I.
Methylobacter capsulatus Y NRRL B-11.201
Bildet weiße bis braune Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind beweglich, stäbchenförmig, gram-negativ und aerob. Bildet schleimi-
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- 21 -
2916106
ge Kapseln. Wächst auf Kosten von Methan und Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol unterhalten
das Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur des Typs I.
Kürzlich teilten Patt, CoIe und Hanson (International J.
Systematic Bacteriology, 2J, (2), 226-229 (1976)) mit,
daß methylotrophe Bakterien solche Bakterien sind, die nichtautotroph unter Verwendung von Kohlenstoffverbindungen mit
einem oder mehreren Kohlenstoffatomen, aber ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen
wachsen können. Patt et al. schlugen vor, daß Methylotrophe als "obligat" angesehen werden sollten,
wenn sie nur Kohlenstoffverbindungen ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen
(z.B. Methan, Methanol, Dimethyläther, Methylamin usw.) als einzige Quellen für Kohlenstoff
und Energie zu verwerten vermögen, während "fakultative" Methylotrophe solche Organismen sind, die Verbindungen ohne
Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen sowie komplexe Verbindungen mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen als einzigen Quellen
für Kohlenstoff und Energie zu \erwerten vermögen. In ihrer Veröffentlichung offenbarten Patt el al. ein Methan-oxydierendes
Bakterium, das sie als Methylobacterium organophilum sp. nov. (ATCC 27.886) identifizierten. Dieses Bakterium
unterscheidet sich vermutlich von allen zuvor beschriebenen Gattungen und Arten Methan-verwertender Bakterien aufgrund
seiner Fähigkeit, eine Vielzahl organischer Substrate mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen als Quellen für Kohlenstoff
und Energie zu verwerten.
Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde gefunden,
daß dieser Mikroorganismus (Methylobacterium organophilum sp. nov. ATCC 27.886) und andere mit Methan oder Methanol
gezüchtete fakultative methylotrophe Mikroorganismen auch
und Co-Cg-sec.-Alkohole zu oxydieren vermögen.
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Mit anderen Worten, sie besitzen oxydative (und Alkoholdehydrogenase-)Enzymaktivität,
wenn sie in Gegenwart von Methan oder Methanol (im Falle der Alkoholdehydrierung)
kultiviert worden sind. Wie oben im Hinblick auf die Methanverwertenden methylotrophen Mikroorganismen von Whittenbury
et al. erörtert, können die fakultativen Methylotrophen in Form ihres löslichen Extrakts verwandet oder immobil
gemacht oder in zellgebundener Form verwendet werden, wenn sie beim erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden.
Andere bekannte Methan-verwertende methylotrophe Stämme
können beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, z.B. Methylomonas sp. AJ-367Q (FERM P-2400), erwähnt in der
US-PS 3 930 947 als vom Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry for
industrial Trade and Industry, Chiba, Japan,frei verfügbar, jind Methylococcus 999, in der US-PS 4 042 458 mit der NCIB-{Zugangsnummer
11083 erwähnt,sowie Methylomonas SM3 mit der NCIB-Zugangsnummer 11084 (beschrieben in der niederlänä.schen
Patentanmeldung 74/16644). Gemische methylotropher und nichtmethylotropher
Mikroorganismen können verwendet werden, wie die in den US-PS'en 3 996 105 und 4 042 458 beschriebenen
Systeme.
Im Stand der Technik sind verschiedene obligate und fakultative Methanol-verwertende methylotrophe Mikroorganismen beschrieben
(d.h. solche Methylotrophen, die mit Methan nicht zu wachsen vermögen). Von diesen früher beschriebenen Mikroorganismen
stammende Mikrobenzellen und deren Enzympräprate,
worin die Mikroorganismen mit Methanol gezüchtet worden sind, vermögen C2-C,--sec,-Alkohole in die entsprechenden Methylketone
zu überführen. Spezielle Methanol-verwertende methylotrophe Mikroorganismen, die früher beschrieben worden sind
und für die praktische Durchführung der Erfindung brauchbar
sind, sind nachfolgend beschrieben.
909844/075Ö
An eine einzige Lebensbedingung gebundene (obligate) Methanolverwertende
methylotrophe Mikroorganismen:
Methanomonas methylovora, ATCC 21.852 (K. Kouno et al.,
J. Gen. and Appl. Microbiol., Jj^, 11 (1973)). Die Organismen
sind gram-negativ, beweglich, nicht-sporenbildend. Die Organismen wachsen nur mit Methanol und Methylamin.
Methan unterhalt das Wachstum nicht.
sPseudomonas sp., ATCC 21.439. Die Organismen sind weiß,
gram-negativ und frei beweglich. Sie wachsen mit Methanol und Methylamin, nicht aber mit Methan.
Pseudomonas W1(J. S. Dahl et al., J. Bacteriol., 109/
916 (1972)). Die Organismen sind gram-negativ, beweglich, nicht-sporenbildend. Die Organismen wachsen nur mit Methanol
und Methylamin. Methan unterstützt das Wachstum nicht.
Bacterium C3A1 (J. Colby und L. J. Zatman, J. Biochem.,
132, 101 (1973)). Die Organismen sind gram-negativ. Sie
wachsen nur mit Methanol und Methylamin. Methan unterhält das Wachstum nicht.
Bacterium 4B6 (J. Colby und L. J. Zatman, J. Biochem., 132,
101 (1973)). Die Organismen sind gram-negativ und beweglich. Sie wachsen nur mit Methylamin. Methan, Methanol und
andere organische Verbindungen unterstützen das Wachstum nicht.
Hyphomicrobium sp. (N. Takada et al., Proc. Japan Soc.
for Ferment. Tech., S. 72 (1973)). Die Organismen sind farBrlose,
gestielte Bakterien, die wachsen, indem sie von den Enden der Hyphae wegknospen. Sie wachsen mit Methanol und
Methylamin. Methan unterhalt das Wachstum nicht.
8 0 9 8 L, L I 0 7 S ö
Achromobacter sp. \S. Kubasawa et al., Proc. Japan Soc.
for Agricultural Chem., S. 344 (1970)). Die Organismen sind gram-negativ, nicht-sporenbildend und beweglich.
Sie wachsen nur mit Methanol. Methan unterhalt das Wachstum
nicht.
Fakultativ Methanol-verwertende methylotrophe Mikroorganismen!
Pseudomonas sp. ATCC 21.438. Die Organismen sind rosa, gramnegativ und beweglich. Sie wachsen mit Methanol, Methylamin
und anderen organischen Verbindungen, nicht aber mit Methan.
Pseudomonas AM1 (Peel und Ouayle, J. Biochem., 8_[, 465
(1961)). Die Organismen sind gram-negativ/ rosa, beweglich und nicht-sporenbildend. Sie wachsen mit Methanol, Methylamin,
Methylformiat und anderen organischen Verbindungen, nicht aber mit Methan.
Hyphomicrobium sp. (Hirsh und Conti, Arch. Mikrobiol.,
6^, 289 (1968)). Die Organismen sind farblose, gestielte
Bakterien, die wachsen, indem sie von den Enden der Hyphae her knospen. Sie wachsen mit Methanol, Methylamin, Methylformiat
und anderen organischen Verbindungen, nicht aber mit Methan.
Protaminobacter ruber (Stocks und McCleskey, J. Bacteriol., 88, 1065 (1964)). Die Organismen sind rot, gram-negativ und
beweglich. Sie wachsen mit Methanol, Methylamin, Methylformiat und organischen Verbindungen, nicht aber mit Methan.
!Vibrio extorquens (Bassalik, Jb. Wiss Bot., 5_3, 255 (1913)).
Die Organismen sind rot, beweglich, gram-negativ. Sie wachsen mit Methanol, Methylformiat und anderen organischen
Verbindungen, nicht aber mit Methan.
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- 25 -
Rhodopseudomonas acidophila (H. Sahm et al., J. Gen. Microbiol.,
ji4, 313 (1976)). Die Organismen sind gram-negativ. Sie wachsen anaerob in Gegenwart von Licht mit Methanol
und anderen organischen Verbindungen, nicht aber mit Methan.
Pseudomonas MS ATCC 25.262 (H. F. Kung und C. Wagner, Biochem. J., 116, 357 (1970)). Die Organismen sind gramnegativ, beweglich und nicht sporenbildend. Sie wachsen
mit Methanol, Methylamin und anderen organischen Verbindungen, nicht aber mit Methan.
Achromobacter rufescens (T. Akiba et al., J. Fermentation
Technology, ^8_, 323 (1970)). Die Organismen sind gramnegativ, beweglich und nicht-sporenbildend. Sie wachsen mit
Methanol und anderen organischen Verbindungen, nicht aber mit Methan.
Bacillus soraceus (T. Akiba et al., J. Fermentation Technology, 48, 323 (1970)). Die Organismen sind gram-positiv und unbeweglich.
Sie wachsen mit Methanol und anderen organischen Verbindungen, nicht aber mit Methan.
Brevibacterium sp. (veröffentlichte japanische Patentanmeldung 48-77083, Fukimbara et al. (1973)). Die Organismen
sind gram-negativ und nicht-sporenbildend. Sie wachsen mit Methanol und anderen organischen Verbindungen, nicht
aber mit Methan.
Pseudomonas M^7 (C. Anthony und L-. J. Zatman, Biochem. J.,
92, 609 (1964)). Die Organismen s:ind gram-negativ, beweglich
und nicht-sporenbildend. Sie wachsen mit Methanol, Methylamin, Methylformiat und anderen organischen Verbindungen,
nicht aber mit Methan.
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- 26 -
Pseudomonas C (Y. Chalfan und R. I. Mateles, Appl. Microbiol.,
23y 135 (1972)). Die Organismen sind gram-negativ,
beweglich und nicht-sporenbildend. Sie wachsen mit Methanol, Methylformiat und anderen organischen Verbindungen, nicht
aber mit Methan.
iIn früheren Arbeiten wurden auch verschiedene fakultativ
■jMethanol-verwertende methylotrophe Hefen beschrieben (d.h.
Hefen sind nicht in der Lage, mit Methan zu wachsen. Aus diesen früher beschriebenen Hefen stammende Mikrobenzellen
und ihre Enzympräparate (insbesondere die zellfreien Extrakte, die SADH-Enzymaktivität und NAD enthalten), worin die Hefe-Mikroorganismen
mit Methanol oder einer ähnlichen C- -Verbindung (d.h., einer Methylreste liefernden Verbindung) gezüchtet
worden sind, vermögen unter aeroben Bedingungen C3-Cß-sec-Alkohole
in die entsprechenden Methylketone zu überführen.
Spezielle C--Verbindungen verwertende methylotrophe Hefen, die früher beschrieben wurden und bei der praktischen Durchführung
der Erfindung brauchbar sind, sind folgende: Candida utilis ATCC 26387? Candida utiiis NRRL ¥-660;
Hansenula polymorpha ATCC 26012; Hansenula polymorpha NRRL Y-2214; Hänsenüia polymorpha NRRL Y-2267; Hansenula
anomala NRRL Y-336; Pichiapastoris NRRL Y-55; Pichia pastoris NRRL y-7556.
Außerdem können die folgenden neu isolierten Hefen bei der praktischen Durchführung der Erfindung verwendet werden:
| Stamm-Bezeichnung ER&E-Bezeichnung | sp. | CRL-72 | 909844/07ί | USDA-Agriculture Research Center - Bezeichnung |
| Pichia sp. | sp. | A1 | NRRL y-11.328 | |
| Torülopsis | NRRL y-11.419 | |||
| Kloeckera | NRRL y-11.420 | |||
| 50 | ||||
Diese neuen Hefe-Isolate haben die folgenden taxonomisehen
Merkmale:
Pichia sp. CRL-72 (NRRL Y-11.328). Bildet schleimige, weiße
Kolonien auf Platten. Zellen sind groß und oval; manche haben {Knospen. Reproduzieren sich durch Knospung und wachsen
aerob auf C1-Cg-Prim.-Alkoholen, C1-C4-prim.-Aminen, Methyliformiat,
Succinat und Nähr-Agar. Sie wachsen nicht mit Methan.
Torulopsis sp. A- (NRRL Y-11.419) kann auf Methanol, Methylformiat,
Methylamin, Äthanol, Propylamin und Nähr-Agar wachsen. Wächst nicht mit Methan. Zellen sind groß und oval
und zeigen bei mikroskopischer Prüfung vielseitige Knospung.
Kloeckera sp. A9 (NRRL Y-11.420). Kann mit Methanol, Methylformiat,
Methylamin, Äthanol, Propylamin und Nähr-Agar wachsen. Wächst nicht mit Methan. Zellen sind von großovaler Form und zeigen bipolares Knospen bei mikroskopischer
Prüfung.
Außer den oben beschriebenen neu isolierten Hefen können bei der praktischen Durchführung der Erfindung die in der
USSN 896 476 (vom 14. 4. 1978 , deren Offenbarung hiermit
einbezogen wird) offenbarten und beanspruchten neuen Bakterienstämme verwendet werden.
Typische Bakterienstämme, die in dieser Anmeldung offenbart sind, sind folgende:
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- 2*8 -
III-
Methylotrophe Stamm-Bezeichnung
ERSE-Bezeichnung
Bezeichnung des USDA Agriculture Research Center
Methylosinus trichosporium JMethylomonas streptobacterium JMethylomonas agile
iMethylococcus capsulatus Methylobacterium organophilum
CRL 15 PM1
CRL 17 PM3
CRL 22 PM9
CRL Ml
CRL 26 R6
CRL 17 PM3
CRL 22 PM9
CRL Ml
CRL 26 R6
NRRL B-11.202 NRRL B-11.208
NRRL B-11.209 NRRL B-11.219 NRRL £>- Π "2?
Die vorstehenden neuen Stämme sind beim United States Department
of Agriculture, Agriculture Research Service, Norcnern
Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria, Illinois 61604, hinterlegt worden und haben von NRRL die einzelnen
NRRL-Bezeichnungen erhalten, wie oben angegeben, gemäß Vertrag
zwischen NRRL und dem Anmelder vorliegender Anmeldung (Exxon Research and Engineering Company (ER&E)) . Der Vertrag
mit NRRL gewährleistet ständige Verfügbarkeit vermehrungsfähigen Materials dieser Stämme für die Öffentlichkeit, auch
für Bürger der Bundesrepublik Deutschland bei Ausgabe der US-Patentschrift oder Veröffentlichung einer dieser entsprechenden
deutschen Patentanmeldung, je nachdem- welche zuerst erscheint, sowie daß vermehrungsfähiges Material dieser
Stämme Personen zur Verfügung steht, die vom U^S* Commissioner
of Patents and Trademarks als berechtigt gemäß 35 USC 122 und den zugehörigen Commissioner-Regeln (einschließlich
37 CRF 1.14 unter besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638)
oder vom Patentamt der Bundesrepublik Deutschland benannt werden. Der Anmelder vorliegender Patentanmeldung hat, zugestimmt,
daß, wenn irgendeiner dieser Stämme während der Hinterlegung und der tatsächlichen Laufzeit des Patents absterben
oder zerstört werden sollte, er durch einen lebenden Stamm
des gleichen Organismus ersetzt werden wird.
Es versteht sich, daß Mutanten dieser Bakterien und Hefen
auch für die Produktion von Mikrobenzellen und aus diesen Zellen stammenden Enzyrapräparaten verwendet werden können.
909844/0750
- 29 -
Die Haltung der Kulturen dieser neu entdeckten und isolierten Stämme sollte sorgfältig kontrolliert werden. Die bevorzugten
Maßnahmen zur Haltung der Kulturen werden nachfolgend beschrieben.
Ku1türha1tung
Die Organismen werden vorzugsweise alle zwei Wochen auf mineralischen Salzagarplatten in einer Nebenkultur weitergezüchtet,
die das in Beispiel 1 beschriebene Medium enthalten. Im Falle von Hefezellen wird dem obigen Medium Hefe-Stickstoff
base zugesetzt.
Diese Platten sollten in Glas-Exsikkatoren inkubiert werden,
die Deckel mit einem luftdichten Verschluß und äußeren Ansätzen mit einer Schlauchverbindung aufweisen. Die Exsikkatoren
sind zu evakuieren und mit einem Gasgemisch aus Methan und Luft (1:1 Vol/Vol) zu füllen. Die Inkubation sollte
bei 300C erfolgen. Kulturen überleben in diesen Exsikkatoren
3 Monate bei 40C. Doch ist häufige Überführung von
Kulturen bevorzugt.
Bei kommerziellen Vermehrungsprozessen für Mikroorganismen muß im allgemeinen in Stufen vorgegangen werden. Diese Stufen
können einige wenige oder zahlreich sein, je nach der Art des Verfahrens und den Eigenschaften der Mikroorganismen.
Gewöhnlich beginnt die Vermehrung durch Einimpfen von Zellen einer Schrägkultur in ein vorsterilisiertes Nährmedium,
das sich gewöhnlich in einem Kolben befindet. In dem Kolben wird das Wachstum der Mikroorganismen durch verschiedene Maßnahmen
gefördert, z.B. durch Schütteln zur gründlichen Durchlüftung und Halten bei geeigneter Temperatur. Dieser Schritt
oder diese Stufe wird ein- oder mehrmals in Kolben oder Behältern wiederholt, die das gleiche oder größere Volumina
an Nährmedium enthalten. Diese Stufen können angebrachter-
909844/0750
weise als Kulturentwicklungsstufen bezeichnet werden. Die Mikroorganismen mit oder ohne begleitendes Kulturmedium
aus der letzten Entwicklungsstufe werden in einen Fermentator großen Maßstabs eingeführt oder eingeimpft, um kommerzielle
Mengen der Mikroorganismen oder deren Enzyme zu produzieren.
Die Gründe für das Züchten von Mikroorganismen in Stufen sind vielfältig, hängen aber in erster Linie von den Bedingungen
ab, die für das Wachstum der Mikroorganismen und/oder die Produktion ihrer Enzyme notwendig sind. Dazu gehören die
Stabilität der Mikroorganismen, geeignete Nährmedien, der pH, osmotische Beziehungen, der Grad der Belüftung, die
Temperatur und das Einhalten reiner Kulturbedingungen während der Fermentation. Um beispielsweise maximale Ausbeuten an
Mikrobenzellen zu erhalten, können die Fermentationsbedingungen in der Endstufe etwas gegenüber denen geändert werden
müssen, die zur Erzielung von Wachstum der Mikroorganismen in den Kulturentwicklungsstufen praktiziert werden. Die Erhaltung
der Reinheit des Mediums ist auch ein äußerst wichtiger Gesichtspunkt, insbesondere, wo die Fermentation unter aeroben
Bedingungen erfolgt, wie im Falle der methylotrophen Mikroorganismen. Wird die Fermentation anfangs in einem großen
Fermentator gestartet, ist eine verhältnismäßig lange Zeit erforderlich, um eine erhebliche Ausbeute an Mikroorganismen
und/oder deren oxydativen und Dehydrogenase-Enzymen zu erreichen. Dies steigert natürlich die Möglichkeit der Verunreinigung
des Mediums und einer Mutation der Mikroorganismen.
Die für das Wachstum der methylotrophen Mikroorganismen und das Induzieren des oxydativen Enzymsystems verwendeten Kulturmedien
setzen sich aus anorganischen Phosphatsalzen, Sulfaten und Nitraten sowie aus Sauerstoff und einer Quelle für C-.-Verbindungen
zusammen. Die Fermentation erfolgt im allgemeinen
909844/0750
bei Temperaturen im Bereich von 5 bis etwa 500C, vorzugsweise
bei Temperaturen im Bereich von etwa 25 bis 450C. Der
pH-Wert des Kulturmediums sollte auf einen Wert im Bereich von etwa 4 bis 9 und vorzugsweise etwa 5,5 bis 8,5, insbesondere
bevorzugt 6,0 bis 7,5 eingeregelt werden. Die Fermentation kann bei Atmosphärendrücken erfolgen, wenngleich
höhere Drücke bis zu etwa 5 bar (5 at) und darüber angewandt werden können.
Typischerweise v/erden für das Wachstum der methylotrophen
Mikroorganismen und zum Induzieren der Oxygenase- und Dehydrogenase-Enzyme die Mikroorganismen in das Medium eingeimpft,
das das Substrat für Enzym-induzierendes Wachstum und Energie (z.B. Methan, Methanol c Methylamin usw.) und
Sauerstoff enthält» Ist Methan das induzierende Wachstumssubstrat, kann es in Form von Naturgas zugeführt werden. Für
kontinuierliche Strömungskultur können die Mikroorganismen in jedem geeigneten, angepaßten Fermentationsbehalter wachsen
gelassen werden, z.B. in einem gerührten und mit Prallflächen ausgestatteten Fermentator oder einem gespülten Turmfermentator,
der entweder mit Innenkühlung oder einer äußeren Rückführkühlschleife ausgestattet ist. Frisches Medium kann
kontinuierlich in die Kultur mit Geschwindigkeiten entsprechend 0,02 bis 1 Kulturvolumen pro Stunde gepumpt werden, und die
Kultur kann in solchem Umfang entfernt werden, daß das Kulturvolumen konstant bleibt. Das Auslöser-Wachstumssubstrat-Sauerstoff-Gemisch
und möglicherweise Kohlendioxid oder andere Gase wird bzw. werden mit dem Medium vorzugsweise durch
kontinuierliches Durchblasen durch einen Sprinkler am Boden des Behälters in Berührung gebracht. Die Sauerstoffquelle
für die Kultur kann Luft, Sauerstoff oder mit Sauerstoff angereicherte Luft sein. Verbrauchtes Gas kann oben am Behälter
entfernt werden. Das verbrauchte Gas kann entweder durch eine Außenschleife oder intern mit Hilfe eines Gaseinführgebläses
rückgeführt werden. Die Gasströme und die Rückführung sollten so gestaltet sein, daß sich maximales Wachstum des Mikroorganismus
und maximale Verwertung des induzierenden Wachstums-
909844/0750
Substrats ergibt. Igt Methan oder Methanol dieses Substrat,
liegt die Menge an Methan oder Methanol im Bereich von 0,2 bis etwa 2 % auf Volumenbasis. Im Falle anderer induzierender
Wachstumssubstrate, wie Methylamin, liegt die Menge bei etwa 0,4 % auf Volumenbasis.
Die Mikrobenzellen können aus dem Wachstumsmedium nach irgendeiner der üblicherweise verwendeten Standardtechniken
geerntet werden, z.B. durch Flockung, Sedimentation und/oder f Fällung, mit nachfolgendem Zentrifugieren und/oder Filtrie-
% ί'ΐ^Χ *m ren. Die Biomasse kann auch getrocknet werden, z.B. durch
'f. \ Wif, ^- 1 ι1 Gefrier- oder Sprühtrocknen, und kann in dieser Form zur
tU Vi^ it/ ι weiteren Verwendung bei dem oxydativen und/oder Älkoholde-'&
" % " f t ν' hydrogenase-ümwandlungsprozeß verwendet werden. Wird ein
J "J ·" oxydatives Enzymsystem erhalten (d.h., Methan-induzierte
ε1 · ls Zellen) , hängt das Enzym im allgemeinen eng an den ZeIl-
','fj jl membranen, und es kann wünschenswert sein, die Mikrobenk'zellen
als Enzymquelle zu verwenden. Im Falle des Alkoholr, · dehydrogenase-Enzymsystems kann man bequemerweise das Enzym
in Form des löslichen Extrakts verwenden (das gegebenenfalls
' an einem inerten Träger unbeweglich gemacht sein kann).
4 ' Anders ausgedrückt, kann man im Falle des Erhalts des
' ( Oxygenase-Enzymsystems, das aus den Methan-induzierten ZeI-
\ί : len (nicht Methanol, Methylamin usw.) zur Verwendungfür die
' P , aerobe Umwandlung niedriger Alkane in see.-Alkohole und
- ' , Methylketone erhältlich ist, die intakten Zellen selbst
" oder die zellfreie Teilchenfraktion der Zellen verwenden.
Die letztere zellfreie Teilchenfraktion ist das Material,
j) das ausfällt, wenn die überstehende Flüssigkeit nach dem
1 ' Zentrifugieren zerbrochener Zellen bei 10.000 g für 30 min
I '" ^ t .1h lang bei 10.000 g oder darüber zentrifugiert wird.
. 1 , Soli andererseits die sec.-Alkohol-Dehydrogenase (SADH)-
i «ki ' Enzymfraktion erhalten v/erden, bricht man zuerst die Zellen
Γΐ :~ i! auf, z.B. durch Schallbehandlung usw., entfernt dann die
Zellbruchstücke, z.B. zentrifugiert etwa 20 min mit 10.000 g,
9098U/075G
■ η t — —
und das gewonnene rohe SADH-Enzym kann danach weiter durch milde Wärmebehandlung, Säulenchromatographie usw. gereinigt
werden, wie in den folgenden Beispielen beschrieben. Das SADH-Enzym tritt in der überstehenden Fraktion der zentrifugierten,
zerbrochenen Zellen auf, während das Oxygenaseenzym (d.h., die durch Methan induzierten Zellen) in der
Teilchenfraktion, wie oben beschrieben, auftritt.
Zur praktischen Durchführung der Erfindung wird das oxydative und/oder Alkoholdehydrogenase-Enzymsystem beispielsweise
wie oben beschrieben erhalten, wobei die Mikrobenzellen aus den methylotrophen Mikroorganismen stammen, die aerob
in einem Nährmedium mit dem induzierenden Wachstumssubstrat oder den daraus stammenden Enzympräparaten gezüchtet worden
sind. Die Enzymquelle ist nicht kritisch, vorzugsweise wird aber ein solches Präparat aus einem der oben beschriebenen
induzierten obligaten oder an eine einzige Lebensbedingung gebundenen oder fakultativen methylotrophen Mikroorganismen
erhalten. Das Nährmedium, für das die Mikroorganismen induziert und gezüchtet werden, kann das von Whittenbury et al.
oder noch bevorzugter das von Foster und Davis, J. Bacteriol«,.,
91, 1924-1931 (1966) beschriebene Kulturmedium sein. Sind die Mikroorganismen einmal eingeführt und gezüchtet, werden
die Mikrobenzellen vorzugsweise geerntet, gewaschen und die erhaltenen ruhenden Mikrobenzellen oder das anfallende
Enzympräparat können dann als solches zur Umwandlung von C_-Cg-Alkanen in die entsprechenden see.-Alkohole oder Methylketone
oder zur Umwandlung von C3-C6-SeC.-Alkoholen in die
entsprechenden Methylketone unter aeroben Bedingungen (in Gegenwart von Sauerstoff) in einer gepufferten Lösung verwendet
werden. Das Gemisch aus Substratmaterial und induzierten, ruhenden Mikrobenzellen oder Enzympräparat in der
gepufferten Lösung wird inkubiert, bis der gewünschte Umwandlungsgrad
erreicht ist. Danach wird das Ketonprodukt auf herkömmliche Weise, z.B. dürcli Destillation usw., gewonnen.
909844/0750
Zur Ermöglichung des notwendigen wirksamen Kontakts von Sauerstoff
und Enzymsystem (gleich, ob es ein Enzympräparat als
solches oder aus den induzierten methylotrophen Mikroorganismen stammende Mikrobenzellen sind) wird zur Erzielung
bester Ergebnisse vorzugsweise ein starker, fein verteilter Luftstrom in eine kräftig gerührte Dispersion des
Substrats (C_-Cg-Alkan oder C^-Cg-sec.-Alkohol) im Oxydationsmedium verwendet, das im allgemeinen Wasser und einen Puffer
enthält und in dem das Enzympräparat oder das induzierte: ikikrobenzellsystem suspendiert ist. Das Enzympräparat oder
das induzierte Mikrobenzellsystem kann dann vom flüssigen Medium abgetrennt werden, vorzugsweise durch Filtration oder
Zentrifugieren. Das erhaltene Keton kann dann im allgemeinen erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ansatzweise, halbkontinuierlich,
kontinuierlich, im Gleichstrom oder im Gegenstrom durchgeführt werden. Gegebenenfalls wird die das Enzympräparat oder
methylotrophe Mikroorganismen und Pufferlösung enthaltende Suspension nach unten unter kräftigem Durchmischen im Gegenstrom
zu einem in einem Rohrreaktor aufsteigenden Luftstrom geführt. Die obere Schicht wird aus der abwärts fließenden
Suspension entfernt, während Kuiturbeständteile und solche
der verbliebenen Pufferlösung zumindest teilweise mit weiterem oxydativem Substrat und unter Zusatz von frischem Enzympräparat
oder induziertem Mikrobenzellsystem, je nach Bedarf, rückgeführt werden.
Das Wachstum der methylotrophen Mikroorganismen und das Oxydationsverfahren können bequemerweise durch gleichzeitige,
aber getrennte Durchführung und unter Anwendung einer viel höheren Durchlüftung im Oxydationsprozeß gekoppelt werden
(beispielsweise ein Luftüberschuß von wenigstens dem Zweifachen dessen, der für das Wachstum erforderlich ist, vorzugs-
909844/0750
weise wenigstens die fünffache Durchlüftung). Der Wachstumsprozeß, der oxydative oder dehydrierende Prozeß können im
gleichen Reaktor nacheinander oder gleichzeitig durch alternierende Anwendung normaler und starker Durchlüftung durchgeführt
werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht,
die jedoch in keiner Hinsicht beschränkend sein sollen. Alle Teile und Prozentsätze, sofern nicht ausdrücklich
anders angegeben, sind auf das Gewicht bezogen.
Ein Nährmedium, wie von Foster und Davis, J. Bacteriol., 91_,
1924-1931 (1966) beschrieben, mit folgender Zusammensetzung pro Liter wurde hergestellt:
Na2HPO4 NaH2PO4
NaNO3
MgSO4·7Η2Ο
KCl CaCl2 FeSO4.7H2O
CuSO4·5H2O H3BO4
MnSO4.5H2O
ZnSO4 MoO3
Der pH-Wert des Nährmediums wurde auf 7,0 durch Zusatz von
Säure oder Base eingestellt, und 50 ml-Proben des Nährmediums wurden in eine Reihe von 300 ml-Schüttelkolben gebracht.
Die Schüttelkolben wurden mit einer Inokulationsschleife von Zellen von einer Agarplatte mit homogenen Kolonien der
909844/0750
| 0,21 | g |
| 0,09 | g |
| 2,0 | g |
| 0,2 | g |
| 0,04 | g |
| 0,015 | g |
| 1 | mg |
| 0,01 | mg |
| 0,02 | mg |
| 0,02 | mg |
| 0,14 | mg |
| 0,02 | mg |
Mikroorganismen auf der Platte beimpft (die Reinheit der Isolate wurde durch mikroskopische Prüfung bestätigt). Die
Isolate waren auf Methanol (0,4 % Vol./Vol.) Agarplatten oder auf Agarplatten unter einer Atmosphäre aus Methan
und Luft mit einem 1:1 Vol./Vol.-Gasverhältnis gehalten, die alle zwei Wochen übertragen worden waren. Zum Wachstum
mit Methanol wurde das Medium mit 0,4 % Methanol ergänzt. Zum Wachstum mit Methan wurde die Gasphase der beimpiiüi.
Kolben durch ein Gasgemisch aus Methan und Luft mit einem Verhältnis von 1:1 auf Volumenbasis ersetzt. Die beimpften
Kolben wurden luftdicht verschlossen und auf einem Rotai_ioii~-
schüttler mit einem Orbitalradius von 2,5 cm bei 250 UpM und bei 300C 2 Tage inkubiert, bis im Medium Trübung entstanden
war. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 10.000 g und 40C für 30 min geerntet. Der Zellkuchen wurde zweimal
mit einem 0,05 m Phosphatpuffer bei einem pH von 7,0 (mit 0,02 m MgCl2) gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden dann
in einem 0,05 m Phosphatpuffer bei pH 7,0 suspendiert.
Eine 0,5 rnl-Probe einer jeden gewaschenen Zellsuspension
(2 mg Zellen) wurde in 10 ml--Röhrchen bei 40C gebracht,
die mit einer Gummikappe verschlossen wurden. Die Gasphase der Röhrchen wurde abgesaugt und dann durch ein Gasgemisch
des reagierenden Substrats (d.h. Alkan oder see.-Alkohol)
und Sauerstoff im Volumenverhältnis 1:1 ersetzt (im Falle eines flüssigen Substrats, d.h. eines see.-Alkohols, wurden
10 μΐ des Substrats in die 10 ml-Röhrchen gebracht). Die
Röhrchen wurden dann bei 300C auf einem Rotationsschüttler
bei 300 UpM inkubiert. Produktproben ( 1 bis 3 μΐ) wurden
mit einer Mikrospritze periodisch entnommen und die Produkte gaschromatographxsch (Ionisatiolisflammendetektorsäule)
analysiert.
Tabelle I zeigt die Umwandlungsgeschwindigkeiten für die Umwandlung
von n-Propan, η-Butan, n-Pentan und η-Hexan in
909844/0750
Aceton, 2-Butanon, 2-Pentanon bzw. 2-Hexanon durch induzierte, ruhende (gewaschene) Mikrobenzellsuspensionen
verschiedener Mikroorganismen, von denen Stämme mit Methan nach der oben beschriebenen Versuchsarbeitsweise
gezüchtet worden waren. Aus diesen Daten ist zu ersehen, daß die ruhenden (gewaschenen) Zellen der mit Methan gezüchteten
Mikroorganismen C3-C6-n-Alkane in die entsprechenden
Methy!ketone umzuwandeln vermögen.
909844/0750
Umwandlungsgeschwindigkeiten für die Oxydation von Kohlenwasserstoffen
in Ketone durch Zellsuspensionen von mit Methan gezüchteten Methylotrophen
methylotrdpher Mikroorganismus, UmwSndlungsgeschwindigkeiten (a)
.Stammbezeichnung (b) μΜοΙ/h/mg Protein
n-Propan η-Butan n-Pentan n-Hexan
—» Aceton —*2-Butanon —^2-Pentanon —* 2-Hexanon
Methylosinus trichosporium OB3b 1,5 1,2 0,72 0,05
(NRRL B-11.196)
Methylosinus sporiüm 5 cd (NRRL B-11.197)
to Methylöcystis parvüs OBBP 1,8 1,0 0,51 0,04
oo (NRRL B-11.198)
^ Methyiimbnäs methan ic ei SI 2,5 0,30 0,28 0,02
-^, (NRRL B-11 .199)
° Methylomonas albus BG8 m (NRRL B-11.200)
° Methyiobacter capsulatus Y 1,6 1,1 0,63 0,07
(NRRL B-11.201)
Methyiococcus capsulatus Texas 1,2 0,52 0,42 0,09
(ATCC 19069)
Methylobacterium organophilum XX 2,8 2,0 0,58 0,09
(a) Die Produkte wurden gäschromatögräphisch durch Vergleiche der Retentionszeit mit ιν>
authentischen Standardproben identifiziert. Die Analyse zeigte auch, daß keine CD
weitere Oxydation der Produkte erfolgte. —*
(b) Das Trockengewicht der Zellen betrug etwa 0,2 g/100 ml Kulturbrühe. tn
CZ) CO
| 1,5 | 1,2 |
| 2,1 | 0,58 |
| 1,8 | 1,0 |
| 2,5 | 0,30 |
| 2,7 | 0,60 |
| 1,6 | 1,1 |
| 1,2 | 0,52 |
| 2,8 | 2,0 |
■JIK···· ·· · i 11
291 öl
Mikrobiologische Umwandlung von see.-Alkoholen in Ketone
Die Arbeitsweise des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei eine Vielzahl von Methan-verwertenden methylotrophen
Mikroorganismen jeweils aerob in einem Nährmedium mit
Methan als das Alkoholdehydrogenase-Enzym induzierend und - als Hauptkohlenstoff- und Energiequelle für das Wachstum Fgezüchtet wurden. Die» Zeilen »wurden geerntet und gewaschen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die ruhenden Mikrobenzellen der induzierten, mit Methan gezüchteten, Methan-verwertenden methylotrophen Mikroorganismen wurden dann mit C^-Cg-sec.-Alkoholen in einer gepufferten Lösung nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 in Berührung gebracht. Die Er-'gebnisse dieser Versuchsserie sind in Tabelle II wiedergegeben .
Mikroorganismen jeweils aerob in einem Nährmedium mit
Methan als das Alkoholdehydrogenase-Enzym induzierend und - als Hauptkohlenstoff- und Energiequelle für das Wachstum Fgezüchtet wurden. Die» Zeilen »wurden geerntet und gewaschen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die ruhenden Mikrobenzellen der induzierten, mit Methan gezüchteten, Methan-verwertenden methylotrophen Mikroorganismen wurden dann mit C^-Cg-sec.-Alkoholen in einer gepufferten Lösung nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 in Berührung gebracht. Die Er-'gebnisse dieser Versuchsserie sind in Tabelle II wiedergegeben .
909844/0750
Tabelle IiT
" ^
J
ümwandlungsgeschwindigkeiten für die Oxydation von see.-Alkoholen in Ketone durch
Suspensionen ruhender Zellen von mit Methan gezüchteten Methylotrophen
methylotropher Mikroorganismus, Stamm-Bezeichnung (b)
Ümwandlungsgeschwindigkeiten (a),
μΜοΙ/h/mg Protein
2-Propanol 2-Butanol 2-Pentanol 2-Hexanol
—>Aceton —>2-Bütarion —>2-Pentanon —-^2-Hexanon
Methylosinus trichosporium OB3b 0,25 3,7 2,7 0,07
(NRRL B-11.196)
Methylosinus spörium 5 0,30 3,0v - -
(NRRL B-11.197)
Methylocystis parvus OBBP 0,32 1,1 0,80
(NRRL B-11.198)
Methylomonas methanica S1 0,40 0,39 '0,25
(NRRL B-11.199)
Methylomonas albus BG8 1,3 3,5
(NRRL B-11.200)
Methylobaoter capsulatus Y 0,15 0,84 0,5
(NRRI1 B-11 .201)
Methylococcus capsulatus, Texas 0,80 0,60 2,5
(ATCC 19069)
Methylobacterium organophilum XX 0,5 2,5 0,82
(ATCC 24886)
(a) Die Produkte wurden gaschromatogräphisch durch Vergleich der Retentionszeiten mit
authentischen Standardproben identifiziert. Die Analyse zeigte auch, daß keine
weitere Oxydation der Produkte eintrat.
(b) Das Trockengewicht der Zellen betrug etwa 0,2 g/100 ml Kulturbrühe.
| 0,065 | ■ · · \ " |
| 0,01 | • # * * t» · ν m W m |
| 0,1 | • |
| 1,0 | ro- : : |
| 0,12 |
"CJTi
CD CD |
Mikrobiologische Umwandlung von see.-Alkoholen in Ketone
In diesem Beispiel wurde die Arbeitsweise des Beispiels 1 wiederholt, mit der Ausnahme, daß eine Vielzahl Methanverwertender
methylotropher Mikroorganismen jeweils aerob in einem methanolhaltigen Nährmedium anstelle eines
methanhaltigen Mediums gezüchtet wurden. Die Nährstoffe in dem Medium waren die gleichen, wie in Beispiel 1 angegeben,
mit der Ausnahme, daß 0,4 VoI.-/Vol.~% Methanol als Alkoholdehydrogenase-Induktor
und Hauptquelle für Kohlenstoff und Wachstumsenergie verwendet wurden. Nach dem Wachstum
wurden die Zellen geerntet und gewaschen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die ruhenden Zellen der induzierten, mit Methanol
gezüchteten methylotrophen Mikroorganismen wurden dann mit see«-Alkoholen in einer gepufferten Lösung nach der in
Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise in Berührung gebracht. Die Ergebnisse dieser Versuchsserie sind in Tabelle III
wiedergegeben.
909 8 4 4/0750
Umwandlungsgeschwindigkeiten für die Umwandlung von see.-Alkoholen in Ketone durch .
Zellsuspensionen von mit Methanol gezüchteten Methylotrophen
methylotropher Mikroorganismus,
Stamm-Bezeichnung (b)
Umwandlungsgeschwindigk'eiten (a) ,
μΜοΙ/h/mq· Protein
μΜοΙ/h/mq· Protein
2-Propanol 2-Butanol 2-Pentanol
► Aceton —>2-Butanon —» 2-Pentanon
2,9
| 0,30 | 4,1 |
| 0,45 | 3,5 |
| 0,25 | 1,0 |
| 0,35 | 0,40 |
| 1,5 | 3,0 |
| 0,52 | 1,5 |
| 0,75 | 0,70 |
| 0,70 | 2,8 |
2-Hexanol
—/2-Hexanon
—/2-Hexanon
0,9
Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL B-11.196)
Methylosinus sporium 5 (NRRL B-11.197)
Methylocystis parvus OBBP 0,25 1,0 0,82 0,05
(NRRL B-11 .198]l
Methylomonas methanica S1 0,35 0,40 0,45 0,04
(NRRL B-11.199)
Methylomonas albus BGB (NRRL B-11.200)
Methylobacter capsulatus Y 0,52 1,5 0,60 0,12
(NRRL B-11.201)
Methylococcus capsulatus, Texas 0,75 0,70 3,5 1,3
(ATCC 19069)
Methylobacterium organophilum XX 0,70 2,8 0,9 1,1
(ATCC 27886)
(a) Die Produkte wurden gaschromätographisch durch Vergleiche der Retentionszeit mit
authentischen Standardproben identifiziert. Die Analyse zeigte auch, daß keine
weitere Oxydation der Produkte erfolgte.
(b) Das Trockengewicht der Zellen betrug etwa 0,2 g/100 ml Kulturbrühe.
cn
CD (J)
» * ·» »ill·· I J)I--
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• «.«««if 4| 4 ρ J 1
Mikrobiologische Umwandlung von see.-Alkoholen in Ketone
Bei diesem Beispiel wurden Mikrobenzellen Methanol-verwertender methylotropher Mikroorganismen/ mit Methanol gezüchtet,
zur Umwandlung von see.-Alkoholen in Methy!ketone verwendet.
Die Arbeitsweise des Beispiels 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß eine Vielzahl von Methanol-verwertenden methylotrophen
Mikroorganismen jeweils aerob in einem methanolhaltigen Nährmedium anstelle eines methanhaltigen Mediums gezüchtet
wurden. Die Nährstoffe in dem Medium waren die gleijchen,
wie in Beispiel 1 angegeben, mit der Ausnahme, daß 0,4 Vol.-/Vol.-% Methanol als Alkoholdehydrogenase-Induktor
und als Hauptquelle für Kohlenstoff und Energie für das Wachstum verwendet wurden. Die Zellen wurden gewonnen und gewaschen,
wie in Beispiel 1 beschrieben. Die ruhenden Mikrobenzellen der induzierten, mit Methanol gezüchteten, Methanol-verwertenden
methylotrophen Mikroorganismen wurden dann in einer gepufferten Lösung nach der Arbeitsweise des Beispiels 1
mit C.J-C -see.-Alkoholen in Berührung gebracht. Die Reaktionsprodukte
wurden gaschromatographisch analysiert, und es zeigte sich, daß sie 2-Ketone enthielten, wie in Tabelle IV
angegeben. Die Ergebnisse dieser Versuchsserie sind in Tabelle IV wiedergegeben.
909844/075
Umwandlungsgeschwindigkeiten für die Umwandlung von see.-Alkoholen in Ketone
durch Zellsuspension von mit Methanol gezüchteten, obligat und fakultativ
Methanol-verwertenden Methylotrophen
methylotropher Mikroorganismus, Umwandlüngsgeschwiridigk'eiten (a) ,
Stamm-Bezeichnung (b) μΜοΙ/h/mg Protein
| ATCC | 25262 | 2-Propanol —»Aceton |
2-Butanol —>2-Butanon |
2-Pentanol —* 2-Pentanon |
2-Hexanol -^2-Hexanon |
■: ·..· | |
| Pseudomonas MS (Fakultativ) |
ATCC | 21438 | 0,80 | 3,5 | 2,1 | 0,80 | |
| Pseudomonas sp, (Fakultativ) |
ATCC | 21439 | 0,45 | 3,2 | 2,7 | 0,7 | |
| Pseudomonas sp. (Obligat) |
ithylo | vora | 7,4 | 4,7 | 0,05 | 0,03 | |
| Methanomonas me | 0,28 | 2,5 | 2,1 | 1,0 | |||
O CD OO
-J Mel
ν* ATCC 21852 (Obligat)
(a) Die Produkte wurden gaschromatographisch durch Vergleiche der Eleten'tionszeit mit
authentischen Standardproben identifiziert. Die Analyse zeigte auch, daß keine
weitere Oxydation der Produkte erfolgte.
(b) Das Trockengewicht der Zellen betrug etwa 0,2 g/100 ml Kulturbrühe.
• I I I · ·
- 45 -
Mikrobiologische Umwandlung von see.-Alkoholen in Ketone
Bei diesem Beispiel wurden Mikrobenzellen beider Methan- und Methanol-verwertender methylotropher Mikroorganismen
(sowohl des nur an eine einzige Lebensbedingung gebundenen oder obligaten und des fakultativen Typs) zur Umwandlung
von see.-Alkoholen in Methylketone verwendet.
Die Arbeitsweise in Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die methylotrophen Mikroorganismen jeweils
aerob in einem Alkoholdehydrogenase-induzierenden Wachstumsmedium mit Methylamin oder Methylformiat als Alkoholdehydrogenaseenzym-Induktor
und Wachstumssubstrat anstelle von Methan gezüchtet wurden. Die Nährstoffe in dem Medium waren
die gleichen wie in Beispiel 1 angegeben, mit der Ausnahme/ daß 0,4 Vol.-/Vol.-% des Alkoholdehydrogenase-Induktor-Wachstumssubstrats
als Hauptquelle für Kohlenstoff und Energie verwendet wurden. Die Zellen wurden geerntet und
gewaschen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die ruhenden Mikrobenzellen wurden dann mit C^-Cg-sec.-Alkoholen in einer
gepufferten Lösung nach der Umwandlungsarbeitsweise des Beispiels 1 in Berührung gebracht. Tabelle V zeigt die Umwandlungsgeschwindigkeiten
der see.-Alkohole in die Ketone für die mit Methylamin gezüchteten Mikrobenzellsuspensionen
und Tabelle VI 7.eigt die Umwandlungsgeschwindigkeiten für
die see.-Alkohole in Ketone für die mit Methylformiat gezüchteten
Mikrobenzellsuspensionen.
909844/Q75Q
ümwändlungsgeschwindigkeiteh für die Umwandlung von see.-Alkoholen in Ketone
durch Zellsuspensionen von mit Methylamin gezüchteten, an eine einzige Lebensbedingung
gebundenen (obligaten) und fakultativ Methanol-verwertenden Methylotrophen
methylotropher Mikroorganismus, Umwäridlungsgeschwindigkeiten (a) ,
Stamm-Bezeichnung (b) μΜοΙ/h/mg Protein
eo Methäribmöriäs methylbvorä
° ATCC 21852 (obligat)
*^ PseÜdömonas sp. ÄTCC 21438
4^ (fakultativ)
(a) Die Produkte wurden gaschromätögraphisch durch Vergleiche der Retentionszeit mit
authentischen Standardproben identifiziert. Die Analyse zeigte auch, daß keine
weitere Oxydation der Produkte erfolgte.
(b) Das Trockengewicht der Zellen betrug etwa 0,2 g/100 ml Kulturbrühe.
| 2-Propanol —^Aceton |
2-Butanol —^2-Butanon |
2-Pentanol —>2-Pentanon |
2-Hexanol —?2-Hexanon |
| 0,82 | 3,2 | 1,0 | 0,09 |
| 1f0 | 2,1 | 0,82 | 0,07 |
•CD ■cn
Tabelle VI
wi
Uinwandlüngsgeschwindigkeiten für die Umwandlung von see.-Alkoholen in Ketone durch
Zellsuspensionen von mit Methylformiat gezüchteten, obligat und fakultativ Methan-
und Methanol-verwertenden Methylotropheh
methylotropher Mikroorganismus,
Stamm-Bezeichnung (b)
Methylosinus trichosporium 0B3b (obligat Methan-Verwerter)
Methyiöbacteriüm orgänöphilum XX ATCC 27886 (fakultativ Methan-Verwerter)
Methanomonas ltiethylovora ATCC 21852 (obligat Methanol-Verwerter)
Pseudomonas sp. ATCC 21438 (fakultativ Methanol-Verwerter)
Umwandlüngsgeschwindigkeiten (a) , μΜοΙ/h/mg Protein
2-Propänol 2-Bütänol 2-Pen€anol 2-Hexanol
—^Aceton —^2-Butanon —»2-Pentanon —->2-Hexanon
0,95
0,48
0,62
0,52
4,5
3,5
2,1
3,2
1,5
1,0
1,5
2,0
0,72
0,70
0,60
0,80
(a) Die Produkte wurden gaschromatographisch durch Vergleiche der Retentionszeit mit
authentischen Standardproben identifiziert. Die Analyse zeigte auch, daß keine
weitere Oxydation der Produkte erfolgte.
(b) Das Trockengewicht der Zellen betrug etwa 0,2 g/100 ml Kulturbrühe.
Wie oben gezeigt, wurde ein Verfahren gefunden, durch das Methylketone erhalten werden, indem C,-Cg-n-Alkane oder
lineare C3-Cg-SeC.-Alkohole mit ruhenden Mikrobenzellen (oder
daraus stammenden Enzympräparaten), die in Gegenwart einer Oxygenase und/oder eines Alkoholdehydrogenaseenzym-Induktors
als Hauptkohlenstoff- und Energiequelle gezüchtet worden sind,
in Berührung gebracht werden. Die methylotrophen Mikroorganismen können entweder obligat, d.h. an eine einzige Lebensbedingung
gebunden, oder fakultativ sein. In jedem Falle sind, wenn die methylotrophen Mikroorganismen aerob in einem den
Enzyminduktor, Methan,enthaltenden Nährmedium aerob gezüchtet werden, die erhaltenen ruhenden Mikrobenzellen oder ihre
Enzympräparate in der Lage, entweder die C3-Cg-Alkane oder die
C3-Cg-SeC.-Alkohole in die entsprechenden Methylketone umzuwandeln.
Im Falle entweder der obligaten oder der fakultativen methylotrophen Mikroorganismen, die aerob in einem Nährmedium,
das Methanol, Methylamin oder Methylformiat als Alkoholdehydrogenaseenzym- Induktor enthält,· gezüchtet worden sind, vermögen
die erhaltenen ruhenden Mikrobenzellen oder ihre Enzympräparate nur C3-Cg-SeC-Alkohole in die entsprechenden Methylketone
umzuwandeln. Diese induzierten Enzyme können nicht die C3-C,-Alkane
in die entsprechenden Methylketone überführen. In keinem Falle wurde weitere Reaktion des Keton-Produkts beobachtet.
In Ansatzversuchen unter Verwendung der ruhenden, mit Methan, Methanol, Methylamin oder Methylformiat gezüchteten
Mikrobenzellen verlief die Umwandlungsreaktion wenigstens 4 h linear.
iDas oxydative und/oder Alkoholdehydrogenase-Enzymsystem der
,aerob induzierten methylotrophen Mikroorganismen ist induzierbar,
und das Ketonprodukt sammelt sich extrazeilulär an (d.h., nach der Reaktion und dem Zentrifugieren des
Reaktionsgemischs findet sich das Keton-Produkt in der über-
&QSS4A/Q75Q
- 49 -
28151
stehenden Fraktionen und nicht im Zellkuchen).
Es hat sich gezeigt, daß einige der Stämme methylotropher Mikroorganismen Zellen oder Enzympräparate mit höherem
ÜKiwandlungsvermögen für see.-Alkohole in Ketone als andere
hervorbringen. Beispielsweise produzierten Mikrobenzellen aus Methylosinus trichosporium OB3b die größte Menge an
Methy!ketonen aus see.-Alkoholen (z.B. 15 μΜοΙ/2 mg
Protein nach 2 Stunden).
Wie aus den folgenden Beispielen zu entnehmen ist, besitzen die mit Methan gezüchteten Mikrobenzellen und ihre
Enzympräparate (einschließlich zellfreie Extrakte) sowohl Oxygenase- als auch Alkoholdehydrogenase-Enzym-Aktivität.
Vermutlich induziert das Methan selbst die Oxygenase-Enzym-Aktivität und das Methanol aus der Oxydation von Methan
durch den methylotrophen Mikroorganismus während des Wachstums das Alkoholdehydrogenase-Enzym. Das induzierte Oxygenase-Enzym
ist verantwortlich für die Umwandlung des Co-Cg-Alkans
in ein Oxydationszwischenprodukt, den sekundären Alkohol, während das induzierte Alkoholdehydrogenase-Enzym
den sekundären Alkohol zum entsprechenden Methylketon dehydriert .
Wie auch in den folgenden Beispielen gezeigt, können zusatz-*
lieh zu den methylotrophen Bakterien andere Mikroorganismen zur Durchführung der Umwandlung der C,-Cfi-Alkane oder
der Umwandlung der C3-C6-see.-Alkohole in die entsprechenden
Methylketone verwendet werden. Dazu gehören Bakterien,
Fungi und Hefen, die mit kurzkettigen Alkanen wachsen, z.B. Methan, oder mit Alkoholen, wie Methanol usw.
909844/0750
Alkohol-Oxydationssysteme
Wie oben (Tabellen II und III) gezeigt und erörtert, oxydierten (dehydrierten) Zellsuspensionen von mit Methan und
Methanol gezüchteten Mikrobenzellen CU-Cg-sec.-Alkohole
zu ihren entsprechenden Methylketonen. Die Produkt-Methylfketone
sammelten sich extrazellulär an, bestimmt durch Anailyse
der überstehenden Flüssigkeit des zentrifugierten •Reaktionsgemischs. Kontrollversuche mit durch Wärme abgetöteten
Zellen zeigten an, daß die Methylketone enzymatisch erzeugt waren. Bei diesen Tests fand sich sec.-Alkoholdehydrogenase
(SADH)-Aktivität in allen getesteten Cj-Verwertern. Weitere Tests haben gezeigt, daß die SADH-Aktivität
in Zellsuspensionen von mit Methanol oder Methylamin gezüchteten Mikroorganismen zu finden war. Die SADH scheint
jedoch kein konstitutives Enzym zu sein, da die SADH-Enzym-Aktivität nicht in mit Succinat gezüchteten fakultativen
C1-Verwertern gefunden wurde.
Zur Herstellung des zellfreien see.-Alkoholdehydrogenase-(SADK)-Systems
wurden die gewaschenen Zellen mit einem ultraschallwellenoszillator, Modell W201 (Wave Energy
System, Inc., Newtown, Pa.) aufgebrochen und 30 min bei 20.000 g zentrifugiert. Die klare überstehende Flüssigkeit
enthielt die SADH-Aktivität. Die Enzymaktivität wurde mit
einem Fluoreszenz-Spektrophotoneter (Perkin Eimer, Modell MPF
44A) durch Verfolgen der Bildung von reduziertem NAD (Ex 340 πια, Ein 460 nm) gemessen. Die Bildung von reduzier—
tem NAD wurde auch mit einem Absorptionsspektrophotometer
bei 340 nm verfolgt. Das Testsystem (3 ml) enthielt: Kaliümphösphatpuffer, pH 7,0; 150 μΜοΙ; NAD 1 μΜοΙ;
eine gegebene Menge eines Enzympräparats und see.-Alkohol,
90 9SAU/0750
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2915108
10 μΜοΙ. Die Reaktion wurde durch Zusatz des Substrates gestartet.
Eine Einheit Enzymaktivität entspricht der Reduktion von 1 μΜοΙ NAD pro Minute. Proteinkonzentrationen wurden
nach der Methode von Lowry bestimmt (J. Biol. ehem.,
193, 255-275 (1951)).
Nachfolgend sind Tests zusammengefaßt, die zu den Optimalbedingungen für die Produktion von Methylketonen aus C3~Cg~
sec.-Alkoholen durchgeführt wurden. Es versteht sich, daß dies die gefundenen Optimalbedingungen waren und die Erfindung
nicht an sie gebunden sein soll. Umwandlungen können noch durch Abweichen von dem nachfolgend angegebenen Optimum
erzielt werden, aber mit geringeren Ausbeuten und Umwandlungen .
Zeitverlauf
Die Produktion von 2-Butanon aus 2-Butanol erreicht nach
14h Inkubation bei Ansatzversuchen mit allen getesteten
Mikroorganismen ein Maximum. Die Menge an 2-Butanon fiel nach 30 h Inkubation nicht ab. Die 2-Butanon-Produktionsgeschwindigkeit
war für die ersten 4 h linear. Daher wurde die Produktion von 2-Butanon innerhalb dieses Zeitraums
gemessen, wenn der Einfluß einer Variablen untersucht wurde.
Der Einfluß des pH-Wertes auf die Produktion von 2-Butanon wurde mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer (0,05 m)
für pH-Werte von 8,0 bis 10^0 und mit 0,05 m Kaliumphosphatpuffer
für Werte von 5,0 bis 8,0 untersucht. Ein pH-Wert um 8,0 erwies sich als Optimum für die 2-Butanon-Bildung
bei allen untersuchten Mikroorganismen- Von den neuen Stämmen zeigte Methylobacterium organophilum CRL 26 (NRRL B-11.222)
909844/07
t V
* * ί I J J > I
Il > 1 J
IJ fill
hohe Aktivität sowohl bei pH 8 als auch 9. Die Hefezellen schienen durch den pH bei der Bildung von 2-Butanon weniger
beeinträchtigt zu werden.
Temperatur
Das Temperaturoptimum für die Produktion von 2-Butanon
durch Zellsuspensionen war etwa 35°C, ausgenorrson die
Hefekultur, die ein Optimum von etwa 400C hatte.
Substratkonzentration
2-Butanol wurde in verschiedenen Konzentrationen zu Zellsuspensionen
von Hefe und des Stammes Pseudomonas sp. ATCC 21.439 gegeben. Nach 35 min Inkubation wurde die 2-Butanon-Produktion
getestet. Die gebildete Menge des 2-Butanons hing von der anfangs zugesetzten Substratmenge
ab. Eine 2-Butanol-Konzentration von etwa 50 μΜοΙ lieferte
maximale 2-Butanon-Produktion.
Zellkonzentration
Die Zellkonzentration hat auch einen Einfluß auf die Geschwindigkeit
der 2-Butanon-Produktion. Die nach 2 h Inkubation angesammelte Menge an 2-Butanon stieg linear mit
bis auf etwa 12 mg/O,5 ml für Hefe und für Methylococcus
capsulatus CRL M1 (NRRL B-11.219) und etwa 17 mg/0,5 ml
für die Stämme Methylobacterium organophilum CRL 26 (NRRL B-11.222), Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL B-11.196)
und Pseudomonas sp. ATCC 21.439 erhöhter Zellkonzentration an.
Produkthemmung und weitere Oxydation
Die Untersuchung des Zeitablaufs der Produktion von 2-Butanon zeigte, daß die Geschwindigkeit nach 4 h Inkubation
909844/0750
abnahm, was unter anderen Möglichkeiten entweder eine Produkthemmung
oder weitere Oxydation von 2-Butanon vermuten läßt. Zur Untersuchung dieser Möglichkeiten wurden 8 μΜοΙ
2-Butanon lebensfähigen oder durch Wärme abgetöteten Zellsuspensionen zugesetzt und unter den oben für die Erzeugung
von 2-Butanon beschriebenen Bedingungen inkubiert. In allen durch Wärme abgetöteten Zellsuspensionen wurde
kein Absinken in der 2-Butanon-Konzentration beobachtet, aber 2-Butanon verschwand langsam in Gegenwart lebensfähiger Zellen
aller untersuchter Stämme. Wurde 2-Butanol (5 μΙ/0,5 ml
Reaktionsgemisch) zu lebensfähigen Zellsuspensionen zusammen mit dem von außen zugeführten 2-Butanon zugesetzt, wurde eine
Nettozunahme der 2-Butanon-Produktion festgestellt. Die Reaktionsgeschwindigkeiten waren identisch mit denen, bei denen
der sekundäre Alkohol anfangs in das Methylketon überführt wurde, und wurden durch die Gegenwart des von außen zugeführten
2-Butanons nicht beeinflußt. Diese Daten zeigen, daß es bei der Produktion von 2-3utanon keine Produkthemmung gibt.
Eine weitere Oxydation von 2-Butanon in geringer Menge durch lebensfähige Zellsuspension wurde beobachtet. Das Absinken
der 2-Butanon-Produktionsgeschwindigkeit nach 4 h Inkubation kann auf der Erschöpfung weiterer Erfordernisse, z.B. eines
oder mehrerer Cofaktoren, beruhen.
Hemmuntersuchungen
Die Produktion von 2-Butanon aus 2-Butanol durch Zellsuspensionen der getesteten Stämme wurde durch mit Metallen Chelate
bildende Mittel, wie 1,10-Phenanthrolin undα,α-Bipyridyl,
gehemmt. Die Aktivität wurde jedoch nicht durch Natriumcyanid oder Thioharnstoff gehemmt, was für das Enzym die Beteiligung
von Metall vermuten läßt. Die Ergebnisse der Hemmtests sind in Tabelle VII gezeigt.
9098U/075Q
-'54'-" ' "2315106
| Konzentration | Hemmung (%) |
| 1 mMol | 0 |
| 1 mMol | 10 |
| 1 mMol | 70 |
| 1 mMol | 95 |
| 1 mMol | 75 |
| 1 mMol | 0 |
Einfluß von mit Metall Chelate bildenden Mitteln und anderen Inhibitoren auf die Produktion von 2-Butanon durch Zellsuspensionen
von mit Methanol gezüchtetem Methylococcus capsulatus CRL M1 (NRRL B-11.219)
Metallchelatbildner 'Natriumcyanid Natriumazid
ÄDTA
1,1O-Phenanthrolin
α,α-Bipyridy1
Thioharnstoff
Substratspezifität
Die Substratspezifität für die Oxydation von C--Cg-sec.-Alkoholen
durch die Stämme der C1-Verwerter wurde untersucht.
Unter den sekundären Alkoholen wurden 2-Propanol und 2-Butanol mit höheren Geschwindigkeiten oxydiert; 2-Pentanol,
2-Hexanol und 2-Heptanol wurden mit viel geringerer Geschwindigkeit
oxydiert. Die Oxydationsprodukte dieser sekundären Alkohole waren die entsprechenden Methylketone, bestimmt durch
Vergleich gaschromatographischer Retentionszeiten mit authentischen Standardproben.
Zellfreies System
Zelifreie lösliche Extrakte aus mit Schall aufgebrochenen Zellen neuer Stämme und bekannter Stämme oxydierten auch
2-Butanol zu 2-Butanon. Diese Ergebnisse sind in Tabelle XVII wiedergegeben. Alle untersuchten zellfreien Systeme brauchten
jedoch den Zusatz eines Cofaktors, NAD, für ihre Aktivität.
909844/0750
Andere untersuchte Cofaktoren {einschließlich NAD(P)H,
NADP, Phenazinmethosulfat, GSH, FAD, Kaliumferricyanid und Dichlorphenolindophenol) waren nicht wirksam. Die Stöchiometrie
für den Verbrauch von 2-Butanol, die Reduktion von NAD und die Bildung von 2-Butanon wurde für Pseudomonas sp.
ATCC 21.439 erhalten, wie in Tabelle IX gezeigt. Dies ist der erste Bericht über eine NAD-abhängige sec-Alkohol-Dehydrogenase.
Die experimentelle Arbeitsweise für die in Tabelle VIII angegebenen
Tests war wie folgt: 1 mg Protein des Rohextrakts wurde in 10 ml-Röhrchen in 0,5 ml eines 0,05 m Phosphatpuffers
{pH 7,0) gegeben. 1 μΜοΙ NAD und 10 μΜοΙ 2-Butanol
wurden zugesetzt und die Röhrchen wurden mit einer Gummikappe verschlossen, um ein Verdampfen minimal zu halten. Das Reaktionsgemisch
wurde bei 300C auf einem Wasserbad inkubiert. Nach 15 min Inkubation wurde eine 3 μΙ-Probe mit einer Spritze
entnommen und durch Gas/Flüssigkeits-Chromatographie getestet. Die katalytische Aktivität wurde auch durch Fluoreszenz
spelvtrophotometrie getestet. Die aus diesen beiden Tests
erhaltenen Daten stimmten miteinander überein. Vergleichbare Umwandlungen (wie in Tabelle VIII angegeben) für Extrakte,
die aus mit CH,NH2 und HCOOCHo gezüchteten Mikroben stammten,
wurden, wie in TabelleIIIgezeigt, auch erhalten.
Tabelle Villa zeigt ähnlich Umwandlungen von 2-Propanol, 2-Butanol und 2-Pentanol in die Methylketone mit den zellfreien
Extrakten von SADH.
909844/07 S-O
Oxydation von 2-Bütandl zu 2-Butanon durch zellfreie lösliche
Extrakte von C.-verwertenden Mikroben
Mikroben
obligate Methylotrophe
Membranstrüktür Typ I
Membranstrüktür Typ I
Methylosinus trichosporium 0B3b (NRRL B-11.196)
Ca')'
Wachs turns s üb s trät
Methylosinus· sporium 5
(NRRL B-T 1.1 9 7')
(NRRL B-T 1.1 9 7')
Methylocystis parvus OBBP
(NRRL B-11.198)
(NRRL B-11.198)
Membranstrüktür Typ II
Methylömonas methanica S1
(NRRL B-11.199)
(NRRL B-11.199)
Methylömonas albus BG 8
Methylömonas streptobäcterium CRL 17
(NRRL B-11.208)
Methylömonas agile GRL 22
(NRRI, B-11 .209
(NRRI, B-11 .209
CH^OH CH3NH2
HCOOCH, CH,
CH, CH,
Umwandlungsgeschwindigkeit (nMol/min/mg Protein)
4,5
2,4 2,5 2,0 1,5
1,2
0,5
2,5 1,8
1,4 3,2
Methylococcus cäpsulatus CRL M1 (NRRL B-11.219)
(a) Die Zellen wurden, wie oben beschrieben, aufgebrochen, und die beim Zentrifugieren
mit 10.000 g überstehende Flüssigkeit wurde für den Enzymtest verwendet.
Tabelle VIII (Fortsetzung)
Oxydation von 2-Butanol zu 2-Butanon durch zellfreie lösliche Extrakte von
(a)
-α ifi ο
C--verwertenden Mikroben
Mikroben
Methylococcus capsulatus CRL M1 (NRRL B-11.219)
MethylOGOccus capsulatus Y (NRRL B-11.201)
Fakultative Methan-Verwerter
Methylobacterium organophilum CRL (NRRL B-H .222)
Il Il ■■
Methylobacterium organophilum XX (ATCC 27.886)
Obligate Methanol-Verwerter
Bseudomonas sp. CRL
(ATCC 21.439)
Methylomonas methylovora
(ATCC 21.852)
Fakultative Methanol-Verwerter Pseudomonas sp. CRL
(ATCC 21.438)
Pseudomonas Ms. (ATCC 25.262)
(a) wie zuvor.
Wachstumssubstrat
CH3OH
CH3NH2 HCOOCH.
CH,
CH,
CH3OH CH3NH2
HCOOCH. CH,
CH3OH CH3OH
CH3OH
CH3OH Umwandlungsgeschwindigkeit (nMol/min/mg Protein)
2,0
1,8 2,0 0,8
1,8
2,5 2,0 2,0 2,6
25,0 2,0
3,0 5,0
Tabelle VIII (PortSetzung}
Oxydation von 2-Butanol zu 2-Butanon durch zellfreie lösliche
Extrakte von C. -verwertenden Mikroben (a)
O
CD
OO
CD
OO
Mikroben
Hefen
Candida utilis
(ATCC 26.387)
(ATCC 26.387)
Candida utilis
(NRRL Y-66O)
(NRRL Y-66O)
Hansenula polymorpha
ATCC 26.012)
ATCC 26.012)
Hansenula polymorpha
(NRRL Y-2214)
(NRRL Y-2214)
Hansenula polymorpha
(NRRL Y-2267)
(NRRL Y-2267)
Hansenula anomala
(NRRL Y-336)
(NRRL Y-336)
Pichia pastoris
(NRRL Y-55)
(NRRL Y-55)
Pichia pastoris
(NRRL Y-7556)
(NRRL Y-7556)
Wachstumssubstrat
CH3OH
CH3OH
CH3OH
CH3NH2
HCOOCH-
CH3OH
CH3OH
CH3OH
CH3OH
CH3OH ümwandlungsgeschwindigkeit
(nMol/min/mg Protein)
2,4 15,0 23,2
20,0
,0
1,5
1,8 2,2 1,6
(a) wie zuvor.
to ο co oo
Oxydation von see.-Alkoholen durch lösliche Rohextrakte von
mit Methanol gezüchteten C.. -Verwertern
Oxydationsgeschwindigkeit (iiMol/min/mg Protein)
Methylosinus trichosporium 0B3b (NRRL B-11.196)
Methylococcus capsulatus CRL M1 (NRRL B-11.219)
Methylobacterium organophilum CiRL (NRRTa B-11 .222)
Pseudomonas sp.
(ATCC 21.4391 2-Propanol 2~Butanol 2-Pentanol 2-Hexanol
Aceton 2-Butanon 2-Pentanon 2-Hexanon
2,4
2,0
2,5
,
0,1
0,1
0,1
1,2
Stöchiometrie der Produktion von 2-Bütanöh aus 2-Bütariöl durch Zeilfreie
Extrakte dies Stammes ATCC 21.439
2-Butanol verbraucht NAD verbraucht (b' 2-Butanon ia)
Versuch (nMol) (nMol) verbraucht (nMol)
1 260 270 250
2 530 540 520
ο Die Reaktionsgemische, 3 ml (1,0 mg Protein), wurden bei 300C 10 min (Versuch 1)
^ und 20 min (Versuch 2) in Gegenwart von 1,0 μΜοΙ NAD und 10 nMol 2-Butanol inkubiert
Gaschromatographisch bestimmt.
* 'Fluoreszenzspektrophotometrisch bestimmt. Endogener Verbrauch von NAD wurde
korrigiert.
Reinigung und Eigenschaften von sec.-Alkohol-Dehydrogenase
sec.-Alkohol-Dehydrogenase (SADH) aus einem obligaten Methanol-Verwerter,
Pseudomonas sp. ATCC 21.439/ wurde wie folgt gereinigt:
Die Zellen, die mit Methanol als Kohlenstoffquelle gezüchtet worden waren, wie in den vorhergehenden Beispielen
beschrieben, wurden in 300 ml 0,05 m Natriumphosphatpuffer,
pH 7,0, mit 0,5 mMol Dithiothretol (Puffer A) suspendiert und durch Schallbehandlung (5x1 min) aufgebrochen. Der Rohextrakt
wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Er wurde 10 min in einem Wasserbad bei 500C wärmebehandelt. Der erhaltene
Niederschlag wurde abzentrifugiert. Der überstehenden Lösung wurden 25 ml Protaminsulfatlösung (2%ige Lösung in 0,1 m Tris-Base)
unter ständigem Rühren zugetropft. Nach 30 min Stehen wurde der Extrakt zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde
mit festem Ammoniumsulfat fraktioniert. Das zwischen 30 und 60 % Sättigung ausfallende Material wurde gesammelt und über
Nacht gegen Puffer A dialysiert. Das dialysierte Material wurde auf eine DEAE-Cellulose-Säule (3 cm χ 35 cm) aufgebracht,
die mit Puffer A ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die see.-Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität wurde im Leervolumen
eluiert. Dieses DEAE-Cellulose-Eluat wurde durch Ammoniumsulfatfraktionierung
konzentriert. Das sich zwischen 30 und 50 % Ammoniumsulfat-Sättigung ausscheidende Material wurde
durch Zentrifugieren gesammelt und über Nacht gegen A dialysiert. Diese Fraktion wurde weiter gewaschen und durch eine
Amicon-Einheit mit XM 50-Membran filtriert. Die konzentrierte
Fraktion (6 ml) in der Amicon-Einheit wurde auf eine Affi-Gel Blue-Säule (0,8 χ 18 cm) aufgebracht, die mit Puffer
A zur Affinitätschromatographie ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Säule wurde über Nacht mit Puffer A
(0,18 ml/min) gewaschen und dann mit Puffer A mit 5 mMol NAD eluiert. Jede 1 ml-Fraktion wurde aufgefangen. Die SADH-Aktivität
wurde in den Röhrchen 8 bis 12 lokalisiert. Eine Zusammenfassung der Reinigungsschritte ist in Tabelle X wiedergegeben.
909844/0750
Reinigung von sec.-Alkohöl-Dehydrogeriäse aus Pseudomöriäs Sp. ATCC 21.439
| Maßnahmen Volumen (ml) |
250 | Protein (mg) |
Sp. Akt. (Einheiten/ mg Protein) |
Einheiten insgesamt |
Ausbeute |
| Rohextrakt | 245 | 2698 | 25 | 67450 | 100 |
| Wärmebehandlung | 260 | 949 | 67,5 | 64Ό80 | 95 |
| Protaminsulfat | 30 | 526 | 103,8 | 54640 | 81 |
| (NH4)2SÖ4 | 232 | 200 | 4&450 | 69 | |
| (30-60 % Sättigung) |
150 | ||||
| DEAE-Cellulöse- Säule |
6 | 42,2 | 875 | 37Ϊ60 | 55 |
| Amicon-Filtfa- tiön (XM-50) |
22,0 | 1500 | 33050 | 49 |
Affi-Gei Biue-Säule
0,34
65600
22300
Das gereinigte sec.-Alkohol-Dehydrogenase-Enzym (SADH) kann
direkt zur Umwandlung von Cg-Cg-sec.-Alkoholen in die entsprechenden
Methylketone nach den oben beschriebenen Arbeitsweisen verwendet werden; dem Reaktionsmedium muß jedoch
eine Quelle für NAD+ zugesetzt werden. Man kann die an NAD gebundene see.-Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität mit
einem Fluoreszenzspektrophotometer (Perkin Eimer, Modell MPF 44A) durch Verfolgen der Bildung von reduziertem NAD
(Ex 340 run, Em 460 nm) bestimmen. Das Probensystem (3 ml) enthält typischerweise Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 150
UiMoI; NAD 1,0 μΜοΙ; eine gegebene Menge Enzympräparat und
20 μΜοΙ sec.-Alkohol. Die Reaktion wird durch Zusatz von
see.-Alkohol gestartet. Eine Einheit der SADH-Enzymaktivität
entspricht der Reduktion von 1 nMol NAD pro min.
Die in Tabelle X angeführte Arbeitsweise zur Reinigung kann dadurch abgewandelt werden, daß man die Wärmebehandlung wegläßt.
Eine höhere spezifische Aktivität kann durch Weglassen der Wärmebehandlung erreicht werden (eine spezifische
Aktivität von 45 Einheiten SADH/mg Protein aus Pseudomonas sp. ATCC 21.439 wurde erhalten). Die Gegenwart eines Reduktionsmittels,
wie Dithrothretol, im Dialysepuffer hat sich als während der Dialyse des zwischen 30 und 60 % (NH4J2SO4-Sättigung
ausgefällten Materials wesentlich erwiesen. Bei einem speziellen Experiment wurde die Äffi-Gel-Blue-Säule
auf eine Größe von 2,5 χ 25 cm erhöht. Aus 10 1 Rohextrakt mit 200 g Protein wurde eine reine 45 mg-SADH-Fraktion
mit einer spezifischen Aktivität von 65.600 SADH-Einheiten/mg Protein (33 % Rückgewinnung) erhalten.
Eine Metallanalyse der gereinigten SADH-Enzyme wurde nach der
Röntgenstrahlenluoreszenztechnik mit einem halbautomatischen
Vakuumspektrographen (Phillips PW 1220C) durchgeführt. Da-
909844/0760
bei wurde das gereinigte SADH zuerst gründlich mit entionisiertem,
destilliertem Wasser gewaschen und dann gleichmäßig auf einer Aniicon XM 50 Ultrafiltrationsmembran getrocknet.
Diese Membran wurde dann mit der Röntgenstrahlenfluoreszenztechnik geprüft. Kontrollversuche erfolgen mit
Ultrafiltrationsmembranen als Blindprobe. Die Mindestmenge
an qualitativ und quantitativ nachweisbarem Metall nach dieser Methode sind >
0,02 ng bzw. > 0,5/cm2. Metallanalysen an den gereinigten, von Bakterien stammenden SADH-Enzymen
..,nach dieser Technik zeigten 0,7 μg Zink/cm2 der Ul traf iltrationsmembran.
Dies entspricht 2 Mol Zink pro Mol SADH-Enzym oder 1 Zink pro Untereinheit. Kein weiteres Metall wur-
' de festgestellt.
- Das Molekulargewicht des gereinigten SADH wurde durch Acrylarnidgelelektrophorese
unter Verwendung von 7,5 % Gel und eingefärbt sowohl mit Coomassie-ßrilliantblau als auch mit
Nitroblau-tetrazolium-Aktivitätsfarbe bestimmt. Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese
in einem 10 % Gelsystem und
die Dissoziation des Enzymproteins erfolgten unter Verwendung von SDS-PAGE-Standards. Sowohl der Proteinfleck als auch der
Enzymaktivitätsfleck der getesteten gereinigten SADH-Enzyme zeigte eine einzige Proteinbande. Die Beweglichkeit des SADH
aus den verschiedenen Arten mit Methanol gezüchteter Bakterienzellen bei der Gelelektrophorese war identisch. Aus
Hefe stammendes SADSI hatte eine größere Beweglichkeit zur Anode bei der Gelelektrophorese. Die Molekulargewichte verschiedener
aus Bakterien und Hefen stammender und gereinigter SADH-Enzyme hatten jeweils ein identisches Molekulargewicht
von 95.000 Dalton, festgestellt mit einer Biogelagaroae A-1,5-Säule„ SDS-Gelelektrophorese der gereinigten Enzyme
zeigte zwei identische Untereinheiten von 48.000 Dalton.
Die für die Aktivität des gereinigten SADH optimalen Werte von pH und Temperatur waren 8 bis 9 bzw. 30 bis 350C, wenn-
909844/0750
• · t
- 65 -
29151
gleich größere Bereiche des pH und der Temperatur die Enzymaktivität
nicht wesentlich beeinflußten. Die Aktivierungsenergie für SADH, berechnet nach der Arrhenius'sehen Darstellung
der Geschwindigkeit gegen den Reziprokwert der absoluten Temperatur, beträgt 19,8 kcal. Das Absorptionsspektrum der
gereinigten SADH-Fraktion zeigte keinen Peak im sichtbaren Bereich.
Die Michaelis-Konstanten (K ) des SADH, berechnet aus dem
-5 Lineweaver-Burk-Diagramm, war 1,1 χ 10 m für NAD. Ähnliche
Reaktionsgeschwindigkeiten wurden erhalten, ob nun SADH entweder mit NAD oder mit 2-Butanol 10 min vorinkubiert wurde.
Dies zeigt an, daß die Zugabe von Substraten zur SADH-Reaktion nicht eine zwangsläufige Reihenfolge ist, sondern vielmehr
ein statistischer oder Zufallsmechanismus. Während der Reaktion wurde kein Verbrauch an gelöstem Sauerstoff beobachtet.
Der Einfluß mit Metallen Chelate bildender Mittel und Thioreagentien
auf die Aktivität des gereinigten SADH-Enzyms wurde untersucht. Die SADH-Aktivität wurde wie folgt inhibiert
(% Hemmung, Aktivität spektrofluorometrisch gemessen
und jeder Inhibitor mit einer Endkonzsntration von 1 inMol
zugesetzt): Jodessigsäure, 0 %; N-Äthylma3eimid, 6 %; p-Hydroxymercuribenzoat, 100 %; 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure),
100 %; Natriumcyanid, 0 %; Natriumazid, 10 %;
ÄDTA, 63 %; 1,10-Phenanthrolin, 95 %; α,α-Bipyridyl, 70 %;
Thioharnstoff, 0 %; Kupfer(II), 25 %; Eisen(III), 35 %;
Eisen(II), 50 %; Nickel, 20 % und Zri++, Co++, Mn++ oder
Mg++, 0 %. Trotz der Tatsache, daß SADH 2 Mol Zink pro Mol
Enzym enthält, regte die Zugabe von von außen zugeführtem Zink die Aktivität nicht an. Die Möglichkeit der Hemmung
durch Äthanol oder n-Propanol wurde untersucht. Trotz der strukturellen Ähnlichkeit beim Konkurrieren mit 2-Butanol
für die AlkyIbindungsstelle(n), hemmten beide die SADH-Aktivität
nicht.
909844/0750
Die Substratspezifität gereinigter SADH war für 2-Propanol
und 2-Butanol am höchsten. Es oxydierte auch mit geringerer Geschwindigkeit 2-Pentanol, 2-Hexanol, Acetaldehyd,
Propanol, Cyclohexanol, Butan-1,3-diol und Butan-2,3-diol.
Primäre Alkohole waren keine Substrate für gereinigtes SADH, Für die Enzymaktivität scheint ein hydrophober Kohlenstoffrest
nahe dem sekundären Alkohol erforderlich zu sein.
Das gereinigte SADH-Enzym wurde auf Aminosäuren mit einem Aminosäureanalysator (Beckman Modell 120B) nach Säurehydroiyse
des Enzyms analysiert. Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse sind in Tabelle XI zusammengefaßt. Die Werte
sind als Durchschnittszahl der Reste pro Molekül, erhalten aus 24-,48- und 72-stündiger Säurehydrolyse, ausgedrückt
unter der Annahme eines Molekulargewichts von 95.000. Nur zwei Cysteinreste wurden festgestellt.
| Zahl der Reste/95.000 Dalton | 909 84 4/07 50 | |
| Tabelle XI | 52 | |
| Aminosaurezusammensetzung von gereinigter SADH | 14 | |
| Aminosäure | 26 | |
| Lysin | 2 | |
| Histidin | 78 | |
| Arginin | 26 | |
| Cysteinsäure | 14 | |
| Asparaginsäure | 76 | |
| Threonin | 32 | |
| Serin | 72 | |
| Glutamin | 92 | |
| Prolin | 68 | |
| Glycin | 6 | |
| Alanin | 54 | |
| Valin | 74 | |
| Methionin | 6 | |
| Isoleucin | 28 | |
| Leucin | 28 | |
| Tyrosin | ||
| Phenylalanin | ||
| Tryptophan | ||
-67- 29151
Das sec.-Alkohol-Dehydrogenase-Enzym wurde aus aus Pseudo-
monas sp. ATCC 21 .439, aerob mit Methanol gezüchtet, stammenden
Zellen gereinigt.
Aus Hefe stammende SADH
Wie zuvor angegeben, überführen sowohl Zellsuspensionen als auch zellfreie Extrakte von mit C--Verbindungen gezüchteten
•Hefen enzymatisch C^-Cg-sec.-Alkohole in die entsprechenden
Methylketone. Ferner wurde speziell, gefunden, daß Zellsuspensionen
der Hefen Candida utilis ATCC 26.387; Hansenula polymorpha ATCC 26.012; Pichia sp. NRRL Y-11.328; Torulopsis
sp. Stamm A.. NRRL Y-11.419 und Kloeckera sp. Stamm A2 NRRL
Y-11.420, mit verschiedenen C.-Verbindungen (z.B. Methanol, Methylamin, Methylformiat), Äthanol und Propylamin gezüchtet,
die Oxydation von C3-Cg-SeC„-Alkoholen zu den entsprechenden
Methylketonen katalysierten.
Die Zellen wurden während des exponentieIlen Wachstums durch
15-minütiges Zentrifugieren mit 12.000 g geerntet. Der Zellkuchen wurde zweimal mit 50 mMol Phosphatpuffer, pH 7,
gewaschen. Der endgültige Kuchen wurde im gleichen Puffer erneut suspendiert. Zellsuspensionen von mit Äthanol, Methylamin
und Methylformiat gezüchteten Hefen wurden, wie oben beschrieben, unter Verwendung von 0,4 Vol./Vol. Äthanol,
10 mMol Methylamin und 10 mMol Methylformiat als einziger Quelle für Kohlenstoff und Energie hergestellt.
Eine 1 ml-Menge jeder gewaschenen Zellsuspension von mit
verschiedenen Kohlenstoffquellen gezüchteten Hefen wurde in
10 ml-RÖhrchen bei 400C gebracht. 10 μΐ sec.-Alkohol (2-Propanol,
2-Butanol, 2-Pentanol und 2-Hexanol) wurden in einem
unabhängigen Röhrchen den Zellsuspensionen zugesetzt. Die Röhrchen wurden bei 300C auf einem rotierenden Wasserbadschüttler
bei 200 UpM inkubiert. Das Oxydationsprodukt
909844/0750
•le»*
- 68 -
29151
sekundärer Alkohole wurde durch Vergleich gaschromatographischer Retentionszeiten und gleichzeitige Chromatographie
mit authentischen Standardproben nachgewiesen. Wie in Tabelle XII gezeigt, katalysieren die Zellsuspensionen von Hefen
die Umwandlung von Isopropanol, 2-Butanol, 2-Pentanol und
2-Hexanol in die entsprechenden Methylketone. Die Oxydationsprodukte der see.-Alkohole sammelten sich extrazellulär an,
und gaschromatographische Analyse zeigte keine «äice^
Oxydation der Produkte (Methylketone). Ähnliche Umwandlungen von 2-Butanol in 2-Butanon erfolgten mit Zellsuspensionen
der Hefen Candida boidinii NRRL Y-2332; Hansenula anoiuaJ^
NRRL Y-336; und Pichia pastoris NRRL Y-55. Die Umwandlungsgeschwindigkeiten (μΜοΙ/h/mg Protein) waren 6,0, 5,5 bzw.
5,8.
Zellfreie Extrakte dieser Hefen katalysierten die NAD -abhängige
Oxydation der C3-Cg-see.-Alkohole zu den entsprechenden
Methy!ketonen. Die Gegenwart von NAD als Elektronenakzeptor
war wesentlich im Falle des zellfreien Extrakts dieser aus Hefe stammenden Enzyme. Primäre Alkohole wurden
durch dieses gereinigte Enzym nicht oxydiert. Das Molekulargewicht des gereinigten, aus Hefe stammenden SADH-Enzyms
war 98.000 Dalton, bestimmt durch Gelfiltration, und die Größe der Untereinheit war nach der Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese
48.000.
Zu bemerken ist, daß das Molekulargewicht des gereinigten SADH etwa 95.000 + 3.000 (nach der Biogel-Säulenchromatographie)
ist, ob aus Hefe oder Bakterien stammend, aber aufgrund von Reinigungsarbeitsweisen und Versuchsfehlern
variieren kann.
Die Aktivität des gereinigten, aus Hefe stammenden SADH wurde durch Sulfhydryl-Inhibitoren und metallbindende Mittel
gehemmt. Der optimale pH des gereinigten Enzyms wurde zu etwa 8 bestimmt.
9 0 9 8 4 4/0750
- 69 -
Ein typisches, aus Hefe stammendes SADH-Enzym wurde wie
folgt hergestellt:
Die Hefen wurden bei 300C in einem 2,8 1-Kolben mit 700 ml
Mineralsalzmedium (später beschrieben) mit 0,1 % Hefeextrakten und 0,4 Vol.-/Vol.-% Methanol gezüchtet.
Hefe-Wachstumsmedium
| KH2PO4 | 2,5 | g |
| NH4NO3 | 2,5 | 9 |
| MgSO4·7H2O | 0,3 | g |
| KCl | 0,04 | g |
| CaCl2 | 0,015 | g |
| FeSO4·7H2O | 1/0 | mg |
| CuSO4·5H2O | 0,01 | mg |
| H3BO3 | 0,02 | mg |
| MnSO4'5H2O | 0,04 | mg |
| ZnSO4 | 0,14 | mg |
| MoO3 | 0,02 | mg |
| Hefeextrakt | 1/0 | g |
| Methanol | 4 | ml |
1 ' Die Zusammensetzung gilt für 1 1.
909844/0750
Oxydation von see.-Alkoholen zu Ketonen durch Zellsüspensiorieri von Hefen
ümwähdlungsgeschwindigkeit (|j,Möl*/h/mg Protein)
(a)
| Organismus | Wachstumssubstrat | Isopropanöl | 2-Eutario:r —^ |
2-Pentanol | 2-Hexanol > |
I . . | • * | |
| Aceton | 2-Butanön'" | 2-Pentanon | 2-Hexanon | -J · ° :. ". |
||||
| Candida utilis | Methanol | 6,2 | 6,8 | 1,5 | 0,8 | ~ · · I * ·· |
CD "'*· | |
| ATCC 26387 | Äthanol | 5,2 | 5,2 | 1,0 | 0,72 | * | —* | |
| Methylamin | 5,0 | 5,0 | 1,2 | 0,61 | • · · · | cn | ||
| Methyiformiat | 5,6 | 6,2 | 1,3 | 0,75 | » · • · · · |
|||
| Propylamin | 4,2 | 4,2 | 0,9 | 0,52 | • · · · | G2 | ||
| O | Hänseriula poly- | Methanol | 5,9 | 5,8 | 1,4 | 0,72 | ||
| CD | morpha | Äthanol | 5,0 | 4,8 | 1,1 | 0,54 | ||
| OO | ATCC 26012 | Methylamin | 5,2 | 4,5 | 1,2 | 0,62 | ||
| .S- | Methyiformiat | 5,6 | 5,2 | 1,3 | 0,70 | |||
| "^ | Fröpylamin | 4,1 | 4,0 | 0,82 | 0,48 | |||
| O | Pichia sp. | Methanol | 5,2 | 6,8 | 1,2 | 0,50 | ||
| NRRL-Y-11328 | Äthanol | 4,5 | 6,2 | 1,0 | 0,28 | |||
| cn | Methylamin | 4,2 | 5,1 | 0,72 | 0,31 | |||
| Methyiformiat | 4,9 | 6,9 | 0,98 | 0,48 | ||||
| Propylamin | 3,2 | 2,1 | 0,60 | 0,21 | ||||
| Torulopsis sp. | Methanol | 4,5 | 4,9 | 1,0 | 0,21 | |||
| Stamm A1(NRRL-Y- | Äthanol | 4,2 | 4,7 | 1,2 | 0,20 | |||
| 11.419) ' | Methylamin | 4,3 | 4,5 | 0,9 | 0,12 | |||
| Methyiformiat | 4,5 | 4,9 | 1,1 | 0,25 | ||||
| Propylamin | 3,2 | 3,8 | 0,62 | 0,10 | ||||
| Kloeckera sp. | Methanol | 4,8 | 5,9 | 1,2 | 0,25 | |||
| Stamm L0 (NRRL-Y- | Äthanol | 4,5 | 5,7 | 1,0 | 0,12 | |||
| 11.420) | Methylamin | 4,0 | 5,4 | 1,0 | 0,10 | |||
| Methyiformiat | 4,9 | 5,9 | 1,2 | 0,28 | ||||
| Propylamin | 4,0 | 4,2 | 0,92 | 0,11 | ||||
Die Oxydationsprodukte wurden durch Vergleich der gaschromatographischan Retentionsseit
und durch gemeinsame Chromatographie mit authentischen Standardproben identifiziert.
Die Analyse zeigte auch, daß keine weitere Oxydation der Produkte (Methylketone)erfolgte.
Zellsuspensionen (2 g Naßgewicht) gepackter Zellen in 10 ml
50 mMol Natriumphosphatpuffer, pH 7/0, bei 40C wurden durch
Schallbehandlung mit einer Megason-ültraschallzerstörung aufgebrochen. Die schallbehandelten Zellsuspensionen wurden
15 min bei 30.000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde als Rohextrakt bezeichnet.
Reinigung von aus Hefe stammender sec.-Alkohol-Dehydrogenase
:Große Kulturen von Pichia sp. NRRL Y-11.328 wurden unter Belüftung
bei 300C in einem 14 1-New Brunswick f-Fermentator
in einem Mineralsalzmedium mit Methanol (0,4 Vol.-/Vol.-%) als einziger Kohlenstoffquelle gezüchtet. Die Zellen (200 g
Naßgewicht) wurden in 50 mMol Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, mit 1 mMol Dithiothreitol (Puffer A) suspendiert, und Rohextrakte
wurden hergestellt, wie zuvor beschrieben. Die Rohextrakte wurden mit 18 ml Protaminsulfatlösung (2%ige Lösung
in 0,1 m Tris(hydroxymethyl)aminomethan, (Tris)-Base) unter
kontinuierlichem Rühren tropfenweise versetzt. Nach 30-minütigem Stehen wurden die Extrakte 60 min bei 20.000 g
zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde mit festem Ammoniumsulfat fraktioniert. Die Extrakte wurden auf 50 %
Sättigung Ammoniumsulfat durch Zusatz von 313 g des Salzes
pro 1 Extrakt gebracht. Ausgefällte Proteine wurden abzentrifugiert, und 137 g Ammoniumsulfat wurden pro 1 der überstehenden
Flüssigkeit zugesetzt, um sie auf 70 % Sättigung zu bringen. Zwischen 50 und 70 % Sättigung ausgefälltes Material
wurde durch Zentrifugieren gesammelt und in Puffer A gelöst. Dieses Präparat wurde über Nacht gegen Puffer A dialysiert,
und das dialysierte Material wurde auf eine DEAE-Cellulose-Säule
(5 χ 40 cm) aufgebracht, die mit Puffer A ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Probe wurde mit 200 ml Puffer A
gewaschen und mit 2 1 Puffer A eluiert, die NaCl mit linearem Gradienten von einer Konzentration von 0 bis 0,5 m enthielten.
9098U/075Q
15 ml-Fraktionen wurden aufgefangen. Fraktionen mit sec-Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität
wurden gesammelt und als DEAE-Cellulose-Eluat bezeichnet. Das DEAE-Cellulose-Eluat
wurde durch Ammoniumsulfatfraktionierung konzentriert.
Zwischen 50 und 70 % Ammoniumsulfatsättigung ausfallendes Material wurde durch Zentrifugieren gesamirslt und in Puffer A
gelöst. Dieses Präparat wurde über Nacht gegen Puffer A dialysiert, und 4 ml-Proben wurden durch eine Biogel-Agarose
A-1,5-Säule (2,5 χ 100 cm) geführt, die mit Puffer A ins Gleichgewicht gebracht worden war. Fraktionen mit konstanter
spezifischer Aktivität des Enzyms wurden vereinigt und durch Amicon-ültrafiltration unter Verwendung eines XM-50-Filters
konzentriert.
Das Reaktionsgemisch, insgesamt in 3,0 ml, enthielt 50 iriMol
' Phosphatpuffer, pH 7,0, 20 μΜοΙ NAD+, Zell-extrakte (1 ml).
Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 50 Mol see.-Alkohol
(Isopropanol, 2-Butanol, 2-Pentanol, 2-Hexanol) gestartet
und die Produktionsgeschwindigkeit von Methy!ketonen (Aceton,
2-Butanon, 2-Pentanon, 2-Hexanon) wurde gaschromatographisch gemessen.
Das aus der Oxydation von see.-Alkoholen durch Zellextrakte
von Organismen erhaltene Ketonprodukt wurde durch Flammenionisations-Gaschromatographie
unter Verwendung einer rostfreien Stahlsäule (3,65 m χ 3,2 mm bzw. 12 Fuß χ 1/8 Zoll),
gepackt mit 10 % Carbowax 2OM auf 80/100 Chromosorb W (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, Conn.) ermittelt. Die Säulentemperatur
wurde isotherm bei 1300C gehalten, der Trägergasstrom war 30 ml Helium/min. Die verschiedenen Ketonprodukte
(Aceton, 2-Butanon, 2-Pentanon, 2-Hexanon) wurden durch Vergleich der Retentionszeiten und gleichzeitige Chromatographie
mit authentischen Standardproben identifiziert. Der Proteingehait der Zellsuspensionen wurde nach der Methode von Lowry
et al. bestimmt.
909844/Q75G
Die sec.-Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität wurde spektrophotometrisch
bei 340 nm mit einem NAD+ als Elektronenakzeptor
gemessen. Das Reaktionsgemisch in insgesamt 3/0 ml enthielt 50 mMol Phosphatpuffer, pH 8,0, 5 μΜοΙ NAD+,
Rohextrakte, und Substrat. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 100 μΐ 0,1 m Substrat gestartet und die Geschwindigkeit
der NAD -Reduktion wurde gemessen. Die Proteinkonzentration wurde nach der Methode von Lowry et al
bestimmt.
Zellfreie Extrakte, die aus Hefen, Candida utilis ATCC 26.387, Hansenula polymorpha ATCC 26.012, Pichia sp. NRRL Y-11.328,
Torulopsis sp. Stamm A- NRRL Y-11.419 und Kloeckera sp.
Stamm A0 NRRL Y-11.420, mit Methanol gezüchtet, stammten,
katalysierten eine NAD -abhängige Oxydation von see.-Alkoholen (Isopropanol, 2-Butanol, 2-Pentanol, 2-Hexanol) zu
den entsprechenden Methylketonen (Aceton, 2-Butanon, 2-Pentanon, 2-Hexanon). Die Geschwindigkeit der Produktion von
Methylketonen aus see.-Alkoholen ist in Tabelle XIII wiedergegeben.
Oxydation von see.-Alkoholen wurde auch spektrophotometrisch durch Messen der Reduktion von NAD abgeschätzt.
Die spezifischen Aktivitäten (nMol reduzierten NAD /min/mg
Protein) von 78, 85 f 105, 62 bzw. 90 wurden mit Extrakten
aus Candida utilis ATCC 26.387, Hansenula polymorpha ATCC 26.012, Pichia sp. NRRL Y-11.328, Torulopsis sp.
NRRL Y-11.419, Stamm A^ bzw. Kloeckera sp., Stamm A2
NRRL Y-11.420 unter Verwendung von 2-Butanol als Substrat
erhalten.
9 09 SU it/O 750
Oxydation von see.-Alkoholen zu Methy!keton durch Zellextrakte von Hefen
Umwandlungsgeschwindigkeit μΜοΙ/h/mg Protein
■ta)
Organismus
Candida utilis ATCC 26.387
Hansenula polymorpha ATCC 26.012
Pichia sp. NRRI1-Y-11 .328
Torulöpsis sp.
Stamm A1 NRRL-Y-I1.419
Kloeckera sp.
Stamm A2 NRRL-Y-11.420
| Isopropanol | 2-Butanol | 2-Pentanol | 2-Hexanol |
| Aceton | 2-Butanon | 2-Pentanon | 2-Hexanon |
| 4,5 | 4,92 | 0,82 | 0,45 |
| 4,3 | 5,2 | 1,0 | 0,51 |
| 5,5 | 6,2 | 1,2 | 0,60 |
| 4,5 | 4,9 | 1,0 | " 0,21 |
| 4,IB | 5,9 | 1,2 | 0,25 |
ie Reaktionen wurden durchgeführt,wie oben beschrieben. Die Oxydätibnsprodukte
der see.-Alkohole wurden gaschromatographisch identifiziert und bestimmt.
Cn CD
Das SADH-Enzym wurde aus einer DEAE-CeIlulosesäule bei
0,08 m NaCl-Konzentration eluiert. Die insgesamt 60-fache Reinigung wurde aus Rohextrakten erreicht. Die Reinheit des
Enzympräparats wurde durch Polyacrylamid-Ge!elektrophorese
geprüft. Die gereinigten Enzympräparate wanderten als einzelne Proteinbande bei der Elektrophorese auf Polyacryl-^
amidgel. Tabelle XIV gibt eine Zusammenfassung der Reinigungsschritte und eine Analyse der Produkte am Ende jeder
Stufe wieder.
Die Substratspezifität der gereinigten sec.-Alkohol-Dehydrogenase
wurde spektrophotometrisch geprüft. Unter verschiedenen getesteten see.-Alkoholen katalysierte das Enzym
die Oxydation von Isopropanol, 2-Butanol, 2-Pentanol und
2-Hexanol.
2-Heptanol, 2-Octanol, Methanol, Äthanol, Propan-1-öl, Butan-1-ol,
Pentan-1-ol, 1,2-Propandiol, 1,2-Butandiol und 1,3-Butandiol
wurden durch das gereinigte Enzym nicht oxydiert.
Das gereinigte Enzym brauchte NAD als Elektronenakzeptor*
NADP, Phenazinmethosulfat, Kaliumferricyanid, Cytochrom c, 2,e^Dichlorphenolindophenol, Flavin=adenin=dinucleotid
konnten nicht als Elektronenträger wirken.
Verschiedene, durch sec.-Alkohol-Dehydrogenase nicht oxydierte
primäre Alkohole wurden als potentielle Inhibitoren der Enzymaktivität untersucht. Die Snzymaktivität wurde nicht
durch primäre Alkohole bei 10 m gehemmt. Von verschiedenen untersuchten Sulfhydryl-Inhibitoren und metallbindenden Verbindungen wirkten p-Hydroxymercuribenzoat, Glutathion,
Imidazol und 1,10-Phenanthrolin stark hemmend auf die sec-Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität.
Die Enzym-Aktivität wurde auch durch Schwermetalle, wie Silberniträt, Quecksilber(II)-thiocyanat
und Kupfer(II)sulfat, gehemmt.
9098U/Q7BÖ
Reinigung von see.-Alkohol-Dehydrogenase aus Pichia sp. NRRL Y-11.328
■Ca)
Stufe
1. Rohextrakte
2. Protaminsulfat-Behandlung
3. Ammoniumsulf at-Fraktionie-·
rung (50 - 70 % Sättigung)
4. DEAE-Cellulose-Eluat
5« Biogelchromatographie
| Vol. (ml) |
Protein (mg) |
Einheiten | Sp. Aktivität (Einheiten/mg Protein) |
Ausbeute (%) |
| 875 | 21 .875 | 2391375 | 109 | 100 |
| 890 | 21.360 | 2370960 | 111 | 99 |
| 117 | 3.090 | 1820010 | 589 | 76 |
| 55 | 200 | 706800 | 3534 | 29 |
| 19 | 52 | 312624 | 6012 | 13 |
(a)
Die sec.-Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität wurde spektrophötometrisch ermittelt,
wie oben beschrieben,unter Verwendung von 2-Butanol als Substrat. Die spezifische
Aktivität wurde als riMol an reduziertem NAD /min/mg Protein ausgedrückt.
Aceton und 2-Butanon wurden als Produkt der Oxydation von
Isopropanol bzw. 2-Butanol durch das gereinigte Enzym nachgewiesen. Die Menge an reduziertem NAD und gebildetem
Produkt steht im Einklang mit der quantitativen Oxydation beider Substrate. Diese Ergebnisse sind in Tabelle XV wiedergegeben
.
Stöchiometrie der Oxydation von Isopropanol und sec.-Butänöl
durch die gereinigte see.-Alkohol-Dehydrogenase
Substrat (μΜοΙ) NAD+ reduziert *a' gebildetes Produkt1
(UMo1) (μΜοΙ)
Isopropanol 5,7 5,4 Aceton 5,5
2-Butanol 6,0 5,9 2-Butanon 5,7
*a'Die Ermittlung des reduzierten NAD+ erfolgte durch
spektrophotometrische Messung bei 340 nm.
' Die Ermittlung der Produkte erfolgte gaschromatographisch,
wie bei den Verfahren beschrieben.
Das Alkan-Oxydationssystem
Sowohl Zellsuspensionen ίTeilchenfraktion) als auch zellfreie
Teilchenfraktionen von mit Methan gezüchteten methylotrophen Mikroorganismen vermögen die Umwandlung von
CU-Cg-n-Alkanen in die entsprechenden Alkohole, einschließlich
see.-Alkohole zu katalysieren. Die. Bedingungen für die Herstellung der Zellsuspensionen oder die zellfreien Teilchenfraktionen
aus mit Methan gezüchteten methylotrophen Mikroorganismen sind die gleichen wie oben beschrieben.
Die zellfreie Teilchenfraktion erfordert die Anwesenheit von Sauerstoff und NADH als Elektronendonor. Die Umwandlung des
809844/078Θ
VWran η·ΐΓ«η¥ΊΠΓΛΐ π
- 78 -
Alkohols wurde durch metallbindende Mittel gehemmt, was
die Beteiligung von Metallion(en) bei der Umwandlung der Alkane in sekundäre Alkohole vermuten läßt. Propylen
erwies sich auch als die Umwandlung hemmend, was vermuten läßt, daß das Propylen und das n-Alkan (z.B. Propan) um
dasselbe bzw. dieselben Enzymsysteme konkurrieren. Ascorbat und reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat
(NADPH) könnten auch als Elektronendonor anstelle von NADH für: die Umwandlung verwendet werden. Die Tabellen
-XVIi und;XVII zeigen-die Umwandlung von X^-Cg-nr-Alkanen
zu den entsprechenden sekundären Alkoholen unter Verwendung von Zellsuspensionen bzw. zellfreien Teilchenfraktionen
von\mit Methan gezüchteten, methylotrophen Mikroorganismen.
098U/07SQ
Table IXe XVI
Umwandlung von n-Alkänen in see.-Alkohole durch Mikroorganismen
Umwandlung von n-Alkänen in see.-Alkohole durch Mikroorganismen
ia)
Umwaridlungsgeschwindigkeit (uMol/h/5 mg Protein)
O
CO
OO
■P-
Mikroorgani smus
Wachsturnssubstrat
Methylosinus tricho- Methan
sporium (0B3b, NRRL-B-11.196)
Methylococcus capsulatus Methan (Texas, ATCC 19.069)
Methylobäcter capsulatus Methan (Y, NRRL-B-11.201)
Methylosinus sp. Methan
(CRL-15, NRRL-B-11.202)
Methylobäcterium sp. Methan
(CRL-26, NRRL-B-11.208)
Methylömonas sp. Methan
(CRL-I7, NRRL-B-11.209)
| n-Pröpan | η-Butan | n-Pentan | n-Hexan |
| 2-Propanol | 2-Butanol | 2-Pentanol | 2-Hexanol |
| 2,5 | 1,5 | 0,06 | 0,01 |
| 1,1 | 1,0 | 0,032 | 0,01 |
| 0,20 | 0,09 | - | - |
| 2,1 | 1,2 | - | - |
| 1,4 | 0,80 | 0,01 | 0,007 |
| 1,6 | 1,2 |
VD ._
(a)
Die Produkt-sec.-Alkohole wurden durch Vergleich der gaschromatographischen
Retentionszeit und gleichzeitige Chromatographie mit authentischen Standardpröben
identifiziert und ermittelt.
CO
CD CD
to ο cd co
Hydroxylierung von n-Älkänen zu sec.-Alkoholen durch die P(40j
fraktion von Methylotrophen
-Teilchen
Umwandlungsgeschwindigkeit (μΜο1/ίϊ/2,0 mg Protein)
Organismen
MethylÖsinüs sp. (CRL-15, NRRL-B-11.202)
,Methylocöccus capsulatüs
(Texas, ATCC 19.069)
Methylösihus trichospörium
(OB3b, NRRL-B-11.196)
Methylobacterium sp.
(CRL-26, NRRL-B-11.222)
n-Propan
2-Propanol
2-Propanol
1,5
1,2
1,32
1,0
1,2
1,32
1,0
n-Butan 2-Butanol
0,89 0,92 0,79 0,61
(a)
Die P(40)-Teilchenfraktion wurde wie folgt hergestellt: ZeTlsuspensionen bei
4°C wurden durch eine Französische Druckzelle zerstört und 15 min bei 4.000 g
zentrifugiert, um nicht-aufgebrochene Bakterien zu entfernen. Die überstehende
Lösung wurde dann 30 min bei 4°C mit 40.000 g zentrifugiert, was die Teilchenfraktionen
P(40) und die lösliche Fraktion S(40) lieferte. Die Produkte wurden
gaschromatographisch und durch gleichzeitige Chromatographie mit authentischen Standardproben identifiziert.
Die Tabelle XVIII zeigt, daß die Zellsuspensionen von mit Methan gezüchteten methylotrophen Mikroorganismen C1-C^-
Alkane in die entsprechenden Alkohole überführen und Propan und Butan in eine Vielzahl von Oxydationsprodukten
überführt werden, darunter primäre und sekundäre Älkhole, Methylketone und Aldehyde.
Tabelle XVIII
Umwandlung von n-Alkanen in Oxydationsprodukte
Umwandlungsgeschwindigkeit, {uMol/h/mg Protein)
| Substrat | Produkte | Methylosinus trichosporium OB3b NRRL B-11.196 |
Methylococcus capsulatus CRL M1 NRRL B-11.219 |
| Methan | Methanol | 1,5 | 2,5 |
| Sthan | Äthanol | 1,3 | 2,0 |
| Propan | 1-Propanol | 0,4 | 0,5 |
| Propan | 2-Propanol | 0,6 | 0,7 |
| Propan | Propanol | 0,1 | 0,2 |
| Propan | Aceton | 0,2 | 0,3 |
| Butan | 1-Butanol | η ι | 0 4 |
| Butan | 2-Butanol | 0,4 | 0,5 |
| Butan | 2-Butanon | 0,1 | 0,2 |
| Butan | n-Butanol | 0,1 | 0,2 |
Zellsuspensionen von mit Methan gezüchteten methylotrophen Mikroorganismen in 0,15 m Phosphatpuffer, pH 7,0, inkubiert
in den Alkanen, wie angegeben, bei 30C. Die Oxydationsproduk^e
wurden durch Gas/Flüssigkeitschromatographie bestimmt.
909844/0750
Claims (9)
- Patentansprüche.1 . Verfahren zur enzymatischen Umwandlung eines orc'anischen Substrats, dadurch gekennzeichnet, daß ein organisches Substrat der Gruppe der CU-Cg-n-Alkane oder C,-Cg-sec- -Alkohole unter aeroben Bedingungen mit ruhenden Mikrobenzellen aus einem methylotrophen Mikroorganismus mit Oxygenase- oder Dehydrogenase-Enzymaktivität oder einem aus diesen Zellen stammenden Enzympräparat in Berührung gebracht wird, wobei der Mikroorganismus zuvor unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium mit einer C--Verbindung gezüchtet worden ist, die die Kohlenstoff- und Energiequelle für das Wachstum der Zellen darzustellen vermag und die Fähigkeit besitzt, in den Zellen im Falle der Oxydation der Alkane Oxygenase-Enzymaktivität oder im Falle der Oxydatior der Alkohole Alkohol-Dehydrogenase-Enzymaktivität zu induzieren.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da0 als Mikroorganismen obligate oder fakultative Methylotrcphe eingesetzt v/erden«
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Substrat ein C^-Cg-n-Alkan verwendetwird.909844/07
- 4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Substrat ein C^-Cg-sec-Alkohol verwendet wird.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzympräparat eine zellfreie Teilchenfraktion der ruhenden Mikrobenzellen eingesetzt wird.
- -~' ■'"■ V6.-'Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) enthaltendes Reaktionsmedium verwendet wird. f
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein see.-Alkohol erhalten wird.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzympräparat ein zellfreier Roh- oder gereinigter Extrakt der ruhenden Zellen mit Co-C^-sec.-Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität eingesetzt wird.■ ϊ|
- 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daßein zusätzlich endogenes oder exogenes Nicotinamidadenin-dinucleotid (NAD ) enthaltendes Reaktionsmedium verwendet wird.Ψ
TO. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,dadurch gekennzeichnet, daß die Umwandlung kontinuierlich erfolgt und das Enzym immobil gemacht wird.• · · I 1 I I11. sec.-Alkohol-Dehydrogenase-Enzyirit dadurch gekennzeichnet, daß es C,-C-.-sec.-Alkohole unter aeroben Bedingungen in Methylketone zu überführen vermag.12. Enzym nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Molekulargewicht von etwa 95.000 + 3.000 Dalton, bestimmt durch Biogel-Säulenchromatographie, und zwei Zinkatome pro Molekül Protein aufweist.r=~VI3.-Enzym nach Anspruch 11 oder 12, das zusätzlich Nicotinamid- -"'^ aderiin-dinucleotid (NAD ) enthält.1^14. Verfahren zur Herstellung des Enzyms gemäß Anspruch. 11, I-'F", gekennzeichnet durch, (a) Kultivieren eines obligaten oder fakultativen methylo-Tf4. trophen Mikroorganismus in einem Nährmedium mit einer, Methylreste liefernden Verbindung unter aeroben Be- : ' dingungen zu Mikrobenzellen mit sec.-Alkohol-Dehydro- * genase-Aktivität,
ν (b) Gewinnen und Aufbrechen der Zellen und je) Entfernen der Zelltrümmer und Gewinnen der das see-Alkohol-Dehydrogenase-Enzym enthaltenden überstehenden >; Flüssigkeit,909844/0750
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US89647578A | 1978-04-14 | 1978-04-14 | |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2915106A1 true DE2915106A1 (de) | 1979-10-31 |
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ID=26700073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP (1) | JPS54151194A (de) |
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| CH (1) | CH651316A5 (de) |
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