JPS59135889A - トリメトプリムに対する耐性が増強したプラスミド - Google Patents
トリメトプリムに対する耐性が増強したプラスミドInfo
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- JPS59135889A JPS59135889A JP58009735A JP973583A JPS59135889A JP S59135889 A JPS59135889 A JP S59135889A JP 58009735 A JP58009735 A JP 58009735A JP 973583 A JP973583 A JP 973583A JP S59135889 A JPS59135889 A JP S59135889A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
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- C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、宿主菌に導入した場合、宿主菌が２００μｇ
／ｍｌの濃度のトリメトプリムに耐性を獲７１）する
ことができるプラスミドに関するものであり、該プラス
ミドの製造方法及び該プラスミドを含む宿主菌からのジ
ヒドロ葉酸還元ｒ（ｙ素の簡便精製法に関しても言及し
ている。 近年、分子生物学及び遺伝子工学の発展を背景に組替え
ＤＮＡ手法を用いて有用な物質を生み出す方法が脚光を
浴びつつある。 本発明者らは、すでに犬１ｔ！！＋ ｒ’Ｍｉのジヒド
ロ葉酸費元酵累（以下ＤＨＰＲと略す。）を多コピープ
ラスミドに組み込み、これを＋Ｗ体内に導入することに
より、ＤｕＦＲの菌体内含晴が］−０〜２０倍増加する
こと、またトリメトプリムは、Ｊ）ＨＦＲの強力な阻害
剤であり抗細菌剤として知られＣいるが、プラスミド導
入によりＤＨＦＲの含量が増加−１４３５２０，および
９Ｍ、工ｗａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ、 、Ｔ。 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ、 ９］、、 ｐｐ
、 １２０５−１２１２（：＋９ａｚ））Ｌかし、大腸
菌本来のＤＨＰＲ含量は少なく、１０〜２０倍増加した
としても、菌体内タンパク質の０．５％以下である。細
菌における遺伝子発現、すなわちタンパク質の生産は、
主にＲＮＡ合成の開始段階、すなわち転写の段階におい
て？ＪＩ ｔｆｊされている。ＲＮＡ合或は、プロモー
タと呼ばれる特別なりＮＡ配列を持つ部位から開始され
る。菌体内のタンパク質含量は、タンパク質の種類によ
って各、臀異なっているが、これは各りンバク遺伝子の
プロモータ配列が微妙に異なってＤ ＨＰ Ｒ；ｆｌｌ
壬子、タンパク質を暗号化しているＤＮＡ配列中に制限
酵素ＥｃｏＲ１’ｒ切断される配列を有する。この部位
に異種ＤＮＡを挿入丈ることによりＤＨＰＲの一部と、
異種ＤＮＡによって暗号化されるタンパク質とが結合し
たタンパクＦｊを生産することが川ｎ１；であり、＋６
４１）Ｊな方法、例えば、結合部位にメヂオニンを作る
暗号を導入することによりＦ種ＤＮｈによって暗号化さ
れるタンパク質とＤＨＰＲの一部とを、ブロモシアン分
解により分離することが可能である。もし、ＤＨＰＲ遺
伝子を含んだプラスミドを遺伝子工学的手法を用いて改
変し、ＤＩ（ＦＲを高１１に率で作るように変換できる
ならば、それは、」−３己のように他のタンパク質にも
応用できる。 このようなＩＦ 幻Ｖから、本発明者は、ＤＩｉＦＲの
含量を増大さゼるべく鋭意研究を重ねた結果、すでに本
発明者が開発しているトリメトプリム、耐性の出現を目
安としたプロモータ活性を有するＤＮＡ断片の検出方法
（特訓１ｓ７−１（１２５５幻を応用することによりす
・ガカなプロモータを導入することを考えるに至った。 プロモータｔ（料として、大腸菌の染色体ＤＮＡを制限
酵素旧−ｎｃｌ によって切断したものを用いた結果、
２００μｌ ７ｍｌの箔！１度のトリメトプリムに対し
ても耐性を（＝Ｊ−ケできるプラスミドを製造すること
ができ、またこのプラスミドを有“４る菌体は、ＤＨＦ
Ｒ含量が全タンパク質の約１０％にも達することを見い
出し、この知見に基づい”Ｃ本発明を完成するに至った
。 本発明に用いられる宿主菌は大腸菌であるが、該プラス
ミドが自立的に複製される宿主、例えば大腸菌の近縁［
■であれば応用可能である。以下は大ｎ ｉ？ｉについ
て記載している。 Ｄ ＨＰ Ｒ遺伝子を組込んだプラスミドとしては、発
明者がすでに作製したプラスミドｐＴＰ６−６（特１ｌ
ｉ５７−１０２５５３に記載）を用いた。ｐＴＰ ６−
６は、宿主にアンピシリン耐性をｆ」与するプラスミド
であり、ＤＨＦＲ辿伝子のプロモータ配列がほんの一部
欠除しでいるために、トリメトプリム耐性をイ〜」ｂで
きないプラスミドである。 プロモータＤＮＡ材料としては、大腸菌の染色体ＤＮＡ
を制限酵素Ｈ１ｎｃＪｌで９Ｊ断したものを用いた。制
限酵素ＨＪ、 ｎ Ｃ１１は、二本鎖ＤＮＡ中の５’−
ＧＴＰｙＰｕＡ（Ｊ −３’ ３’−０ＡＰｕＰ３ｒＴＧ −５’ の配列をｕＮｋしくＡ、Ｏ，Ｇ、Ｔ、Ｐｕ、およびＰ７
は、それぞれアデニン、シヂジン、ゲアニン、ヂミン、
プリン、およびピリミジン残）＾を表わしＣいる。）ち
ょうど中央の部分を切断し、平沼末端を作製する。制限
酵素ＩＩ ：ｉ ｎ ｃｌｌでＩ）Ｊ断された大腸■１
の染色体ＤＮＡは、平均約］、 ＯＯＯ塩、）、ｔ、２
．１の断片を作る。その中には、プロモータ配列が鎖国
で存在する断片が数多く存在するものと考えられる。そ
れらのうち、強力なプロモータ配列を含む断片を利用す
ることができれば、Ｄ １１ Ｆ Ｈの含量を高めるこ
とが可能である。逆に、強力なプロモータが結合した場
合、Ｄ ＨＩＰＲの含量が高まり、そのことによりトリ
メトプリム耐性が強力になるはす′である。従って、ｐ
ＴＰ６−６のＤ ＨＦ Ｒ７Ｊ伝子のプロで一部を少し
欠除さゼ、この部分に“ｒ４ＤＮＡリガ・−ゼを用い−
Ｃ１大腸閑の染ｆρ体ＤＮＡの制限酵：ＫＨ４，ｎｃｌ
切断によっ（７：）られる１１ノ１片を結合Ｖることに
よつで、ｔｌ（々の断片が挿入された種々のプラスミド
をイ１三刺し、これを宿主１１′１である大腸菌に）ノ
゛メ入し、昌濃度のトリメトプリムをａまセた培」１（
ルで培養し、生長できるものを＋Ｒ’４び、これからプ
ラスミドを得ることができる。目的のプラスミドを（Ｔ
する菌体におい°Ｃは、ＤＨＦＲが１’６ｆ Ｉｋタン
パクのｆｉ：’、３ ｚ ｏ％４・５度存在４−る。本
発明者らのこれ士での知見では、単にＤ ＩＩ Ｆ Ｒ
’、ｅｉ伝子をａむ多コピープラスミドを有する菌体は
、約２（−）μダ、５／ηＩｌ （／−１θ度のトリメ
トプリムを含む培地においては生育が困４−１Ｆであっ
たが、目的のプラスミドを有４−る１１′１体は、２０
０ ／Ｉ ｆ ／ｎｒｌのｌ！ｔＪ度のトリメトプリム
＼を含む培地中でも生育が可能である。さらに、この１
？１体を音波破砕した液より２段階の精製、すなわち６
・１ｃ安分画、及びＤＥＡＪＩ、−セフアゾエクスカラ
ムクロマトグラフィーをＨＪ’うことにより高い収出で
Ｄ ＨＦ Ｈの精製を行うこ七ができ、均一 なタンパ
ク標品を得ることができる。 次に実１寵例によって本発明をさらＧこＨＹ才１１１Ｇ
こＬｉＱ ｔｕＪする。なツ、５、実ｆｉｉｉ例に士５
りるｉｎ イイ
／ｍｌの濃度のトリメトプリムに耐性を獲７１）する
ことができるプラスミドに関するものであり、該プラス
ミドの製造方法及び該プラスミドを含む宿主菌からのジ
ヒドロ葉酸還元ｒ（ｙ素の簡便精製法に関しても言及し
ている。 近年、分子生物学及び遺伝子工学の発展を背景に組替え
ＤＮＡ手法を用いて有用な物質を生み出す方法が脚光を
浴びつつある。 本発明者らは、すでに犬１ｔ！！＋ ｒ’Ｍｉのジヒド
ロ葉酸費元酵累（以下ＤＨＰＲと略す。）を多コピープ
ラスミドに組み込み、これを＋Ｗ体内に導入することに
より、ＤｕＦＲの菌体内含晴が］−０〜２０倍増加する
こと、またトリメトプリムは、Ｊ）ＨＦＲの強力な阻害
剤であり抗細菌剤として知られＣいるが、プラスミド導
入によりＤＨＦＲの含量が増加−１４３５２０，および
９Ｍ、工ｗａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ、 、Ｔ。 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ、 ９］、、 ｐｐ
、 １２０５−１２１２（：＋９ａｚ））Ｌかし、大腸
菌本来のＤＨＰＲ含量は少なく、１０〜２０倍増加した
としても、菌体内タンパク質の０．５％以下である。細
菌における遺伝子発現、すなわちタンパク質の生産は、
主にＲＮＡ合成の開始段階、すなわち転写の段階におい
て？ＪＩ ｔｆｊされている。ＲＮＡ合或は、プロモー
タと呼ばれる特別なりＮＡ配列を持つ部位から開始され
る。菌体内のタンパク質含量は、タンパク質の種類によ
って各、臀異なっているが、これは各りンバク遺伝子の
プロモータ配列が微妙に異なってＤ ＨＰ Ｒ；ｆｌｌ
壬子、タンパク質を暗号化しているＤＮＡ配列中に制限
酵素ＥｃｏＲ１’ｒ切断される配列を有する。この部位
に異種ＤＮＡを挿入丈ることによりＤＨＰＲの一部と、
異種ＤＮＡによって暗号化されるタンパク質とが結合し
たタンパクＦｊを生産することが川ｎ１；であり、＋６
４１）Ｊな方法、例えば、結合部位にメヂオニンを作る
暗号を導入することによりＦ種ＤＮｈによって暗号化さ
れるタンパク質とＤＨＰＲの一部とを、ブロモシアン分
解により分離することが可能である。もし、ＤＨＰＲ遺
伝子を含んだプラスミドを遺伝子工学的手法を用いて改
変し、ＤＩ（ＦＲを高１１に率で作るように変換できる
ならば、それは、」−３己のように他のタンパク質にも
応用できる。 このようなＩＦ 幻Ｖから、本発明者は、ＤＩｉＦＲの
含量を増大さゼるべく鋭意研究を重ねた結果、すでに本
発明者が開発しているトリメトプリム、耐性の出現を目
安としたプロモータ活性を有するＤＮＡ断片の検出方法
（特訓１ｓ７−１（１２５５幻を応用することによりす
・ガカなプロモータを導入することを考えるに至った。 プロモータｔ（料として、大腸菌の染色体ＤＮＡを制限
酵素旧−ｎｃｌ によって切断したものを用いた結果、
２００μｌ ７ｍｌの箔！１度のトリメトプリムに対し
ても耐性を（＝Ｊ−ケできるプラスミドを製造すること
ができ、またこのプラスミドを有“４る菌体は、ＤＨＦ
Ｒ含量が全タンパク質の約１０％にも達することを見い
出し、この知見に基づい”Ｃ本発明を完成するに至った
。 本発明に用いられる宿主菌は大腸菌であるが、該プラス
ミドが自立的に複製される宿主、例えば大腸菌の近縁［
■であれば応用可能である。以下は大ｎ ｉ？ｉについ
て記載している。 Ｄ ＨＰ Ｒ遺伝子を組込んだプラスミドとしては、発
明者がすでに作製したプラスミドｐＴＰ６−６（特１ｌ
ｉ５７−１０２５５３に記載）を用いた。ｐＴＰ ６−
６は、宿主にアンピシリン耐性をｆ」与するプラスミド
であり、ＤＨＦＲ辿伝子のプロモータ配列がほんの一部
欠除しでいるために、トリメトプリム耐性をイ〜」ｂで
きないプラスミドである。 プロモータＤＮＡ材料としては、大腸菌の染色体ＤＮＡ
を制限酵素Ｈ１ｎｃＪｌで９Ｊ断したものを用いた。制
限酵素ＨＪ、 ｎ Ｃ１１は、二本鎖ＤＮＡ中の５’−
ＧＴＰｙＰｕＡ（Ｊ −３’ ３’−０ＡＰｕＰ３ｒＴＧ −５’ の配列をｕＮｋしくＡ、Ｏ，Ｇ、Ｔ、Ｐｕ、およびＰ７
は、それぞれアデニン、シヂジン、ゲアニン、ヂミン、
プリン、およびピリミジン残）＾を表わしＣいる。）ち
ょうど中央の部分を切断し、平沼末端を作製する。制限
酵素ＩＩ ：ｉ ｎ ｃｌｌでＩ）Ｊ断された大腸■１
の染色体ＤＮＡは、平均約］、 ＯＯＯ塩、）、ｔ、２
．１の断片を作る。その中には、プロモータ配列が鎖国
で存在する断片が数多く存在するものと考えられる。そ
れらのうち、強力なプロモータ配列を含む断片を利用す
ることができれば、Ｄ １１ Ｆ Ｈの含量を高めるこ
とが可能である。逆に、強力なプロモータが結合した場
合、Ｄ ＨＩＰＲの含量が高まり、そのことによりトリ
メトプリム耐性が強力になるはす′である。従って、ｐ
ＴＰ６−６のＤ ＨＦ Ｒ７Ｊ伝子のプロで一部を少し
欠除さゼ、この部分に“ｒ４ＤＮＡリガ・−ゼを用い−
Ｃ１大腸閑の染ｆρ体ＤＮＡの制限酵：ＫＨ４，ｎｃｌ
切断によっ（７：）られる１１ノ１片を結合Ｖることに
よつで、ｔｌ（々の断片が挿入された種々のプラスミド
をイ１三刺し、これを宿主１１′１である大腸菌に）ノ
゛メ入し、昌濃度のトリメトプリムをａまセた培」１（
ルで培養し、生長できるものを＋Ｒ’４び、これからプ
ラスミドを得ることができる。目的のプラスミドを（Ｔ
する菌体におい°Ｃは、ＤＨＦＲが１’６ｆ Ｉｋタン
パクのｆｉ：’、３ ｚ ｏ％４・５度存在４−る。本
発明者らのこれ士での知見では、単にＤ ＩＩ Ｆ Ｒ
’、ｅｉ伝子をａむ多コピープラスミドを有する菌体は
、約２（−）μダ、５／ηＩｌ （／−１θ度のトリメ
トプリムを含む培地においては生育が困４−１Ｆであっ
たが、目的のプラスミドを有４−る１１′１体は、２０
０ ／Ｉ ｆ ／ｎｒｌのｌ！ｔＪ度のトリメトプリム
＼を含む培地中でも生育が可能である。さらに、この１
？１体を音波破砕した液より２段階の精製、すなわち６
・１ｃ安分画、及びＤＥＡＪＩ、−セフアゾエクスカラ
ムクロマトグラフィーをＨＪ’うことにより高い収出で
Ｄ ＨＦ Ｈの精製を行うこ七ができ、均一 なタンパ
ク標品を得ることができる。 次に実１寵例によって本発明をさらＧこＨＹ才１１１Ｇ
こＬｉＱ ｔｕＪする。なツ、５、実ｆｉｉｉ例に士５
りるｉｎ イイ
【力・らのプラスミドの分１；ｉｌｌは
、Ｔａ、ｎａｋａ及びＷＯ２，ｏ １） ］−ｕｎの方
法〔・ｒ。 Ｔａｎａｋａ、、 Ｅ、 ＷｅＪｎｂｌ、ｕ＋ｎ ｉ
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｌ、ｏ：Ｌｎｇｙ、 １２１゜３５
４ （１９’７５））に、ＤＮＡσ）？１イ主へσ）４
叉りｉΔみＧま、陽画の染色体ＤＩＪＡの分離２７４
ｉｔ’すＯ」、５ａＪｔＯ及びＭｉｕｒａの方法（Ｈ，
５ａｊｔｎ、に、ＭｉｕｒａｉＩＮｏｃｈｉｍ。 ＢｉｏｐｈｙＦＩ、 ＡＯｔａ、 ’７２．６１９ （
１９６３）） Ｉこ？吊った。 実施例１ プラスミドｐＴＰ６−６と大１’％ Ｖ′ｊ染イρイド
］）ＮＡを１１４イタト＋） メトブリノ、に対する耐
’Ｍ：ｈ’ ｊｉ’ｌ ｉｎｎ ｔツタプラスミドｐＴ
Ｐ ６−］ ｏの作１λｉｌｌ。。 プラスミドＴＩＴ２６−６は、宿主＆、−アン１＜９１
１２番こ力【する耐性を（−、ｔ ’ｊするプラスミド
−であり、１でに発明昔らが開発したものである。（特
ｇｒｉ５ｔ−４゜２５５３に記載）約５μノのｐＴＰ６
−６をａｏｏ／＋７？σ〕反応液（６ｍＭ ＭｇＯい（
１，２ｍＭエチレンジアミンテトラ酢「俊（以Ｆ ％
：ＩＩＩ Ｄ Ｔ Ａと略す）、及び］、５５０ｍＭＮ
ａ１ｌを含む８ｍＭ Ｔｒｉｎ−ＨＯＩ ｐ＄ｊ液（１
７，６） ）巾で、］０ユニットの制限酵素Ｓａ１．ｉ
で３７”Ｃ２２時間消化した後、８ｐｌのＩ Ｍ Ｔｚ
ｌ−ｓ−ＨＧＩ緩術液雨滴Ｈ８，０） 、 ４ｔｔｌ
のＩ Ｍ ＭｇＯ］、 、 ５ｐｌのＩ Ｍ ＯａＯ
］４゜８μｌの５ Ｍ ＮａＣＪ］−及び］μｌの０．
２５ＭＥＤＴＡを加え、２５℃に保ち、２ユニツトのエ
キソヌクレアーゼＢＡＬ３］を２０秒作用させた。エキ
ソヌクレアーゼの反応は、４００μｌの水飽和フエ／−
ルを加えることにより停止させ、３０００回転／回転速
心分譲により水層とフエ／−ル層とに分け、水層を取り
、これを５０ｍＭのＮ ＆ Ｏ］、を含む５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−１１０１緩衝液（ｐＨ７，ａ）に透析した。透析
済ＤＮＡ液をＡ液と名付けた。 次に、大腸菌の染色体ＤＮＡ約２μｆを】、ｏｏｎｌの
反応液（： ７ｍＭ Ｍｇ０３ｔ、１ｍＭジチオトレイ
トール（以下、ＤＤＴと略す） 、６０ｍＭ Ｍａｉｌ
を含むＴｒｌ、５−１１０〕−緩衝液（ｐＨ７，４）
）中で、５ユニツトの制限酵１Ｈ１ｎｃｌと３７℃、２
時間反応させる。これに、］００μｌの水飽和フェノー
ルを加え、酵素反応を停止さぜ、３０００回転／回転速
心分離により水層とフェノール層とに分け、水Ｅ’ｔを
取り、これを５０ｍＭＮａ１ｌを含むＴｒｌ、５−Ｊ（
Ｏ］、４１ Ｉｉ７液（ｐＨ７，４）に透析した。透析
済ＤＩＩＡ液をＢ液と名付けた。 Ａ液を１００μ！、 Ｂ液を１０ｏＡｌ取り両者を混ぜ
、これに２０ｔｒｌ：の３ Ｍ ＯＨ３００ＯＮａを加
え、さらに、６００Ａｌ！のエタノールを加え、−２０
℃で一晩放置することによりＤＮＡを沈殿させた。：１
．２０００回転７／分の遠心分離により、沈殿を集め、
減圧「にエタノールを除いた後、２０μｌのリガーゼ用
反応液（５ｍＭ ’ｇＯ１＊＋ ｌｏｍＭＤＴＴ、０．
５ｍＭ ＡＴＰ、及び５０ｍＭＮａ１ｌ を含む５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｎ−１ｕｌ］、緩衝液（ｐｌ？７．４） ）
に充分溶かした。これに、５ユニツトのＴ ４ ＤＮＡ
リガーゼを加え、４′ｃで１８時間反応させ、ＤＮＡを
連結さけ一１混成プラスミドを作製した。この反応生成
物をＮｏｒｇａｒｎらの方法に従って、Ｅｓｃｈｅｒｌ
−ｃｈｉ、ａｃｏｌｉ Ｋ１２０６００株に取り込ませ
た。この処理をした菌体を２０ ｓ ７１７ｐｌ−アン
ピシリンナトリウム及び２０’Ｏ＃ＩＦ／ｍｔ）リメト
ブリムを含む栄養寒天培地上にまき、生長する菌体を１
制得た。この菌体がらプラスミドを分離し、再びＥｎ
ｃｈｅ ｒ Ｉ Ｃｈ １− ａ Ｃ（ｌ ］−１に１
２ （７６００株に導入したところ、約１０′８／／１
ｌｆＩＤＮＡの頻度で、２００μｆ／ｎｉの濃度のトリ
メトブリｊ＼に対して耐性を示す菌体が得られた。この
プラスミドをｐＴＰ６−’ＬＯと名付けた。ｐＴＰ６−
４０の大きさは、約４３００塩基対の大きさであり、制
限酵素ＷｃｏＲ１，ｐＦＩｔｌ、 Ｐｖｕｉ、 Ｐｖｕ
、ｌにより各々１ケアＷｉ切断されたが、制限酵９Ｅ、
ＢａｍＨ■、 Ｈ４ｎｄｌ、 Ｓａｔ■によってはり
り断されなかった。第１図番こｐＴＰ６−１０の制限酵
素による切断地図を示す。 実施例２ ｐＴＰ６−１．０を保有する大腸菌かへのＤ Ｉ（Ｆ
Ｒの単阿及び粕９４゜ 実施例１において得られた菌体を、２０１Ｉｇ／″ｒｎ
ｌのアンピシリンナトリウムを含む３ｅの栄養培地３７
″にで一晩培養し、１ｆ１１０ ｙの菌体を得た。５０
ｍＭ Ｔｒｉ、ａ−ＨＯＩ緩彷液（ｐＨ７，４）で洗浄
した後、４０ｒｎｌの同絹ｉｉ石液に懸濁した。菌体を
１ｏ分間音波破砕することにより、細胞を壊した。この
液を２００００回転／分で３０分遠心分宮１ｒすること
により、−１−ｉｊ′Ｉと沈殿とを分ｎ［Ｆシ、上清を
約５０ｍ１（ｊ７だ。この上清について、総タンパクｈ
１と総ＤＨＰＲ活性を測定したところ、５２４．７ｍ９
のタンパク及び１，９９６．５ユニツトの１） ＨＦ
ｎ活性が含まれＣおり、この−に清の比活性ＩＪ、３．
８ユニツト／ ｍｔｉタンパクと４算された。このγｒ
波破砕上清５０イに、６０％飽和となるように固体１’
ＡＩ安（１ｇ、５ｊ’）を加え、４ ’Ｃで約３０分攪
拌した後、２００００回転／分で、５０分間遠心分部す
ることにより、」二清と沈殿とを分離し、−４−清を約
６０ｒｎ／得た。これを５０ｍＭ ＫＯＩを含む１０ｍ
Ｍ リン酸カリウム１ＨＲｉ液（ｐｌ（７，０）に充
分透析した。ｊ秀析されたタンパク溶液を、５０ｍＭＫ
Ｏ１１含む１．Ｏｍλ（リン酸カリウム緩種Ｓ液（１１
）Ｈ’７． （１）であらかじめ平衡化したＤ Ｋ Ａ
Ｅ−３ｅｐｈａ＋ｌ＋ｘ Ａ５０カラム（（ｆ＋ ５
ｃｍ Ｘ ５０ｍ）に吸着させ、同紡術液で充分洗った
後、５０ｍＭから０．５ＭのｉＮ（線膿度勾配を作った
ＫＯＩでタンパク質を溶出させ、５記ずつフラクション
をｙ（１め、各々について、ＤＨＦＪＩ活性及び２８０
ｎｍの吸収を１１′ｌ１１定した。ＤＨＦＲ活性を２Ｅ
ＩＯｎｍの吸収度で割った値を各フラクションごとに求
め、糸′１５０となるフラクシＦ７ご６−４べでイ、［
−めメー（庁Ｉｆ約４０記）。この１１５、について左
、１；ヒソンバク（Ｉ（と総１）ＩＩ Ｆ Ｒ活ｔ′Ｉ
−をＮ！’Ｉ ７．ｉ：しスーところ、１’７．８ｍ９
のタンパク質及び７２６ユニツトの１） 、ＨＦ Ｒ活
１１−が６士第１でおり、この標品のル活ｔ’ｉ： Ｉ
ｉ ４０゜７ユニツト／ ｍ９タンパクと計算された。 この標品＋ｙ９ｏ％飽和となるように固体硫安を加えで
、４′ｃで２０分間ｔ）１４拌し、クンノぐりを沈殿さ
せ、２００００回転／分で３０分間遠心分子（１９する
ことにより沈殿を５７・め、沈殿を５０ｍＭ ｘｏｌを
含むＩｏｎλ１リン酸カリウムξ少征１液（ｐＨ“７．
０）、約１ ｍｌ、に溶かした。このクンバク溶液をＳ
Ｄ Ｓ −ポリアクリルアミドゲル電気流動により分
析したところ、６′Ｉ−′Ｔ−琶約２万のｋころにのめ
タンパク質［のバンドが一本現われただけで他にはタン
パクｆｌ（のバンドが紹められなかった。このことは、
以上のｔｙｙ作により得られたＤ Ｉｉ Ｆ ＲＧＪ
、均なタンパク標品であることを示している。また、均
一なタンパク標品の比活性４；ｉ、４０．７ユニツト／
ｍｑタンパクであり、１４波破砕」二ｈ１Ｊの比活性
が３．８ユニット／ｌ？Ｉｇタンパクであることがら、
ｐＴＰ６−１０を保有する菌体においては、ＤＢＰＲが
全可溶性タンパク質のうち約９．３％も生産されでいた
ことが示された。
、Ｔａ、ｎａｋａ及びＷＯ２，ｏ １） ］−ｕｎの方
法〔・ｒ。 Ｔａｎａｋａ、、 Ｅ、 ＷｅＪｎｂｌ、ｕ＋ｎ ｉ
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｌ、ｏ：Ｌｎｇｙ、 １２１゜３５
４ （１９’７５））に、ＤＮＡσ）？１イ主へσ）４
叉りｉΔみＧま、陽画の染色体ＤＩＪＡの分離２７４
ｉｔ’すＯ」、５ａＪｔＯ及びＭｉｕｒａの方法（Ｈ，
５ａｊｔｎ、に、ＭｉｕｒａｉＩＮｏｃｈｉｍ。 ＢｉｏｐｈｙＦＩ、 ＡＯｔａ、 ’７２．６１９ （
１９６３）） Ｉこ？吊った。 実施例１ プラスミドｐＴＰ６−６と大１’％ Ｖ′ｊ染イρイド
］）ＮＡを１１４イタト＋） メトブリノ、に対する耐
’Ｍ：ｈ’ ｊｉ’ｌ ｉｎｎ ｔツタプラスミドｐＴ
Ｐ ６−］ ｏの作１λｉｌｌ。。 プラスミドＴＩＴ２６−６は、宿主＆、−アン１＜９１
１２番こ力【する耐性を（−、ｔ ’ｊするプラスミド
−であり、１でに発明昔らが開発したものである。（特
ｇｒｉ５ｔ−４゜２５５３に記載）約５μノのｐＴＰ６
−６をａｏｏ／＋７？σ〕反応液（６ｍＭ ＭｇＯい（
１，２ｍＭエチレンジアミンテトラ酢「俊（以Ｆ ％
：ＩＩＩ Ｄ Ｔ Ａと略す）、及び］、５５０ｍＭＮ
ａ１ｌを含む８ｍＭ Ｔｒｉｎ−ＨＯＩ ｐ＄ｊ液（１
７，６） ）巾で、］０ユニットの制限酵素Ｓａ１．ｉ
で３７”Ｃ２２時間消化した後、８ｐｌのＩ Ｍ Ｔｚ
ｌ−ｓ−ＨＧＩ緩術液雨滴Ｈ８，０） 、 ４ｔｔｌ
のＩ Ｍ ＭｇＯ］、 、 ５ｐｌのＩ Ｍ ＯａＯ
］４゜８μｌの５ Ｍ ＮａＣＪ］−及び］μｌの０．
２５ＭＥＤＴＡを加え、２５℃に保ち、２ユニツトのエ
キソヌクレアーゼＢＡＬ３］を２０秒作用させた。エキ
ソヌクレアーゼの反応は、４００μｌの水飽和フエ／−
ルを加えることにより停止させ、３０００回転／回転速
心分譲により水層とフエ／−ル層とに分け、水層を取り
、これを５０ｍＭのＮ ＆ Ｏ］、を含む５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−１１０１緩衝液（ｐＨ７，ａ）に透析した。透析
済ＤＮＡ液をＡ液と名付けた。 次に、大腸菌の染色体ＤＮＡ約２μｆを】、ｏｏｎｌの
反応液（： ７ｍＭ Ｍｇ０３ｔ、１ｍＭジチオトレイ
トール（以下、ＤＤＴと略す） 、６０ｍＭ Ｍａｉｌ
を含むＴｒｌ、５−１１０〕−緩衝液（ｐＨ７，４）
）中で、５ユニツトの制限酵１Ｈ１ｎｃｌと３７℃、２
時間反応させる。これに、］００μｌの水飽和フェノー
ルを加え、酵素反応を停止さぜ、３０００回転／回転速
心分離により水層とフェノール層とに分け、水Ｅ’ｔを
取り、これを５０ｍＭＮａ１ｌを含むＴｒｌ、５−Ｊ（
Ｏ］、４１ Ｉｉ７液（ｐＨ７，４）に透析した。透析
済ＤＩＩＡ液をＢ液と名付けた。 Ａ液を１００μ！、 Ｂ液を１０ｏＡｌ取り両者を混ぜ
、これに２０ｔｒｌ：の３ Ｍ ＯＨ３００ＯＮａを加
え、さらに、６００Ａｌ！のエタノールを加え、−２０
℃で一晩放置することによりＤＮＡを沈殿させた。：１
．２０００回転７／分の遠心分離により、沈殿を集め、
減圧「にエタノールを除いた後、２０μｌのリガーゼ用
反応液（５ｍＭ ’ｇＯ１＊＋ ｌｏｍＭＤＴＴ、０．
５ｍＭ ＡＴＰ、及び５０ｍＭＮａ１ｌ を含む５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｎ−１ｕｌ］、緩衝液（ｐｌ？７．４） ）
に充分溶かした。これに、５ユニツトのＴ ４ ＤＮＡ
リガーゼを加え、４′ｃで１８時間反応させ、ＤＮＡを
連結さけ一１混成プラスミドを作製した。この反応生成
物をＮｏｒｇａｒｎらの方法に従って、Ｅｓｃｈｅｒｌ
−ｃｈｉ、ａｃｏｌｉ Ｋ１２０６００株に取り込ませ
た。この処理をした菌体を２０ ｓ ７１７ｐｌ−アン
ピシリンナトリウム及び２０’Ｏ＃ＩＦ／ｍｔ）リメト
ブリムを含む栄養寒天培地上にまき、生長する菌体を１
制得た。この菌体がらプラスミドを分離し、再びＥｎ
ｃｈｅ ｒ Ｉ Ｃｈ １− ａ Ｃ（ｌ ］−１に１
２ （７６００株に導入したところ、約１０′８／／１
ｌｆＩＤＮＡの頻度で、２００μｆ／ｎｉの濃度のトリ
メトブリｊ＼に対して耐性を示す菌体が得られた。この
プラスミドをｐＴＰ６−’ＬＯと名付けた。ｐＴＰ６−
４０の大きさは、約４３００塩基対の大きさであり、制
限酵素ＷｃｏＲ１，ｐＦＩｔｌ、 Ｐｖｕｉ、 Ｐｖｕ
、ｌにより各々１ケアＷｉ切断されたが、制限酵９Ｅ、
ＢａｍＨ■、 Ｈ４ｎｄｌ、 Ｓａｔ■によってはり
り断されなかった。第１図番こｐＴＰ６−１０の制限酵
素による切断地図を示す。 実施例２ ｐＴＰ６−１．０を保有する大腸菌かへのＤ Ｉ（Ｆ
Ｒの単阿及び粕９４゜ 実施例１において得られた菌体を、２０１Ｉｇ／″ｒｎ
ｌのアンピシリンナトリウムを含む３ｅの栄養培地３７
″にで一晩培養し、１ｆ１１０ ｙの菌体を得た。５０
ｍＭ Ｔｒｉ、ａ−ＨＯＩ緩彷液（ｐＨ７，４）で洗浄
した後、４０ｒｎｌの同絹ｉｉ石液に懸濁した。菌体を
１ｏ分間音波破砕することにより、細胞を壊した。この
液を２００００回転／分で３０分遠心分宮１ｒすること
により、−１−ｉｊ′Ｉと沈殿とを分ｎ［Ｆシ、上清を
約５０ｍ１（ｊ７だ。この上清について、総タンパクｈ
１と総ＤＨＰＲ活性を測定したところ、５２４．７ｍ９
のタンパク及び１，９９６．５ユニツトの１） ＨＦ
ｎ活性が含まれＣおり、この−に清の比活性ＩＪ、３．
８ユニツト／ ｍｔｉタンパクと４算された。このγｒ
波破砕上清５０イに、６０％飽和となるように固体１’
ＡＩ安（１ｇ、５ｊ’）を加え、４ ’Ｃで約３０分攪
拌した後、２００００回転／分で、５０分間遠心分部す
ることにより、」二清と沈殿とを分離し、−４−清を約
６０ｒｎ／得た。これを５０ｍＭ ＫＯＩを含む１０ｍ
Ｍ リン酸カリウム１ＨＲｉ液（ｐｌ（７，０）に充
分透析した。ｊ秀析されたタンパク溶液を、５０ｍＭＫ
Ｏ１１含む１．Ｏｍλ（リン酸カリウム緩種Ｓ液（１１
）Ｈ’７． （１）であらかじめ平衡化したＤ Ｋ Ａ
Ｅ−３ｅｐｈａ＋ｌ＋ｘ Ａ５０カラム（（ｆ＋ ５
ｃｍ Ｘ ５０ｍ）に吸着させ、同紡術液で充分洗った
後、５０ｍＭから０．５ＭのｉＮ（線膿度勾配を作った
ＫＯＩでタンパク質を溶出させ、５記ずつフラクション
をｙ（１め、各々について、ＤＨＦＪＩ活性及び２８０
ｎｍの吸収を１１′ｌ１１定した。ＤＨＦＲ活性を２Ｅ
ＩＯｎｍの吸収度で割った値を各フラクションごとに求
め、糸′１５０となるフラクシＦ７ご６−４べでイ、［
−めメー（庁Ｉｆ約４０記）。この１１５、について左
、１；ヒソンバク（Ｉ（と総１）ＩＩ Ｆ Ｒ活ｔ′Ｉ
−をＮ！’Ｉ ７．ｉ：しスーところ、１’７．８ｍ９
のタンパク質及び７２６ユニツトの１） 、ＨＦ Ｒ活
１１−が６士第１でおり、この標品のル活ｔ’ｉ： Ｉ
ｉ ４０゜７ユニツト／ ｍ９タンパクと計算された。 この標品＋ｙ９ｏ％飽和となるように固体硫安を加えで
、４′ｃで２０分間ｔ）１４拌し、クンノぐりを沈殿さ
せ、２００００回転／分で３０分間遠心分子（１９する
ことにより沈殿を５７・め、沈殿を５０ｍＭ ｘｏｌを
含むＩｏｎλ１リン酸カリウムξ少征１液（ｐＨ“７．
０）、約１ ｍｌ、に溶かした。このクンバク溶液をＳ
Ｄ Ｓ −ポリアクリルアミドゲル電気流動により分
析したところ、６′Ｉ−′Ｔ−琶約２万のｋころにのめ
タンパク質［のバンドが一本現われただけで他にはタン
パクｆｌ（のバンドが紹められなかった。このことは、
以上のｔｙｙ作により得られたＤ Ｉｉ Ｆ ＲＧＪ
、均なタンパク標品であることを示している。また、均
一なタンパク標品の比活性４；ｉ、４０．７ユニツト／
ｍｑタンパクであり、１４波破砕」二ｈ１Ｊの比活性
が３．８ユニット／ｌ？Ｉｇタンパクであることがら、
ｐＴＰ６−１０を保有する菌体においては、ＤＢＰＲが
全可溶性タンパク質のうち約９．３％も生産されでいた
ことが示された。
第１図は、ｐＴＰ６−１０の制限酵素による切断地図で
あり、図中符号は制限酵素を表わし、ＥはＢｃｏＲ■、
Ｐはｐｓｔｉ、ｐｌはＰｖｕｌ、Ｐ２はＰｖｌｌを示す
。また、数学の＋４を位はキロ塩基であり、遠吠Ｄ Ｎ
Ａ １ｒｔ造を便宜上直線上で表わしているが、本来
は両端が同一＋ １ｆｌＳ位である。 第 １ １ズ
あり、図中符号は制限酵素を表わし、ＥはＢｃｏＲ■、
Ｐはｐｓｔｉ、ｐｌはＰｖｕｌ、Ｐ２はＰｖｌｌを示す
。また、数学の＋４を位はキロ塩基であり、遠吠Ｄ Ｎ
Ａ １ｒｔ造を便宜上直線上で表わしているが、本来
は両端が同一＋ １ｆｌＳ位である。 第 １ １ズ
Claims (1)
- ジヒドロ葉酸還元ｎＹ 素’＋”Ｊ伝子を含むプラスミ
ドであり、導入された宿主菌が２００μｙ ／ｍｅ以上
のｒＩ度のトリメトプリムに対して耐性を示すように７
メジヒドロ葉酸還元酵素を生産さゼることを特徴とする
改良プラスミド
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58009735A JPS59135889A (ja) | 1983-01-24 | 1983-01-24 | トリメトプリムに対する耐性が増強したプラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58009735A JPS59135889A (ja) | 1983-01-24 | 1983-01-24 | トリメトプリムに対する耐性が増強したプラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59135889A true JPS59135889A (ja) | 1984-08-04 |
| JPH036796B2 JPH036796B2 (ja) | 1991-01-30 |
Family
ID=11728565
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58009735A Granted JPS59135889A (ja) | 1983-01-24 | 1983-01-24 | トリメトプリムに対する耐性が増強したプラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59135889A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5523223A (en) * | 1992-03-13 | 1996-06-04 | Forschungszentrum Julich Gmbh | Ketoester reductase for conversion of keto acid esters to optically active hydroxy acid esters |
-
1983
- 1983-01-24 JP JP58009735A patent/JPS59135889A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5523223A (en) * | 1992-03-13 | 1996-06-04 | Forschungszentrum Julich Gmbh | Ketoester reductase for conversion of keto acid esters to optically active hydroxy acid esters |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH036796B2 (ja) | 1991-01-30 |
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