JPS6126356B2

JPS6126356B2 -

Info

Publication number: JPS6126356B2
Application number: JP6784680A
Authority: JP
Inventors: Masato Okada; Hiroko Tokunaga
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1980-05-23
Filing date: 1980-05-23
Publication date: 1986-06-20
Also published as: JPS56164786A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ノカルデイア属に属しプレトシン・
オキシダーゼ生産能を有する微生物を培養し、そ
の培養物からプトレシン・オキシダーゼを採取す
ることからなるプトレシン・オキシダーゼの製造
法に関する。プトレシンはスペルミジン，スペルミンととも
にポリアミンと総称される化合物であり、ウイル
スからヒトに至るまで総ての生物に含まれてい
る。これらのポリアミンは、増殖の著しい細胞中
では含量が高く、特に腫瘍細胞中での含量が高い
ことから、医学上で重要視されている。また癌患
者の体液例えば血液，尿等のポリアミン含量は健
康人のそれに比べて高いことが1971年ラツセル等
〔キヤンサー・リサーチ・31巻、1555〜1558
（1971）〕により示された。それ以後、癌と体液中
のポリアミンの濃度との相関性が多くの研究者に
よつて調べられ、ラツセル等の研究の妥当性が確
かめられている。〔例えば、クリニカル・ケミス
トリー、23巻、22〜27（1977）参照〕一方、体液中のポリアミンの定量は、その濃度
が低いことと塩基性度が高いことから困難を極め
ている。現在の時点で最も信頼性の高いポリアミ
ン定量法は、高速液体クロマトグラフイーを使用
する方法である。しかしながら、この方法を使つ
た場合は１検体の分析に１時間以上を要するた
め、研究レベルでの方法としての域を脱しきれな
い。〔例えばペリニ等、アナリテイカル・バイオ
ケミストリー、94巻、431〜439（1979）参照〕。
したがつて、体液中のポリアミン濃度を迅速に分
析することを目的として酵素法が注目されてい
る。酵素法によるポリアミンの定量の原理は、ポ
リアミンをポリアミン分解酵素により検出の容易
な生成物を得、その出成物を検出することより成
る。しかるに酵素法によるポリアミン定量において
ポリアミン分解酵素として何を選択するかが重要
である。ポリアミン分解酵素のうちプトレシン・
オキシダーゼは、プトレシンとスペルミジンを酸
化し、それぞれアミノアルデヒドと過酸化水素と
アンモニア，アミノアルデヒドと過酸化水素を与
える酵素である。過酸化水素の定量は容易である
ことから、プトレシン・オキシダーゼはプトレシ
ンとスペルミジンの酵素的定量用の酵素として用
いることができる。一方、プトレシン・オキシダーゼなる酵素は足
立等によりミクロコツカス・ローゼウス中に見出
されている〔アグリカルチヤラル・バイオロジカ
ル・ケミストリー、30巻、1202（1966）〕。しか
し、上記ミクロコツカス・ローゼウスから得られ
る酵素を酵素法によるポリアミン定量に適用する
場合、次に示す欠点を有することが判明した。(1)
ミクロコツカス・ローゼウスなる菌体内のプトレ
シン・オキシダーゼ量が少く、酵素の調製が煩雑
である。(2)ミクロコツカス・ローゼウスから得ら
れるプトレシン・オキシダーゼのプトレシンに対
するKm値が比較的高い（1.2×10^-4M）ため、非
常に微量のポリアミン（10^-7〜10^-5M）を定量す
る場合に酵素反応速度が遅くなり、従つて定量時
間が長くなるという欠点がある。本発明者らは上記２点の欠点、すなわちプトレ
シン・オキシダーゼの調製が煩雑であること、及
びプトレシン・オキシダーゼのプトレシンに対す
るKm値が高いことを解決するために、各種微生
物のプトレシン・オキシダーゼの検索を行なつ
た。検索方法としては、プトレシンを0.5％含有
する液体培地に微生物を培養し、生育した菌体を
集菌し水洗後超音波により細胞を破砕，遠心し、
その上清部のプトレシン・オキシダーゼ活性を測
定する方法を採つた。この検索の結果、プトレシ
ン・オキシダーゼ含有量がミクロコツカス・ロー
ゼウスに比較して高い微生物を見出し、かつま
た、この微生物の生産するプトレシン・オキシダ
ーゼのプトレシンに対するKm値がミクロコツカ
ス・ローゼウスが生産するプトレシン・オキシダ
ーゼのそれよりも小さいことを見出すことによ
り、本発明を完成した。即ち、本発明に使用する
微生物はノカルデイア属に属するプトレシン・オ
キシダーゼ生産菌で、例えばノカルデイア・エリ
スロポリス（IFO―12682）で放線菌に属する微
生物である。なおIFOとはインステイテユート・
フオー・フアーメンテイシヨン，オーサカ
（Institute for fermentation・Osaka）の略号で
ある。本発明を実施するに当つては、まず上記の微生
物をプトレシンを含有する培地下、酵素などを生
産する通常の方法で培養する。培養の形態は液体
通気培養が有利である。培地の栄養源としては、
微生物の培養に通常用いられるものが広く使用さ
れる。炭素源としては同化可能な炭化水素であれ
ば良く、例えばグルコース，糖蜜，グリセリンな
どが使用される。窒素源としては、利用可能な窒
素化合物であれば良く、例えばペプトン，酵母エ
キス，肉エキス，コーン・ステイープ・リカー，
硫安，塩安などが使用される。その他、食塩，塩
化カリウム，硫酸マグネシウム，リン酸第一カリ
ウム，リン酸第二カリウムなどの塩類が必要に応
じて使用される。また、培地中にプトレシンあるいはスペルミジ
ンを添加せしめて、培養時プトレシン・オキシダ
ーゼの生産能を上昇せしめることが好ましい。添
加するプトレシンとスペルミジンを比較した場
合、価格とプトレシン・オキシダーゼの生産能の
上昇効果の点からプトレシンの方が有利である。
プトレシンあるいはスペルミジンの添加量として
は0.05〜1.0％の範囲で、好ましくは0.1〜0.5％程
度添加される。培養温度は菌が発育しプトレシ
ン・オキシダーゼを生産する範囲内で良いが、好
ましくは25〜35℃である。培養時間は条件によつ
て多少異なるが、通常13〜30時間程度であつて、
菌の生育が定常相（stationary phase）に達した
時期に培養を終了すればプトレシン・オキシダー
ゼ生産が最高に達する。かくして得られた培養物
中においてプトレシン・オキシダーゼはその菌体
内に含有、蓄積される。この様にして得られた培養物中よりプトレシ
ン・オキシダーゼを抽出し、粗製のプトレシン・
オキシダーゼ含有液を得るためには、例示すれ
ば、まず培養物を遠心分離等の手段で固液分離
し、得られる湿菌体を必要に応じてリン酸緩衝液
やトリス―塩酸緩衝液などに懸濁せしめ、次いで
超音波破砕処理やダイノミルによる破砕処理など
の菌体処理手段を適宜選択組合せて、菌体内より
プトレシン・オキシダーゼを抽出し、粗製のプト
レシン・オキシダーゼ含有液を得る。さらにこの粗製プトレシン・オキシダーゼ含有
液を公知の蛋白質，酵素などの単離、精製手段を
使用して処理することにより精製されたプトレシ
ン・オキシダーゼを得ることが出来る。例えば粗
製プトレシン・オキシダーゼ含有液を中性条件下
でDEAE―セルロースを充填したカラムに通しプ
トレシン・オキシダーゼを吸着させ、さらに食塩
の直線濃度勾配をかけて溶出せしめる。この
DEAE―セルロースカラムから溶出されたプトレ
シン・オキシダーゼ含有液をω―アミノドデカン
―セフアーロスを充填したカラムに通しプトレシ
ン・オキシダーゼを吸着させ、0.5規定の食塩を
含む10mMのリン酸緩衝液にてカラムを洗浄し、
さらに5mMのプトレシン及び1.0規定の食塩を含
有する10mMのリン酸緩衝液をカラムに通過させ
るとプトレシン・オキシダーゼが選択的に溶出さ
れて来る。この溶出されたプトレシン・オキシダ
ーゼ含有液を硫安沈澱及び透析処理することによ
り、純粋なプトレシン・オキシダーゼを得ること
が出来る。本発明によつて得られるプトレシン・オキシダ
ーゼは以下に述べる理化学的性質を有するもので
ある。 (1) 作用１モルのプトレシンより、１モルの酸素を消費
して、１モルの１―ピロリン，１モルのアンモニ
ア，１モルの過酸化水素を生成する。すなわち、
プトレシンを酸化して１―ピロリン，アンモニ
ア，過酸化水素を生成する反応を触媒する作用を
有する。 (2) 力価の測定法 0.01％の４―アミノアンチピリン，0.005％の
２，４―ジクロロフエノール，0.004％のパーオ
キシダーを含む0.1Mトリス―塩酸緩衝液（PH
8.0）を2.0ml，10mMのプトレシン・２塩酸塩を
0.2mlよりなる反応液2.2mlを分光光度計の標準キ
ユベツトに入れ、酵素液0.05mlを添加混合し、30
℃に設定された分光光度計のセルホールダーに設
置し、514nmの吸収の時間当りの増加を測定し、
生成する過酸化水素の量を求める。酵素活性は１
分間に１μmoleの過酸化水素を生成する活性を
１単位（1unit、1u）とする。 (3) 基質特異性 0.01％の４―アミノアンチピリン，0.005％の
２，４―ジクロロフエノール，0.004％のパーオ
キシダーゼを含む0.1Mトリス―塩酸緩衝液2.0ml
および下記化合物を基質とする10mM基質溶液
0.2mlよりなる反応液2.2mlに、プトレシン・オキ
シダーゼを0.1u添加、混合して514nmの吸収の時
間当りの増加を測定した。基質相対活性（％）プトレシン 100 スペルミジン 6.3 スペルミン０オルニチン０リジン０ (4) 至適PH 各PHにおけるプトレシンの酸化速度を測定する
ことにより至適PHを求めた結果、第１図に示す通
りでありプトレシン・オキシダーゼの至適PHは
8.0〜8.5付近と認められる。尚、用いた緩衝液と
してはPH6.5，7.0，7.5，8.0の0.1Mリン酸緩衝液
（Phosphate）、PH8.0，8.5，9.0，9.5，10.0の
0.1M水酸化ナトリウム―ホウ酸緩衝液
（Borate）およびPH8.0のトリス―塩酸緩衝液
（Tris―HCl）である。 (5) 至適温度上記の力価の測定法における測定法を使つてそ
の温度条件を変えて酵素反応を行い、プトレシ
ン・オキシダーゼのプトレシンに対する酵素活性
を測定した結果、第２図に示す通りであつて、そ
の至適温度は45℃付近と認められる。 (6) PH安定性 PH5.0〜8.0としてリン酸緩衝液，PH8.0〜10.0と
して水酸化ナトリウム―ホウ酸緩衝液を用い、各
PHの緩衝液0.2mlに酵素溶液（酵素蛋白質濃度150
μｇ/ml）を0.05mlを加え、37℃，60分間インキ
ユベーシヨンし、次いで各インキユベーシヨン混
合物から0.05ml採取して、それぞれのプトレシ
ン・オキシダーゼのプトレシンに対する酵素活性
を上記の力価の測定法における測定法を使つて測
定した。その結果は第３図に示す通りであつて、
そのPH安定性は6.5〜9.5付近と認められる。 (7) 熱安定性酵素蛋白質30μｇ/mlを含有する10mMリン酸
緩衝液（PH7.2）0.25mlを各温度にて10分間維持
し、次いで各酵素溶液から0.05mlの酵素を採取
し、上記の力価の測定法と全く同じ測定法によつ
て、プトレシン・オキシダーゼのプトレシンに対
する酵素活性を測定した結果、第４図に示す通り
であつて、その熱安定性は40℃付近以下であると
認められる。 (8) 分子量（MW）酵素蛋白質1.5mg/mlを含有するプトレシン・オ
キシダーゼ溶液0.8mlをセフアアクリルＳ―200充
填カラム（2.1×90cm）に通過させてゲル濾過を
行い、その溶出位置を上記の力価の測定法と全く
同様の測定法によつてプトレシン・オキシダーゼ
のプトレシンに対する酵素活性を測定することに
より決定し、既知の分子量を有する蛋白質（カタ
ラーゼ catalase：240000，ボバイン血清のアル
ブミン albumin：68000，トリ卵のアルブミン
albumin：45000，チトクロームＣ
cytochromC：12500）の溶出位置を比較して分子
量を求めた。その結果は第５図に示す通りであつ
て、本酵素の分子量は98000付近と認められる。 (9) デイスク電気泳動上のＲ_f値 PH8.9，10％のポリアクリルアミドゲルにて本
酵素の電気泳動を行つた結果、ブロムフエノール
ブルー（BPB）の移動度を1.0としてＲ_f値は0.74
と認められた。 (10) サブユニツト構成 0.1％のラウリル硫酸ナトリウム（SDS）を含
む、10％のポリアクリルアミドゲルにて本酵素を
電気泳動し、本酵素のサブユニツトの分子量
（MW）を測定した。分子量決定の際、標準蛋白
質として大腸菌のRNAポリメラーゼβ―サブユ
ニツトRNA―Polymerase β―subunit（分子量
165000），α−サブユニツト，α―subunit（同：
39000），ボバイン血清アルブミンalbumin（同：
68000），大豆のトリプシン・インヒビター
Trypsin inhibitor（同：21500）を使用した。そ
の結果は第６図に示す通りであつて、サブユニツ
トの分子量は42000付近と認められ、本酵素は２
個のサブユニツトから構成されている。 (11) プレトシンに対するKm値上記の力価の測定法に従つて0.1Mトリス―塩
酸緩衝液（PH8.0）存在下で本酵素のプトレシン
に対するKm値を測定した結果、4.7×10^-5Mと認
められた。 (12) 反応生成物の定量１―ピロリンの定量反応液 0.1Mリン酸緩衝液 2.0ml 5mMプトレシン 0.2ml プレトシン・オキシダーゼ(u) 0.1ml 上記反応液2.3mlを30℃，120分間インキユー
ベーシヨンを行つた後、反応液に0.1％オルソ
―アミノベンズアルデヒド1.0mlを添加し、さ
らに30℃，60分間インキユーベーシヨンを行
い、435nmの吸光度の測定を行うことにより、
１―ピロリンとオルソ―アミノベンズアルデヒ
ドとの複合体を定量した結果、吸光度は0.634
と測定され1.0μmoleのプトレシンから1.0μ
moleの１―ピロリンを生成することが認めら
れた。アンモニアの定量反応液 0.1Mリン酸緩衝液 2.0ml 1.0mMプトレシン 0.2ml プトレシン・オキシダーゼ(0.5u) 0.05ml 上記反応液を30℃，120分間インキユーベー
シヨンした後、反応液10μをマイクロシリン
ジで採取して、高速液体クロマトグラフイーに
よりアンモニアを分析し、あらかじめ硫酸アン
モニウムで作成しておいた検量線と対比させた
結果89μＭと定量された。その結果、0.2μ
moleのプトレシンから0.2μmoleのアンモニア
を生成することが確認された。過酸化水素の定量４―アミノアンチピリン――２，４―ジクロ
ロフエノール――パーオキシダーゼ系による方
法で定量した。反応液 0.1Mトリス―塩酸緩衝液 2.0ml 含 0.01％４―アミノアンチピリン 0.005％２，４―ジクロロフエノール 0.004％パーオキシダーゼ 1.0mMプトレシン 0.1ml プトレシン・オキシダーゼ（1u） 0.1ml 上記反応液を30℃，60分間インキユーベーシ
ヨンした後、514nmにおける吸光度を測定する
と0.458であつた。上記反応液中において、
1.0mMプトレシン溶液0.1mlの代りに水を用い
て全く同様の操作を行つた結果、0.031という
値が得られた。その結果、過酸化水素の生成に
よる514nmの吸光度の増加は0.427であり、こ
の増加値は過酸化水素0.1μmoleに対応し、プ
トレシン１モルから過酸化水素１モルを生成す
ることが確認された。以上の通り、本発明の酵素プトレシン・オキシ
ダーゼは、プトレシンに作用して１―ピロリン，
アンモニアおよび過酸化水素を生成せしめること
より、酵素番号１，４，３，10，、プトレシン：
オキシゲン・オキシドレダクターゼ（デイアミネ
イテイング）なる酵素に分類される酵素と認めら
れるが、ミクロコツカス・ローゼウスから採取さ
れる公知の酵素とは第１表に示す通り、理化学的
性質の差異が認められる。

【表】本発明のプトレシン・オキシダーゼは酵素的臨
床診断剤、例えば組織液や尿中のポリアミンの定
量に利用され、癌の診断への利用などの種々の有
用性を有しているものである。尚、本発明のプト
レシン・オキシダーゼのプトレシンに対するKm
値は、第１表に示す通り、ミクロコツカス・ロー
ゼウスから採取されるプトレシン・オキシダーゼ
のそれに比べ約２倍小さいことから、Km値より
低濃度のプトレシンを定量する場合には本発明の
酵素を使用する方が有利である。次に実施例を挙げて本発明を具体的に述べる
が、本発明は何らこれにより限定されるものでは
ない。実施例１プトレシン0.5％，ポリペプトン0.5％，グルコ
ース0.5％，酵母エキス0.2％，食塩0.1％よりなる
倍地（PH7.0）1000mlを500ml容の坂口フラスコ５
本に200mlずつ加え、120℃，20分間滅菌処理し、
これにノカルデイア・エリスロポリス（IFO―
12682）を接種し、30℃，40時間振とう培養を行
い、得られた培養物1000mlを10000rpm，10分間
遠心分離して集菌し、その湿菌体25ｇを0.85％の
食塩水で洗浄後、10mMリン酸緩衝液（PH7.2）
200mlに懸濁せしめ、５℃以上に温度が上昇しな
いよう冷却しながら20MHz，90W，60分間超音波
処理を行い菌を破砕した。この破砕液を
15000rpm，60分間遠心分離して上清液を得た
（プトレシン・オキシダーゼの酵素活性185μ，比
活性0.066u/mg―タンパク質）。この上清液を
DEAE―セルロース（DE―52，ワツトマン社
製）を充填したカラム（22×280mm，PH7.2の
10mMリン酸緩衝液にて平衡化）に通過せしめ、
食塩濃度が0.0Mから0.6Mである直線勾配（総容
積2000ml）にて吸着された蛋白質を溶出せしめ、
その食塩濃度0.29Mによる溶出の活性画分を回収
し、次いでこの活性画分に70％飽和になる様に硫
安を加えて蛋白質を沈澱せしめる。その沈澱物を
10000rpm，30分間遠心分離して回収し、10mM
リン酸緩衝液（PH7.2）に溶解せしめ、同じ緩衝
液に対して15時間透析せしめプトレシン・オキシ
ダーゼ溶液（プトレシン・オキシダーゼの活性
170u，比活性2.59u/mg―タンパク質，回収率91.9
％）を得た。比較例１実施例１に示した中でノカルデイア・エリスロ
ポリスをミクロコツカス・ローゼウス（IFO―
3768）に代えた以外は実施例１に示したものと全
く同一の条件で操作を行うことによりプトレシ
ン・オキシダーゼを製造した。細胞破砕した上清
液中のプトレシン・オキシダーゼの活性は45uで
あり、比活性は0.043u/mg―タンパク質であり、
最終的に得られた酵素溶液はプトレシン・オキシ
ダーゼ活性40u（回収率88.9％），比活性は2.41u/
mg―タンパク質であつた。用途例本発明のプトレシン・オキシダーゼを使つてプ
トレシンおよびスペルミジンの酵素的定量を行つ
た。検出はプトレシン・オキシダーゼがプトレシ
ンあるいはスペルミジンに作用して生成する過酸
化水素を４―アミノアンチピリン――フエノール
――パーオキシダーゼ系で発色せしめることによ
り行つた。反応液 0.1Mトリス―塩酸緩衝液 1.0ml 含 0.012％４―アミノアンチピリン 0.004％フエノール 0.005％パーオキシダーゼプトレシンあるいはスペルミジン検体 0.5ml プトレシン・オキシダーゼ（0.5u） 0.1ml 上記反応液を30℃，30分間インキユベーシヨン
した後、480nmの吸光度を測定した結果、プトレ
シン検体は0.527，スペルミジン検体は0.465であ
つた。検体の代わりに水0.5mlを用いて同様の操
作を行いプランク値を求めた結果0.018であつ
た。また既知の濃度のプトレシンあるいはスペル
ミジン溶液0.5mlを検体の代わりに使い同様の操
作を行つて、これらのポリアミンの濃度：Ｃと
480nmの吸光度：OD₅₁₄との関係式を求めた結
果、次の様になつた。Ｃ＝ＯＤ_５１４／１８９４（Ｍ）従つて、プトレシン検体中のプトレシン濃度：
Ｃ_Pは次の様に算出される。Ｃ_P＝０．５２７−０．０１８／１８９４＝2.69×10^-
4M またスペルミジン検体中のスペルミジン濃度：
Ｃ_Sは次の様に算出される。Ｃ_S＝０．４６５−０．０１８／１８９４＝2.36×10^-
4M

【図面の簡単な説明】

第１図はプトレシン・オキシダーゼの至適PHを
示し、第２図はプトレシン・オキシダーゼの至適
温度を示し、第３図はプトレシン・オキシダーゼ
のPH安定性を示し、第４図はプトレシン・オキシ
ダーゼの熱安定性を示し、第５図はプトレシン・
オキシダーゼの分子量を示し、第６図はプトレシ
ン・オキシダーゼのサブユニツトの分子量を示
す。

Claims

【特許請求の範囲】

１ノカルデイア属に属しプトレシン・オキシダ
ーゼ生産能を有する微生物を培養し、その培養物
からプトレシン・オキシダーゼを採取することか
らなるプトレシン・オキシダーゼの製造法。