ES2226228T3 - Crecimiento mejorado de las bacterias del acido lactico en la leche. - Google Patents
Crecimiento mejorado de las bacterias del acido lactico en la leche.Info
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Abstract
Un medio para el crecimiento de lactobacillus que comprende una base derivada de la leche, caracterizada por como mínimo cuatro aminoácidos, ribonucleósidos y hierro se añade en una cantidad suficiente para promover el crecimiento de los lactobacillus.
Description
Crecimiento mejorado de las bacterias del ácido
láctico en la leche.
La presente invención hace referencia a un medio
nuevo adaptado para el crecimiento de lactobacillus que
comprende una base derivada de la leche complementada con, como
mínimo, cuatro aminoácidos, ribonucleósidos y hierro. En
particular, la presente invención se refiere al uso de dicho medio
nuevo para cultivar una variedad de cepas de lactobacillus
distintas, por ejemplo, L. Johnsonii, L.acidophilus, L.
Gallinarum para la preparación de productos lácteos.
Las bacterias del ácido láctico se han utilizado
desde hace tiempo para la producción de una variedad de material
alimenticio, como el yogur, queso, requesón etc.. Además de su uso
general en la industria alimenticia para objetivos de
fermentación, recientemente algunas cepas pertenecientes al género
Lactobacillus o Bifidobacteria han supuesto una gran
atención debido a las propiedades probióticas atribuidas a las
mismas. Como consecuencia de ello, existía un deseo de mejorar las
condiciones de cultivo con el fin de maximizar el rendimiento de la
biomasa microbiana.
Una carencia de bacterias de ácido láctico con
respecto a su preparación a gran escala y a su aplicabilidad puede
verse en sus distintos requisitos nutricionales. En este contexto,
cepas ya diferentes que pertenecen a un género o a una especie
específica requieren distintos medios para un crecimiento óptimo,
lo que complica y dificulta una producción estandarizada de las
biomasas microbianas. De forma que para producir una biomasa de
diferentes cepas del género Lactobacillus, tienen que
utilizarse una variedad de medios diferentes, cada uno de los
cuales, sin embargo, únicamente cumple las necesidades
nutricionales de una cepa en particular, mientras que no aporta un
crecimiento suficiente de otras cepas de Lactobacillus.
Un medio frecuentemente utilizado para cultivar
las cepas bacterianas de ácido láctico es la leche de vaca. Por un
lado, este medio aporta un entorno natural complejo y sus productos
de fermentación, por ejemplo el yogur, pueden ser utilizados
directamente como material alimenticio. Con todo, se ha demostrado
que este medio únicamente apoya el crecimiento de un número limitado
de cepas de bacterias de ácido láctico. Por ejemplo, los
lactobacillus del grupo Johnson A y B han resultado ser
incapaces de proliferar y crecer en leche, lo que hace que este
medio sea inútil para dichas cepas.
En algunos casos, el crecimiento bacteriano se
podía mejorar si las sustancias de una composición poco definida y
muy compleja, como el extracto de levadura o las peptonas de
diversos orígenes se hubieran añadido a la leche. Sin embargo, estos
componentes adicionales a menudo pueden provocar un mal sabor con
el resultado de que los cultivos que crecen en un medio
complementado de este modo quizás no se utilicen para la
fabricación industrial de productos lácteos. Además, los costes
implicados y los resultados a veces diversos en cuanto a la
repetibilidad de los recuentos bacterianos que se pueden conseguir,
los hace inapropiados para una fabricación comercial de
cepas
microbianas.
microbianas.
A la vista de todo esto, un problema de la
presente invención será conseguir un medio que apoye el crecimiento
de las cepas de lactobacillus, y que a su vez evite las
carencias de la técnica actual.
Este problema se ha resuelto mediante un medio
para el crecimiento de las cepas de lactobacillus, que
consta de una base derivada de la leche a la que se han añadido
como suplemento al menos cuatro aminoácidos, ribonucleósidos y
hierro.
De acuerdo con la configuración preferida, la
cantidad de precursores de ribonucleótidos (es decir, bases libres,
ribonucleósidos, deoxiribonucleósidos) que se añadirán al medio se
sitúa en el intervalo entre 10 y 500 mg /cada medio, preferiblemente
entre 10 y 100 mg/1 medio.
De acuerdo con otra configuración todavía más
preferida, el hierro se añade al medio en una cantidad entre 50 y
100 mg/1 leche.
Además al medio se añaden al menos cuatro
aminoácidos, que pueden ser cualquier aminoácido existente que
disponga el técnico. La cantidad de aminoácidos que se añadirán a
la base de leche se sitúa entre 10 y 200 mg/l, preferiblemente
entre 50 y 100 mg/1 leche. Incluso, según la configuración
preferida, los aminoácidos son seleccionados del grupo formado por
la cisteina, alanina, serina e isoleucina, que resulta que mejoran
las condiciones del crecimiento de los lactobacillus.
De acuerdo con otra configuración también
preferida, al medio se pueden añadir compuestos que proporcionen
una actividad reductora, como el ácido ascórbico, la vitamina E, el
tocotrienol, ubiquinol, beta-caroteno y otros
carotinoides, compuestos de rosemary (es decir, carnosol) y otros
flavonoides, y otros antioxidantes que contienen sulfuro 02que
incluyen el glutatión, los -ácidos lipóicos, la
N-acetilcisteina o los compuestos que llevan grupos
sulfidrilo, la cisteina o el ácido tioglucólico o mezclas de los
mismos. Con respecto al uso de un aminoácido, la cisteina se
prefiere como compuesto que proporciona una actividad
reductora.
La base derivada de la leche que se va a incluir
en el medio puede ser leche en todas sus variaciones, como leche
parcial o totalmente desengrasada, leche desnatada o leche UHT o
preparada a partir de leche en polvo a la que se añade agua. La
base de leche fluida puede utilizarse como tal o pueden añadirse
otros componentes bien conocidos, como por ejemplo el agua, para
diluir la leche hasta un grado deseado.
En las figuras,
Figura 1 muestra una comparación entre las curvas
RABIT obtenidas después de 24 horas de incubación para L.
Johnsonii La1 (NCC 533) en un 10% de leche desnatada y leche
UHT entera con un suplemento de un 1% de extracto de levadura y una
mezcla de cuatro ribonucleósidos, cuatro aminoácidos y sulfato
ferroso; (1)leche UHT entera + cuatro ribonucleósidos +
cuatro aminoácidos; (2) leche UHT entera + extracto de levadura;
(3) leche desnatada + extracto de levadura; (4) leche desnatada +
cuatro ribonucleósidos + cuatro aminoácidos + sulfato ferroso; (5)
leche desnatada + adenosina y guanosina + cuatro aminoácidos +
sulfato ferroso.
Figura 2 muestra el efecto de un suplemento de un
10% de leche desnatada y leche UHT entera con cuatro
ribonucleósidos, cuatro aminoácidos y sulfato ferroso en el
crecimiento de la L. Gallinarum DSM 33199^{T};
(1)10% de leche desnatada; (2)10% de leche desnatada
+ cuatro aminoácidos + cuatro ribonucleósidos + sulfato ferroso;
(3) leche UHT entera; (4) leche UHT entera + cuatro aminoácidos +
cuatro ribonucleósidos + sulfato ferroso.
Durante los extensos estudios que han llevado a
la presente invención, se ha descubierto que diversos parámetros
parecen ser responsables del crecimiento de los
lactobacillus en un medio a base de leche.
Se sabe que la leche de Cow tiene un contenido
específico de ribonucleótidos, que varia dependiendo de la estación
y del país de producción. Los derivados de la purina son una
pequeña cantidad, mientras que aproximadamente más de un 95% de los
ribonucleótidos en leche se encuentra representado por el ácido
orótico, que se utiliza como un precursor de la pirimidina por
parte de las células bacterianas. El escaso contenido en
nucleótidos de adenina y guanina en la leche afecta negativamente el
crecimiento bacteriano con el requisito de que algunas cepas puedan
crear una síntesis "de-novo" de
precursores DNA y RNA, como la L. Casei y L.
Plantarum. Sin embargo, en algunos casos incluso se han
observado efectos inhibidores al añadir derivados de purina a la
leche.
Debido a la incapacidad de algunas cepas
Lactobacillus, como la L. Johnsonii, L. Gasseri, L.
Crispatus, L. Amylovorus, L. Gallinarum y L.acidophilus,
para reproducirse a elevada densidad en leche, se ha estudiado una
combinación de diferentes sustancias químicas que hipotéticamente
eran capaces de reemplazar a las sustancias estimuladoras del
crecimiento de composición indefinida.
Para hallar la identidad de otras sustancias
supuestamente estimuladoras, se han llevado a cabo varios ensayos
con precursores de los ribonucleótidos, es decir bases libres
(adenina, guanina, citosina, timina, uracilo), ribonucleósidos
(adenosina, histidina, uridina, guanosina) y
2'-deoxiribonucleósidos (deoxiadenosina,
deoxiguanosina, deoxicitidina, deoxiuridina y timidina). Se añadían
a la leche como soluciones neutras o alcalinas concentradas en
distintas concentraciones.
Una adición de ribonucleósidos mejoraba las
condiciones de crecimiento para los lactobacillus en la
leche, donde la adenosina y la guanosina presentaban el efecto más
fuerte. Este hallazgo confirmaba la hipótesis de que el nivel bajo
de purinas en leche obviamente influye negativamente en el
crecimiento bacteriano. En general, resultaba que el contenido
elevado de ácido orótico representa un factor estimulador para el
crecimiento de los lactobacillus, que permite la síntesis de
bases de pirimidina. No se habían detectado diferencias
significativas en los valores del pH por la adición de bases libres
y deoxiribonucleósidos entre las condiciones aeróbicas y
anaeróbicas. Se observaba más de 1 log de mejora en el crecimiento
bacteriano, lo que indicaba un efecto positivo en cuanto a los
ribonucleósidos en un entorno anaeróbico.
Las grandes mejoras para aumentar el número de
lactobacillus por adición de ribonucleósidos y los niveles
máximos de acidificación, respectivamente, se conseguían añadiendo
adenosina, guanosina, y /o histidina y uridina en una cantidad
aproximada de 0,1 g/l. Aunque esta mezcla de por sí ya revelaba la
capacidad de soportar el crecimiento de la L. Johnsonii,
L.acidophilus y L. Gallinarum, a niveles comparables a los
conseguidos por la adición del extracto de levadura (ver figuras 1,
2 y tabla 3), no se observaban efectos positivos destacados con las
otras cepas de lactobacillus, de las especies L.
Amilovorus, L. Crispatus y L. Gasseri.
Al añadir las bases libres a la leche (adenina,
citosina, uracilo, timina y guanina) en sustitución de los
ribonucleósidos como suplementos, se obtenían resultados similares.
Sin embargo, en ese caso, las cepas tendía a mostrar un requisito
para el magnesio y el ácido aspártico.
Además, varios ensayos se realizaban añadiendo
leche con distintos 2'-deoxinucleósidos, lo que
implicaba un aumento del número viable de células de únicamente
algunas cepas en particular.
En lugar del hallazgo anterior de que ninguna de
las sustancias químicas mencionadas era capaz de soportar el
crecimiento bacteriano para una pluralidad de cepas bacterianas
distintas a un nivel elevado si se añadían solas a la leche,
sorprendentemente se ha descubierto que una combinación formada por
aminoácidos, ribonucleósidos y hierro (por ejemplo en forma de
sulfato de hierro) promueve realmente el crecimiento de diferentes
especies de lactobacillus. En los experimentos, en los
cuales el número de compuestos distintos en la mezcla de la
combinación anterior se reducía a un mínimo, podía verse que el
número mínimo para cada uno de los compuestos especificados a
añadir a la leche es como mínimo de dos ribonucleósidos,
preferiblemente la adenosina y guanosina, cuatro aminoácidos y el
hierro. La mezcla era capaz de mejorar el crecimiento de una
variedad de cepas lactobacillus diferentes, como las del
grupo de Johnson, con recuentos celulares y un pH final comparable
al obtenido por la adición a la leche del extracto de levadura o de
las peptonas.
Además, se ha demostrado que la adición de hierro
a una mezcla formada por el medio complementado con una combinación
de las anteriores sustancias químicas mejora incluso más los
resultados obtenidos. Este hallazgo puede explicarse de tal forma
que a pesar de su rica composición, la leche presenta una importante
deficiencia en hierro y al formar el complejo de lactoferrina
imposibilita el crecimiento de algún organismo en ella.
Por consiguiente, los mejores resultados se
obtenían mediante la adición de adenosina, guanosina y /o citidina
y uridina en una cantidad de 0,1 g/l respectivamente, alanina,
serina, isoleucina, cisteina (0,05 g/l respectivamente) y
FeSO_{4} (0,1 g/l).
El hecho de que tanto la leche desnatada como la
leche grasa entera dieran unos resultados óptimos al mezclarse con
la combinación de los compuestos mencionados, conducía al supuesto
de que los componentes grasos de la leche no intervenían en la
estimulación del crecimiento del lactobacillus, así como los
tratamientos de esterilización (UHT) no afectaban negativamente al
potencial de la leche para soportar el desarrollo bacteriano.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención sin
limitarla.
Cepas L. johnsonii ATCC 33200^{T}, Lal
(NCC 533), ATCC 11506 (anteriormente conocido como
L.acidophilus R-26), ATCC 332, DSM 20553,
L.acidophilus ATCC 4356^{T}, La10(NCC 90), L.
Gasseri DSM 20243^{T}, L. Crispatus DSM 20531^{T},
L. Amylovorus DSM 20584^{T} y L.gallinarum DSM
33199^{T} se propagaban en caldo de MRS (Difco) o agar a 37ºC. La
leche desnatada (Difco) un 10% p/v en un medio estéril y la leche
entera UHT (Parmalat, Italia) se empleaban para realizar los ensayos
de crecimiento. Los tubos de leche era inoculados un 1% de un
cultivo MRS durante la noche y se lavaban dos veces y se volvían a
suspender con la misma cantidad de agua destilada estéril para
evitar el paso del nutriente por el medio.
Tubos de leche se incubaban aeróbicamente en un
termostato (Sorvall Heraeus) a 37ºC durante 24 horas y
anaeróbicamente en un incubador anaerobio (modelo 1024, Forma
Scientific, USA) a 37ºC durante 24 horas.
Las sustancias químicas que se añadían a la leche
correspondían a soluciones concentradas preparadas según las
instrucciones del Indice de Merck. El pH final de la leche se
ajustaba a 6,8 tras el suplemento usando NaOH 4N. El pH inicial de
la solución de leche desnatada del 10% y de la leche UHT entera
grasa era de 6,8 y 6,7, respectivamente.
Los resultados del crecimiento se estimaban
mediante los recuentos celulares y se efectuaba una medición final
del pH después de 24 horas de incubación a 37ºC.
Se usaba el Análisis rápido de la Técnica de
Impedancia Bacteriana (RABIT) (Don Whitley Scientific West
Yorkshire, Reino Unido) para efectuar las pruebas con leche
desnatada y leche UHT entera durante 24 horas a 37ºC.
Los experimentos se realizaban usando las 11
cepas mencionadas de todas las seis especies del grupo Johnson A y
B, que incluían la cepa tipo de L. Johnsonit ATCC 33200 y
L. Johnsonii Lal (NCC 533) para determinar sus requisitos
nutricionales en la leche. Los resultados llevaban a la
identificación de algunas sustancias químicas capaces de reproducir
los efectos positivos de los extractos de levadura y de otras
sustancias de una composición químicamente indefinida en el
crecimiento bacteriano en la leche.
Las cepas objeto de investigación no eran capaces
de crecer ni en leche desnatada al 10% ni en leche UHT totalmente
entera. Los resultados, que se resumen en la tabla 1 para L.
Johnsonii, indican que se producía una acidificación moderada de
estos medios naturales después de un periodo de incubación de 24
horas, que daba lugar a un aumento inferior a 1 log del número
final de células viables incluso si la incubación se llevaba a cabo
en unas condiciones anaerobias. El mismo comportamiento tanto en la
leche desnatada como en la leche UHT entera se observaba para las
cepas tipo de L. Gasseri, L. Amylovorus, L. Crispatus, L.
Acidophilus y L. Galliarum.
El añadir a la leche desnatada un 1% v/v de
extracto de levadura (Adsa, Italia) daba lugar a un aumento de 2
log en el número de células viable. Este resultado se podía
confirmar usando leche UHT entera. Después de 24 horas de incubación
se obtenía un pH final de 4,0 con la adición del extracto de
levadura (tabla 1).
La concentración final del extracto de levadura
requerida para el crecimiento bacteriano óptimo variaba entre un
0,1% y un 1,0% v/v. El desarrollo de malos sabores y cambios de
color puede observarse en los productos lácteos fermentados a los
que se ha añadido esta sustancia.
Tabla
1
Valor final del pH y recuentos celulares después
de una incubación de 24 horas de L. Johnsonii La 1 (NCC
533) en leche desnatada 10% /leche UHT y después del suplemento de
un 1% de extracto de levadura. Todos los resultados eran confirmados
en las otras cepas L. Johnsonni investigadas, a excepción de
la cepa ATCC 332, que no mostraba ningún crecimiento incluso con la
adición del extracto de levadura.
Una mezcla de 19 aminoácidos (alanina, glicina,
histidina, lisina, fenilalanina, prolina, serina, treonina,
cisteina, arginina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico,
isoleucina, leucina, metionina, tirosina, triptófano y valina) se
añadía a la leche desnatada (concentración final 0,05 g/l v/v de
cada aminoácido) lo que producía un efecto positivo en el
desarrollo de los L. Johnsonii que casi era comparable a los
niveles de acidificación después de la adición del extracto de
levadura. Se medía un pH final de 4,1 después del suplemento de
aminoácidos pero el recuento celular todavía no era satisfactorio
(4x10E+08 cfu/ml)
Para determinar aquellos aminoácidos que tienen
un papel esencial para el crecimiento de L. Johnsonii en la
leche, se aplicaba la "técnica de omisión" (Reiter, B.&
Oram, J.D, J.Dairy Res, 29(1962),63-77)
mediante el cultivo de la cepa ATCC 33200^{T} en leche desnatada,
añadiendo cuatro ribonucleósidos + sulfato ferroso (control
positivo), complementado con la mezcla de 19 aminoácidos descritos
antes privados de un componente en particular en cada momento dado.
El Análisis Rápido de la Técnica de Impedancia Bacteriana
(RABIT)permitía la identificación de cuatro aminoácidos
(cisteina, alanina, serina e isoleucina) que daba unos resultados
excelentes. Los tres últimos eran estimulantes en las cepas
analizadas si se añadían de forma exógena a la leche.
El papel más fuerte, entre los aminoácidos
identificados, se atribuía a la cisteina, y se confirmaba que la
ausencia de cisteina o cistina en leche, puede afectar
negativamente al desarrollo bacteriano. El papel de los grupos SH
parece no ser totalmente sustituible por la anaerobiosis. La
ausencia de oxígeno debida a la incubación anaerobia de los
cultivos de L. Johnsonii no permitía conseguir los mismos
resultados de crecimiento obtenidos cuando la cisteina se añadía a
la leche desnatada o entera.
La medición del pH revelaba un valor de pH 4,3 en
ausencia de cisteina en unas condiciones anaerobias frente a un pH
de 3,9 obtenido en presencia de este compuesto en condiciones
aerobias. Sin embargo, la eliminación de la cisteina daba lugar a
una pérdida más significativa del número de células viable en un
entorno aeróbico que anaeróbico. Si el L. Johnsonii se
cultivaba en unas condiciones aerobias, una solución de ácido
tioglicólico (concentración final del 0,5% v/v) revelaba su
capacidad para reemplazar la cisteina, dando lugar a unos recuentos
celulares elevados superiores a 1,0x10E+09 cfu/ml.
A pesar de las acciones estimulantes debidas a
los cuatro aminoácidos citados (cisteina, alanina, serina e
isoleucina) se observaba un efecto negativo inesperado para los
otros 15 aminoácidos (por ejemplo, ver figura 3).
Tabla
2
Valor final del pH después de 24 horas de
incubación a 37ºC de L. Johnsonii Lal (NCC 533) en leche
desnatada un 10% (pH inicial de 6,8) complementada con 0,1 g/l
(v/v) de bases libres (adenina, citosina, guanina, uracilo y
timina), ribonucleósidos (adenosina, histidina, guanosina, uridina)
o bien deoxiribonucleósidos (2'-deoxiadenosina,
2'-deoxiguanosina, 2'-deoxicitidina,
2'-deoxiuridina, timidina).
| Sustancias químicas | Aerobiosis | Anaerobiosis |
| Bases libres | 5,9 | 5,8 |
| Ribonucleósidos | 6,3 | 5,6 |
| Deoxiribonucleósidos | 5,8 | 5,9 |
| Bases libres: adenina, citosina, guanina, uracilo y timina | ||
| Ribonucleósidos: adenosina, histidina, guanosina, uridina | ||
| Deoxiribonucleósidos: 2-deoxiadenosina, 2-deoxiguanosina, 2-deoxicitidina, 2-deoxiuridina, timidina |
Resultados similares se obtenían para otras
cepas, por ejemplo, por ejemplo, Lb. Johnsonii ATCC
33200^{T}
Tabla
3
Valor final del pH después de 24 horas de
incubación a 37ºC de L. Johnsonii Lal (NCC 533) y otras
cepas Lb. Johnsonii en leche desnatada un 10%, en
unas condiciones aerobias y anaerobias, y en leche UHT entera
complementada con cuatro ribonucleósidos, cuatro aminoácidos y
sulfato ferroso.
Se obtenían resultados similares para las otras
cepas.
Claims (9)
1. Un medio para el crecimiento de
lactobacillus que comprende una base derivada de la leche,
caracterizada por como mínimo cuatro aminoácidos,
ribonucleósidos y hierro se añade en una cantidad suficiente para
promover el crecimiento de los lactobacillus.
2. El medio conforme a la reivindicación 1, donde
la cantidad de ribonucleósidos se sitúa entre 1 y 500 mg/l,
preferiblemente entre 10 y 100 mg/l.
3. El medio conforme a la reivindicación 1 ó 2,
donde los ribonucleósidos son la adenosina o guanosina.
4. El medio conforme a cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que contiene hierro en una cantidad
que oscila entre 10 y unos 200 mg/l, preferiblemente entre 50 y 100
mg/l de leche.
5. El medio conforme a cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde los aminoácidos añadidos son
preferiblemente la cistina, alanina, serina e isoleucina, en una
cantidad que oscila entre 10 y unos 200 mg/l, preferiblemente entre
50 y unos 100 mg/l de leche.
6. El medio conforme a cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que contiene compuestos que aportan la
actividad reductora.
7. El medio conforme a la reivindicación 6, donde
el compuesto que proporciona la actividad reductora se selecciona
del grupo formado por la cisteina, el ácido tioglicólico, el ácido
ascórbico o las mezclas de los mismos.
8. El uso de un medio conforme a cualquiera de
las reivindicaciones anteriores para cultivar lactobacillus
que pertenece al grupo A y B de Johnson.
9. Uso de un medio conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 para la producción de productos lácteos
fermentados o no fermentados.
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|---|---|---|---|
| EP99108717A EP1048215B2 (en) | 1999-04-30 | 1999-04-30 | Enhanced growth of lactic acid bacteria in milk |
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| AT (1) | ATE272320T1 (es) |
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