CN115786190B

CN115786190B - 一株可产尿石素a抗衰老的植物乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115786190B
Application number: CN202211404309.8A
Authority: CN
Inventors: 唐鑫; 张孟炜; 毛丙永; 张秋香; 刘小鸣; 崔树茂; 赵建新; 陈卫
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-11-10
Filing date: 2022-11-10
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2042-11-10
Also published as: CN115786190A

Abstract

本发明公开了一株可产尿石素A抗衰老的植物乳杆菌及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一株植物乳杆菌CCFM1291，所述植物乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62802，保藏日期为2022年09月15日。本发明的植物乳杆菌能够将膳食中的鞣花单宁代谢产生尿石素A，通过PINK1‑Parkin通路和BNIP3受体介导通路抗衰老，该植物乳杆菌及其发酵制品和合生制剂可促进功能障碍的线粒体自噬从而发挥显著的抗衰老功效。因此，植物乳杆菌CCFM1291可用于辅助开发抗衰老的产品，从而应用于减缓衰老、延长寿命以及促进运动，具备良好的功能应用价值，具有工业化生产的潜力。

Description

一株可产尿石素A抗衰老的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株可产尿石素A抗衰老的植物乳杆菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

衰老是老龄化社会关注的热点问题之一，其对社会经济的发展产生严重的制约。通过联合国发布的《世界人口展望2022》可知，2020年世界60岁以上人口占总人口的比例达到9.7%，表明全球已进入老龄化社会，预计2045年这一比例将上升至16.4%，全球进入超级老龄化社会。

已知衰老的九大机理：基因组不稳定、表观遗传改变、端粒磨损、蛋白质稳态丧失、新陈代谢失调、线粒体功能障碍、细胞衰老、干细胞耗竭、细胞之间的通讯异常。其中，线粒体功能障碍与其他八种机理密切关联，是衰老的关键之一（公开于Journal Of ClinicalInvestigation, 2013, 123(3):951-7）。已有研究表明线粒体功能障碍可以驱动衰老表型；而衰老细胞失去功能障碍线粒体后表现出与年轻细胞相似的特征，炎症水平、氧自由基含量等细胞衰老的标志下降到年轻细胞的水平（公开于The EMBO Journal, 2016, 35.）；还有研究表明通过修复线粒体DNA来恢复线粒体功能，可逆转与衰老相关的特征，如皮肤皱纹和脱发等（公开于Cell Death Dis, 2018, 9(7):735.）。因此，重构功能障碍线粒体的功能是抵抗衰老最关键的密钥之一。

已有研究表明尿石素A（Urolithin A, Uro-A）在抗衰老、抗氧化、抗炎、抗癌、预防肥胖、调节雌激素受体等方面有着重要的功效（公开于Food Chemistry, 2012, 132(3):1465-1474.）。其中，Uro-A在抗衰老方面的研究受到了重点关注，其主要通过回收功能障碍线粒体来重建细胞，从而达到缓解衰老的作用（公开于Trends in Molecular Medicine,2021, 27(7):687-699.）。目前经过线虫、细胞、小鼠、临床等一系列试验证明了Uro-A良好的抗衰老功效以及安全性（公开于Nature Medicine, 2016, 22(8):879-888.、NatureMetabolism, 2019, 1(6):595-603.）。

鞣花单宁（Ellagitannins, ETs）主要来源于浆果、坚果等，其在胃和小肠被水解并转化形成鞣花酸（Ellagic acid，EA），然后在结肠经由定殖的肠道菌群代谢为尿石素（Urolithin, Uro）（公开于Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2022:1-23.）。但不同人体的肠道菌群具有特异性，因而产生的代谢物存在着显著的个体间差异（公开于Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(28): 6535-8.）。即大多数人没有合适的细菌/菌群来自然产生有益水平的Uro-A。因此，筛选具有产生Uro-A能力的可食用菌种并进一步实现抗衰老产品开发具有潜在的经济效益。

目前文献仅报道一株具有转化EA产生Uro-A能力的双歧杆菌属菌株：假小链双歧杆菌INIA P815（公开于Journal of Functional Foods, 2018, 45(18):95-99.）。但是假小链双歧杆菌不位于可食用菌种目录中，并且EA在自然界中主要以缩合形式——ETs存在；此外EA由于不溶于水从而限制了其在生产实践中的应用。因此，急需寻找一株能够转化膳食来源的鞣花单宁产生尿石素A的益生菌，并制成发酵制品或合生制剂。

发明内容

本发明提供一株可转化膳食中的鞣花单宁产生尿石素A的植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）CCFM1291，并制备成富含尿石素A的合生制剂。

本发明提供了一株植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）CCFM1291，所述植物乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62802，保藏日期为2022年09月15日。

将本发明筛选获得的菌株经测序分析，16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为乳杆菌属植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌CCFM1291。

所述植物乳杆菌在MRS固体培养基上的菌落凸起，呈白色、光滑、圆形状，直径约3mm。

本发明提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中，含有植物乳杆菌CCFM1291，或含有植物乳杆菌CCFM1291的发酵液，或含有植物乳杆菌CCFM1291的冻干粉，或含有植物乳杆菌CCFM1291灭活的菌体，或含有植物乳杆菌CCFM1291的裂解物，或含有植物乳杆菌CCFM1291提取物。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，植物乳杆菌CCFM1291的含量不低于2×10⁹CFU/mL或2×10¹⁰CFU/g。

本发明还提供了一种产品，所述产品中含有上述植物乳杆菌CCFM1291或上述微生物菌剂。

本发明提供了一种延长动物寿命和/或抗衰老的药品，所述药品中含有上述植物乳杆菌CCFM1291或权利要求2或3所述的微生物菌剂。

本发明还提供了上述植物乳杆菌CCFM1291，或上述微生物菌剂在制备延缓衰老的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，植物乳杆菌CCFM1291的含量不低于2×10⁹CFU/mL或2×10¹⁰CFU/g。

本发明还提供了一种尿石素A的发酵制品，所述发酵制品的制备方法为：将植物乳杆菌CCFM1291接种于含有鞣花单宁的物质的反应体系中，进行发酵制备得到的发酵制品。

在本发明的一种实施方式中，将活化后的植物乳杆菌CCFM1291种子液以2~4%（v/v）的接种量接种于所述的富含鞣花单宁的物质的反应体系中，于37℃条件下有氧、200 rpm震荡发酵48 h。

在本发明的一种实施方式中，所述富含鞣花单宁的物质包括但不局限于浆果和/或坚果。

在本发明的一种实施方式中，所述浆果包括但不限于石榴、桑椹、覆盆子、草莓。

在本发明的一种实施方式中，所述坚果包括但不限于胡桃、腰果、核桃、开心果。

在本发明的一种实施方式中，所述富含鞣花单宁的物质为石榴汁，具体的处理方法如下：

先将市售NFC石榴汁的pH调至6.8~7.2，再加入维持发酵过程中的pH并提供菌株生长所需的氮源；再通过巴氏杀菌（85℃、20 min）后，趁热立即放入4℃环境骤冷使得菌体破灭，于4℃环境下储藏备用；所述氮源为：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母粉、2 g/L 磷酸氢二钾、2 g/L柠檬酸二胺。

本发明提供了一种合生制剂，所述合生制剂中含有植物乳杆菌CCFM1291，同时含有富含鞣花单宁的物质。

在本发明的一种实施方式中，所述合生制剂为：植物乳杆菌CCFM1291菌粉与冻干石榴粉按质量比为5：2的比例均匀混合。

本发明还提供了发酵制品和/或合生制剂在制备用于延长动物寿命和/或抗衰老的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述产品应用于（a）~（c）至少一方面：

（a）减缓衰老；

（b）延长寿命；

（c）提高动物运动能力。

在本发明的一种实施方式中，所述减缓衰老是抑制衰老生物标记物随年龄增加而出现的积累，主要表现为抑制脂滴、脂褐质含量的积累以及β-半乳糖苷酶酶活的增加。

在本发明的一种实施方式中，所述延长寿命是延长机体生命期的最大长度或者延迟其死亡的时间。

在本发明的一种实施方式中，所述提高运动能力是提高机体平均时间的自发运动强度。

在本发明的一种实施方式中，所述动物为秀丽隐杆线虫。

本发明还提供了一种制备尿石素A的方法，所述方法为，采用上述植物乳杆菌CCFM1291，以含有鞣花单宁或鞣花酸的物质为底物，进行反应，制备得到反应液，从反应液中提取得到尿石素A。

在本发明的一种实施方式中，所述含有鞣花单宁的物质包含：石榴、桑葚、覆盆子、草莓、核桃、开心果、胡桃。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的条件为30~37℃，150~200 rpm，时间为24~72h。

在本发明的一种实施方式中，所述尿石素A的提取方法，所述方法为，所述取一定量的发酵液，分别加入相同体积的乙醚和乙酸乙酯进行萃取，并重复3次，汇集萃取液进行冻干，然后甲醇复溶，最后通过0.22 μm滤膜过滤，通过HPLC和LC-MS/MS进行检测。

有益效果

本发明提供了一株植物乳杆菌CCFM1291，将该菌株的有以下优势（以下数值均为四个平行实验的值所取得平均值）：

（1）此植物乳杆菌具有鞣花单宁、鞣花酸代谢能力，可转化膳食中的鞣花单宁、鞣花酸产生尿石素A。基于该菌开发的发酵制品中尿石素A的产量达32.01±0.97 μM，转化率达10.73±0.38％。

（2）本发明提的发酵制品及合生制剂还可有效抑制秀丽隐杆线虫随年龄增加而出现的脂质积累，它们干预线虫8天后可分别降低线虫23.78%和5.62%的脂滴积累水平，从而有效发挥降脂功效。

（3）本发明提供了一款富含Uro-A的发酵制品及合生制剂，它们可显著减缓秀丽隐杆线虫的衰老程度，延长寿命。它们对线虫安全无毒害副作用，证明了植物乳杆菌CCFM1291可用于辅助开发抗衰老的产品，从而应用于减缓衰老、延长寿命以及促进运动，具备良好的功能应用价值，具有工业化生产的潜力。

生物材料保藏

一株植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）CCFM1291，分类学命名为Lactiplantibacillus plantarum，已于2022年09月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62802，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。

附图说明

图1：尿石素A产生菌的菌落特征。

图2：发酵提取物HPLC和LCMS/MS图谱。

图3：发酵液中不同时间点的尿石素A积累量变化图。

图4：发酵制品及合生制剂对秀丽隐杆线虫脂滴积累的影响。

图5：发酵制品及合生制剂对秀丽隐杆线虫衰老及寿命的影响。

图6：发酵制品对秀丽隐杆线虫自噬基因表达的影响。

图7：发酵制品对秀丽隐杆线虫线粒体的影响。

图8：尿石素A促进功能障碍的线粒体自噬信号通路图。

具体实施方式

本发明所述的动物模型为秀丽隐杆线虫，秀丽隐杆线虫是探究退行性疾病发生和治疗机制的理想模型。通过秀丽隐杆线虫寿命实验发现可转化鞣花单宁产生尿石素A的菌株的发酵提取物可干预线虫衰老。

下面结合具体实施例和附图对本发明进行做出进一步的阐述。

下述实施例中涉及的石榴来源的ETs（安石榴苷）购自sigma，纯度≥98%；下述实施例中涉及的Uro-A购自sigma，纯度≥97%；此外，下述实施例中涉及的NFC石榴汁购买于无锡欧尚超市。下述实施例中所涉及的秀丽隐杆线虫为：N2野生型秀丽隐杆线虫，来自于江南大学食品生物技术中心菌种保藏中心。下述实施例中所涉及的冻干石榴粉购自：淘宝（产品品牌：Navitas Organics）。

下述实施例中所涉及的油红O染色液购自：Solarbio（货号：G1262），Trizol试剂购自：Thermo Fisher Scientific（货号：15596018），逆转录试剂盒购自：Vazyme（货号：Q711-02），β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自：Solarbio（货号：G1580），线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）购自：Solarbio（货号：M8650），ATP含量检测试剂盒购自：Solarbio（货号：BC0300）。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB固体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L、琼脂15.0 g/L，pH值调至7.0±0.2（25℃）。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L、pH值调至7.0±0.2（25℃）。

MRS固体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、乙酸钠2.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、磷酸二氢钾2.0 g/L、硫酸锰0.05 g/L、硫酸镁0.1 g/L、吐温80 1mL/L、琼脂15.0 g/L，pH值调至6.2±0.2（25℃）。

MRS液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、乙酸钠2.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、磷酸二氢钾2.0 g/L、硫酸锰0.05 g/L、硫酸镁0.1 g/L、吐温80 1mL/L，pH值调至6.2±0.2（25℃）。

石榴汁发酵液：NFC石榴汁、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母粉、2 g/L 磷酸氢二钾、2g/L柠檬酸二胺，pH值调至7.0±0.2（25℃）。

NGM培养基：蛋白胨2.5 g/L、氯化钠3.0 g/L、氯化钙0.111 g/L、硫酸镁0.12 g/L、胆固醇0.005 g/L、磷酸二氢钾3.4 g/L、琼脂17.0 g/L，pH值调至7.2±0.2（25℃）。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

Uro-A的含量的检测，采用HPLC检测Uro-A的含量，使用Q Exactive液质联用仪进一步确认产物Uro-A的存在：

HPLC检测：使用Waters 1525液相色谱仪，液相柱X Bridge RC18（250×4.6 mm, 5µm）；流动相：0.1％甲酸水（A相），甲醇（B相）；光谱扫描以确定最大吸收波长，306nm；洗脱条件：流速1.0ml/min，梯度洗脱。安石榴苷具有两种同分异构体，分别为α型和β型，且不断相互转化。α-安石榴苷出峰时间：8.5 min；β-安石榴苷出峰时间：18.1 min。Uro-A出峰时间：19.1 min（图2 a）。

LCMS检测：使用Q Exactive液质联用仪进一步确认产物Uro-A的存在，色谱柱C18，流动相：0.1％甲酸水（A相），乙腈（B相）。Uro-A，出峰时间为10.88min，分子式为C₁₃H₈O₄，实际m/z为229.04840。（图2 b）。

实施例1：Uro-A产生菌的筛选

1、筛选

从江南大学食品生物技术中心的菌库中获取源于健康人体粪便并处于可食用菌种目录的菌株，然后对这些菌株进行体外鞣花单宁发酵，发酵液经提取冻干以及复溶后，通过HPLC和LCMS/MS进行检测，从而筛选出具有转化ETs产生Uro-A能力的可食用菌株，最终筛选获得1株目标菌株。

2、鉴定

将筛选得到的Uro-A产生菌的16S rDNA进行扩增和测序（扩增得到得16S rDNA得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），将获得的序列于NCBI-Blast中进行核酸序列比对，显示菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌CCFM1291；

16S rDNA扩增所用引物如下：

27F（正向）：5’-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3’；

1492R（反向）：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

16S rDNA扩增程序如下：

94℃ 5min；共重复30个循环（94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 2 min）；72℃ 10min；12℃ 2min。

3、观察

挑取植物乳杆菌CCFM1291的单菌落接入MRS固体培养基，37℃培养48 h，观察菌株在MRS固体培养基上的菌落特征（图1）。经观察，所述植物乳杆菌在MRS固体培养基上的菌落呈白色圆润凸起状，直径3mm左右。

实施例2：植物乳杆菌CCFM1291发酵石榴汁制备尿石素A

1、植物乳杆菌CCFM1291制备尿石素A

（1）植物乳杆菌CCFM1291的活化

用接种环蘸取植物乳杆菌CCFM1291的菌液在MRS固体培养基上划线，于37℃倒置培养48 h；取单菌落至MRS液体培养基中，在37℃条件下有氧培养18 h，混匀后取菌液按2%（v/v）的接种量接种至新的MRS液体培养基中培养，如此操作连续活化3次，最终得到活化的菌液。

（2）石榴汁发酵用培养液的制备

将市售NFC石榴汁的pH调至6.8~7.2后，添加10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母粉、2 g/L磷酸氢二钾、2 g/L柠檬酸二胺，在85℃、20 min条件下进行杀菌，杀菌后趁热立即放入4℃环境骤冷使得菌体破灭，于4℃环境下储藏备用，制备得到处理过后的石榴汁。

（3）植物乳杆菌CCFM1291的发酵

将步骤（1）获得的活化的菌液以2%（v/v）的接种量接种至步骤（2）得到的处理后的石榴汁中，在37℃环境下200 rpm震荡培养72 h，并分别在0、18、27、48、72 h处取1 mL发酵液。

（4）Uro-A含量的检测

取1 mL发酵液，分别用1 mL乙醚和乙酸乙酯连续萃取3次，用冷冻真空离心浓缩仪使萃取液挥发至近干状，加入1 mL色谱级甲醇并超声30 min（促溶），过0.22 μm有机系滤膜后，转移至进样瓶中，检测尿石素A（Uro-A）含量。结果如表1、图2a~b、图3所示：

表1：不同发酵时间的Uro-A的产量

平行发酵时间	1	2	3	4
					0 h	0.00 μM	0.00 μM	0.00 μM	0.00 μM
18 h	10.96 μM	9.60 μM	12.05 μM	6.57 μM
					27 h	21.91 μM	20.07 μM	20.55 μM	17.62 μM
48 h	31.55 μM	31.24 μM	32.03 μM	33.22 μM
					72 h	31.33 μM	31.95 μM	33.26 μM	33.30 μM

结果显示，植物乳杆菌CCFM1291在石榴汁中可将ETs（安石榴苷）转化为Uro-A，随着发酵的进行，发酵液中的Uro-A的含量逐渐增加；当发酵至48 h时，发酵液中Uro-A产量保持基本稳定（图3）。

2、植物乳杆菌CCFM1291后生元的制备

（1）后生元的制备：

将活化的植物乳杆菌CCFM1291菌液以2%（v/v）的接种量接种至石榴汁发酵用培养液中，于37℃环境下200 rpm震荡培养48 h，取发酵48 h处的石榴汁发酵液进行过滤，滤液杀菌并3000 rpm离心15 min，收集上清液，获得所述后生元制剂。

实施例3：合生制剂的制备

（1）植物乳杆菌CCFM1291的菌粉的制备

用接种环蘸取植物乳杆菌CCFM1291的菌液在MRS固体培养基上划线，于37℃倒置培养48 h；取单菌落至MRS液体培养基中，在37℃条件下培养18 h，混匀后取菌液按2%（v/v）的接种量接种至新的MRS液体培养基中培养，如此操作连续活化3次，制备得到种子液。

将制备得到的种子液以2~3%（v/v）的接种量接种于MRS培养基中，37℃有氧培养18~24 h，离心收集菌泥，用磷酸缓冲液充分冲洗3-5次，用冻干保护剂重悬达到浓度10¹⁰CFU/mL，然后用冷冻干燥机冻干，获得植物乳杆菌CCFM1291菌粉。

其中，所述冻干保护剂成分为5%脱脂奶粉、3%甘油、4%甘露醇、20%海藻糖，将这些冻干保护剂原料与饮用水混合充分溶解并115℃灭菌20 min。

（2）将步骤（1）植物乳杆菌CCFM1291菌粉与冻干石榴粉按质量比为5：2的比例均匀混合后，制备得到合生制剂。经检测，所述合生制剂中植物乳杆菌CCFM1291活菌数为（1.0~1.4）×10¹⁰CFU/g。

实施例4：秀丽隐杆线虫的干预实验方案

具体步骤如下：

1、大肠杆菌OP50的培养

用接种环蘸取大肠杆菌OP50的菌液在LB固体培养基上划线，大肠杆菌于37℃有氧条件下培养18 h；然后挑取单菌落至LB液体培养基中，再于37℃环境下有氧培养24 h，混匀后取菌液按2%（v/v）的接种量接种至LB液体培养基进行活化培养，如此操作连续传代3-5次，最终得到活化的OP50菌液。

2、秀丽隐杆线虫的复苏、传代及同步化

从-80℃冰箱取出已保藏的线虫，再在37℃水浴锅中迅速融化后涂布于接种大肠杆菌OP50的NGM培养基上，置于20℃环境下培养。传代时，使用M9缓冲液冲洗并收集平板上的线虫，然后弃去上清，将溶液底部的线虫转移至新的接有大肠杆菌OP50的NGM平板上。

用M9缓冲溶液收集NGM培养基上的秀丽隐杆线虫并洗去多余的大肠杆菌，掌上离心机离心30~60 s使得虫体及虫卵沉淀到底部，弃去上清，按含有秀丽隐杆线虫的M9缓冲液：5% NaClO：1M NaOH = 2：1：2的体积比例进行混合，然后立即持续震荡5 min，待虫体裂解完全后于6000 rpm 离心2 min，并弃去上清，加入M9缓冲溶液润洗，反复清洗3次以充分除去残余的裂解液以保护虫卵，最后将虫卵置于M9缓冲溶液中并于20℃环境下孵育，虫卵基本于18 h内完成孵化，得到同步化线虫。

3、植物乳杆菌CCFM1291发酵石榴汁得到的发酵制品对线虫的影响

（1）植物乳杆菌CCFM1291发酵石榴汁得到的发酵液（发酵制品）：

按照实施例2中的步骤1的方法，取步骤（3）得到的发酵48 h的石榴发酵液；

（2）未发酵石榴汁：

（3）用相等体积的乙醚和乙酸乙酯连续3次充分萃取石榴汁发酵液/未发酵石榴汁，再冷冻离心浓缩至干，并加入1/100原发酵液体积的DMSO，最后再用OP50菌液稀释到原体积，即获得石榴汁发酵提取物；

未发酵石榴汁提取物为对照组1；

（4）分别取步骤（3）得到的80 μL提取物均匀添加到NGM培养基表面。

（5）将同步化后的线虫使用正常NGM培养基进行培养48 h（L4期）后，将线虫转移至步骤（4）得到的已添加提取物的NGM培养基中进行干预，并且为了保持NGM培养基中提取物浓度的稳定，平均每两天将线虫转移至新的含有石榴汁发酵/未发酵石榴汁的提取物的NGM培养基。

在20℃、每2天更换一次培养基、每个干预用的培养基额外含有150 μM 5-氟-2'-脱氧尿苷（抑制线虫产卵，防止其子代对实验的影响）条件下，持续干预8天。

4、合生制剂对线虫的影响

取实施例3制备的合生制剂为实验组，大肠杆菌OP50菌粉（菌浓为：以冻干保护剂重悬OP50菌泥后液体体积计，10¹⁰CFU/mL；或以OP50冻干菌粉重量计，1.07×10¹⁰CFU/g ）与相应的冻干石榴粉按质量比为5：2的比例混合后作为对照组2。

分别将合生制剂和对照组2这两组粉剂水溶后，涂抹至NGM平板来干预秀丽隐杆线虫的生长：

将同步化后的线虫使用正常NGM培养基进行培养48 h（L4期）后，将线虫转移至步骤得到的已添加上述粉剂的NGM培养基中进行干预，并且为了保持NGM培养基中提取物浓度的稳定，平均每两天将线虫转移至新的含有上述粉剂的NGM培养基。

实施例5：发酵制品和合生制剂对线虫脂质水平的影响

具体实施方式同实施例4。

实验结束后，即在衰老期（第8天）用M9缓冲溶液清洗并收集平板上的线虫，向收集的溶液中加入固定液固定30 min，弃去固定液，加入现配制的油红O染色液，浸染20 min，再用M9缓冲液洗涤3次以除去染液，然后显微拍照并使用 ImageJ软件计算平均光密度值（图4），以此来显示脂滴积累水平，从而表征衰老程度。

结果显示：

（1）相比于对照组1（未发酵石榴汁提取物），发酵制品组降低了线虫23.78%的脂滴积累水平（P＜0.001）；

（2）相比于对照组2，合生制剂组降低了线虫5.62%的脂滴积累水平（P＜0.05）；

这些结果表明发酵制品和合生制剂均有效降低了线虫油红O染色的平均光密度值，即有效降低了脂滴的积累，发挥了降脂功效。

实施例6：发酵制品和合生制剂对线虫衰老及寿命的影响

1、秀丽隐杆线虫受干预后的衰老程度的表征

脂褐质是一种在衰老细胞中逐渐积累的自发荧光化合物，是细胞衰老过程的生物标志物。而秀丽隐杆线虫的脂褐质含量也会随衰老程度的加深而增加。因此我们检测了线虫在被干预8天后的脂褐质的积累和β-半乳糖苷酶的酶活情况。具体实施方式同实施例4。

实验结束后，使用100 mM叠氮化钠麻醉干预8天后的线虫，转移至载玻片上，然后于倒置荧光显微镜下观察线虫体内自发荧光化合物脂褐质积累的水平，（激发/发射 358nm/461 nm）。使用 ImageJ软件计算荧光强度（图5 a）；

然后根据β-半乳糖苷酶染色试剂盒中的制造商说明进行衰老相关 β-半乳糖苷酶染色（Solarbio, 中国，货号：G1580）检查干预8天后线虫体内β-半乳糖苷酶活性，该过程所用试剂均来源于该试剂盒，具体方法为：用M9缓冲溶液清洗并收集平板上的线虫，加入-β-Gal固定液固定线虫15 min，弃去固定液，PBS缓冲液洗涤3次，每次3 min，加入0.5 ml染色工作液，37℃孵育12 h，转移至载玻片上，普通光学显微镜观察并拍照并使用 ImageJ软件量化结果以计算平均光密度值（图5 b）。

结果显示：

（1）相比于对照组1（未发酵石榴汁提取物），发酵制品组显著降低了线虫34.46%的脂褐质水平（P＜0.001），同时降低了38.01%的β-半乳糖苷酶酶活（P＜0.001）；

（2）相比于对照组2，合生制剂组显著降低了线虫15.67%的脂褐质水平（P＜0.05）、同时降低了29.56%的β-半乳糖苷酶酶活（P＜0.01）；

这些结果表明发酵制品和合生制剂均有效降低了线虫的自发荧光强度和β-半乳糖苷酶染色的平均光密度值，即有效降低了脂褐质水平和β-半乳糖苷酶活性，减缓了秀丽隐杆线虫的衰老程度，发挥了抗衰老功效。

2、秀丽隐杆线虫受干预后的寿命情况

具体实施方式同实施例4，实验期间，每日记录线虫的存活情况，直至所有线虫死亡。

结果显示：

（1）相比于对照组1（未发酵石榴汁提取物），发酵制品从L4期开始干预秀丽隐杆线虫直至其死亡，线虫的寿命延长了46.33%（图5 c）。

（2）相比于对照组2，合生制剂（实验组）从L4期开始干预秀丽隐杆线虫直至其死亡，线虫的寿命延长了16.67%（图5 c）。

综上，实验结果表明，基于具有转化膳食中的ETs产生Uro-A的植物乳杆菌CCFM1291开发的发酵制品和合生制剂，均可显著减缓秀丽隐杆线虫的衰老程度，并延长其寿命。

实施例7：发酵制品对线虫发挥抗衰作用的机制解析

1、秀丽隐杆线虫自噬基因表达检测

有研究表明Uro-A可促进功能障碍的线粒体自噬，从而抑制线粒体功能随年龄增长而出现的衰退，最终达到抗衰老的功效。因此，本发明在分子水平上进一步进行了相关的验证。

首先，检测了发酵制品是否影响了秀丽隐杆线虫自噬基因的表达，包括自噬基因（bec-1、sqst-1和vps-34）和线粒体自噬基因（pink-1、dct-1和skn-1）。

具体实施方式同实施例4的步骤1~3。

实验结束后，用M9缓冲溶液收集干预8天后的线虫，然后根据制造商的方案使用Trizol 试剂（Thermo Fisher Scientific，中国，货号: 15596018）从线虫中提取总RNA，并使用逆转录试剂盒（Vazyme，中国，货号: Q711-02）将RNA逆转录为cDNA。再使用RT-qPCR系统（Bio-Rad, Emeryville, CA, USA）测定mRNA的转录水平，mRNA水平以act-1作为对照进行标准化。

实验结果发现在老年线虫中（干预8天），自噬基因和线粒体自噬基因的表达显著增加（图6）。

2、秀丽隐杆线虫线粒体功能检测

参考上述基因表达水平的结果，本发明进一步检测了各组线虫的线粒体功能状态。

具体实施方式同实施例4的步骤1~3。

（1）实验结束后，测量各组线虫的线粒体功能状况（MMP、ATP含量）。具体方法为：线粒体荧光染料 JC-1和ATP含量检测试剂盒分别检测线虫体内线粒体的MMP及ATP含量。

实验结果发现，发酵制品干预8天后的线虫体内膜电位（红绿荧光比值）显著高于对照组1（图7 a），ATP水平显著高于对照组1，并且ATP含量与膜电位具有正相关性（图7 b）。

（2）在实验过程中，分别检测各组年轻（干预1天）和老年（干预8天）线虫的线粒体含量：

取干预1天和干预8天的线虫来检测虫体的线粒体含量。检测方法为：用M9缓冲液收集并清洗100只线虫，使用线粒体绿色荧光探针对线虫体内线粒体进行特异性荧光染色，然后用M9缓冲液洗涤3次，最后通过酶标仪（激发/发射：490/516 nm）进行测定。

实验显示：

（1）在年轻线虫中（干预1天），与对照组1相比，发酵制品组线虫体内线粒体含量降低；

（2）老年线虫中（干预8天），发酵制品组线虫的线粒体含量比对照组1的水平更高（图7 c）。

综上，实验结果表明，在短期干预之后功能障碍的线粒体出现自噬，线粒体含量下降；长期干预之后线粒体含量恢复乃至超过对照组线粒体水平，并且线粒体功能状态优于对照组。这些表明了发酵制品促进了功能障碍的线粒体自噬和健康线粒体的生物发生，从而抑制了线粒体功能随年龄增长而出现的衰退，最终达到抗衰老的功效（图8）。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一株植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）CCFM1291，其特征在于，所述植物乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62802，保藏日期为2022年09月15日。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，含有权利要求1所述的植物乳杆菌CCFM1291，或含有植物乳杆菌CCFM1291的发酵液，或含有植物乳杆菌CCFM1291的冻干粉。

3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，植物乳杆菌CCFM1291的含量不低于2×10⁹ CFU/mL。

4.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，植物乳杆菌CCFM1291的含量不低于2×10¹⁰ CFU/g。

5.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的植物乳杆菌CCFM1291或权利要求2~4任一项所述的微生物菌剂。

6.一种含有尿石素A的发酵制品，其特征在于，所述发酵制品是按照下述方法制备得到的：将权利要求1所述的植物乳杆菌CCFM1291接种于含有鞣花单宁的反应体系中，进行发酵制备得到的发酵制品。

7.一种延长动物寿命和/或抗衰老的药品，其特征在于，所述药品中含有权利要求1所述的植物乳杆菌CCFM1291或权利要求2~4任一项所述的微生物菌剂。

8.权利要求1所述的植物乳杆菌CCFM1291，或权利要求2~4任一项所述的微生物菌剂在制备延长动物寿命和/或抗衰老的产品中的应用，其特征在于，所述产品为药品。

9.一种制备尿石素A的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的植物乳杆菌CCFM1291，以含有鞣花单宁或鞣花酸的物质为底物，进行反应，制备得到反应液，从反应液中提取得到尿石素A。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述含有鞣花单宁的物质选自：浆果、核桃、开心果或胡桃。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述浆果选自石榴、桑葚、覆盆子或草莓。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述反应的条件为30~37℃，150~200 rpm，时间为24-72 h。