CN110325638A - 新型微生物及使用了该新型微生物的尿石素类的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明要解决的问题是提供具有高尿石素类产生能力的新型微生物、以及提供使用了该微生物的尿石素类的制造方法，本发明利用产生尿石素类且属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物而解决了上述问题。

Description

新型微生物及使用了该新型微生物的尿石素类的制造方法
技术领域
本发明涉及新型微生物和使用了该微生物的尿石素类的制造方法。
背景技术
以尿石素A和尿石素C为代表的尿石素类，作为石榴、覆盆子、黑莓、云莓、草莓、核桃等中所含的鞣花单宁来源的鞣花酸的代谢物而被已知。
已知鞣花单宁被归类为水解性单宁，被摄入后，会在体内水解并转化为鞣花酸。此外，它还作为鞣花酸存在于水果等中。这样的鞣花单宁、鞣花酸在体内的肠道吸收性非常低，但已知在它们被摄入时，会被人结肠微生物群进一步代谢并转化为尿石素类。
例如，关于生物体内尿石素类的产生，已有下述报道：在使大鼠摄入老鹳草素(Geraniin)等鞣花丹宁后，通过分析尿液中的尿石素类，发现尿石素类的产生(非专利文献1)。
此外，对于人类，有下述报道：在摄入了含有以安石榴苷(Punicalagin)为主的鞣花丹宁的石榴提取物后，在尿液中会检测到尿石素类，特别是尿石素A和尿石素C是主要的鞣花酸代谢物(非专利文献2)。
此外，还报道了尿石素A具有抗氧化作用(非专利文献3)、消炎作用(非专利文献4)、抗糖化作用(非专利文献5)、线粒体自噬的促进作用(非专利文献6)等功能，正期待着其作为具有抗老化功能的材料的开发。
作为合成这些尿石素类的方法，已报道了下述方法：将2-溴-5-甲氧基苯甲酸作为起始原料，通过脱甲基化而制成2-溴-5-羟基苯甲酸，并通过使其与间苯二酚反应，从而得到尿石素A(非专利文献7)。然而，化学合成法并不适合于使用尿石素类作为功能性食品(包括饮料、健康食品)原料的目的。
近年来，作为由鞣花酸产生作为尿石素类的一种的尿石素C的肠内细菌，已经分离、分析了Gordonibacter urolithinfaciens，并且报道了通过使用该肠内细菌发酵鞣花酸来产生尿石素C的方法(专利文献1、非专利文献8)。然而，发酵液中尿石素C的蓄积浓度为2mg/L左右，并不适用于上述目的。此外，已有下述报道：虽作为Gordonibacterurolithinfaciens的近缘种的Gordonibacter pamelaeae DSM 19378菌株具有产生尿石素的能力，但Eggerthella lenta DSM2243菌株、Eggerthella sinensis DSM 16107菌株、Paraeggerthella honkongensis DSM 16106菌株等其他肠内细菌并未具有产生尿石素的能力(非专利文献8)。
现有技术文献
专利文献
[专利文献1]国际公开2014/147280号小册子
非专利文献
[非专利文献1]J.Agric.Food Chem.56,393-400(2008)
[非专利文献2]Mol.Nutr.Food Res.58,1199-1211(2014)
[非专利文献3]Biosci.Biotechnol.Biochem.76,395-399(2012)
[非专利文献4]J.Agric.Food Chem.60,8866-8876(2012)
[非专利文献5]Mol.Nutr.Food Res.55,S35-S43(2011)
[非专利文献6]Planta Med,77,1110-1115(2011)
[非专利文献7]J.Agric.Food Chem.,56,393-400(2008)
[非专利文献8]Food Func.,5,8,1779-1784(2014)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于提供具有高尿石素类产生能力的新型微生物、以及提供使用了该微生物的尿石素类的制造方法。
解决问题的方法
为了解决上述课题，本发明人等对目标的微生物进行了深入研究，结果发现了具有高尿石素产生能力的新型微生物，从而完成了本发明。
本发明如下所述。
[1]属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物，其产生尿石素类。
[2]根据[1]所述的微生物，其以鞣花酸为原料产生所述尿石素类。
[3]根据[1]或[2]所述的微生物，其中，所述尿石素类是尿石素C。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的微生物，其中，所述属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物是伊格尔兹氏菌(Eggerthella sp.)DC 3563(NITE BP-02376)。
[5]尿石素类的制造方法，其包括下述工序：
工序(a)：在含有尿石素类的原料的溶液中，使具有由尿石素类的原料产生尿石素类的能力的属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物，由尿石素类的原料产生尿石素类的工序。
[6]根据[5]所述的制造方法，其中，所述尿石素类的原料是鞣花酸。
[7]根据[5]或[6]所述的制造方法，其中，所述尿石素类是尿石素C。
[8]根据[5]～[7]中任一项所述的制造方法，其中，在气相和/或含有尿石素类的原料的溶液包含氢的环境中，进行工序(a)。
[9]根据[5]～[8]中任一项所述的制造方法，其中，含有所述尿石素类的原料的溶液还包含选自含有α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精以及它们的衍生物的包合物中的一种以上。
[10]根据[9]所述的制造方法，其中，所述包合物是选自β-环糊精、γ-环糊精及它们的衍生物中的一种以上。
[11]伊格尔兹氏菌(Eggerthella sp.)DC 3563(NITE BP-02376)的16S rRNA基因，其以SEQ ID NO:1表示。
发明的效果
根据本发明，可提供具有高尿石素产生能力的新型微生物、以及使用了该微生物的尿石素类的有效制造方法。
进而，通过将利用该制造方法得到的尿石素类用于化妆品、准药品、医疗用品、卫生用品、药品、饮品与食品(包括健康食品)等，能够期待得到抗氧化、消炎、抗糖化、线粒体自噬的促进作用等效果。
具体实施方式
本发明包括：涉及新型微生物的发明(第一发明)、涉及使用了该新型微生物的尿石素的制造方法的发明(第二发明)、以及新型微生物的16S rRNA基因(第3发明)。
<1、第一发明>
本发明的第一发明是涉及新型微生物的发明。具体而言，新型微生物是产生尿石素类且属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物。在下文中，有时将该微生物记作“本微生物”等。
(产生尿石素类且属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物)
本发明的第一发明是产生尿石素类且属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物。本微生物优选为伊格尔兹氏菌(Eggerthella sp.)DC 3563(NITE BP-02376)菌株。在下文中，有时将该菌株记作“本菌株”或“DC 3563菌株”等。
以健康人类粪便为分离源而分离出了本菌株。本菌株于2016年11月11日基于布达佩斯条约而国际保藏于下述机构：NPMD-国际技术评估学会，专利微生物保藏中心(千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室，邮编292-0818)，保藏号为NITE BP-02376。
此外，本菌株也可以是与其实质上等同的菌株。实质上等同的菌株是指，产生尿石素类且属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物中、与本菌株具有同等程度的高尿石素类产生能力的菌株。此外，其16S rRNA基因的碱基序列与本菌株的16S rRNA基因的碱基序列(SEQ ID NO:1)具有98％以上、优选99％以上、更优选100％的同源性，并且优选具有与本菌株相同的菌学性质。此外，本菌株可以是由本菌株或与其实质上等同的菌株，通过突变处理、遗传重组、自然突变菌株的选择等育种而成的菌株。
与作为已知的尿石素类产生菌的Gordonibacter urolithinfaciens相比，本微生物具有更高的尿石素类产生能力。尿石素类产生能力可以与实施例中描述的方法同样地进行测定。
本微生物产生的尿石素类的原料只要可使用该原料通过本微生物而产生尿石素类即可，没有特别限制，例如可举出：鞣花酸；作为该鞣花酸的前体的安石榴苷(Punicalagin)、老鹳草素(Geraniin)等鞣花丹宁等。其中，由于基于本微生物的尿石素类的产生效率高于其他原料，因此优选鞣花酸。即，本微生物优选已鞣花酸为原料来产生尿石素类。关于尿石素类的原料，可适用后述的本发明的第二发明中的“尿石素类的原料”栏中记载的内容。
(产生尿石素类且属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物的培养条件)
本微生物例如可通过进行培养而容易地增殖。其方法没有特别限制，只要本微生物能够增殖即可，可以根据需要对在本微生物的增殖中通常采用的方法进行适当变更而使用。尽管下文中记载了其实施例，但也可以利用后述的本发明的第二发明中的“尿石素类的产生”栏中记载的各种实施方式进行培养。
本微生物的培养温度优选为20℃以上，更优选为25℃以上，进一步优选为30℃以上，另一方面，优选为42℃以下，更优选为40℃以下，进一步优选为37℃以下。作为培养基，没有特别限制，可以根据需要适当改变通常使用的培养基而使用。例如，可以使用OXIO公司制造的ANAEROBE BASAL BROTH(ABB)培养基、Oxoid公司制造的Wilkins-ChalgrenAnaerobe Broth(CM0643)、日水制药株式会社制造的GAM培养基、改良GAM培养基等。
此外，例如可以添加水溶性的有机物作为碳源。作为水溶性的有机物，可举出下述化合物。例如，山梨糖、果糖、葡萄糖(glucose)及葡萄糖等糖类；甲醇等醇类；戊酸、丁酸、丙酸、乙酸、甲酸等有机酸类。
为了实现有效的发育，可以适当调节作为碳源添加到培养基中的有机物的浓度。通常，可以在0.1～10wt/vol％的范围内进行选择。
除了上述碳源之外，还可以向培养基中加入氮源。作为氮源，可以使用在通常的培养、发酵中使用的各种氮化合物。
优选的无机氮源是铵盐和硝酸盐。更优选硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、磷酸氢铵、柠檬酸三铵、硝酸钾以及硝酸钠。
另一方面，优选的有机氮源是氨基酸类、酵母提取物、蛋白胨(例如，多聚蛋白胨N等)、肉提取物(例如，牛肉浸粉(Lab-Lemco Powder)、肉汤(Bouillon)等)、肝脏提取物、消化血清粉末等。更优选的有机氮源是精氨酸、胱氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、酵母提取物、蛋白胨类(例如，多聚蛋白胨N等)。
此外，除了碳源、氮源之外，还可以向培养基中添加其他的有机物或无机物。例如，可以通过向培养基中添加维生素等辅助因子、各种盐类等无机化合物来增强增殖、活性。例如，作为无机化合物、维生素等动植物来源的微生物增殖辅助因子，可举出下述物质。
添加无机化合物、维生素类等动植物来源的微生物增殖辅助因子来制备培养液的方法是公知的。培养基可以是液体、半固体或固体。优选的培养基的形态是液体培养基。
(属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物的静止菌体)
本微生物包含其静止菌体。静止菌体是指，通过离心分离等操作从培养得到的微生物中除去培养基成分，用水、生理盐水等盐溶液或缓冲液进行洗涤，并使其悬浮于洗涤液等而成的菌体，在本发明的第一发明中，是指至少具有产生尿石素类的代谢系统的菌体。作为缓冲液，优选磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、MOPS缓冲液、乙酸缓冲液、甘氨酸缓冲液等。可以根据常规方法适当调节缓冲液的pH、浓度。
(尿石素类)
尿石素类是下述通式(1)所示的已知物质。例如，如表1所示，已知根据化学式中的R1～R6的不同，尿石素类有：尿石素A、尿石素B、尿石素C、尿石素D、尿石素E、尿石素M3、尿石素M4、尿石素M5、尿石素M6、尿石素M7、及异尿石素A等。
在本发明的第一发明中，从基于本微生物的生产效率高的观点出发，优选尿石素C。
[化学式1]
[表1]
表1.尿石素的种类
R1 R2 R3 R4 R5 R6
尿石素A -OH -H -OH -H -H -H
尿石素B -OH -H -H -H -H -H
尿石素C -OH -H -OH -OH -H -H
尿石素D -OH -OH -OH -OH -H -H
尿石素E -OH -OH -OH -H -OH -H
尿石素M3 -OH -H -OH -OMe -H -H
尿石素M4 -OH -H -OMe -OH -H -H
尿石素M5 -OH -OH -OH -OH -OH -H
尿石素M6 -OH -H -OH -OH -OH -H
尿石素M7 -OH -H -OH -H -OH -H
异尿石素A -OH -H -H -OH -H -H
<2、第二发明>
本发明的第二发明是使用了具有产生尿石素类的能力的属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物的尿石素类的制造方法。
本发明的第二发明包括下述工序(a)，也可以包括其他工序。
(1)工序(a)
工序(a)：在含有尿石素类的原料的溶液中，使具有由尿石素类的原料产生尿石素类的能力的属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物，由尿石素类的原料产生尿石素类的工序。
(属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物)
本发明的第一发明中的描述也适用于本发明的第二发明中的属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物。
(含有尿石素类的原料的溶液)
本发明的第二发明中的所述含有尿石素类的原料的溶液，只要是能够在该溶液中，使具有由该尿石素类的原料产生尿石素类的能力的本微生物，由该尿石素类的原料产生尿石素类，则没有特别限制。优选为培养基，可以采用上述“产生尿石素类且属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物的培养条件”栏中记载的实施方式。
需要说明的是，本说明书中记载的“培养基”是指，包含基本培养基且能够使本微生物增殖的任何溶液，其不包括无法使本微生物增殖的溶液，例如上述盐溶液、缓冲液等。
当本微生物是静止菌体时，作为含有尿石素类的原料的溶液，优选为前述的盐溶液、缓冲液。
(尿石素类的原料)
作为尿石素类的原料，只要可使用该原料通过本微生物而产生尿石素类则没有特别限制，例如可举出：鞣酸；作为该鞣酸的前体的安石榴苷、老鹳草素等鞣花丹宁等。其中，由于基于本微生物的尿石素类的产生效率高于其他原料，因此优选鞣花酸。此时，可以从植物中提取安石榴苷、老鹳草素等鞣花丹宁并将其水解而形成鞣花酸，也可以提取鞣花酸本身。
可以在产生尿石素类之前，将尿石素类的原料加入到待成为含有尿石素类的原料的溶液的溶液、溶剂中，此外，也可以在产生尿石素类期间向溶液中追加地添加尿石素类的原料。此时，可以将该原料一次性添加、逐步添加、连续添加。
含有尿石素类的原料的溶液中该原料的含量通常为0.01g/L以上，优选为0.1g/L以上，更优选为1.0g/L以上。另一方面，其通常为100g/L以下，优选为20g/L以下，更优选为10g/L以下。
作为生产鞣花酸和/或鞣花单宁的植物，没有特别限制，例如可举出：石榴、覆盆子、黑莓、云莓、波森莓、草莓、核桃、尼泊尔老鹳草等。其中，由于含有大量的鞣花酸和/或鞣花单宁，因此优选石榴、波森莓、尼泊尔老鹳草，更优选石榴。
这些植物可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。此外，从该植物中提取鞣花酸和/或鞣花单宁的提取方法及提取条件没有特别限制，按照常规方法进行即可。例如，可以使用水提取、热水提取、温水提取、醇提取、超临界提取等公知的提取方法。
当进行溶剂提取时，作为溶剂，例如可举出：水；甲醇、乙醇等低级醇、丙二醇、1,3-丁二醇等多元醇等醇类(无水、含水在所不问)；丙酮等酮类、乙醚、二烷、乙腈、乙酸乙酯等酯类、二甲苯等，优选为水、乙醇等。这些溶剂可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。
作为将提取得到的安石榴苷等鞣花单宁水解为鞣花酸的方法，没有特别限制，可举出利用酸、酶、微生物进行水解的方法。
对于得到的鞣花酸和/或鞣花单宁，也可以直接保持其状态使用，但也可以经过使其干燥而形成为粉末状的工序。此外，根据需要，还可以对得到的鞣花酸和/或鞣花单宁进行纯化、浓缩处理等。作为纯化处理，可以进行过滤或使用了离子交换树脂、活性炭柱等的吸附、脱色之类的处理。此外，作为浓缩处理，可以使用蒸发器等常规方法。此外，也可以经过将得到的鞣花酸和/或鞣花单宁(或它们的纯化处理物或浓缩物)按照公知的方法进行粉末化的工序，所述公知的方法包括：使其经历冷冻干燥处理而进行粉末化的方法；加入糊精、玉米淀粉、阿拉伯树胶等赋形剂，通过喷雾干燥处理进行粉末化的方法等。进一步，还可以在之后根据需要将其溶解在纯水、乙醇等中来使用。
只要是含有鞣花酸和/或鞣花单宁的物质，则也可以使用市售的饮品与食品等。例如，可以使用石榴提取物、石榴浓缩果汁、石榴汁等，但不限于此。
(尿石素类)
本发明的第二发明中的尿石素类可以援用上述本发明的第一发明中的尿石素类的记载。
(基于本微生物的尿石素类的产生)
在含有尿石素类的原料的溶液中，以适于尿石素类的产生的方法对本微生物进行培养，由此产生尿石素类。
该溶液优选为培养基(培养液)，作为其实施方式，可以适用本发明的第一发明中记载的描述。需要说明的是，关于使用了本微生物的静止菌体的情况，将在后文中进行描述。
此外，所述适于尿石素类的产生的方法，可以根据需要将本微生物的增殖中通常使用的方法适当变更而使用。
在工业制造中，还可以使用能够连续供给培养基、基质气体、且具备用于回收培养物的机构的连续培养系统(continuous fermentation system)。
作为培养容器，可以直接使用通常使用的培养槽。也可用于本微生物的培养的培养槽已有市售。也可以用氮气等不活泼气体或基质气体等置换培养槽中混入的氧，由此制成厌氧性气体氛围。
在本微生物的培养中，可以为培养槽赋予附加性的功能。例如，除了通常使用的搅拌混合罐外，还可以使用鼓泡塔型、汲取管(draft tube)型培养槽。通过鼓入液体培养基中的混合气体，使本微生物游离分散，从而可以使本微生物充分与培养基接触。此外，还可以在将水分滴加到生物滴滤器(biotrickling filter)这样的高透气性炉渣、其他陶瓷类无机填充物、或聚丙烯等有机合成物质的填充层中的同时，使本微生物栖息，在此处进行通气的同时进行培养。此外，可以通过常规方法将要使用的本微生物固定在卡拉胶凝胶、海藻酸凝胶、丙烯酰胺凝胶、甲壳质、纤维素、琼脂等而使用。
还可以根据培养槽的形状，出于充分搅拌培养基的目的而使用搅拌器等。通过对培养槽中的培养物进行搅拌，可以增加培养基成分、基质气体与厌氧性微生物接触的机会，优化尿石素类的产生效率。此外，也可以将基质气体以纳米气泡形式供给。
为了实现本微生物的充分生育，培养物的pH优选为6.0以上，更优选为6.5以上，进一步优选为6.8以上，另一方面，优选为8.5以下，更优选为8.0以下，进一步优选为7.5以下。
此外，培养槽的温度没有特别限制，但为了增加尿石素类的回收量，优选为20℃以上，更优选为25℃以上，进一步优选为30℃以上，另一方面，优选为42℃以下，更优选为40℃以下，进一步优选为37℃以下。
培养时间可以根据尿石素类的产生量、原料的残存量等进行适当设定。通常为8小时以上，优选为12小时以上，更优选为16小时以上，另一方面，通常为340小时以下，优选为240小时以下，更优选为170小时以下，但不限于此。
为了有效地回收尿石素类，也可以连续地供给培养基。就供给至培养槽中的新鲜的培养基的量而言，培养槽内的培养物的稀释率优选为0.04/hr，更优选0.08/hr，另一方面，优选2/hr以下，更优选1/hr以下。
作为培养液的气相、水相(含有尿石素类的原料的溶液)，优选不含空气或氧，例如可举出：以任意比率含有氮和/或氢、以任意比率含有氮和/或二氧化碳，优选为包含氢的气相、水相。
从促进尿石素类的产生的观点出发，气相中氢的比例通常为0.1％以上，优选1％以上，更优选2％以上，另一方面，通常为100％以下，优选50％以下，更优选20％以下。
使气相、水相形成为这样的环境的方法没有特别限制，例如可采用下述方法：在培养前用上述气体置换气相；在培养中也从培养器的底部供给；向培养器的气相部供给；在培养前利用上述气体对水相进行鼓泡；等等。作为通气量，通常为0.005vvm以上，优选0.05vvm以上，另一方面，通常为2vvm以下，优选0.5vvm以下。此外，混合气体也可以以纳米气泡形式供给。需要说明的是，在本说明书中，“vvm”表示在一分钟内进行了液体容量的几倍的通气，例如，对10L水相进行2vvm的通气，意味着进行了每分钟20L的通气。
此外，作为上述氢，也可以直接使用氢气，但也可以在水相中添加甲酸或其盐等氢的前体。
培养本微生物时的加压条件没有特别限制，只要是本微生物能够生育的条件即可。作为优选的加压条件，可举出0.02～0.2MPa的范围，但不限于此。
此外，有时可通过向水相中添加表面活性剂、吸附剂、包合物等而促进尿石素类的生成。
作为表面活性剂，例如可举出吐温80等，可添加0.001g/L以上且10g/L以下程度。
作为吸附剂，例如可举出：纤维素及其衍生物；糊精；Mitsubishi Chemical株式会社制造的作为疏水吸附剂的Diaion HP系列、Sepabeads系列；Organo株式会社制造的Amberlite XAD系列等。
作为包合物，例如可举出α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、族群糊精(clusterdextrin)(超支化环状糊精)以及它们的衍生物等。此外，通过使两种以上的包合物共存，有时可以进一步促进尿石素类的生成。
相对于尿石素类的原料，包合物的添加量以摩尔比的总量计通常为0.2当量以上，优选为1.0当量以上，更优选为2.0当量以上，另一方面，通常为10.0当量以下，优选为5.0当量以下，更优选为4.0当量以下。
(基于本微生物的静止菌体的尿石素类的产生)
当本微生物是静止菌体时，含有尿石素类的原料的溶液中，优选用上述“属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物的静止菌体”栏中记载的盐溶液、缓冲液来代替上述培养基。对于其他条件，可援用上述“基于本微生物的尿石素类的产生”栏中的描述。
(其他工序)
除了上述工序之外，本发明的第二发明可以包括下述工序：测定产生的尿石素类的量的工序、将产生的尿石素类进行纯化的工序、以及其它的必要工序。
(测定产生的尿石素类的量的工序)
产生的尿石素类的量因产生条件而异，在尿石素类产生后的每1.0L溶液中，产生的尿石素类的量以总量计通常为0.005g以上，优选为0.1g以上，更优选为1g以上。另一方面，上限没有特别限制，但通常为20g以下，优选为15g以下，更优选为10g以下。
尿石素类的产生可以通过对尿石素类产生后的溶液中的原料、尿石素类进行定量来确认。以下示出其一例。
例如，在尿石素类产生后的溶液中，根据需要加入添加有甲酸等酸的乙酸乙酯，剧烈搅拌后进行离心，取出乙酸乙酯层。根据需要可以对该溶液进行数次相同的操作，将它们的乙酸乙酯层合并以得到尿石素类提取液。使用蒸发器等在减压下对该提取液进行浓缩、干固，使其溶解于甲醇。可以使用聚四氟乙烯(PTFE)膜等膜对其进行过滤，并将除去了不溶物后的液体作为高效液相色谱(HPLC)的样品。作为高效液相色谱的条件，可举出例如下述条件，但不限于此。
[高效液相色谱条件]
色谱柱：Inertsil ODS-3(250×4.6mm)(GL Science公司制造)
洗脱液：水/乙腈/乙酸＝74/25/1
流速：1.0mL/min
柱温：40℃
检测：305nm
(将产生的尿石素类进行纯化的工序)
对于产生的尿石素类，也可以直接保持其状态使用，但也可以经过使其干燥而形成为粉末状的工序。此外，根据需要，还可以对得到的尿石素类进行纯化、浓缩处理等。作为纯化处理，可以进行过滤或使用了离子交换树脂、活性炭柱等的吸附、脱色之类的处理。此外，作为浓缩处理，可以使用蒸发器等常规方法。此外，也可以经过将得到的尿石素类(或它们的纯化处理物或浓缩物)按照公知的方法进行粉末化的工序，所述公知的方法包括：使其经历冷冻干燥处理而进行粉末化的方法；加入糊精、玉米淀粉、阿拉伯树胶等赋形剂，通过喷雾干燥处理进行粉末化的方法等。进一步，还可以在之后根据需要将其溶解在纯水、乙醇等中来使用。
就通过上述方法得到的经过了加热干燥处理或喷雾干燥处理、或冷冻干燥处理的尿石素类而言，在干燥粉末中，以尿石素的总量计通常包含1～50质量％。此外，优选为例如以选自1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％中的两点的质量百分浓度为下限(～以上、或高于～)及上限(～以下、或低于～)的浓度范围表示的质量％。
<3、第三发明>
本发明的第三个发明是以SEQ ID NO:1表示的伊格尔兹氏菌(Eggerthella sp.)DC 3563(NITE BP-02376)的16S rRNA基因。16S rRNA基因的碱基序列的确定方法是公知的。该碱基序列是通过实施例中记载的方法而确认的。
实施例
在下文中，将参考具体实施例来更详细地描述本发明，但本发明不限于这些实施例。
<1、本菌株的分离、分类学性质>
[实施例1]
作为本菌株的伊格尔兹氏菌(Eggerthella sp.)DC 3563(NITE BP-02376)的分离和分类学性质如下所述。
为了分离本菌株，将最终浓度为1g/L的鞣花酸加入到ABB培养基(OXOID公司制造)中，然后进行加热灭菌，将气相用N2:CO2:H2(80％/10％/10％)气体进行置换，并将得到的培养基用作基本培养基。将人类粪便接种到基本培养基，在37℃下进行了厌氧性培养。将培养后的培养液稀释、涂布在ABB琼脂培养基上。在37℃下进行厌氧性培养，得到了多个单菌。将得到的多个单菌分别接种至基本培养基，在37℃下进行了厌氧性培养。
培养后的培养液中的尿石素类的定量是通过下述方法进行的。
相对于5mL培养液利用等量的乙酸乙酯萃取尿石素类，将得到的乙酸乙酯相进行减压浓缩、干燥。将由此得到的干固物再溶解在0.5mL甲醇中，通过HPLC进行了尿石素类的定量分析。
HPLC在下述条件进行。
HPLC分析条件：
色谱柱：Inertsil ODS-3(250×4.6mm)(GL Science公司制造)
洗脱液：水/乙腈/乙酸＝74/25/1
流速：1.0mL/min
柱温：40℃
检测：305nm
作为标准品，将DALTON PHARMA公司制造的尿石素类溶解在DMSO中使用。作为通过2周的培养将添加的鞣花酸转化为尿石素C的微生物，取得了作为本菌株的伊格尔兹氏菌(Eggerthella sp.)DC 3563(NITE BP-02376)菌株。
使用公知的方法所分析的DC 3563菌株的菌学性质总结在表2中。
[表2]
表2
<2、菌株的鉴定>
[实施例2]
从作为本菌株的DC 3563菌株中提取DNA，使用对于16S rRNA基因特异性的通用引物，将16S rRNA基因的全长进行PCR扩增，确定了本菌株的16S rRNA基因的碱基序列(作为SEQ ID NO:1)。
当使用国际碱基序列数据库(DDBJ)进行同源性搜索时，作为本菌株的DC 3563菌株与Eggerthella lenta JCM 9979(AB558167)菌株具有99.9％的同源性。
此外，在将从核酸数据库获取的与本菌株具有高度同源性的各基准菌株的碱基序列进行多重比对后，通过NJ法制成分子系统发育树，其结果，作为本菌株的DC 3563菌株与由爱格士菌(Eggerthella)属构成的菌种形成簇、表现为近缘种。
对上述方式、同化性、16S rRNA基因的分析结果进行综合性判断，其结果，鉴定出作为本菌株的DC 3563菌株为属于伊格尔兹氏菌(Eggerthella sp.)的微生物。
<3、尿石素类的产生(发酵)>
[实施例3]
将作为本菌株的DC 3563菌株接种到实施例1中记载的基本培养基中，在37℃下厌氧性培养2周。培养完成后，通过实施例1中记载的方法进行了尿石素类的定量分析。
其结果，相对于添加的鞣花酸，以90.3％的摩尔产率得到了尿石素C。
[实施例4]
使用了在实施例1中记载的基本培养基中进一步添加相对于鞣花酸以摩尔比计为2.4当量的β-环糊精而得的培养基、进一步添加相对于鞣花酸以摩尔比计为2.4当量的γ-环糊精而得的培养基、或者两者都未添加的培养基，除此之外，以与实施例1相同的方式进行，将其作为实施例4。
其结果，当相对于添加的鞣花酸而未添加环糊精时，以26.6％的摩尔产率得到了尿石素C。当添加了β-环糊精时，以30.2％的摩尔产率得到了尿石素C。当添加了γ-环糊精时，以31.9％的摩尔产率得到了尿石素C。
工业实用性
与具有尿石素类产生能力的现有微生物相比，本发明的新型微生物具有更高的尿石素类产生能力。在使用了该微生物的尿石素类的制造方法中，与使用了微生物的现有的尿石素类的制造方法相比，可以更有效地制造尿石素类。
使用了尿石素类的化妆品、准药品、医疗用品、卫生用品、药品、饮品与食品(包括健康食品)等可用于抗氧化、消炎、抗糖化等。
本说明书引用的全部现有技术文献均作为参照并入本说明书中。
序列表
<110> 株式会社大赛璐
<120> 新型微生物及使用了该新型微生物的尿石素类的制造方法
<130> 17P0063-8064
<150> JP 2017-031674
<151> 2017-02-23
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1464
<212> DNA
<213> 伊格尔兹氏菌(Eggerthella sp.)
<400> 1
gatgaacgct ggcggcgtgc ctaacacatg caagtcgaac gatgaaaccg ccctcgggcg 60
gacatgaagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgaccaacc tgccccttgc tccgggacaa 120
ccttgggaaa ccgaggctaa taccggatac tcctcgcccc cctcctgggg ggcccgggaa 180
agcccagacg gcaagggatg gggtcgcggc ccattaggta gtaggcgggg taacggccca 240
cctagcccgc gatgggtagc cgggttgaga gaccgaccgg ccacattggg actgagatac 300
ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaattttgc gcaatggggg aaaccctgac 360
gcagcaacgc cgcgtgcggg acgacggcct tcgggttgta aaccgctttc agcagggaag 420
aaattcgacg gtacctgcag aagaagctcc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 480
acgtagggag cgagcgttat ccggattcat tgggcgtaaa gagcgcgtag gcggcctctc 540
aagcgggatc tctaatccga gggctcaacc cccggccgga tcccgaactg ggaggctcga 600
gttcggtaga ggcaggcgga attcccggtg tagcggtgga atgcgcagat atcgggaaga 660
acaccgatgg cgaaggcagc ctgctgggcc gcaactgacg ctgaggcgcg aaagctaggg 720
gagcgaacag gattagatac cctggtagtc ctagccgtaa acgatggata ctaggtgtgg 780
ggggctccgc cctccgtgcc gcagccaacg cattaagtat cccgcctggg gagtacggcc 840
gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcagcggag catgtggctt 900
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag ggcttgacat ggacgtgaag ccggggaaac 960
ccggtggccg agaggagcgt ccgcaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccctgcccc atgttgccag cattaggttg 1080
gggactcatg ggggactgcc ggcgtcaagc cggaggaagg tggggacgac gtcaagtcat 1140
catgcccttt atgccctggg ctgcacacgt gctacaatgg ccggtacaac gggctgcgag 1200
accgcgaggt cgagcgaatc cctcaaagcc ggccccagtt cggatcggag gctgcaaccc 1260
gcctccgtga agtcggagtt gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc 1320
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acccgagtcg tctgcacccg aagccgccgg 1380
ccgaacccgc aaggggcgga ggcgtcgaag gtgtggaggg taaggggggt gaagtcgtaa 1440
caaggtagcc gtaccggaag gtgc 1464
PCT/RO/134表

Claims (11)

1.属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物，其产生尿石素类。
2.根据权利要求1所述的微生物，其以鞣花酸为原料产生所述尿石素类。
3.根据权利要求1或2所述的微生物，其中，
所述尿石素类是尿石素C。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的微生物，其中，
所述属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物是伊格尔兹氏菌(Eggerthella sp.)DC3563(NITE BP-02376)。
5.尿石素类的制造方法，其包括下述工序(a)：
工序(a)：在含有尿石素类的原料的溶液中，使具有由尿石素类的原料产生尿石素类的能力的属于爱格士菌(Eggerthella)属的微生物，由尿石素类的原料产生尿石素类的工序。
6.根据权利要求5所述的制造方法，其中，
所述尿石素类的原料是鞣花酸。
7.根据权利要求5或6所述的制造方法，其中，
所述尿石素类是尿石素C。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的制造方法，其中，
在气相和/或含有尿石素类的原料的溶液包含氢的环境中，进行工序(a)。
9.根据权利要求5～8中任一项所述的制造方法，其中，
所述含有尿石素类的原料的溶液还包含选自包含α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精及它们的衍生物的包合物中的一种以上。
10.根据权利要求9所述的制造方法，其中，
所述包合物是选自β-环糊精、γ-环糊精及它们的衍生物中的一种以上。
11.伊格尔兹氏菌(Eggerthella sp.)DC 3563(NITE BP-02376)的16S rRNA基因，其以SEQ ID NO:1表示。
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