CN116515695A - 青春双歧杆菌bas05在制备降尿酸药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了青春双歧杆菌BAS05在制备降尿酸药物中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开的青春双歧杆菌BAS05在制备降尿酸药物中的应用，青春双歧杆菌BAS05在高尿酸斑马鱼体内能显著抑制黄嘌呤氧化酶的活性和显著降低尿酸的含量，具备应用于体内调节尿酸水平的潜能，此为利用青春双歧杆菌BAS05开发预防或治疗高尿酸血症的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及青春双歧杆菌BAS05在制备降尿酸药物中的应用。
背景技术
高尿酸血症是一种由嘌呤代谢异常所导致的以尿酸盐生成过量或肾脏尿酸排泄减少，或两者共同存在而引起的全身代谢性疾病。高尿酸血症大多数无症状，常在体检时发现尿酸过高，尿酸过高容易引起痛风发作、尿酸性肾病等。临床上，使用现有促进尿酸排泄药或现有抑制尿酸生成药来控制血液中的尿酸浓度，前者通过抑制近端肾小管对尿酸的重吸收，而能够促进尿酸的排泄，例如别嘌呤醇；后者则通过抑制将黄嘌呤)代谢成为尿酸的主要酵素─黄嘌呤氧化酶，使尿酸无法形成，例如丙磺舒。然而，别嘌呤醇的副作用发生率低，但却有部分患者对别嘌呤醇会产生致命性的严重药物不良反应，而当患者的肌酸酐廓清率过低时，丙磺舒会失去效用，且会有尿路结石及尿酸肾病变的危险。与传统药物治疗相比，具有降尿酸功能的益生菌因其副作用小并且具有其他益生功效等特点，而被广泛关注。
因此，提供青春双歧杆菌BAS05在制备降尿酸药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了青春双歧杆菌BAS05在制备降尿酸药物中的应用。
在尿酸形成的生化链中，黄嘌呤氧化酶将次黄嘌呤代谢为黄嘌呤，进一步将黄嘌呤分解代谢为终产物尿酸。在斑马鱼及大多数哺乳动物中存在尿酸氧化酶，一种高效降低尿酸水平的酶，可将尿酸分解成高水溶性的尿囊素，并随着尿液排出。所以建立斑马鱼高尿酸模型需要加入氧嗪酸钾抑制尿酸氧化酶的活性，同时增加尿酸形成的前体物质黄嘌呤来增加尿酸的合成。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
青春双歧杆菌BAS05在制备降尿酸药物中的应用，所述青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BAS05的保藏编号为CGMCC No.22515，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年05月13日，分类命名为青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis。
进一步，所述的青春双歧杆菌BAS05在抑制黄嘌呤氧化酶中的应用。
进一步，所述青春双歧杆菌BAS05为菌悬液。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了青春双歧杆菌BAS05在制备降尿酸药物中的应用，青春双歧杆菌BAS05是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，在高尿酸斑马鱼体内能显著抑制黄嘌呤氧化酶的活性和显著降低尿酸的含量，具备应用于体内调节尿酸水平的潜能，此为利用青春双歧杆菌BAS05开发预防或治疗高尿酸血症的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明青春双歧杆菌BSA05在BS琼脂平板上的菌落形态；
图2附图为本发明青春双歧杆菌BSA05对高尿酸斑马鱼体内尿酸含量的影响；
图3附图为本发明青春双歧杆菌BSA05对高尿酸斑马鱼体内尿酸含量的抑制作用；
图4附图为本发明青春双歧杆菌BSA05对高尿酸斑马鱼体内黄嘌呤氧化酶活性的影响；
图5附图为本发明青春双歧杆菌BSA05对高尿酸斑马鱼体内黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
别嘌醇、氧嗪酸钾、黄嘌呤钠盐均购自上海源叶生物科技有限公司；尿酸检测试剂盒和黄嘌呤氧化酶测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司；青春双歧杆菌15703(ATCC 15703)购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
实施例1青春双歧杆菌BAS05分离、鉴定及保藏
(1)分离：
1)将长寿老人粪便(约0.1g)溶解于装有1mL无菌生理盐水的1.5mL离心管中，用1mL无菌枪头充分吹打混匀，备用。
2)在6个无菌1.5mL离心管中各加入900μL的无菌生理盐水。
3)从第1个装有10-1样品稀释液的离心管中，吸取100μL的液体加入第2个离心管(10-2)，稀释到10-2；
4)从第2个装有10-2样品稀释液的离心管中，吸取100μL的液体加入第3个离心管(10-3)，稀释到10-3；
5)重复上个步骤，一直稀释到10-4、10-5、10-6、10-7。
6)从装有10-4样品稀释液的离心管中吸取100μL的样品稀释液分别接种于MRS固体培养基、BS固体培养基上，将100μL的菌液摊平涂干，注意涂布的手法要温和，动作快速，必须在酒精灯火焰附近操作。涂布完成后，在培养皿侧面做好标记，包括姓名、样品编号、培养基名称、培养时间、稀释梯度、培养条件(厌氧/好氧)等信息。
7)重复上个步骤，完成10-5、10-6、10-7稀释梯度的稀释涂布。
8)涂布完成后，将培养皿分别放在37℃、厌氧养条件下进行培养，48h后可进行观察记录。
9)用接种环挑取平板上的单菌落划线至BS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，分离得到纯菌落。
10)将平板上的纯菌落接种于BS液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。
(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过PCR技术利用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增16S rDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。
其中，通用引物27F和1492R的引物序列如下：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。
实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16S rDNA鉴定，其中菌株BAS05被鉴定为青春双歧杆菌，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
TCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGATCCCAGGAGCTTGCTCCTGGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATACACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGCTCCAGTTGACCGCATGGTCCTCTGGGAAAGCTTTTGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGATGGCGGGGTAACGGCCCACCATGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGCGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGACTGGGAGCAAGCCCTTCGGGGTGAGTGTACCTTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGACCATTCCACGGTCTCCGTGTCGGAGCCAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACAGCCCCAGAGATGGGGCCTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTGTGTTGCCAGCACGTCGTGGTGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACACCGTGAGGTGGAGCGGATCCCTTAAAACCGGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAACCCGACTCCATGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGTAGCACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCTTTTGGGGGGGAGCCGTCTA；SEQ ID NO.3。
菌株BAS05单菌落接种到BS固体培养基上，在37℃有氧条件下生长良好，菌落乳白色、边缘整齐，呈球形、表面光滑(图1)。菌株BAS05已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年05月13日，分类命名为青春双歧杆菌Bifidobacteriumadolescentis，保藏编号为CGMCC No.22515。
实施例2青春双歧杆菌BSA05菌悬液(菌体)的制备
将青春双歧杆菌BSA05活化培养后接种于BS液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×106CFU/mL得到菌悬液(菌体)。
实施例3青春双歧杆菌15703菌悬液(菌体)的制备
将青春双歧杆菌15703活化培养后接种于BS液体培养基中，37℃培养24 h后，4℃，6000 r/min离心10 min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×106 CFU/mL得到菌悬液(菌体)。
实施例4青春双歧杆菌BSA05对高尿酸斑马鱼体内尿酸含量的影响
模型构建：将野生型AB系斑马鱼(5 dpf)置于于六孔板中。实验设置正常组、模型组、阳性对照组(别嘌醇)、青春双歧杆菌15703干预组(1×106CFU/m)，青春双歧杆菌BSA05干预组(1×106 CFU/m)，每组设置6个复孔，每孔50条鱼，用200μmoL/L氧嗪酸钾与10μmoL/L黄嘌呤钠盐联合处理斑马鱼(5 dpf)24 h后构建高尿酸模型。
干预：正常组和模型组每孔加入5 mL PBS；阳性对照组每孔加入5 mL 3mmoL/L别嘌醇溶液；青春双歧杆菌15703干预组加入1×106 CFU/mL青春双歧杆菌15703，青春双歧杆菌BSA05干预组加入1×106 CFU/mL青春双歧杆菌BSA05，每孔5 mL，28℃孵育，24 h后更换新溶液；孵育48 h后收集斑马鱼至1.5 mL离心管，每管40条斑马鱼，每个实验组收集6管；将离心管中的水吸干后，加入50μL冰PBS缓冲液，用S-18KS手持微量电动组织匀浆器将斑马鱼匀浆破碎，直至无明显组织碎块，15000×g，4℃离心15 min，收集上清液。使用尿酸试剂盒检测各组的尿酸浓度(A)。降尿酸率计算如下：
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SD数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：####p<0.001，与模型组相比：**P<0.01，****P<0.001。
结果见图2和图3；由图2和图3可知，与正常组(17.44±2.23μmoL/L)相比，模型组斑马鱼体内的尿酸含量(53.89±4.11μmoL/L)显著增加(P<0.001)，说明本次斑马鱼高尿酸模型建立成功。
由图2和图3可知，阳性对照组斑马鱼体内的尿酸含量为23.94±4.31μmoL/L，同时降尿酸率为82.18±11.83％，与模型组(53.89±4.11μmoL/L)相比差异性显著(P<0.001)，因此，别嘌醇具有降尿酸的作用，与临床结果一致，说明本次降尿酸的功效评价试验有效。青春双歧杆菌15703组(1×106CFU/mL)斑马鱼体内的尿酸含量为43.99±5.32μmoL/L，降尿酸率为27.16±14.60％，与模型组(53.89±4.11μmoL/L)相比差异性显著(P<0.01)。另外，青春双歧杆菌BSA05组(1×106CFU/mL)斑马鱼体内的尿酸含量为27.70±5.56μmoL/L，降尿酸率为71.86±15.25％，与模型组(53.89±4.11μmoL/L)相比差异性显著(P<0.001)。因此，上述结果表明，在相同的浓度时，青春双歧杆菌BSA05对高尿酸斑马鱼体内尿酸降低的作用强于青春双歧杆菌15703，具有预防或治疗高尿酸血症的潜能。
实施例5青春双歧杆菌BSA05对高尿酸斑马鱼体内黄嘌呤氧化酶活性的影响
取实施例4各组斑马鱼匀浆离心后的上清液，使用黄嘌呤氧化酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)检测各组斑马鱼体内黄嘌呤氧化酶的活性(F)。黄嘌呤氧化酶活性抑制率计算如下：
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SD数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：####p<0.001，与模型组相比：*P<0.05，****P<0.001。
结果见图4和图5；由图4和图5可知，与正常组(9.70±2.53U/L)相比，模型组斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性(27.15±3.50U/L)显著升高(P<0.001)，说明本次斑马鱼高尿酸模型建立成功。
由图4和图5可知，阳性对照组斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性为14.22±2.24U/L，同时黄嘌呤氧化酶活性抑制率为74.05±12.82％，与模型组(27.15±3.50U/L)相比差异性显著(P<0.001)，因此，别嘌醇具有抑制黄嘌呤氧化酶活性的作用，与临床结果一致，说明本次降尿酸的功效评价试验有效。青春双歧杆菌15703组(1×106CFU/mL)斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性为22.74±2.70U/L，黄嘌呤氧化酶活性抑制率为25.28±15.49％，与模型组(27.15±3.50U/L)相比差异性显著(P<0.05)。另外，青春双歧杆菌BSA05组(1×106CFU/mL)斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性为15.80±2.55U/L，黄嘌呤氧化酶活性抑制率为65.00±14.61％，与模型组(27.15±3.50U/L)相比差异性显著(P<0.001)。因此，上述结果表明，在相同的浓度时，青春双歧杆菌BSA05对高尿酸斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用强于青春双歧杆菌15703，具有降尿酸的潜能。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.青春双歧杆菌BAS05在制备降尿酸药物中的应用，其特征在于，所述青春双歧杆菌BAS05的保藏编号为CGMCCNo.22515。
2.根据权利要求1所述的青春双歧杆菌BAS05在制备降尿酸药物中的应用，其特征在于，所述青春双歧杆菌BAS05为菌悬液。
3.权利要求1中所述的青春双歧杆菌BAS05在抑制黄嘌呤氧化酶中的应用。
4.根据权利要求3所述的青春双歧杆菌BAS05在抑制黄嘌呤氧化酶中的应用，其特征在于，所述青春双歧杆菌BAS05为菌悬液。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN117547558A (zh) * | 2023-11-20 | 2024-02-13 | 广东南芯医疗科技有限公司 | 青春双歧杆菌bas05在制备抗抑郁药物中的应用 |
| NL2035839B1 (en) * | 2022-11-23 | 2024-05-30 | Guizhou Zhende Biotechnology Co Ltd | Medicinal and edible homologous enzyme with uric acid lowering effect and preparation method thereof |
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- 2023-04-27 CN CN202310469856.2A patent/CN116515695A/zh active Pending
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