CN111154693A - 一株可改善上呼吸道感染症的鼠李糖乳杆菌Probio-M9及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一株可改善上呼吸道感染症的鼠李糖乳杆菌Probio‑M9及其应用。本申请以鼠李糖乳杆菌Probio‑M9为研究对象，选择志愿者91人，随机分为益生菌组和安慰剂组进行为期6周的干预试验，并每周对志愿者进行一次调查随访。实验证明，鼠李糖乳杆菌Probio‑M9可改善成人在流感高发季节上呼吸道感染的症状并缩短症状持续时间。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别涉及一株可改善上呼吸道感染症的鼠李糖乳杆菌Probio-M9及其应用。
背景技术
流感有季节性流行和流感大流行之分。季节性流感指的是每年冬春季节发生的流感，主要因流感病毒发生小的变异所致。流感大流行是指当流感病毒发生突变，人类对其缺乏免疫能力，从而引发全球范围内流行。患流感的几率在一定程度上取决于每个人免疫系统的强弱。
上呼吸道感染是常见病、多发病，是包括鼻腔、咽或喉部急性炎症的总称。广义的上呼吸道感染不是一个疾病诊断，而是一组疾病，包括普通感冒、病毒性咽炎、喉炎、疱疹性咽峡炎等；狭义的上感又称普通感冒，是最常见的急性呼吸道感染性疾病，多呈自限性，但发生率较高，其发病率历年都高于其他病种。成人每年发生2-4次，儿童发生率更高，每年6-8次，全年皆可发病，冬春季较多。
目前，成人或儿童预防或治疗上呼吸道感染通常采用注射或口服给药的方式，但这些方式在预防和治疗过程中会对病人造成给药痛苦以及疼痛，尤其儿童因为害怕疼痛以及厌恶药的味道对注射以及口服给药的方式配合度很低，治疗效果受到影响。因此，缺少一种高效、安全、无毒副作用的可改善成人流感季节上呼吸道感染症状的益生菌。
发明内容
本申请的目的之一在于提供一株可改善上呼吸道感染症的鼠李糖乳杆菌Probio-M9。
本申请的目的之二在于提供鼠李糖乳杆菌Probio-M9在改善上呼吸道感染症的应用。
进一步地，所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9在发酵剂或添加的发酵乳、健康食品以及动物保健制品中的应用。
本申请的鼠李糖乳杆菌Probio-M9是通过以下技术方案实现的：
本申请所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9是从中国内蒙古、新疆、湖北、北京等地区100份健康妇女母乳样中分离得到的540株乳酸菌和双歧杆菌中筛选出的一株具有潜在益生特性的益生菌。具体地，通过以下分离方法得到的：
步骤1：将采集到的100份健康妇女的母乳样品进行倍比稀释，得到10-1-10-2稀释梯度，吸取各梯度母乳样品200μL均匀涂布于MRS固体培养基平皿内，37℃厌氧培养48-72h；
所述MRS培养基的组成有大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、Tween80 1ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，琼脂15g，121℃、15min灭菌。
步骤2：挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养24h；
步骤3：待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检。保存分离株，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析；
步骤4：将冷冻保存的供试菌株接种于TPY增菌液体培养基中，于30℃恒温培养24h，经TPY传代培养2-3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内离心，经8000×g离心3min(4℃)后收集菌体，弃上清；
所述TPY增菌培养液的组成有乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、磷酸氢二钾2.5g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.1g、吐温80 0.25g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、15g琼脂、蒸馏水1L，121℃、15min灭菌。
步骤5：采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA；
步骤6：采用PacBio SMRT RSII第三代测序平台对菌株全基因组进行测定，其基因组长度3,002,913bp，GC含量46.77％，染色体基因组含有2965个编码基因，76个RNA基因。
所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9形态学特征为菌体在显微镜(5000倍电镜)下呈杆状，细胞成单、成对或成链状，不具鞭毛或纤毛，不会移动。
所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9在MRS培养基上形成的明显菌落且较大，直径在0.5-1mm之间，边缘整齐，呈奶油白色的不透明菌落。
本申请提供一株可改善上呼吸道感染症的鼠李糖乳杆菌Probio-M9，所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9(Lactobacillus rhamnosus Probio-M9)是从100份健康妇女母乳样中分离得到的540株乳酸菌和双歧杆菌中筛选出的一株具有潜在益生特性的益生菌，该菌株保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNo.18639；分类命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)；保藏时间：2019年10月08日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；该菌株的检测结果为存活。
本申请的鼠李糖乳杆菌Probio-M9具有改善上呼吸道症状的效果，具备作为益生菌的基本条件，可以作为益生菌添加到各类普通食品、保健品等中。
本申请提供一株可改善上呼吸道感染症的鼠李糖乳杆菌Probio-M9。本申请以鼠李糖乳杆菌Probio-M9为研究对象，选择志愿者91人，随机分为益生菌组和安慰剂组进行为期6周的干预试验，并每周对志愿者进行一次调查随访。实验证明鼠李糖乳杆菌Probio-M9可改善成人在流感高发季节上呼吸道感染的症状并缩短症状持续时间。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Probio-M9干预期间上呼吸道感染人数图；
图2为益生菌组胃肠症状评分图；
图3为安慰剂组胃肠症状评分图。
具体实施方式
本申请提供一株可改善上呼吸道感染症的鼠李糖乳杆菌Probio-M9，所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9(Lactobacillus rhamnosus Probio-M9)是从100份健康妇女母乳样中分离得到的540株乳酸菌和双歧杆菌中筛选出的一株具有潜在益生特性的益生菌，该菌株保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNo.18639；分类命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)；保藏时间：2019年10月08日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；该菌株的检测结果为存活。
本申请的鼠李糖乳杆菌Probio-M9是通过以下技术方案实现的：
本申请所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9是从中国内蒙古、新疆、湖北、北京等地区100份健康妇女母乳样中分离得到的540株乳酸菌和双歧杆菌中筛选出的一株具有潜在益生特性的益生菌。具体地，通过以下分离方法得到的：
步骤1：将采集到的100份健康妇女的母乳样品进行倍比稀释，得到10-1-10-2稀释梯度，吸取各梯度母乳样品200μL均匀涂布于MRS固体培养基平皿内，37℃厌氧培养48-72h；
所述MRS培养基的组成有大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、Tween80 1ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，琼脂15g，121℃、15min灭菌。
步骤2：挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养24h；
步骤3：待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检。保存分离株，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析；
步骤4：将冷冻保存的供试菌株接种于TPY增菌液体培养基中，于30℃恒温培养24h，经TPY传代培养2-3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内离心，经8000×g离心3min(4℃)后收集菌体，弃上清；
所述TPY增菌培养液的组成有乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、磷酸氢二钾2.5g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.1g、吐温80 0.25g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、15g琼脂、蒸馏水1L，121℃、15min灭菌。
步骤5：采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA；
步骤6：采用PacBio SMRT RSII第三代测序平台对菌株全基因组进行测定，其基因组长度3,002,913bp，GC含量46.77％，染色体基因组含有2965个编码基因，76个RNA基因。
所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9形态学特征为菌体在显微镜(5000倍电镜)下呈杆状，细胞成单、成对或成链状，不具鞭毛或纤毛，不会移动。
所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9在MRS培养基上形成的明显菌落且较大，直径在0.5-1mm之间，边缘整齐，呈奶油白色的不透明菌落。
具体地，鼠李糖乳杆菌Probio-M9的研究设计，包括：
A.以鼠李糖乳杆菌Probio-M9(Lactobacillus rhamnosus Probio-M9)为研究对象，选择91名志愿者，随机分为益生菌组(N＝46)和安慰剂组(N＝45)进行为期6周的干预试验，每周对志愿者进行一次问卷调查；
B.问卷调查的内容包含上呼吸道症状和胃肠症状。
本发明的鼠李糖乳杆菌Probio-M9具有改善上呼吸道症状和胃肠症状的效果，具备作为益生菌的基本条件，可以作为益生菌添加到各类普通食品、保健品等中。
问卷调查的评价结果分析
表1
表2
通过问卷调查中对上呼吸道感染症状的结果进行统计如表1-2和图1，从结果中可以看出，安慰剂组中上呼吸道感染症状平均持续时间为2.60周，益生菌组中症状平均持续时间为2.14周，由此分析服用鼠李糖乳杆菌Probio-M9干预期间，安慰剂组每周上呼吸道感染症状人数显著高于益生菌组，而益生菌组可降低出现上呼吸道感染症状的人数和缩短了症状持续时间。
如图2和图3所示，服用鼠李糖乳杆菌Probio-M9益生菌制剂3周后，肠道症状得到显著改善，说明服用3周鼠李糖乳杆菌Probio-M9对胃肠症状的改善作用最明显。
本申请提供一株可改善上呼吸道感染症的鼠李糖乳杆菌Probio-M9。本申请以鼠李糖乳杆菌Probio-M9为研究对象，选择志愿者91人，随机分为益生菌组和安慰剂组进行为期6周的干预试验，并每周对志愿者进行一次调查随访。实验证明鼠李糖乳杆菌Probio-M9可改善成人在流感高发季节上呼吸道感染的症状并缩短症状持续时间。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的申请后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。
Claims (3)
1.一株可改善上呼吸道感染症的鼠李糖乳杆菌Probio-M9，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9(Lactobacillus rhamnosus Probio-M9)是从100份健康妇女母乳样中分离得到的540株乳酸菌和双歧杆菌中筛选出的一株具有潜在益生特性的益生菌，该菌株已于2019年10月08日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCNo.18639。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Probio-M9在改善上呼吸道感染症的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌Probio-M9在发酵剂或添加的发酵乳、健康食品以及动物保健制品中的应用。
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