CN104997813A

CN104997813A - 益生微生态制剂的制备方法

Info

Publication number: CN104997813A
Application number: CN201510360355.6A
Authority: CN
Inventors: 周东蕊; 白志茂; 张红琳
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: CN104997813B

Abstract

本发明公开了一种益生微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：收集健康动物消化道内容物或粪便，取蛋白类、脂类、碳水化合物类动植物素材混合，得到培养基，高压灭菌、装罐，将消化道内容物或粪便接种于其中，在低于42°C的厌氧条件下发酵，得到粪便发酵物；取部分粪便发酵物再次接种于混合物中，在低于42°C的厌氧条件下发酵，连续接种并发酵至少4次，得到发酵产物；高通量测序最后三次发酵产物的微生物宏基因组中的细菌、真菌或病毒的类型，鉴定其中微生物的遗传稳定情况，遗传稳定的发酵产物低温贮存备用。由本发明制备得到的益生微生态制剂含有多种益生肠道微生物，更有利于调节肠道微生物，刺激机体免疫系统的发育。

Description

益生微生态制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种益生微生物群落的制备技术。

背景技术

该发明是基于卫生假说理论。卫生假说（hygiene hypothesis）是一种医学的假说，指因缺少接触传染源、共生微生物（如胃肠道菌群，益生菌）与寄生物，从而抑制了免疫系统的正常发展，增加了免疫系统相关疾病发病率。卫生假说的相关报导，早在1870S，Blackley CH等就发现，贵族更易患花粉症（过敏性鼻炎，Hayfever）；1966, Leibowitz 报导了在以色列，多发性硬化症（multiple sclerosis）的发生率与清洁度正相关；到了1989年， Strachan 发现兄弟姐妹较多的家庭，花粉症较少发生，在总结前人的报导以及基于相关调查数据，提出‘hygiene hypothesis’这个概念。自2000年以来，多篇文章发表在世界顶级医学杂志《新英格兰杂志》（N Engl J Med）及《柳叶刀》（The Lancet），报导了过敏及慢性炎症在西方社会发生率越来越高，其发生率与清洁度相关。最近的报导表明，成人过于清洁对于免疫系统的健康也具有较大影响，成人后过于清洁，花发粉症等各种免疫系统疾病的发病率显著增加。

研究卫生假说发生原因，有人发现无菌鼠免疫系发育不全，极微量的病原菌就可以导致无菌鼠的感染死亡。人体中的微生物，肠道微生物最为丰富多样，而胃肠道具有人体最大的免疫组织，它包括派伊尔淋巴集结（peyer’s patch ）和肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nod （MLN）），肠道微生物通过对该免疫组织的影响需影响着全身免疫系统的发育。

发达国家青少年自身免疫性疾病与急性淋巴性白血病发病率的增加被认为与卫生假说有关。一些证据表明自闭症是由免疫疾病导致的。人类微生物组学（Human Microbiome Project, HMP）分别测序分析了四十位居住在乡村和城市肠道微生物样本，发现居住在农村的被试肠道微生物群落中嗜酸乳杆菌（lactobacillus acidophilus ）LA 含量是城市居住着的3-5倍，LA具有合成维生素K的功能。还有研究分析了具有变态反应婴儿与没有变态反应的婴儿肠道微生物的组成，发现健康婴儿肠道内有大量的双歧杆菌（Bifidobacteria）和乳酸菌（lactobacillus），而有变态反应的婴儿则具有较多的梭状芽胞杆菌（clostridia）。另外，他们还发现来自于有变态反应婴儿的Bifidobacteria诱导产生较多的炎性因子，而来自于健康儿童的Bifidobacteria则诱导出更多的抗炎性因子。

目前的卫生假说研究进一步证明，卫生假说除与免疫系统疾病相关外，还与孤独症、癌症、糖尿病的发生相关。孤独症是近年来发生率逐年增加的一种大脑广泛发育障碍，患者多数生活不能自理，对家庭对社会带来严重的负担。美国发生率1975年为5000分之一，而2012年已增长为1/88。究其原因，初步研究表明，其发生机理为：过于清洁导致免疫系统紊乱，免疫因子分泌失调，而免疫因子是神经发育的重要调控因子，如长期使用干扰素可引起抑郁症。还有多项报导，过于清洁还可以导致白血病与皮肤病癌的发生。

目前我国大城市居民过敏性鼻炎的发病率已经上升到了10%左右，其他类似的过敏性疾病，包括枯草热、湿疹、哮喘和食品过敏等的发病率也逐年上升，正在向发达国家的水平逼近。西方国家工业化之前，过敏性疾病同样也是十分罕见的。可如今在英国、澳大利亚和新西兰等国，哮喘的发病率已经上升到了20%，成为医疗系统的一大负担。

过于清洁易患免疫系统疾病，不清洁又容易引起各种感染，目前美国多个实验室开始研究治疗方案，但市场上仍未见有相关产品推出。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种多元益生微生态制剂的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：

提供一种益生微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）收集健康动物消化道内容物或粪便；

（2）取蛋白类、脂类、碳水化合物类动植物素材按一定比例混合，磨碎成糊状，高压灭菌，装罐；

（3）将步骤（1）中所述消化道内容物或粪便接种于步骤（2）制备得到的混合物中，在低于42°C的厌氧条件下发酵，得到粪便发酵物；

（4）取部分所述粪便发酵物接种于步骤（2）制备得到的混合物中，在低于42°C的厌氧条件下发酵，连续接种并发酵至少4次，得到发酵产物；

（5）高通量测序最后三次经步骤（4）处理后的发酵产物的微生物宏基因组中的细菌、真菌或病毒类型，鉴定所述发酵产物中微生物的遗传稳定情况；

（6）将经步骤（5）鉴定得到遗传稳定的发酵产物低温贮存备用。

在本发明一个较佳实施例中，所述的益生微生态制剂为微生物群落制剂，所述群落组成包括：细菌、真菌、古细菌、病毒和寄生虫，但无病原微生物和致病性寄生虫。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中的所述动物包括了脊椎动物和无脊椎动物。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中的所述消化道是指口腔、肠腔、食管、胃或肠道。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中的所述蛋白类、脂类、碳水化合物类素材包括：动物源性、植物源性和微生物源性的蛋白类、脂类、碳水化合物。

在本发明一个较佳实施例中，在步骤（4）中，粪便发酵物连续接种，直至微生物能够稳定遗传。

本发明的有益效果是：

1）由本发明制备得到的益生微生态制剂含有多种益生肠道微生物，更有利于调节肠道微生物，有利于刺激机体免疫系统的发育；

2）本发明中的益生微生态可以长期培养，微生物种类与特性都可以了解清楚，具有药用价值的潜力；

3）本发明中采用的原料充足、价格低廉；

4）本发明制备简单易于操作。

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1 羊瘤胃微生物发酵制剂的制备。

技术方案：

（1）选取青玉米栉、青三叶草、干花生秧、干玉米栉、胡萝卜、玉米、大豆，按照重量比分别25：10：9：21：5：21：9进行粉碎后，混合均匀，加入1/3混合物重量的超纯水，搅拌均匀，高压灭菌，制成培养基；

（2）选择健康山羊，屠宰后立即取出羊瘤胃，并将瘤胃内容物收集于灭菌后的容器中，置冰上转移到无菌室；

（3）取部分羊瘤胃内容物样本，抽提微生物宏基因组DNA，PCR法检测瘤胃微生物是否有常见病原微生物（细菌，真菌和病毒），若无病原微生物则进入下一步实验；

（4）无菌条件下，将约5克重量的瘤胃内容物接种于200克上述灭菌后的培养基中，并将接种物与培养基混合均匀；

（5）将羊瘤胃内容物接种物置于严格厌氧37°C条件下发酵20天，每天无菌条件下至少搅拌一次；

（6）将约5克上述发酵物接种于同样的培养基中，同样的条件下发酵20天；连续接种最少4次；

（7）分别取最后三次发酵物200mg，酚氯仿法或者采用粪便微生物试剂盒提取宏基因组DNA；

（8）采用高通量测序仪测序细菌16S rRNA的方法，分析发酵物细菌种类与各种细菌的含量；分析微生物的稳定遗传情况；

（9）如果发酵物细菌群落已能相对稳定传代，在-80°C的条件下保存备用。

本实施例的检测结果如下表所示：

表1. 羊瘤胃微生物发酵制剂中含量为前20种菌属类型与含量。

上表为高通量测序细菌16s rRNA基因结果。其中 S5表示羊瘤胃内容物第5次接种，S6为羊瘤胃第6次接种，S7为羊瘤胃第7次接种。

实施例2 猪盲肠微生物发酵制剂的制备。

（1）选取青玉米栉、青三叶草、玉米、大豆，按照重量比21：9：49：21进行粉碎，然后混合均匀，加入1/3混合物总重量的超纯水，搅拌均匀，高压灭菌，制成培养基；

（2）选择健康成年猪，屠宰后取出盲肠，并将盲肠内容物收集于灭菌后的容器中，置冰上转移到无菌室；

（3）取部分盲肠内容物样本，抽提微生物宏基因组DNA，PCR法检测盲肠微生物是否有常见病原微生物（细菌，真菌和病毒），无病原微生物进入下一步实验；

（4）无菌条件下，将约5克重量的盲肠内容物接种于200克上述灭菌后的培养基中，并将接种物与培养基混合均匀；

（5）将盲肠内容物接种物置于严格厌氧37°C条件下发酵20天，每天无菌条件下至少搅拌一次；

（6）将约5克上述发酵物接种于同样的培养基中，同样的条件下发酵20天；连续接种最少4次。

（8）采用高通量测序仪测序细菌16s rRNA的方法，分析发酵物细菌种类与各种细菌的含量（表2）；分析微生物的稳定遗传情况。

（9）如果发酵物细菌群落已能相对稳定传代，-80°C保存备用。

本实施例的检测结果如下表所示：

表2. 猪盲肠微生物发酵制剂中含量为前20种菌属类型与含量。

上表为高通量测序细菌16s rRNA基因结果。其中P6为猪盲肠内容物第6次接种，P7为猪盲肠内容物第7次接种，P8为猪盲肠内容物第8次接种。

实施例3 健康人新鲜粪便微生物发酵制剂的制备。

（1）选取新鲜芹菜、胡萝卜、土豆、红薯、大米、大豆、鸡蛋、猪后腿精肉、牛奶和食盐，按照重量比15：5：10：5：40：5：4：6：10：0.08进行粉碎后，混合，再加入1/2混合物重量的超纯水，搅拌均匀，高压灭菌，制成培养基；

（2）选择健康成年人，饮食习惯良好，健康状况良好；采集新鲜粪便，冻存备用，或置冰上转移到无菌室；

（3）部分粪便样本，抽提DNA，PCR法检测粪便微生物是否有常见病原微生物（细菌，真菌和病毒），无病原微生物进入下一步实验；

（4）无菌条件下，将约3克重量的粪便接种于200克上述灭菌后的培养基中，并将接种物与培养基混合均匀；

（5）将粪便接种物置于严格厌氧37°C条件下发酵20天，每天无菌条件下至少搅拌一次；

（8）采用高通量测序仪测序细菌16SrRNA的方法，分析发酵物细菌种类与各种细菌的含量（表1）；分析微生物的稳定遗传情况；

本实施例的检测结果如下表所示：

表3. 健康人新鲜粪便微生物发酵制剂中含量为前20种菌属类型与含量。

上表为高通量测序细菌16s rRNA基因结果。其中H4为人粪便第4次接种培养物，H5为人粪便第5次接种培养物，H6为人粪便第6次接种培养物。

动物胃肠道具有丰富的微生物，猪盲肠内微生物含量是10¹⁰-10¹¹个/克食糜。但同时肠道中也往往含有多种病原微生物，使用不当，常常会引起感染等疾病。本发明挑选健康动物，采集粪便或肠内容物进行体外发酵，既可以使肠道微生物得以大量繁殖，又保证了发酵产物中不含病原微生物，为过于清洁导致的免疫系统疾病的预防与治疗提供有效制剂或产品。

本发明中的发酵产物为一个微生物群落，这与和常规的益生菌制剂不同，常规的益生菌制剂只有一种或少数几种益生菌；本发明得到的发酵微生物来源于粪便或肠道微生物，与常规的发酵食品也不同，本发明得到发酵微生物制剂含有多种益生肠道微生物，更有利于调节肠道微生物，有利于刺激机体免疫系统的发育。

本发明制备的益生微生态制剂与传统的益生菌制剂相较，优势在于：

1、该项发明微生态制剂中含有多种益生微生物，具有较好肠道微生态和人体免疫力调节作用：传统的益生菌制剂大多含有一种益生菌或2-6种益生菌联合使用，这些有限的益生菌作用与效果非常有限，最新的多篇研究证明，目前多种益生菌制剂对人体根本没有作用。究其原因，有研究表明调节性T细胞（Regulatory cell ,简称Treg ）的诱导需要多种具有不同抗原性的细菌来诱导，单纯的一种或有限种类的细菌无法正常诱导Treg 细胞的活性，进而引起免疫系统疾病。因此，该项发明具有传统益生菌制剂无法比拟的作用与功能。

2、该发明微生态制剂中含有丰富的常规培养法无法培养的益生菌：动物与人粪便中含有丰富的对人体免疫力及肠道微生态平衡具有重要调控作用的微生物，然而，多项研究证明粪便中99%以上微生物采用传统的分离培养的方法无法培养。该项发明通过大量的微生物共同培养的方式，将大量对人体有益的微生物共同培养出来。多数微生物无法独立培养的原因是由于微生物之间存在着共生关系，只拿出来一种微生物培养，多数微生物无法培养出来。

3、未经培养的肠道微生物的安全性监测成本较高：如前所述，动物及人体肠源微生物对于人体免疫力与肠道微生态起着重要调控作用，如果直接采集和使用动物及人类粪便作为药物或保健品进食，主要存在粪便安全检测成本较高等问题。动物及人类粪便中虽然含有大量的益生微生物，但同时也容易滋生病原，不同动物（人）不同时期粪便中的病原微生物的含量都不一样，加上病原微生物种类繁多，因此安全检测较高。

4、该项发明中的微生态制剂保存运送和生产成本相对较低：如前所述，动物及人体肠源微生物对于人体免疫力与肠道微生态起着重要调控作用，但由于粪便需要在绝对低温与厌氧条件下保存才能保证微生物种类与含量不出现变化，而该项发明在密闭条件下，微生物种类较为稳定，因此，保存运送及生产成本相对较低。

5、该项发明中的微生态制剂采用高通量测序细菌16s核糖体RNA （16s rRNA）的方法来鉴定细菌的种类与微生态的稳定性：16s rRNA是细菌核糖体组成成份，每一种细菌都具有自己特异16s rRNA基因序列，如同细菌种类的条型码，一直被用于细菌鉴定的金标准。采用DNA高通量测序技术，样本种含有上万以上的细菌，一次测序理论上都可以鉴定出来。该项发明采用DNA高通量测序技术鉴定经过多次传代培养的微生态制剂，既可以鉴定该制剂中微生物的种类，也可以鉴定出多次培养后细菌的稳定性，通过细菌种类的稳定性指示真菌和病毒含量的稳定性。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种益生微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）收集健康动物消化道内容物或粪便；

（2）取蛋白类、脂类、碳水化合物类动植物素材按一定比例混合，磨碎成糊状，高压灭菌，装罐，制成培养基；

（3）将步骤（1）中所述消化道内容物或粪便接种于步骤（2）制备得到的培养基中，在低于42°C的厌氧条件下发酵，得到粪便发酵物；

（4）取部分所述粪便发酵物接种于步骤（2）制备得到的培养基中，在低于42°C的厌氧条件下发酵，连续接种并发酵至少4次，得到发酵产物；

2.根据权利要求1所述的益生微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述的益生微生态制剂为微生物群落制剂，所述群落组成包括：细菌、真菌、古细菌、病毒和寄生虫，但无病原微生物和致病性寄生虫。

3.根据权利要求1所述的益生微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中的所述动物包括了脊椎动物和无脊椎动物。

4.根据权利要求1所述的益生微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中的所述消化道是指口腔、肠腔、食管、胃或肠道。

5.根据权利要求1所述的益生微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中的所述蛋白类、脂类、碳水化合物类素材包括：动物源性、植物源性和微生物源性的蛋白类、脂类、碳水化合物。

6.根据权利要求1所述的益生微生态制剂的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，粪便发酵物连续接种，直至微生物能够稳定遗传。