IT202100002000A1 - Integratore alimentare derivante dal contenuto ruminale di bovini e ovini e dal contenuto ciecale di coniglio - Google Patents

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: Integratore alimentare derivante dal contenuto ruminale di bovini e ovini e dal contenuto ciecale di coniglio

Sfondo dell?invenzione

La presente invenzione si riferisce al campo degli integratori alimentari in quanto si riferisce ad un cosiddetto supplemento alimentare probiotico e prebiotico biologicamente appropriato (BAPPAS), preferibilmente in forma liofilizzata o in polvere, che deriva dal contenuto ruminale di bovini e ovini e dal contenuto ciecale di coniglio, e viene utilizzato per l'integrazione alimentare, poich? mantiene intatte le componenti nutritive del materiale di partenza, quali acidi grassi volatili, amminoacidi, vitamine, minerali e fibre alimentari, contiene un'altissima carica di derivati batterici, protozoi e lieviti, che sono in grado di stimolare il sistema immunitario del tratto gastrointestinale degli animali, in particolare animali domestici, come cani e gatti.

Stato dell?arte

Il contenuto predigerito ruminale e il contenuto ciecale sono uno dei sottoprodotti della macellazione e sono costituiti da alimenti vegetali ingeriti e fermentati/predigeriti e non, oltrech? da microrganismi rumine/ciecali e prodotti finali delle attivit? metaboliche dei microrganismi come proteine microbiche, aminoacidi, vitamine e acidi grassi volatili. Questi tipici digeriti gastrointestinali non contengono fattori anti-fisiologici ( 2010. Growth and haematological response of growing rabbits to diets containing graded levels of sun dried bovine rumen content. African Journal of Food, Agriculture, Nutrition and Development. 10: 4444?4457). La proteina grezza (CP) nel digerito ruminale essiccato (DRD) e nel contenuto colico/ciecale essiccato (DCC), varia dal 9% al 20% della sostanza secca (DM) e, se opportunamente trattato, pu? essere utilizzato come fonte di proteine nell'alimentazione animale, riducendo il carico dei residui di DRD/DCC che derivano dalla macellazione, evitando di lasciare questi sottoprodotti a decomporsi o allo smaltimento speciale, con un elevato impatto ambientale e problemi di smaltimento (

2002. Utilization of flavor treated blood-rumen content mixture in the diets of laying hens. Prod. 29,34? 39; (2011b). Nutritive Value of Dried Rumen Digesta as Replacement for Soybean in Diets of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Fingerlings. Pakistan Journal of Nutrition. 10(6): 568-571.

A. B. I. 2006. Evaluation of Performance, Organ Characteristics and Economic Analysis of Broiler Finisher Fed Dried Rumen Digesta. Int. J. Poult. Sci. 5:1116-1118). Sono stati condotti diversi studi soprattutto per quanto riguarda l'integrazione di DRD nelle diete dei pesci (

(2011a). Growth Response of African Catfish (Clarias gariepinus, Burchell 1822) to Dried Rumen as a Dietary Supplement. Pak. J. Nutr., 10(6): 564-567;

V. N. (2011b). Nutritive Value of Dried Rumen Digesta as Replacement for Soybean in Diets of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Fingerlings. Pakistan Journal of Nutrition. 10(6): 568-571), dei polli d?allevamento e delle galline ovaiole (

A. B. I. 2006. Evaluation of Performance, Organ Characteristics and Economic Analysis of Broiler Finisher Fed Dried Rumen Digesta. Int. J. Poult. Sci.

5:1116-1118), Odunsi, A. A. (2003). Blend of bovine blood and rumen digesta as a replacement for fishmeal and groundnut cake in layer diets. Inter. J. Poult. Sci. 2 (1): 58-61), e anche dei conigli ( , A. R. 2005. Performance evaluation of growing rabbits fed varying levels of rumen content and blood rumen content mixture. Nig. J. Anim. Prod. 32(1): 67-72

I. S. 2010. Growth and haematological response of growing rabbits to diets containing graded levels of sun dried bovine rumen content. African Journal of Food, Agriculture, Nutrition and Development. 10: 4444?4457).

Il ruolo degli alimenti funzionali ? stato studiato nei cani (Canis lupus familiaris) e nei gatti (Felis catus) (

(2003). Nutritional genomics: implications for companion animals J. Nutr., 133, 3033-3040). Oggi molte diete per animali carnivori domestici (es. alimenti per cani e gatti) e per carnivori selvatici (es. Ghepardo) sono arricchite con fibre di derivazione vegetale per i loro effetti benefici sull'assunzione di cibo, l'appetito e la salute intestinale ( Talalay P. (2004). The ?Prochaska? microtiter plate bioassay for inducers of NQO1. Chapter 14 in Methods in Enzymology, Vol. 382, Part B, pp. 243-258 (Eds.) Elsevier Science, San Diego, CA). Tuttavia, la dieta naturale di un carnivoro obbligato raramente include fibre vegetali ed ? caratterizzata da un alto contenuto di proteine e da un basso livello di carboidrati (

Hendriks E. H. 2011. Estimation of the dietary nutrient profile of free-roaming feral cats: possible implications for nutrition of domestic cats. Br. J. Nutr., 106, S35-S48.

2015. Dietary nutrient profiles of wild wolves: insights for optimal dog nutrition? Br. J. Nutr. 113, S40-S54).

Nonostante l?elevata capacit? di adattamento del microbiota intestinale ai cambiamenti dietetici, alcuni adattamenti evolutivi sono rimasti invariati. Il gatto domestico e il cane domestico appartengono all'ordine dei carnivori e le loro controparti ancestrali vivevano principalmente o interamente cibandosi di animali da preda catturati. Di conseguenza, hanno sviluppato una serie di adattamenti evolutivi progettati per facilitare la cattura, l'uccisione, il dilaniamento, la masticazione, la digestione e l'assorbimento dei tessuti degli animali. In questi animali, il tratto intestinale ? pi? corto e ha enzimi digestivi e flora intestinale diversi da quelli degli erbivori.

Sia i cani che i gatti sono caratterizzati da una mancanza di amilasi salivare e non sono in grado di sintetizzare la vitamina D e di digerire la cellulosa (NRC - National Research Council, "Carbohydrates and Fiber: Nutrient Requirements of Dogs and Cats," National Academies Press, , pp. 49-80).

In questi carnivori, la digestione della cellulosa e di altri polisaccaridi superiori ? minore rispetto a quella che avviene nei conigli, cavalli e ruminanti, in cui i prodotti della degradazione microbica dei polisaccaridi non sono zuccheri ma principalmente acidi grassi volatili a corta catena (SCFA). Gli SCFA vengono assorbiti e contribuiscono all'approvvigionamento energetico, e l'azione batterica nell'intestino crasso pu? sintetizzare la vitamina B, che pu? essere assorbita e utilizzata dall'ospite. Tuttavia, la sintesi della maggior parte delle vitamine nel tratto digerente nel cane e nel gatto ? insufficiente per il fabbisogno giornaliero, quindi ? necessario per loro assumerla da una fonte alimentare. Negli animali carnivori e onnivori, il materiale di scarto finale della digestione (feci), svuotato dall'intestino crasso, ? costituito da acqua, residui di cibo non digerito (in gran parte da alcune frazioni delle fibre), secrezioni digestive, cellule epiteliali del tratto gastrointestinale, sali inorganici, batteri e prodotti della decomposizione microbica. A partire da circa 33.000 anni fa, i cani furono addomesticati dai lupi (

, van der Plicht J. 2011. A 33,000-year-old incipient dog from the Altai mountains of Siberia: Evidence of the earliest domestication disrupted by the last glacial maximum. PLoS ONE. 6:57.;

2015. Ancient wolf genome reveals an early divergence of domestic dog ancestors and admixture into high-latitude breeds. Curr. Biol.

25:1515?1519). Questi cani ancestrali erano solo parzialmente dipendenti dagli avanzi di cibo umano. Di conseguenza, gli adattamenti comportamentali e fisiologici verso una dieta pi? varia, compreso l?utilizzo e la digestione di alimenti a base vegetale, sono stati necessari per consentire ai cani ancestrali di svilupparsi e raggiungere il successo evolutivo. Rispetto ai lupi carnivori, i cani moderni sono onnivori ed hanno sviluppato una capacit? superiore di metabolizzare i carboidrati e di sopravvivere con una dieta a basso contenuto di proteine (

J.N. 2014. Natural pet food: A review of natural diets and their impact on canine and feline physiology. J. Anim. Sci. 92:3781?3791). Gli adattamenti biochimici che facilitano questo passaggio includono una maggiore espressione genica per l'amilasi pancreatica, la capacit? di convertire il maltosio in glucosio e un aumento dell'assorbimento intestinale del glucosio. Il gatto ? stato invece addomesticato circa 10.000 anni fa (

Kitchener, A. C., et al. 2007. The Near Eastern origin of cat domestication. Science. 317:519?523) e ha svolto un ruolo leggermente diverso. Oltre ad essere usato come animale da compagnia, il gatto veniva usato per cacciare animali considerati parassiti come i topi (

S. J. 2009. From wild animals to domestic pets, an evolutionary view of domestication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106:S9971? S9978). Ancora oggi, i gatti domestici sono ben noti per la loro predilezione, in molti casi, a continuare a cacciare e uccidere animali selvatici. Di conseguenza, la pressione selettiva sui gatti per l?adattamento a nutrirsi con avanzi di cibo umano misto potrebbe essere stata inferiore a quella applicata ai cani, ed ? stata inoltre esercitata per una durata significativamente pi? breve.

Le diete commerciali includono comunemente parti del corpo di mucche, pecore, maiali, tacchini, anatre, polli, pesce e gamberi; alcuni dei quali sono stati etichettati come non idonei al consumo umano; anche il latte vaccino viene comunemente somministrato ai gatti, anche se alcuni, come gli esseri umani, sono intolleranti al lattosio e, di conseguenza, manifestano segni intestinali come la diarrea. Al contrario, la dieta naturale dei gatti selvatici consiste principalmente di piccoli mammiferi interi, uccelli, pesci, rettili e invertebrati. I cani selvatici sono noti per cacciare in branco, in modo simile ai canidi selvatici, e mangiano un'ampia variet? di cibi (

J.N. 2014. Natural pet food: A review of natural diets and their impact on canine and feline physiology. J. Anim. Sci.

92:3781?3791).

Sia nei canidi che nei felini, la maggior parte delle fibre e del materiale vegetale consumati in natura sono metabolicamente diversi dai carboidrati ad alto indice glicemico presenti nelle diete commerciali secche. Le diete naturali a base di carne cruda hanno un indice glicemico molto pi? basso, che aiuta a ridurre la resistenza all'insulina, l'infiammazione e lo stress postossidativo. I gatti, in particolare, non assumono nella dieta attuale commerciale priva di prede, quantit? adeguate di proteine, taurina, niacina, acido arachidonico e vitamine A, B1 e B12, e sono quindi predisposti a rischio di patologie oculari e cutanee, disturbi della coagulazione del sangue, disfunzioni del sistema immunitario, scarsa crescita, perdita di peso, diarrea e disturbi neurologici ( J. G. 1984. "Nutrition of the Domestic Cat, A Mammalian Carnivore" Annual Review of Nutrition. 4, 521-562).

L'abitudine dei predatori carnivori a mangiare prede intere, consente l'assunzione di fibra dalla componente vegetale contenuta nel tratto gastrointestinale della preda, sottoforma di materiale enzimatico predigerito, e assunzione anche della cosiddetta "fibra animale" (

2013. Animal fibre: The forgotten nutrient in strict carnivores? First insights in the cheetah. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. (Berl). 97:146?154.

G. P. 2012. Fermentation of Animal Components in Strict Carnivores: A Comparative Study with Cheetah Fecal Inoculum. Journal of Animal Science. 90(8): 2540-2548).

Questo materiale (peli, piume, squame, ossa etc.) ? ricco di glicoproteine che sono da poco a nulla digeribili, e mostra analogie con le fibre di origine vegetale in termini di potenziale di fermentazione. La fibra di origine vegetale ? una componente importante degli alimenti commerciali per cani e gatti, considerato il basso costo rispetto ad altri ingredienti. Quantit? elevate di questa fibra sono state pubblicizzate come un trattamento efficace per la diarrea perch?, se consumata, tende a rallentare la digestione e a dare pi? volume alle feci. Ci? ? dovuto alla sua tendenza ad attirare l'acqua e formare un gel. Tuttavia, un alto contenuto di fibre pu? anche ridurre la secrezione di enzimi pancreatici necessari per la digestione delle proteine ( 1982. "Effect of Dietary Fiber on Pancreatic Enzyme Activity in Vitro," Gastroenterology 82, 5. 1). I gatti hanno una quantit? inferiore di enzimi pancreatici rispetto ad altri mammiferi, quindi un'elevata quantit? di fibre nella loro dieta si traduce in un minore assorbimento e assimilazione dei nutrienti. Nei ruminanti, i foraggi ed i foraggi grezzi fibrosi, sono costituiti principalmente da polisaccaridi come la cellulosa, che non possono essere scomposti dagli enzimi digestivi dei mammiferi. I ruminanti hanno quindi sviluppato uno speciale sistema di digestione che coinvolge la fermentazione microbica del cibo prima della sua esposizione ai propri enzimi digestivi. Nel rumine, il cibo ? parzialmente fermentato per produrre principalmente acidi grassi volatili, cellule microbiche, gas metano e anidride carbonica. I gas vengono persi per eruttazione e gli acidi grassi volatili vengono assorbiti principalmente attraverso la parete del rumine. Le cellule microbiche e le componenti alimentari non degradate, passano nell'abomaso e nell'intestino tenue, dove vengono digerite e i prodotti della digestione vengono assorbiti. Nell'intestino crasso e nel cieco, gli acidi grassi volatili prodotti a livello intestinale vengono assorbiti e le cellule microbiche vengono escrete ? insieme a componenti alimentari non digerite - nelle feci. Il reticolo-rumine fornisce un sistema di coltura continua per batteri anaerobici, protozoi e funghi. Questa flora normale (batteri) e fauna (protozoi) del rumine diventa stabile molto presto nella vita, gi? a 6 settimane di et? nei vitelli.

Nei ruminanti, i protozoi includono diversi tipi come Dasytricha ruminantium, Isotricha prostoma ed Entodinium. I batteri appartengono a oltre 200 specie identificate e sono presenti in numero di 10<9>-10<10 >per millilitro di contenuto ruminale. La maggior parte di questi batteri sono anaerobi non sporigeni e rappresentano anche le specie/generi pi? importanti che si osservano ad alta concentrazione nel tratto gastrointestinale di carnivori sani (

J. S. 2020. The Effects of Nutrition on the Gastrointestinal Microbiome of Cats and Dogs: Impact on Health and Disease. Frontiers in Microbiology. 11:1266).

La tabella 1 elenca alcune delle specie pi? importanti e indica il substrato che utilizzano e i prodotti finali della fermentazione. Queste informazioni si basano su studi di specie isolate in vitro.

I batteri cellulolitici nei ruminanti svolgono un ruolo fondamentale nell'utilizzo di mangimi non adatti agli animali monogastrici e nel facilitare la sopravvivenza degli animali ruminanti ed erbivori medesimi quando questi sono alimentati con foraggi fibrosi e di scarsa qualit?. Durante il processo di fermentazione, l'energia viene rilasciata sotto forma di adenosina trifosfato (ATP), che viene utilizzata per alimentare diverse attivit? del microbiota ruminale. Questa energia pu? essere migliorata nei ruminanti integrando la dieta degli animali con grassi alimentari, un approccio che viene comunemente praticato. Il ruolo dei funghi nel rumine deve ancora essere completamente caratterizzato. Sono anaerobi stretti, possono utilizzare la maggior parte dei polisaccaridi e molti zuccheri solubili; ed ? noto che sono pi? numerosi (costituendo il 10% della biomassa microbica) quando le diete sono ricche di fibre (cio? non diete a base di cereali o erbe da pascolo giovani).

Tabella 1

C = cellulolitico; X = xilanolitico; A = amilolitico; D = destrinolitico; P = pectinolitico; PR = proteolitico; L = lipolitico; M = metanogeno; GU = utilizza glicerolo; LU = utilizzatore di lattato; SS = principale fermentatore di zucchero solubile, HU = utilizzatore di idrogeno; O = degradante dell'ossalato; F = formiato; A = acetato; E = etanolo; P = propionato; L = lattato; B = butirrato; S = succinato; V = valerato; CP = caproato; H = idrogeno; C = anidride carbonica; M = metano

Al giorno d'oggi, l'uso orale dei probiotici ? molto diffuso. Tuttavia, il profilo di sicurezza sull'uso di probiotici vivi ? ancora oggetto di dibattito. I rischi principali includono: i) casi di infezioni sistemiche dovute a traslocazione, in particolare in pazienti immunocompromessi vulnerabili e animali giovani/anziani; ii) acquisizione di geni di resistenza agli antibiotici; iii) interferenza con la colonizzazione intestinale nei neonati. Per evitare questi rischi, vi ? un crescente interesse per l?utilizzo di microrganismi non vitali o di estratti di cellule microbiche, principalmente batteri probiotici uccisi dal calore (inclusi i batteri tindalizzati) (batteri acido lattici e bifidobatteri e/o altri ceppi). Le cellule probiotiche trattate termicamente, i sovranatanti privi di cellule e i componenti chiave purificati sono in grado di conferire effetti benefici, principalmente effetti immunomodulatori, protezione contro enteropatogeni e mantenimento dell'integrit? della barriera intestinale. Questi trattamenti sulle sospensioni batteriche possono utilizzare un range di temperature compreso tra 70 e 100<?>C e in alcuni casi l'inattivazione si ottiene con la combinazione di trattamenti termici intervallati da periodi di incubazione a temperature inferiori, processo noto come tindalizzazione, per le somiglianze con il metodo di sterilizzazione sviluppato da Tyndall durante il diciannovesimo secolo (Kim, H., Kim, H., Bang, J., Kim, Y., Beuchat, L. R., Ryu, J.H. 2012. Reduction of Bacillus cereus spores in sikhye, a traditional Korean rice beverage, by modified tyndallization processes with and without carbon dioxide injection. Lett. Appl. Microbiol. 55:218?223.; Daelemans, S., Peeters, L., Hauser, B., Vandenplas, Y. 2018. Recent advances in understanding and managing infantile colic. F1000Res. 7:F1000).

Dopo l'inattivazione dei batteri, principalmente mediante trattamento termico, le cellule morte possono rilasciare componenti batteriche con propriet? e effetti immunomodulatori chiave contro i patogeni. ? stato proposto che diversi componenti batterici, come acidi lipoteicoici, peptidoglicani o esopolisaccaridi (EPS), siano i principali responsabili di queste propriet? in preparati contenenti batteri uccisi dal calore (Taverniti, V., Guglielmetti, S. 2011. The immunomodulatory properties of probiotic microorganisms beyond their viability (ghost probiotics: Proposal of paraprobiotic concept). Genes Nutr.

6:261?274; Castro-Bravo, N., Wells, J. M., Margolles, A., Ruas-Madiedo, P. 2018. Interactions of Surface Exopolysaccharides From Bifidobacterium and Lactobacillus Within the Intestinal Environment. Front. Microbiol. 9:2426.). Numerosi studi hanno mostrato i benefici di questi componenti batterici in diverse situazioni, ad esempio nei neonati, senza incorrere nei rischi associati all?utilizzo di microrganismi vivi (Stahler Burta, O., Iacobescu, C., Mateescu, R. B., Nicolaie, T., Tiuca N., Pop, C. S.

2018. Efficacy and safety of APT036 versus simethicone in the treatment of functional bloating: A multicentre, randomised, double-blind, parallel group, clinical study. Transl. Gastroenterol. Hepatol. 3:72.Deshpande, G., Athalye-Jape, G., Patole, S. 2018. Para-probiotics for Preterm Neonates. Next. Front. Nutr. 10:E871), e con vantaggi farmaceutici in termini di trasporto e conservazione. Dopo il trattamento termico, i batteri probiotici coltivati industrialmente, mantengono le loro principali propriet? probiotiche, consentendo cos? lo sviluppo di preparati pi? sicuri con propriet? farmaceutiche pi? ottimali (Canducci, F., Armuzzi, A., Cremonini, F., Cammarota, G., Bartolozzi, F., Pola, P., Gasbarrini, G., Gasbarrini, A. 2000. A lyophilized and inactivated culture of Lactobacillus acidophilus increases Helicobacter pylori eradication rates. Aliment. Pharmacol. Ther. 14:1625?1629; Lee, S.H., Yoon, J.M., Kim, Y.H., Jeong, D. G., Park, S., Kang, D. J. 2016. Therapeutic effect of tyndallized Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 on atopic dermatitis mediated by down-regulation of immunoglobulin E in NC/Nga mice. Microbiol. Immunol. 60:468?476). Inoltre, la tindalizzazione e altri trattamenti termici possono portare alla rottura delle pareti cellulari, con il rilascio di contenuti citoplasmatici (lisati batterici), come DNA e componenti della parete cellulare (cio? peptidoglicani, acidi lipoteicoici o pili termolabili). I componenti batterici rilasciati possono inibire i patogeni per competizione, per adesione e colonizzazione e possono avere un ruolo immunomodulante. ? stato recentemente dimostrato che la degradazione e la lisi dei batteri da parte del lisozima aumentano il rilascio di prodotti batterici, incluso il peptidoglicano, che attivano i recettori dell?immunit? innata (PRR) nelle cellule ospiti, processo questo, importante per la risoluzione dell'infiammazione nei siti mucosi (Ragland, S. A., Criss, A.

2017. From bacterial killing to immune modulation: Recent insights into the functions of lysozyme. PLoS Pathog. 13:e1006512). Questi componenti specifici sono solitamente attivi sui recettori Tolllike (simile a strumento) e su altri recettori di trasduzione del segnale nell'epitelio intestinale, cellule dendritiche e altre cellule immunitarie intestinali. Recentemente sono stati commercializzati dispositivi medici contenenti diversi ceppi tindalizzati in combinazione con protettori mucosali derivati da fibre, come xiloglucano o tannato di gelatina, per il trattamento delle coliche nei bambini e negli adulti (cio? xiloglucano pi? ceppi tindallizzati di L. reuteri e B. breve) e per il trattamento/prevenzione della diarrea, (i.e. xyloglucan pi? ceppi tindalizzati di L. reuteri e B. breve) e per il trattamento/prevenzione della diarrea dovuta a disbiosi intestinale (es. gelatina tannato pi? Lactobacillus acidophilus tindalizzato, L. plantarum, L. casei, L. rhamnosus, Bifidobacterium bifidum e Streptococcus thermophilus).

Nella pratica clinica, i prodotti contenenti ceppi probiotici tindalizzati hanno avuto un ruolo significativo nelle malattie gastrointestinali, inclusi gonfiore e coliche infantili e diarrea, o nella gestione di malattie allergiche dermatologiche o respiratorie. I dati della letteratura esaminati indicano che i batteri uccisi dal calore, o le loro frazioni, o componenti purificati, hanno effetti probiotici chiave, con vantaggi rispetto ai probiotici vivi, principalmente per quanto riguarda il loro profilo di sicurezza.

Secondo le Linee Guida Globali dell'Organizzazione Mondiale di Gastroenterologia, i prebiotici sono sostanze non digeribili assunte dall'ospite che, in quantit? adeguate, producono effetti fisiologici benefici stimolando la crescita e l'attivit? metabolica di un numero limitato di batteri indigeni benefici come bifidobatteri e batteri lattici. I prebiotici sono i principali componenti dietetici degli alimenti, per lo pi? polisaccaridi non amidacei e oligosaccaridi, utilizzati come ingredienti di arricchimento. I prebiotici pi? comunemente noti e caratterizzati includono integratori di frutto-oligosaccaridi (FOS), galattooligosaccaridi, inulina, lattulosio e oligosaccaridi del latte materno (Roberfroid, M.B. 2007. Prebiotics: The concept revisited. J. Nutr. 137(2): 830S7S; Macfarlane, G. T., Steed, H., Macfarlane, S. 2008. Bacterial metabolism and health- related effects of galacto-oligosaccharides and other prebiotics. J. Appl. Microbiol.

104, 305?344). Queste sostanze sono spesso incluse nelle formulazioni simbiotiche contenenti batteri probiotici, allo scopo di favorire la loro rapida crescita nell'ambiente intestinale. I FOS sono in grado di attraversare il lume digestivo, non digeriti e non assorbiti, per raggiungere il colon ascendente non modificati, qui verranno selettivamente metabolizzati dalla componente probiotica residente del microbiota. La loro digestione provoca una significativa diminuzione del pH, creando un habitat sfavorevole per la crescita di batteri putrefattivi (clostridi).

Recentemente, alcuni studi effettuati grazie alla tecnica nota come ?trapianto fecale del microbiota? o Fecal Microbiota Transplants (FMT) (una tecnica che ha molti punti concettuali comuni alla nostra invenzione, essendo caratterizzata dal fatto che l'arricchimento microbico-probiotico dell'intestino del ricevente, viene effettuato trapiantando, a partire da un donatore sano, direttamente materiale fecale, comprese le frazioni fecali pro e prebiotiche) mostrano che, dopo la terapia antibiotica, la tecnica FMT risponde molto meglio e molto pi? facilmente al ripristino del microbiota originale del ricevente (che ? stato trattato con antibiotici). In questi studi effettuati su un gruppo di soggetti umani testando l'uso di probiotici come potenziatore microbico dopo l'uso di antibiotici, ? stato osservato che gli antibiotici possono spazzare via vaste popolazioni di batteri dall?intestino (Suez J., Zmora N., Zilberman-Schapira G., Mor U., Dori-Bachash M., Bashiardes S., Zur M., Regev-Lehavi D., Ben-Zeev Brik R., Federici S., Horn M., Cohen Y., Moor AE., Zeevi D., Korem T., Kotler E., Harmelin A., Itzkovitz S., Maharshak N., Shibolet O., Pevsner-Fischer M., Shapiro H., Sharon I., Halpern Z., Segal E., Elinav E. Post-Antibiotic Gut Mucosal Microbiome Reconstitution Is Impaired by Probiotics and Improved by Autologous FMT. Cell, 2018; 174 (6): 1406 DOI: 10.1016/j.cell.2018.08.047).

Un altro studio ha esaminato i microbiomi intestinali di un gruppo di individui che utilizzavano un integratore probiotico per vedere quanto del probiotico potesse effettivamente essere trattenuto dall'intestino umano. Lo studio ha utilizzato i ceppi di probiotici pi? comuni sul mercato. ? stato eseguito un follow-up di due mesi e confrontato con la loro composizione intestinale di base prima dei probiotici. I risultati hanno mostrato che la colonizzazione di batteri probiotici nell'intestino si ? verificata solo nella met? dei soggetti del test. Hanno chiamato quelli che sono stati colonizzati con successo i "persistenti" e quelli che non lo sono stati, i "resistenti" (Zmora N., Zilberman-Schapira G., Suez J., Mor U., Dori-Bachash M., Bashiardes S., Kotler E., Zur M., Regev-Lehavi D., Ben-Zeev Brik R., Federici S., Cohen Y., Linevsky R., Rothschild D., Moor AE, Ben-Moshe S., Harmelin A., Itzkovitz S., Maharshak N., Shibolet O., Shapiro H., Pevsner-Fischer M., Sharon I., Halpern Z., Segal E., Elinav E. Personalized Gut Mucosal Colonization Resistance to Empiric Probiotics Is Associated with Unique Host and Microbiome Features. Cell, 2018; 174 (6): 1388 DOI: 10.1016/j.cell.2018.08.041).

L'integrazione di prebiotici e fibre alimentari ? stata un punto focale principale della ricerca nelle strategie dietetiche per sostenere la salute dell'intestino nella nutrizione umana e animale. Le applicazioni dei pro e dei prebiotici negli animali da compagnia e il loro sfruttamento sugli animali da allevamento, in acquacoltura sono ancora allo studio. La somministrazione di prebiotici si ? dimostrata benefica sui giovani ruminanti (Uyeno Y, Shigemori S, Shimosato T (2015) Effect of probiotics/prebiotics on cattle health and productivity. Microbes Environ 30(2):126? 132); nel pollame, aumentando il volume delle feci del pollo e modulando il microbiota intestinale attraverso l'inibizione di batteri patogeni (Totton SC, Farrar AM, Wilkins W, Bucher O, Waddell LA, Wilhelm BJ, McEwen SA, Rajic A (2012) The effectiveness of selected feed and water additives for reducing Salmonella spp. of public health importance in broiler chickens: a systematic review, meta-analysis, and meta-regression approach. Prev Vet Med 106(3?4):197?213. https://doi.org/10.1016/j. prevetmed.2012.07.007); in acquacoltura, come immunostimolanti (Akhter N, Wu B, Memon AM, Mohsin M (2015) Probiotics and prebiotics associated with aquaculture: a review. Fish Shellfish Immunol 45(2):733?741. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2015.05.038). Le fibre alimentari come prebiotici ed i probiotici svolgono un ruolo chiave nella salute degli animali da compagnia influenzando la risposta immunitaria e il profilo del microbiota intestinale, modulando la motilit? intestinale, ma anche come potenziali terapie aggiuntive contro gli enteropatogeni, riducendo la concentrazione calorica, riducendo l'incidenza dell'obesit? e di conseguenza del diabete mellito. In uno studio condotto nel 2019, ? stato dimostrato il ruolo della fibra prebiotica nei cani adulti sani. ? stato dimostrato un effetto significativo sui metaboliti fecali, il che indica una via microbica potenzialmente migliore, con cambiamenti benefici nei prodotti finali della fermentazione fecale, salute intestinale, aumento degli acidi grassi fecali a catena corta e diminuzione di fenoli e indoli a catena ramificata, concentrazione di acidi grassi e concentrazione di ammoniaca (Nogueira, J., He, F., Mangian, H. F., Oba, P. M., & De Godoy, M. (2019). Dietary supplementation of a fiber-prebiotic and saccharin-eugenol blend in extruded diets fed to dogs. Journal of animal science,97(11), 4519?4531 https://doi.org/10.1093/jas/skz293).

Studi clinici hanno mostrato l'effetto di una supplementazione simbiotica in cani e gatti con diarrea (Matthewman L, Allenspach K. Pre and probiotics ? Practical applications for VNs in practice. VN Times 2013;13:8?9; Schmitz S, Suchodolski J. Understanding the canine intestinal microbiota and its modification by pro-, pre- and synbiotics - what is the evidence? Vet Med Sci 2016;2:71?94; Rose L, Rose J, Gosling S, Holmes M. Efficacy of a Probiotic-Prebiotic Supplement on Incidence of Diarrhea in a Dog Shelter: A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial. J Vet Intern Med. 2017 Mar;31(2):377-382. doi: 10.1111/jvim.14666. Epub 2017 Feb 10. PMID: 28186660; PMCID: PMC5354029), supportando l'ipotesi che l'integrazione dei cani con un simbiotico riduca l'incidenza della diarrea e fornisca evidenza dell'effetto benefico. E? stato inoltre dimostrato che i pre- es i probiotici sono un valido aiuto se usati per trattare la diarrea a base infettiva o dietetica; per potenziare le funzioni immunitarie specifiche nei cuccioli e la loro risposta immunitaria alla vaccinazione o nei cani geneticamente predisposti a sviluppare la dermatite atopica (Herstad H K, Nesheim B B, L?Ab?e-Lund et al (2010). Effects of a probiotic intervention in acute canine gastroenteritis ? a controlled clinical trial, J Small Anim Pract 51 (1): 34-38; Benyacoub J, Czarnecki-Maulden G L, Cavadini C et al (2003). Supplementation of food with Enterococcus faecium (SF68) stimulates immune functions in young dogs, J Nutr 133: 1,158-1,162. 7; Marsella R, Santoro D and Ahrens K (2012). Early exposure to probiotics in a canine model of atopic dermatitis has long-term clinical and immunological effects, Vet Immunol Immunopathol 15; 146 (2): 185-189). Nei gatti, i probiotici sono risultati un potenziale integratore per combattere enteropatogeni quali Giardia duodenalis e Tritrichomonas fetus (Rachel Dickson, Julie Vose, David Bemis, Maggie Daves, Thomas Cecere, Jody L. Gookin, Joerg Steiner, M. Katherine Tolbert. The effect of enterococci on feline Tritrichomonas foetus infection in vitro, Veterinary Parasitology, Volume 273,2019, Pages 90-96,ISSN 03044017). ? stato dimostrato che le fibre solubili modulano la glicemia e l'insulinemia in condizioni patologiche come il diabete mellito e l'obesit?. Questi studi suggeriscono una possibile modulazione del metabolismo del glucosio attraverso la stimolazione della gluconeogenesi da propionato, che pu? essere utile nel trattamento della resistenza all'insulina e del diabete felino (Verbrugghe, A., Hesta, M., Gommeren, K., Daminet, S., Wuyts, B., Buyse, J., & Janssens, G. (2009). Oligofructose and inulin modulate glucose and amino acid metabolism through propionate production in normal-weight and obese cats. British Journal of Nutrition, 102(5), 694-702. doi:10.1017/S0007114509288982; Massimino, SP, McBurney, MI, Field, CJ, et al. (1998) Fermentable dietary fibre increases GLP-1 secretion and improves glucose homeostasis despite increased intestinal glucose transport capacity in healthy dogs. J Nutr 128, 1786?1793; Hesta, M, Debraekeleer, J, Janssens, GPJ, et al. (2001) The effect of a commercial high fibre diet and an iso-maltooligosaccharide supplemented diet on postprandial glucose concentrations in dogs. J Anim Physiol Anim Nutr 85, 217?221). In natura i carnivori, in particolare i grandi felini, non concentrano la loro alimentazione solo sull?ingestione della componente muscolare della carcassa. Numerosi studi hanno dimostrato che in cattivit?, una dieta equilibrata ? difficile da replicare per questi animali. I ghepardi selvatici non mangiano solo la carne dei muscoli, ma anche organi interni delle prede come grasso, ossa e tessuto connettivo per soddisfare il loro fabbisogno di minerali, vitamine e acidi grassi. La loro preda naturale ? costituita principalmente da piccoli ruminanti (antilopi). I microrganismi del rumine sono in grado di convertire gli acidi grassi polinsaturi (PUFA) e gli acidi grassi monoinsaturi (MUFA) in acidi grassi saturi, che vengono incorporati nelle loro riserve di grasso. Nei ghepardi selvatici i rapporti SFA:MUFA e SFA:PUFA sono pi? alti rispetto ai ghepardi in cattivit? (Tordiffe, A.S.W., et al., (2016). Comparative serum fatty acid profiles of captive and free-ranging cheetahs (Acinonyx jubatus) in Namibia. PLoS ONE 11(12): e0167608; Whitehouse-Tedd, K.M., Lefebvre, S.L., and G.P.J., Janssens, (2015). Dietary Factors Associated with Faecal Consistency and Other Indicators of Gastrointestinal Health in the Captive Cheetah (Acinonyx Jubatus). PLoS ONE 10(4): e0120903). In cattivit? la dieta di questi carnivori ? composta da animali che vengono somministrati interi, ovvero con lo stomaco (carcasse di conigli, cavalli, maiali, polli) che hanno percentuali pi? elevate di MUFA e PUFA. In conclusione, l?integrazione della dieta con prebiotici e fibre animali, come quelle contenute nella nostra ?invenzione?, potrebbe essere benefica anche nei grandi felini tenuti in cattivit?, in particolare nel ghepardo predisposto a malattie croniche (Lane, E.P., Miller, S., Lobetti, R., Caldwell, P., Bertschinger, H.J., Burroughs, R., Kotze,A. and A. van Dyk, (2011). Effect of diet on the incidence of and mortality owing to gastritis and renal disease in captive cheetahs (Acinonyx jubatus) in South Africa. Zoo Biology, 31(6): 669-682; Terio, K.A., Munson, L. and P.F. Moore, (2012). Characterization of the gastric immune response in cheetahs (Acinonyx jubatus) with Helicobacter-associated gastritis. Vet Pathol, 49(5): 824-33).

Problema tecnico

Alla luce dello stato dell?arte, anche se molti studi non incoraggiano un?alimentazione del bestiame soltanto con il digerito ruminale, ma piuttosto la sua supplementazione con altri ingredienti per mangimi ad una dose raccomandata durante la formulazione del mangime (Elfaki, M. O. A., Abdelatti, K. A., Malik, H. E. E. 2014. Effect of Dietary Dried Rumen Content on Broiler Performance, Plasma Constituents and Carcass Characteristics. Glob. J. Anim. Sci. Res. 3, 264?270.11.; Togun, V. A., Farinu, G. O., Ojebiyi, O. O., Awotunde, A. I. 2010. Effect of Replacing Maize with a Mixture of Rumen Content and Blood Meal on the Performances of Growing Rabbits: Initial Study with Mash Feed. World Rabbit Sci. 17, 21?265), gli inventori della presente invenzione hanno sviluppato un probiotico biologicamente sicuro ed un supplemento alimentare prebiotico derivante dai contenuti colico/cecale e ruminale provenienti dai ruminanti e conigli conosciuto come digesta, che ? prodotto di scarto dell?industria zootecnica, preparato mediante uno specifico processo che porta alla preparazione di un prodotto finale ad alto valore biologico essendo biologicamente sicuro, che ha principalmente un effetto prebiotico, in cui gli effetti probiotici e postbiotici derivano da batteri interi, ma anche da porzioni di batteri, protozoi e lieviti contenuti in quantit? molto elevate e che mostrano un effetto simbiotico o sinergico tra la componente fibrosa e la componente batterica. Il prodotto pu? essere aggiunto alla razione giornaliera principalmente di cani e gatti, ma anche di tutti gli animali da produzione, come bovini, ovini, caprini, conigli, polli e suini. Nella maggior parte degli studi il digerito ruminale ? stato miscelato con altri mangimi per dare un valore aggiunto, aumentare l?appetibilit? e migliorare l?efficienza. L?integratore alimentare sviluppato nella presente invenzione ha la prerogativa di essere completo, sicuro e funzionale.

Il processo per la produzione del prodotto della presente invenzione permette di mantenere intatti tutti i principi nutritivi del materiale di partenza, come acidi grassi volatili a catena corta, amminoacidi, vitamine, minerali, fibra alimentare di diverso tipo, ma soprattutto nel contenere una carica molto elevata di derivati batterici, protozoi e lieviti, che stimolano il sistema immunitario del tratto gastrointestinale degli animali.

I principali rischi per animali domestici, associati all'alimentazione con cibi crudi, sono le malattie infettive. in particolare batteriche e parassitarie, e lo squilibrio dei nutrienti.

Il processo per la produzione del prodotto della presente invenzione ? stato messo a punto per garantire l'inattivazione della componente microbica, che comunque mantiene la sua funzionalit?.

Il processo sviluppato nella presente invenzione permette di ottenere un ottenere un alimento complementare in forma liofilizzata di facile utilizzo e privo di cattivi odori. La presente invenzione differisce dall?arte nota perch? il prodotto della presente invenzione ? biologicamente sicuro, mantiene tutti gli effetti post-biotici, fornisce una forte integrazione prebiotica per monogastrici, soprattutto carnivori e onnivori, nonch? una buona base prebiotica e alimentare per monogastrici erbivori e animali poligastrici, che deriva dalla presenza nella presente invenzione dell'intera frazione di fibra alimentare in una forma predigerita, dalla flora microbica a fermentazione cellulosica ruminale e/o cecale.

Oggetto dell?invenzione

Il problema tecnico ? risolto fornendo una composizione comprendente estratto secco di contenuto ruminale di bovino e ovino e contenuto ciecale di coniglio.

Un altro oggetto della presente invenzione ? l?uso di una composizione comprendente estratto secco di contenuto ruminale di bovino e ovino e contenuto ciecale di coniglio come integratore alimentare per animali.

E? anche oggetto della presente invenzione un processo per la preparazione di una composizione comprendente estratto secco di contenuto ruminale di bovino e ovino e contenuto ciecale di coniglio comprendente una primo stadio tindalizzazione in modalit? batch, seguita da uno stadio di atomizzazione (spray drying).

Un altro oggetto della presente invenzione ? un integratore alimentare per animali comprendente estratto secco di contenuto ruminale di bovino e ovino e contenuto ciecale di coniglio per uso per stimolare il sistema immunitario.

Un altro oggetto della presente invenzione ? un integratore alimentare per animali comprendente estratto secco di contenuto ruminale di bovino e ovino e contenuto ciecale di coniglio per uso per uso per il trattamento di patologie selezionate nel gruppo consistete di: disbiosi, infezioni causate da enteropatogeni, gastriti, diarrea, diabete, patologie renali croniche, dermatite atopica, encefalopatia epatica, malattia infiammatoria intestinale (IBD), enterite reattiva delle fibre, enterite antibiotica reattiva, enterite corticosteroide reattiva, colite istiocitica del cane, dismotilit? cronica del colon, costipazione cronica del gatto, enterocolite mucoide del coniglio, adenopatia intestinale suina, malattia di Lawsonia intracellularis dei suini, malassorbimento del lattosio, Enterite necrotizzante del pollo, sindrome da lipidosi epatica, sindrome da colica del cavallo.

Ulteriori caratteristiche ed aspetti della presente invenzione risulteranno chiari dalla seguente descrizione dettagliata con riferimento ai risultati sperimentali forniti.

Descrizione dettagliata dell?invenzione

Oggetto della presente invenzione ? una composizione comprendente estratto secco di contenuto ruminale di bovino e ovino e contenuto ciecale di coniglio.

Preferibilmente la composizione ?: umidit? 7,17%; sostanza secca 92,83%; proteina grezza 17,13%; ceneri 7,49%; estratto etereo 2,81%; grasso 1,10%; fibra grezza 24,58%; estratto privo di azoto (NFE) 40,82%.

Un altro oggetto della presente invenzione ? l'uso di una composizione comprendente estratto secco di contenuto ruminale di bovino e ovino e contenuto ciecale di coniglio per l?integrazione alimentare animale.

Un altro oggetto della presente invenzione ? un integratore alimentare veterinario comprendente estratto secco di contenuto ruminale di bovino e ovino e contenuto ciecale di coniglio per uso per stimolare il sistema immunitario.

Un altro oggetto della presente invenzione ? un integratore alimentare veterinario comprendente estratto secco di contenuto ruminale di bovino e ovino e contenuto ciecale di coniglio per uso per uso per il trattamento di patologie selezionate nel gruppo consistete di: disbiosi, infezioni causate da enteropatogeni, gastriti, diarrea, diabete, patologie renali croniche, dermatite atopica, encefalopatia epatica, malattia infiammatoria intestinale (IBD), enterite reattiva delle fibre, enterite antibiotica reattiva, enterite corticosteroide reattiva, colite istiocitica del cane, dismotilit? cronica del colon, costipazione cronica del gatto, enterocolite mucoide del coniglio, adenopatia intestinale suina, malattia di Lawsonia intracellularis dei suini, malassorbimento del lattosio, Enterite necrotizzante del pollo, sindrome da lipidosi epatica, sindrome da colica del cavallo.

Preferibilmente le infezioni causate da enteropatogeni sono causate da microrganismi gastrici simili a helicobacter, giardia, coccidi, tritrichomonas.

Preferibilmente la composizione viene utilizzata come alimento complementare negli animali domestici, in particolare cani e gatti e bovini, e/o bestiame come bovini, ovini, suini, conigli, polli, pesci e altri animali da fattoria e animali da carne.

Preferibilmente la composizione viene somministrata in una percentuale del 30% sul cibo totale a conigli, del 20-30% sul cibo totale a pecore, capre o mucche, in una percentuale tra il 5 e il 10% sul cibo totale a cani e gatti e in una percentuale tra il 10 e il 15% sul cibo totale nel pollo.

? anche oggetto della presente invenzione un processo per la preparazione di una composizione comprendente un estratto secco di contenuto ruminale di bovino e ovino e di contenuto ciecale di coniglio comprendente un primo stadio di tindalizzazione in modalit? batch, seguita da un secondo stadio di atomizzazione (spray drying).

Preferibilmente lo stadio di tindalizzazione viene effettuato mediante riscaldamento ad una temperatura compresa tra 70-100?C e per un tempo compreso tra 15 e 30 minuti seguito da incubazione a temperatura ambiente per un periodo di 24 ore, ripetuta due o tre volte.

Pi? preferibilmente, lo stadio di tindalizzazione include tre fasi di riscaldamento a 70?C per un massimo di 30 minuti, intervallate da un periodo di incubazione di 24 ore.

Preferibilmente lo stadio di atomizzazione (spray drying) comprende quattro fasi successive in cui il prodotto liquido di partenza viene atomizzato in una forma spray, quindi le goccioline generate dallo spray vengono messe a contatto con aria calda per consentire l'evaporazione dell'umidit? e la formazione di particelle solide secche, quindi le particelle solide secche vengono separate dal flusso d'aria e raccolte.

Pi? preferibilmente lo stadio di atomizzazione (spray drying), l?atomizzazione del prodotto liquido di partenza in uno spray ? eseguita mediante un dispositivo atomizzatore, quindi le goccioline generate dallo spray sono sottoposte al contatto con aria riscaldata in una camera di essiccazione, risultando nell?evaporazione dell'umidit? e la formazione di particelle solide secche che vengono separate dal flusso d'aria e raccolte in un dispositivo di raccolta.

Un altro oggetto della presente invenzione ? una composizione comprendente un estratto secco di contenuto ruminale di bovino e ovino e di contenuto ciecale di coniglio in cui l'estratto secco ? ottenuto mediante un processo comprendente un primo stadio di tindalizzazione in modalit? a blocchi (batch mode) seguita da un secondo stadio di atomizzazione (spray drying).

Esempi

Il succo ruminale e quello ciecale sono stati suddivisi in due lotti. Uno dei due ? stato sottoposto direttamente al processo di tindalizzazione, l'altro ? stato preventivamente filtrato con un setaccio a maglie larghe per rimuovere il materiale vegetale di grandi dimensioni e quindi sottoposto allo stesso processo di tindalizzazione.

La tindalizzazione ? un metodo di sterilizzazione frazionato, in cui viene applicato, in modalit? batch, il riscaldamento a temperature di 70-100?C per 30 minuti. Ad un primo trattamento termico, che abbatte le forme vegetative, segue un periodo di incubazione di 24 ore, che favorisce la germinazione delle spore. Il materiale cos? trattato viene nuovamente riportato ad una temperatura di 70-100?C per 30 minuti, in modo da uccidere le cellule vegetative derivanti dalla germinazione delle spore. Questa procedura dovrebbe essere ripetuta 2 o 3 volte.

Il processo di tindalizzazione produce cellule batteriche con capacit? di replicazione inattivata e capacit? enzimatica inattivata, mantenendo comunque inalterata la struttura cellulare e la parete cellulare delle cellule batteriche stesse. Pertanto, le cellule batteriche tindalizzate possono essere definite come cellule fisiologicamente intatte e, per questo motivo, sono immunologicamente attive e mantengono la loro specifica attivit? immunostimolante nei confronti del tessuto linfoide associato all'intestino (GALT).

La conta microbica totale e il pH dei due lotti di campione sono stati misurati prima e dopo ciascuna fase del processo di tindalizzazione. Per la determinazione della conta microbica aerobica e anaerobica, un'aliquota di ciascuno dei due campioni ? stata serialmente diluita su base 10 e seminata in duplicato per il conteggio su terreno TSA, BHI e MRS. I terreni sono stati incubati in aerobiosi e anaerobiosi a 37?C per 24-48 ore. Le colonie sono state contate dopo l'incubazione e sono state calcolate le UFC/mL. Le conte microbiche sono state trasformate in riduzione logaritmica utilizzando l'equazione: log (N/N0), dove N ? la concentrazione di cellule microbiche prima del processo di tindalizzazione e N0 ? la concentrazione di cellule microbiche dopo la tindalizzazione.

Il processo di tindalizzazione della presente invenzione ha coinvolto tre fasi di riscaldamento a 70?C per un massimo di 30 min, intervallate da un periodo di incubazione di 24 h per consentire la germinazione delle spore cave.

Entrambi i lotti di campioni sono stati immediatamente posti a -80?C. Dopo 12 h di congelamento, i campioni sono stati posti nel liofilizzatore (LyovaporTM L-200, Buchi), con la trappola gi? raffreddata per un periodo di 24 ore in ciclo automatico. Al termine di questo periodo di liofilizzazione, il prodotto liofilizzato ? stato raccolto in sacchetti di plastica e sottoposto a successive analisi.

Il processo di atomizzazione (spray drying) viene eseguito in un atomizzatore (spray dryer), che comprende un riscaldatore per il riscaldamento dell'aria; un atomizzatore per atomizzare la miscela per formare micro particelle; una camera di essiccazione dove le microparticelle umide entrano a contatto con l'aria calda che fa evaporare l'acqua nelle microparticelle generando polvere secca; un separatore a ciclone per la raccolta della polvere; e un ventilatore per lo scarico dell'aria esausta.

La tecnica dello spray drying consente di ottenere polveri secche a basso contenuto di umidit? a partire da prodotti liquidi come soluzioni, emulsioni o sospensioni. ? possibile ottenere un prodotto finale con bassa attivit? dell'acqua, garantendone stabilit? microbiologica, peso e volume ridotti, facilitandone lo stoccaggio, il trasporto e la commercializzazione.

Il processo comprende quattro stadi. Innanzitutto, il campione liquido viene convertito in uno spray da un dispositivo atomizzatore. Queste piccole goccioline sono sottoposte al contatto con aria riscaldata in una camera di essiccazione, con conseguente evaporazione dell'umidit? e formazione di particelle solide secche. Infine, le particelle solide vengono separate dal flusso d'aria e raccolte in un dispositivo di raccolta.

Il campione A ? stato risospeso in acqua ultra pura, lavato e filtrato con un setaccio a maglie piccole per eliminare i solidi in sospensione. Il materiale filtrato (Campione C) ? stato risospeso in acqua ultra pura (rapporto 3:1) e sottoposto al processo di spray drying.

L'essiccazione del succo ruminale/cecale ? stata eseguita in uno strumento B?chi Mini Spray Dryer B-290 (B?chi Laboratoriums-Technik) su scala da laboratorio con un atomizzatore a due ugelli con un diametro interno di 0,7 mm e una camera di essiccazione simultanea di 16 cm. Le due soluzioni (ruminale e ciecale) precedentemente preparate (agitazione a 40?C) sono state inoculate nella camera attraverso una pompa peristaltica a portata costante (9 mL/min). La portata dell'aria di essiccazione ? stata mantenuta al 100% e la portata dell'aria compressa a 450 L/h. Le temperature dell'aria in ingresso testate erano 100 e 120?C. La temperatura dell'aria in uscita non pu? essere regolata, ma ? il risultato della combinazione tra temperatura dell'aria in ingresso, velocit? di alimentazione, portata del gas di essiccazione e contenuto di solidi dell'alimentazione. ? stato utilizzato un unico sistema separatore d'aria a ciclone e le polveri essiccate sono state raccolte dalla base del ciclone. Sono state condotte due repliche per ogni esperimento.

L'analisi delle polveri essiccate ? stata eseguita immediatamente dopo lo spray drying.

La resa di essiccazione ? stata determinata come rapporto percentuale tra il peso della massa totale di prodotto raccolto e la quantit? iniziale di solidi presenti nella soluzione inoculata nello spray dryer.

L'attivit? dell'acqua delle polveri ? stata determinata utilizzando un misuratore di attivit? dell'acqua (Aqualab, 4TE, Decagon Devices Inc.) a una temperatura costante di 23?1?C. Sono state effettuate due letture per ogni campione.

L'ottimizzazione di un processo di essiccazione ? il primo passo per trovare le condizioni migliori per ottenere un prodotto in polvere di buona qualit?. I diversi parametri valutati per ottimizzare il processo di essiccazione del contenuto ruminale/cecale mediante spray drying sono stati i) il contenuto di solidi solubili nel contenuto ruminale/cecale e ii) la temperatura dell'aria in ingresso dello spray dryer. Con i diversi test effettuati, sono state selezionate le condizioni che portano alla massima resa di essiccazione e al prodotto con la pi? bassa AW.

Il contenuto ruminale o cecale liofilizzato (preparazioni di particolato ultra-piccolo e grande; 1 mg) ? stato aggiunto a 1 ml di soluzione deproteinizzante (100 g/l di acido metafosforico e 0,6 g/l di acido crotonico) per la determinazione degli acidi grassi volatili (VFA). I VFA sono stati determinati in campioni centrifugati (1 ml) come descritto in precedenza (Carro et al., 1992). 10 ml circa del campione sono stati conservati con 2-3 gocce di toluene per prevenire la fermentazione. I campioni cos? conservati sono stati immediatamente analizzati, o conservati a una temperatura di -20?C in attesa di analisi. Per l'analisi gascromatografica (GC), i campioni sono stati preparati nel modo seguente: 200 ?l di miscela di acido metafosforico (25%) e acido formico (3:1) sono stati aggiunti a 1 ml di soluzione liquida del liofilizzato ruminale o cecale (Cottyn and Boucque, 1968). Dopo 30 minuti di centrifugazione, il sovranatante ? stato diluito serialmente su base 10 in acqua e iniettato nel cromatografo. I dati della sequenza temporale delle concentrazioni di VFA e NH3 nella fase liquida del vessel sono stati analizzati ad ogni tempo di campionamento. Le somme dei quadrati sono state ulteriormente partizionate attraverso contrasti ortogonali per analizzare le differenze dovute a N forme. I contrasti sono stati distribuiti come segue: forme C1, NH3 v. NAN; C2, amminoacidi v. amminoacidi legati a peptidi e C3, peptidi v. Proteine. Tutte le analisi sono state condotte utilizzando la procedura dei modelli lineari generali del programma Sistemi di analisi statistica (1985; Statistical Analysis Systems Inc., Cary, NC, USA). La determinazione degli acidi grassi a catena corta (SCFA) ? stata eseguita anche in un altro modo: A) ? stato analizzato il succo rumine/ciecale per determinare il contenuto totale di SCFA liberi, inclusi acetico (C2), propionico (C3), butirrico (C4), acido valerico (C5), caproico (C6) e isomeri, acido isobutirrico (iC4), isovalerico (iC5) e isocaproico (iC6). Per l'estrazione degli analiti da ciascun campione (100 mg di peso umido), sono stati aggiunti 200 ?l di H2SO4 (50 p/v%) allo scopo di avere SCFA liberi nella loro forma non dissociata. Dopodich?, ? stato aggiunto etere per estrarre gli SCFA (iC6 ? stato aggiunto all'etere etilico e utilizzato come standard interno, 50 ppm) e si ? vortexato e centrifugato per raccogliere il sovranatante. Cinquanta ?l di ciascun sovranatante sono stati iniettati nel gascromatografo (GC), per eseguire l?analisi. La gascromatografia ? una tecnica composta da una fase mobile, rappresentata da un gas di trasporto (elio o azoto), e da una fase stazionaria composta da uno strato microscopico di liquido o polimero su un supporto inerte all'interno di una colonna. I composti gassosi da analizzare interagiscono con la parete della colonna e vengono eluiti in tempi diversi, chiamati tempi di ritenzione dei composti. Il confronto del tempo di ritenzione con la risposta del rivelatore fornisce gli analiti presenti in un campione in momenti diversi. L'analisi quantitativa ? stata effettuata utilizzando una curva di calibrazione, nota anche come ?curva standard?, che aiuta a calcolare la concentrazione degli analiti in ciascun campione. La curva ? stata creata per definire l'esatto range di utilizzo, considerando tutti i campioni da inserire. L'intervallo selezionato ? stato da 5 a 175 ppm, che indicava le concentrazioni delle diverse soluzioni utilizzate. Le soluzioni utilizzate per la curva standard sono state iniettate nel gascromatografo, cos? come i campioni. L'analisi completa del contenuto di acidi grassi nella polvere, ovvero nel prodotto o "invenzione" finale, era comprensiva della determinazione anche del contenuto di acidi grassi (FAs), come palmitico (C16:0), palmitoleico (C16:1), stearico (C18:0), acido oleico (C18:1), linoleico (C18:2) e linolenico (C18:3). Da ciascun campione, 5-10 mg (peso umido) di polvere rumine/ciecale sono stati aggiunti a 1 ml di esano e 0,1 ml di idrossido di potassio in metanolo (KOH/CH3OH, 2N) per liberare gli acidi grassi ed eseguire una trans- esterificazione. Dopo di che, sono stati aggiunti 1,5 ml di acido acetico (0,15 M) e 1 ml di esano e sono stati applicati vortex e centrifuga per raccogliere il sovranatante. Un ?l di ciascun sovranatante ? stato iniettato nel gascromatografo (GC), per eseguire la gascromatografia, come descritto sopra per la determinazione degli SCFA. I risultati delle analisi di SCFA e FAs hanno rivelato che la composizione dell'invenzione (la polvere finale o il particolato pi? grossolano) ottenuta dal processo di spray drying, conteneva la stessa quantit? di SCFA e FA contenuta nella materia prima (il liquido grezzo ruminale e ciecale prelevati direttamente dal rumine e dagli intestini degli animali al macello). I nostri test hanno quindi stabilito che la presente invenzione mantiene intatta la composizione dei grassi, mantenendo quindi le propriet? nutritive della materia prima fresca originale.

La polvere liofilizzata ruminale o cecale ? stata analizzata per il contenuto di aminoacidi (AA) e vitamine. In particolare, la polvere appartenente al succo ruminale/cecale ? stata analizzata nel tentativo di valutare la quantit? totale di N e la composizione di AA. Tutti i campioni sono stati analizzati, analizzando la loro materia secca (DM) ottenuta dopo 6 ore a 105?C e le loro ceneri secondo la metodica AOAC. 2005. Official Methods of Analysis. 18th edn. Association of Official Analytical Chemists; L'N totale ? stato determinato utilizzando un saggio di combustione (Leco FP-528 N Analyzer, Leco Corp., St. Joseph, MI). Il contenuto di amminoacidi di tutti i campioni ? stato determinato mediante HPLC dopo idrolisi per 24 ore a 110?C in un riscaldatore a blocchi. Per tutti gli AA, esclusi Met, Cys e Trp, un campione contenente 2 mg di N ? stato pesato in provette di idrolisi con 25 ?L di norleucina 250 mM come standard interno. I campioni sono stati quindi idrolizzati, come descritto sopra, con HC1 6 M di elevata purezza (5 mL), dopo il lavaggio con gas N2. Per Met e Cys, aliquote aggiuntive contenenti 2 mg di N e lo standard interno sono state pre-ossidate con 1 mL di acido performico (0,9 mL di acido formico all'88%, 0,1 mL di H2O2 al 30% e 5 mg di fenolo) per 16 ore a 4?C prima dell'idrolisi acida. Dopo l'idrolisi, il contenuto della provetta ? stato filtrato attraverso la carta da filtro Whatman 541 (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) e il filtrato ? stato diluito a 50 mL in un pallone volumetrico con H2O di grado HPLC. Aliquote del campione (0,5 mL) sono state evaporate a 60?C sotto flusso costante con N2, con 3 risciacqui e ri-evaporazioni con H2O di grado HPLC, per rimuovere i residui acidi. Dopo l'evaporazione finale, l'idrolizzato ? stato sciolto in 1 mL di diluente Na (Na220, Pickering Laboratories, Mountain View, CA). I singoli idrolizzati di AA sono stati separati utilizzando un'HPLC Agilent serie 1100 dotata di una colonna a scambio cationico di sodio (Cat. N. 1154110T, Pickering Laboratories), utilizzando un gradiente di fase a 4 tamponi e un gradiente di temperatura della colonna. Il rilevamento degli AA separati ? stata eseguita a 560 nm dopo la derivazione della ninidrina postcolonna. Gli standard (250 nmol / mL) per il singolo AA sono stati preparati diluendo uno standard puro nel tampone del campione. Il volume del campione e degli standard caricati sulla colonna era di 10 ?L. Per la determinazione di Trp, un'aliquota separata di campione, contenente 2 mg di N, ? stata idrolizzata con 1,2 g di Ba(OH)2 a 110?C per lo stesso periodo di tempo di altri AA, su un riscaldatore a blocchi. Nell'idrolisi erano inclusi 125 ?l di 5-metil-Trp (5 mM) come standard interno. Dopo il raffreddamento per far precipitare gli ioni bario, un'aliquota (3 ?L) dell'idrolizzato ? stata aggiunta a 1 mL di tampone acetato (0,07 M di acetato di sodio) e analizzata con il rilevamento della fluorescenza (eccitazione = 285 nm, emissione = 345 nm) dopo la separazione in HPLC.

Campioni rappresentativi sono stati analizzati per la sostanza secca (DM), la proteina grezza (CP) e l'estratto di etere (EE) e il contenuto di ceneri (AOAC, 2005).

L'azoto ? stato determinato secondo il metodo Kjeldhal (Kjeldahl J. New Method for the Determination of Nitrogen. Chem. News 1883, 48 (1240), 101?102; Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen K?orpern. Z. Anal. Chem. 1883, 22,366?382; En ny Methode til Kvaelstofbestemmelsei organiske Stoeffer. Medd. Carlsberg Lab. 1883, 2 (1), 1?27; Sur une Nouvelle Methode de Dosage de l?Azote dans les Substances Organiques (French summary: R?esum?e du CR Trav. Lab. Carlsberg; separately paged section) 1883, 2 (Juni), 1?12e) la proteina ? stata calcolata come N x 6,25. La fibra detergente neutra (NDF) ? stata determinata secondo Van Soest (P.J. Van Soest, J.B. Robertson, B.A. Lewis, Methods for Dietary Fiber, Neutral Detergent Fiber, and Nonstarch Polysaccharides in Relation to Animal Nutrition, Journal of Dairy Science, Volume 74, Issue 10, 1991, Pages 3583-3597, ISSN 0022-0302.), mentre la fibra detergente acida (ADF) e la lignina detergente acida (ADL) secondo Van Soest e Robertson, 1985, (P.J. Van Soest, J.B. Robertson Analysis of forages and fibrous foods. AS 613 Manual Dep. Anim. Sci., Cornell Univ., Ithaca, NY (1985) -cit. in Van Soest, P.J., Robertson, J.B., & Lewis, B.A. (1991) J. Dairy Sci. 74, 3583?3597.) utilizzando l'Ankom Fiber Analyzer (Ankom Technology, 2005). Le emicellulose sono state calcolate come differenza tra NDF e ADF e la cellulosa come differenza tra i contenuti di ADF e ADL.

Per la stima dei minerali, 1 g di campione essiccato ? stato bruciato in un forno a muffola a 550?C per 4 h. La cenere ? stata sciolta in acido cloridrico e filtrata su carta da filtro e il volume finale ? stato portato a 250 ml con acqua Milli-Q (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). Tutti i minerali (cio? Ca, P, Mg, Na, K, Cu, Fe, Mn, Zn) sono stati stimati utilizzando uno spettrofotometro ad assorbimento atomico. Per ogni minerale ? stata utilizzata una lampada specifica e lo spettrofotometro ad assorbimento atomico ? stato calibrato con varie concentrazioni di standard minerali. Gli standard e i campioni sono stati posizionati e iniettati utilizzando l'autocampionatore del forno. Per determinare il contenuto di Ca e Mg, i campioni trattati sono stati ulteriormente diluiti con cloruro di lantanio per mascherare le interferenze di altri minerali.

Secondo (Albal?-Hurtado S, Veciana-Nogu?s MT, Izquierdo-Pulido M, Marin?-Font A. Determination of water-soluble vitamins in infant milk by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A. 1997 Aug 22;778(1-2):247-53. doi: 10.1016/s0021-9673(97)00387-7. PMID: 9299739.) le vitamine idrosolubili sono state valutate mediante il metodo HPLC a coppie ioniche, che prevede l'uso di un rivelatore UV a lunghezza d'onda variabile che ha permesso la determinazione di un'ampia gamma di vitamine idrosolubili alla loro lunghezza d'onda ottimale di assorbimento: nicotinamide, piridossale, piridossina e piridossamina (vitamina B6), riboflavina (vitamina B2), tiamina (vitamina B1), cianocobalamina (vitamina B12) e acido folico. Con questo metodo cromatografico liquido rapido, semplice e affidabile, ? stata possibile la determinazione simultanea di nicotinammide, tiamina, riboflavina, piridossina, piridossale, piridossamina, cianocobalamina e acido folico nel succo ruminale liquido e in polvere e nel succo ciecale/del colon. ? stata utilizzata la cromatografia a coppia ionica con una colonna C 18 a fase inversa. Sei vitamine sono state determinate in una singola analisi; il tempo di analisi totale non ha mai superato i 55 min. Una fase mobile di metanolo-acqua (15:85), 5 mM di acido ottanesolfonico, con 0,5% di trietilammina a pH 3,6 e una portata di 1,0 ml/min sono le condizioni che hanno fornito la separazione pi? soddisfacente di queste vitamine utilizzando un rilevatore UV impostato a differenti lunghezze d'onda. La preparazione del campione prevede l'acidificazione, per far precipitare le proteine, e la centrifugazione seguita dalla filtrazione per gravit?. Linearit?, precisione, recupero e sensibilit? sono sempre state soddisfacenti. I limiti di rilevazione erano compresi tra 0,02 e 0,10 ?g/ml e i limiti di determinazione erano compresi tra 0,03 e 0,25 ?g/ml. Anche la vitamina A e la vitamina E sono state valutate nelle stesse matrici utilizzando un protocollo simile. In particolare, ? stato applicato un metodo cromatografico liquido ad alte prestazioni (HPLC) per la determinazione, in una corsa, di retinolo e alfa-tocoferolo nel succo ruminale liquido e in polvere e nel succo ciecale/del colon. Il metodo prevedeva la saponificazione a temperatura ambiente e una successiva estrazione di vitamine con n-esano. Le vitamine sono state determinate con una colonna C18 a fase inversa e sono state rilevate mediante spettrofotometria UV. Linearit?, precisione, recupero e sensibilit? sono stati soddisfacenti. Il principale vantaggio del metodo proposto ? la determinazione simultanea di entrambe le vitamine utilizzando una procedura di estrazione comune e la rilevazione UV con uno spettrofotometro a lunghezza d'onda variabile.

La composizione finale della presente invenzione BAPPAS ? stata: umidit? 7,17%; sostanza secca 92,83%; proteina grezza 17,13%; ceneri 7,49%; estratto etereo 2,81%; grasso 1,10%; fibra grezza 24,58%; estratto senza azoto (NFE) 40,82% e 2278,50 Kcal/kg come energia metabolica stimata. Inoltre, la popolazione totale di batteri, protozoi e lieviti ? stata tindalizzata ma perfettamente mantenuta nella suddetta preparazione, con la capacit? di esercitare tutte le attivit? immunomodulatorie lungo il tratto GI degli animali nutriti con l'integrazione di BAPPAS nel loro pasto. Sulla base di questa composizione (in particolare in base al contenuto di fibre che differisce nelle diverse specie), si ? concluso consigliando l'incorporazione giornaliera di BAPPAS atomizzato e tindalizzato (appartenente a contenuto di rumine bovino o contenuto ciecale di coniglio), fino ad un livello di integrazione del 30% nella dieta del coniglio, tra il 20-30% nella dieta di pecore, capre o mucche e in una percentuale tra il 5 e il 10% nella dieta di cani e gatti. E? stato evidenziato che il digerito cecale essiccato di coniglio contiene: 18,20% di umidit?; 15,30% di fibra grezza; 18,52% di proteina grezza; 7,60% di ceneri; 8,79% di estratto etereo e 38,39% di NFE. Sulla base di questa composizione, un'integrazione con una percentuale compresa tra il 10 e il 15% nella dieta del pollo, soprattutto nei broiler finisher, indurr? migliori performance in termini di crescita e immunomodulazione (con migliore assunzione di mangime, ottimizzazione del costo del mangime per chilogrammo di aumento di peso corporeo, indice di conversione dell?alimento e peso relativo dei differenti organi dell?animale).

La composizione finale dell'invenzione pu? variare in termini di percentuali di composizione amminoacidica, ma anche di contenuto di fibre (tipologia dei diversi componenti della fibra), quantit? di minerali e vitamine, percentuale di batteri, protozoi e lieviti, in base al tipo di mangime (alla composizione della razione alimentare), del bestiame (bovini e ovi-caprini) o dei conigli da cui proviene il materiale ruminale o il materiale cecale/colico di partenza. Di seguito sono riportati i valori ottenuti analizzando la composizione dell'invenzione, in base ai diversi lotti di contenuto ruminale/ ciecale da cui sono state effettuate l'estrazione e lo spray drying. In particolare, nella tabella 2 ? riportata la composizione percentuale del prodotto secondo i vari lotti esaminati.

Tabella 2

materia secca = DM; proteina grezza = CP; estratto di etere = EE; fibra grezza = CF; residuo incenerito = CENERE; estratto privo di azoto = NFE; fibra detergente neutra = NDF; fibra detergente acida = ADF; Calcio = CA; Fosforo = P

La conta microbica totale e il pH dei due lotti di campioni sono stati misurati prima e dopo ciascuna fase del processo di tindalizzazione. Per l'analisi della conta microbica aerobica e anaerobica, un'aliquota di ciascuno dei due campioni ? stata diluita serialmente su base 10 e seminata in duplicato per il conteggio su terreno TSA, BHI e MRS. I terreni sono stati incubati in aerobiosi e anaerobiosi a 37?C per 24-48 ore. Le colonie sono state contate dopo l'incubazione e sono state calcolate le UFC/mL. Le conte microbiche sono state trasformate in riduzione logaritmica utilizzando l'equazione: log (N/N0), dove N ? la concentrazione di cellule microbiche prima del processo di tindalizzazione e N0 ? la concentrazione di cellule microbiche dopo la tindalizzazione.

Il processo di tindalizzazione utilizzato ha coinvolto tre fasi di riscaldamento a 70?C per un massimo di 30 min separate da un periodo di incubazione di 24 ore per consentire la germinazione delle spore.

Per valutare la possibile efficacia e l'effetto post-biotico, abbiamo condotto uno studio pilota ?aperto? per valutare gli effetti clinici e immunologici della nostra invenzione (il contenuto del rumine liofillizzato e tindallizzato dopo trattamento mediante la tecnica dello spray-drying, derivante da materiale di base rappresentato dal contenuto di rumine misto ovino e bovino) su cani sani [protocollo di prova approvato (Certificato di approvazione n ? 3/2018) dal Comitato Etico del DETO Dipartimento - ]. Il consenso informato scritto ? stato ottenuto dai proprietari per la partecipazione dei loro animali a questo studio. Abbiamo ipotizzato che la nostra invenzione, con somministrazione pre- e post-biotica di materiale ruminale misto, liofilizzato e tindalizzato, a cani sani, modulerebbe i parametri clinici e immunologici. I meccanismi alla base delle propriet? immunomodulanti dei probiotici non sono completamente compresi ma in parte descritti nella parte introduttiva del presente brevetto. I meccanismi possono essere dovuti alla capacit? dei probiotici di bilanciare il microbiota intestinale e/o essere una conseguenza di un effetto coadiuvante diretto sulla produzione di fattori immunitari, come le citochine (

Probiotics: effects on immunity. Am. J. Clin. Nutr. (2001) 73:444-450.), e rilascio post-biotico di fattori immunitari da parte della flora ruminale. Lo stress e i cambiamenti nella dieta sono condizioni che influenzano la microflora intestinale dei cani e per le quali la nostra invenzione potrebbe essere utile. Pertanto, la nostra invenzione (rumine e/o contenuto cecale trattato mediante la tecnica ?spray-dried? e tindalizzato), pu? migliorare le condizioni di salute nei cani esposti a stress e infezioni. Importanti cambiamenti nella microflora si verificano anche durante lo svezzamento e gli eventi che avvengono durante questo periodo della vita possono avere un forte effetto sulla salute generale del cane per tutta la sua vita, in particolare sullo sviluppo del suo sistema immunitario. Pertanto, la logica dell'aggiunta del nostro prodotto a determinati tipi di alimenti per animali domestici, in particolare per i cuccioli, sembra giustificata. Il nostro obiettivo era testare la sicurezza e l'appetibilit? della nostra invenzione per stimolare le funzioni immunitarie nei cani quando il nostro prodotto viene aggiunto al loro regime alimentare standard. A tale scopo (Materiali e metodi), sono stati arruolati nello studio venti (20) cani clinicamente sani di razze diverse. I cani arruolati e i loro proprietari hanno ricevuto informazioni scritte sui metodi e tutti i proprietari hanno dato il loro consenso informato scritto a partecipare allo studio. Tutti i cani erano stati sverminati e vaccinati contro rabbia, cimurro e virus dell'epatite e non erano mai stati trattati con probiotici prima dell'inizio della sperimentazione. Dieci cani sono stati assegnati in modo casuale al gruppo di controllo e dei trattati, con distribuzione uguale per sesso. Il gruppo test (Gruppo A) ha ricevuto un alimento secco commerciale per cani, nutrizionalmente completo, estruso (Maintenance dry dog food, Nutrix? Castelraimondo, Macerata (MC); umidit? 10%, 23% proteine, 8,5% grassi, 2,5% fibre, 8% ceneri, 14,2 kJ energia metabolizzabile/g) integrato con il nostro prodotto. L??Invenzione? ? stata aggiunta alla dieta alla dose del 10% per rispettare giornalmente il peso totale del pasto. Sulla base della composizione dell'?Invenzione? (in particolare in base al contenuto di fibre), abbiamo definito il protocollo raccomandando l'incorporazione in questa percentuale ottimale nel tentativo di avere anche una concentrazione batterica finale di 10<10 >- 10<11 >cellule/ml e oltre 200 specie di batteri liofilizzati (principalmente appartenenti ai generi Prevotella, Butyrivibrio e Ruminococcus dominanti nei phyla batterici) per cane, ogni giorno per 90 giorni. Il dosaggio era basato sulla precedente valutazione della concentrazione in batteri/organismi nella nostra invenzione, per grammo. Il gruppo di controllo (Gruppo B) ha ricevuto lo stesso cibo secco per cani senza alcun additivo. I cani consumavano acqua ad libitum e il cibo veniva offerto per 20 minuti due volte al giorno. Per garantire che la somministrazione dell??Invenzione? non abbia influenzato negativamente l'appetibilit? del cibo e promosso o mantenuto la salute dei cani, l'assunzione di cibo, il peso corporeo, il ?body condition score? (BCS, Nestl? Purina) e il ?fecal scoring system? (FSS, Nestl? Purina) sono stati controllati regolarmente, dall'inizio (T0) alla fine della sperimentazione T8 ) (in totale 90 giorni, tre mesi di somministraizione della composizione della presente invenzione). I campioni fecali sono stati raccolti immediatamente dopo un'evacuazione spontanea e congelati in azoto liquido per la valutazione delle IgA. Poich? la nostra invenzione ? stata somministrata per via orale e ci si aspettava che agisse principalmente a livello della mucosa, le IgA secretorie sono state analizzate nelle feci. Per misurare le IgA nei campioni di feci, le feci di ciascun cane (0,5 g) sono state raccolte e processate. I campioni sono stati prelevati ogni 2 settimane da T0 a T8, da tutti i cani, e la concentrazione di IgA ? stata misurata mediante ELISA, secondo il metodo precedentemente pubblicato (Rossi G., Pengo G., Galosi L., Berardi S., Tambella AM, Attili AR, Gavazza A, Cerquetella M, Jergens AE., Guard BC., Lidbury JA., Stainer JM., Crovace AM, Suchodolski JS. Effects of the Probiotic Mixture Slab51? (SivoMixx?) as Food Supplement in Healthy Dogs: Evaluation of Fecal Microbiota, Clinical Parameters and Immune Function. Front. Vet.Sci.,04September2020,https://doi.org/10.3389/fvets.2020.00613.

? stato eseguito un profilo biochimico (glucosio, urea, creatinina, GGT, GOT, AST, ALP, proteine totali, albumina, ?Globuline, colesterolo) raccogliendo il sangue dalla vena giugulare in una provetta sierologica, all'inizio (T0) e alla fine (T8) dello studio. Il profilo biochimico ? stato determinato con BT 3000 Plus (Biotecnica Instruments, Roma, Italia). Per valutare l'effetto della ?invenzione" sulle risposte umorali sistemiche, sono stati misurati, nel plasma, i livelli di IgG totali circolanti. Il sangue ? stato raccolto mediante prelievo venoso dalla giugulare in provette eparinizzate alla settimana 0 e ogni 2 settimane fino all?ottava settimana dello studio. Il plasma ? stato recuperato dal sangue intero dopo il frazionamento ed ? stato utilizzato lo stesso metodo ELISA descritto sopra per analizzare il livello totale di IgG nel plasma. La quantit? totale di IgG nel plasma ? stata determinata utilizzando piastre ELISA rivestite con 100 ng/pozzetto di IgG anti-canino di coniglio (Jackson Immunoresearch, Cambridge, UK) secondo il metodo precedentemente descritto (Rossi et. Al; Front. Vet. Sci ., 4 settembre 2020, https://doi.org/10.3389/fvets.2020.00613).

I dati cardinali sono stati valutati per la normalit? utilizzando il test di Shapiro-Wilk. L'assunzione di cibo, il peso corporeo e i parametri biochimici del sangue sono stati confrontati tra i gruppi utilizzando il t-test o il test di Mann-Whitney, ove appropriato; l'assunzione di cibo e il peso corporeo sono stati anche confrontati tra i periodi di studio all'interno di ciascun gruppo utilizzando misure ripetute ANOVA o test di Friedman, ove appropriato; anche i parametri biochimici del sangue sono stati confrontati tra l'inizio (T0) e la fine dello studio (T8) all'interno di ciascun gruppo utilizzando t-test accoppiati o test Wilcoxon accoppiati, ove appropriato.

BCS e FSS sono stati analizzati con i test di Mann-Whitney e con il test di Friedman per eseguire il confronto tra i gruppi e tra i periodi di studio all'interno di ciascun gruppo, rispettivamente.

I titoli anticorpali nei sieri e nelle feci sono stati analizzati con il test t di Student per eseguire un confronto tra i gruppi. All'interno di ogni gruppo ? stata utilizzata l'ANOVA per misurazioni ripetute seguita dal test post-hoc di Holm-Sidak per confrontare il tempo di ogni studio rispetto a T0.

I dati sono stati analizzati statisticamente con GraphPad Prism, versione 8.2.1 per MacOS (GraphPad software Inc., San Diego, California, USA). Una differenza con un valore p <0,05 ? stata considerata statisticamente significativa per tutte le analisi sopra descritte.

Nessun cane ha mostrato effetti collaterali durante la prova e tutti sono risultati sani. L'assunzione di cibo e il peso corporeo, BCS, FSS e i parametri biochimici del sangue (dati non mostrati) non differivano statisticamente tra i due gruppi durante lo studio (p> 0,05).

I titoli fecali di IgA (Figura 1) erano simili tra i due gruppi all'inizio dello studio (T0) e dopo due settimane (T2), ma mostravano un livello significativamente pi? alto nel gruppo dei cani trattati, in cui l '"Invenzione" ? stata aggiunta alla dieta (Gruppo A) rispetto ai controlli (Gruppo B) a T4 (t = -3,214; p = 0,005), T6 (t = -2,796; p = 0,012) e T8 (t = -8,587; p <0.0001). Questi dati sono simili ai dati ottenuti in un recente studioprova in cui una miscela di probiotici commerciali ? stata somministrata a cani sani (Rossi et. Al; Effects of the Probiotic Mixture Slab51? (SivoMixx?) as Food Supplement in Healthy Dogs: Evaluation of Fecal Microbiota, Clinical Parameters and Immune Function. Front. Vet. Sci., 04 settembre 2020, https://doi.org/10.3389/fvets.2020.00613).

Confrontando il valore basale (T0) di IgA con quelli di ogni periodo di studio, ? stato osservato un aumento progressivo del titolo anticorpale all'interno del Gruppo A (F = 71,197; p <0,0001), con una differenza significativa gi? apprezzata a T4 (p <0,05) e durante l'intero follow-up successivo (p <0,05). Nel gruppo A, il titolo di IgA a 8 settimane (0,268 ? 0,020 OD450 nm ? SEM) era 4,6 volte superiore al titolo iniziale (0,058 ? 0,004 OD 450 nm ? SEM). Il gruppo B non ha mostrato variazioni significative nella concentrazione di anticorpi fecali durante lo studio; il titolo di IgA a 8 settimane (0,096 ? 0,002 OD450 nm ? SEM) non era statisticamente diverso dal titolo iniziale (0,074 ? 0,006 OD450 nm ? SEM).

Le concentrazioni di IgG plasmatiche erano simili tra i due gruppi all'inizio dello studio (T0) e dopo due settimane (T2), ma hanno mostrato un livello significativamente pi? alto nel gruppo trattato con Slab51? (Gruppo A) rispetto ai controlli (Gruppo B) a T4 (t = -5,748; p <0,0001), T6 (t = -6,346; p <0,0001) e a T8 (t = -18,765; p <0,0001).

Confrontando il valore basale (T0) di IgG con quelli di ogni periodo di studio, ? stato osservato un aumento progressivo del titolo anticorpale all'interno del Gruppo A (F = 161,146; p <0,0001), con un aumento significativo gi? apprezzato a T4 (p <0,05) e durante l'intero follow-up successivo (p <0,05). Nel gruppo A, il titolo di IgG a 8 settimane (11,020?0,261 g / L?SEM) era 2,2 volte superiore al titolo iniziale (5,012?0.199 g/L?SEM.

Nessuna differenza significativa nell'andamento degli anticorpi plasmatici ? stata osservata all'interno del gruppo B quando si confrontava il valore iniziale (T0) con ogni momento dello studio. Nel gruppo B, il titolo di IgG a 8 settimane (5,472?0,138 g / L?SEM) non era statisticamente diverso dal titolo iniziale (5,435?0,225 g / L?SEM).

Lo studio evidenzia che l'integrazione di cibo secco con la composizione della presente invenzione non ha effetti collaterali misurabili sui cani (Gruppo A), senza differenze nell'assunzione di cibo, perdita di peso o parametri chimici del siero tra i due gruppi. ? interessante notare che lo studio mostra che l'integrazione con la composizione della presente invenzione migliora le funzioni immunitarie della mucosa (locale) e sistemiche (plasma), in termini di concentrazione di IgA e IgG.

I diversi organismi uccisi/inattivati (lieviti, batteri, funghi, protozoi e virus) che compongono la composizione della presente invenzione innescano e stimolano direttamente il sistema immunitario sottostante la mucosa intestinale.

Inoltre, i cambiamenti nella quantit? totale di IgG nel plasma indicano anche una risposta sistemica alla polarizzazione GALT e alla stimolazione da parte della flora probiotica enterica intraluminale. In conclusione, i risultati riportati in questo trial clinico, supportano la sicurezza e l'appetibilit? della composizione della presente invenzione che rappresenta una miscela probiotica con molti nutrienti che esercitano una funzione prebiotica. La tindalizzazione del prodotto, non modifica il ruolo antigenico della miscela, provocando un'evidente risposta umorale e mucosale (nei cani trattati), simile a quella ottenuta in precedenti studi effettuati integrando batteri probiotici vivi alla normale dieta ( ,04 September 2020,https://doi.org/10.3389/fvets.2020.00613).

I parametri biochimici, ematici e plasmatici sono risultati inalterati in entrambi i gruppi in studio (cani del gruppo A integrati con "Invenzione" e cani non integrati del gruppo B), suggerendo la sicurezza e l'efficacia dell'integrazione nei cani trattati. Un interessante effetto coadiuvante della nostra ?Invenzione? nei cani trattati, ? evidente dopo due mesi di trattamento orale sia a livello mucosale che sistemico. Questo effetto potrebbe essere rilevante per migliorare la risposta immunitaria protettiva contro le infezioni durante il periodo critico di svezzamento e nelle fasi successive della vita.

Claims (10)

RIVENDICAZIONI

1. Composizione comprendente estratto secco del contenuto ruminale di bovini e ovini e il contenuto ciecale di coniglio.

2. Composizione secondo la rivendicazione 1 avente la seguente composizione umidit? 7,17%; sostanza secca 92,83%; proteina grezza 17,13%; ceneri 7,49%; estratto etereo 2,81%; grasso 1,10%; fibra grezza 24,58%; estratto privo di azoto (NFE) 40,82%.

3. Uso della composizione secondo la rivendicazione 1 o 2 per l?integrazione alimentare animale.

4. Processo per la preparazione di una composizione comprendente l'estratto secco di contenuto ruminale di bovino e ovino e il contenuto ciecale di coniglio comprendente un primo stadio di tindalizzazione in modalit? a blocchi, seguita da un secondo stadio di atomizzazione.

5. Processo secondo la rivendicazione 4 in cui lo stadio di tindalizzazione viene eseguito riscaldando ad una temperatura compresa tra 70-100?C e per un tempo compreso tra 15 e 30 minuti, seguito da incubazione a temperatura ambiente per un periodo di 24 ore, ripetuto due o tre volte.

6. Processo secondo la rivendicazione 5, in cui lo stadio di tindalizzazione include tre fasi di riscaldamento a 70?C per un massimo di 30 minuti separate da un periodo di incubazione di 24 ore.

7. Processo secondo la rivendicazione 4, in cui lo stadio di atomizzazione comprende quattro fasi successive in cui il prodotto liquido di partenza viene atomizzato in una forma spray, quindi le goccioline generate dallo spray vengono messe a contatto con aria riscaldata per l'evaporazione dell'umidit? e la formazione di particelle solide secche, quindi le particelle solide secche vengono separate dal flusso d'aria e raccolte.

8. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 ottenuta mediante un processo comprendente un primo stadio di tindalizzazione in modalit? a blocchi seguita da un secondo stadio di atomizzazione.

9. Integratore alimentare comprendente la composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 e 8 per uso per stimolare il sistema immunitario.

10. Integratore alimentare comprendente la composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 e 8 per uso per il trattamento delle di patologie selezionate nel gruppo consistente di: disbiosi, infezioni causate da enteropatogeni, gastriti, diarrea, diabete, patologie renali croniche, dermatite atopica, encefalopatia epatica, malattia infiammatoria intestinale (IBD), enterite reattiva delle fibre, enterite antibiotica reattiva, enterite corticosteroide reattiva, colite istiocitica del cane, dismotilit? cronica del colon, costipazione cronica del gatto, enterocolite mucoide del coniglio, adenopatia intestinale suina, malattia di Lawsonia intracellularis dei suini, malassorbimento del lattosio, Enterite necrotizzante del pollo, sindrome da lipidosi epatica, sindrome da colica del cavallo.