CN105296406A

CN105296406A - 一种副猪嗜血杆菌的培养方法及其灭活方法

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Publication number: CN105296406A
Application number: CN201510896736.6A
Authority: CN
Inventors: 王晓丽; 王永明; 张效伟; 吴海珍; 范珊; 任明明; 王晓燕; 李士成
Original assignee: SHANDONG HUAHONG BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Current assignee: SHANDONG HUAHONG BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Priority date: 2015-12-07
Filing date: 2015-12-07
Publication date: 2016-02-03

Abstract

本发明提供了一种副猪嗜血杆菌的培养方法及其灭活方法，属于发酵培养和菌种灭活领域，其培养步骤为a.一级种子液的制备；b.二级种子液的制备；c.微生物发酵罐扩大培养,通过上述培养方法可使得副猪嗜血杆菌各菌株活菌数均≥7.0×10⁹CFU/mL；加入菌液总量0.4％的甲醛，在37℃灭活菌种24小时。本发明的培养方法获得各菌株活菌数高且稳定，同时培养成本低，灭活时间短，大大的缩减了生产周期，对疫苗的产业化生产工艺有很大的提高和改善。

Description

一种副猪嗜血杆菌的培养方法及其灭活方法

技术领域

本发明涉及菌种发酵培养和灭活领域，更具体地说涉及一种副猪嗜血杆菌的培养方法及其灭活方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌是巴氏杆菌科的一种短小革兰阴性杆菌，主要引起的猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎的传染病，主要感染断奶前后仔猪。近年来，由该菌直接感染或混合感染给养猪业带来一定的经济损失已成为猪的主要病原之一。

副猪嗜血杆菌在培养基上生长缓慢，对营养条件要求高，在进行副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的制备时，副猪嗜血杆菌培养的活菌浓度直接影响疫苗的质量，同时良好的灭活条件对疫苗的产业化也有一定的影响。

发明内容

本发明提供了一种副猪嗜血杆菌的培养方法及其灭活方法，使其副猪嗜血杆菌各菌株获得最适宜培养和灭活条件，以便制定疫苗的产业化生产工艺。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种副猪嗜血杆菌的培养方法，包括以下步骤：(1)一级种子液的制备；(2)二级种子液的制备；(3)微生物发酵罐扩大培养；其特征在于，所述的扩大培养中副猪嗜血杆菌二级种子液接入量为2％(V/V)。

进一步地，所述的副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌SD02株、HN02株、GZ01株和JX03株。

进一步地，所述的扩大培养所用培养基为含5％新生牛血清和12μg/mL的NAD的TSB培养基。

进一步地，所述的扩大培养条件为搅拌速度为100～150转/分，培养温度37℃，培养时间8～10小时。

进一步地，所述的副猪嗜血杆菌各菌株活菌数均≥7.0×10⁹CFU/mL。

进一步地，所述的灭活方法为加入菌液总量0.4％的甲醛，37℃灭活24小时。

有益效果：本发明的培养方法获得各菌株活菌数高且稳定，同时培养成本低，灭活时间为24h，大大的缩减了生产周期，对疫苗的产业化生产工艺有很大的提高和改善。

具体实施方式

下面详细说明本发明的具体实施，有必要在此指出的是，以下实施只是用于本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整，仍然属于本发明的保护范围。

菌种：副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、5型HN02株、12型GZ01株、13型JX03株，由山东华宏生物工程有限公司提供。

培养基和试剂：含10％血清的TSA培养基和TSB培养基、甲醛溶液，由山东华宏生物工程有限公司研发部实验室配制。

发酵罐：由山东华宏生物工程有限公司提供。

试验动物：3～5周龄健康易感猪，由山东华宏生物工程有限公司试验定点猪场提供；经间接血凝试验，其副猪嗜血杆菌间接血凝抗体效价≤1:4。

实施例1副猪嗜血杆菌生产用种子制备

取副猪嗜血杆菌SD02株、HN02株、GZ01株和JX03株冻干菌种分别用含NAD和新生牛血清的TSB培养基溶解后，划线接种于含NAD和新生牛血清的TSA平皿上，置37℃培养24小时，挑选5个典型菌落，接种含NAD和新生牛血清的TSA固体培养基，37℃培养24小时，作为一级种子。用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子菌落，接种于含5％新生牛血清和12μg/mLNAD的TSB培养基，置37℃振荡培养8～10小时，取样经纯检合格后作为二级种子。

实施例2二级种子接种量的确定试验

种子接种量是指接入的种子体积和培养基体积的比例。

制苗用培养基为含5％的新生牛血清和12μg/mLNAD的TSB培养基。

以1％、2％、4％和5％(V/V)的比例分别接种SD02株、HN02株、GZ01株、JX03株的二级种子，37℃培养，静止培养2小时后，设定搅拌速度为100转/分，培养12小时，每隔2小时取样，进行活菌计数，测定不同接种量不同培养时间菌液中的活菌数，确定二级种子的最佳接种剂量。

将副猪嗜血杆菌各菌株二级种子以不同接种量接入发酵罐中培养不同时间后分别取样进行活菌计数，计数结果见表1～表4。

表1副猪嗜血杆菌SD02株不同接种量、不同培养时间的活菌计数结果

表2副猪嗜血杆菌HN02株不同接种量、不同培养时间的活菌计数结果

表3副猪嗜血杆菌GZ01株不同接种量、不同培养时间的活菌计数结果

表4副猪嗜血杆菌JX03株不同接种量、不同培养时间的活菌计数结果

由表1～表4可知，随着二级种子接种量的增大，达到细菌生长稳定期的菌数所用时间越短。根据活菌计数结果，考虑到生产成本，确定副猪嗜血杆菌各菌株二级种子的接种量为2％(V/V)，培养时间为8～10小时。

实施例3血清和NAD添加量的确定试验

制苗用培养基为含NAD和血清的TSB培养基。按含12μg/mLNAD的TSB培养基总量的5％、10％和15％的比例来添加血清，或按含5％血清的TSB培养基中NAD浓度分别为12μg/mLNAD、16μg/mLNAD、20μg/mLNAD的量分别接种2％的SD02株、HN02株、GZ01株、JX03株的二级种子，37℃培养，静止培养2小时后，设定搅拌速度为100转/分，培养12小时，每隔2小时取样，进行活菌计数，测定含不同含量的血清和含不同浓度NAD的TSB培养基在不同培养时间菌液中的活菌数，确定在TSB培养基中血清和NAD的最佳添加量。

①不同血清添加量对副猪嗜血杆菌各菌株培养浓度影响的结果

制苗用培养基为含NAD和血清的TSB培养基。按含12μg/mLNAD的TSB培养基总量的5％、10％和15％的比例来添加血清，分别接种2％含量的SD02株、HN02株、GZ01株、JX03株的二级种子，37℃培养，设定搅拌速度为100转/分，培养12小时，每隔2小时取样，进行活菌计数，测定含不同血清含量的TSB培养基在不同培养时间菌液中的活菌浓度，试验结果见表5～表8。

表5副猪嗜血杆菌SD02株在不同血清添加量下培养的活菌浓度

表6副猪嗜血杆菌HN02株在不同血清添加量下培养的活菌浓度

表7副猪嗜血杆菌GZ01株在不同血清添加量下培养的活菌浓度

表8副猪嗜血杆菌JX03株在不同血清添加量下培养的活菌浓度

由表5～表8试验结果可知，分别接种2％的副猪嗜血杆菌各菌株二级种子液，37℃培养12小时后，在含NAD的培养基中不同血清浓度的培养基中活菌计数结果也不同，为保证各菌株的活菌数及降低生产成本，将培养基中血清浓度定为5％。

②不同NAD添加量对副猪嗜血杆菌各菌株培养浓度影响的结果

制苗用培养基为含NAD和血清的TSB培养基。按5％血清含量的TSB培养基中NAD添加浓度分别为12μg/mL、16μg/mL、20μg/mL，分别接种2％含量的SD02株、HN02株、GZ01株、JX03株的二级种子，37℃培养，设定搅拌速度为100转/分，培养12小时，每隔2小时取样，进行活菌计数，测定含不同NAD含量的TSB培养基在不同培养时间菌液中的活菌浓度，试验结果见表9～表12。

表9副猪嗜血杆菌SD02株在不同NAD浓度下培养的活菌浓度

表10副猪嗜血杆菌HN02株在不同NAD浓度下培养的活菌浓度

表11副猪嗜血杆菌GZ01株在不同NAD浓度下培养的活菌浓度

表12副猪嗜血杆菌JX03株在不同NAD浓度下培养的活菌浓度

根据以上试验结果，考虑到生产成本，副猪嗜血杆菌各菌株血清添加量为5％，NAD添加浓度为12μg/mL，在此添加条件下，培养8～10小时，副猪嗜血杆菌各菌株培养浓度较高，能满足抗原生产需要。

实施例4按照优化条件培养副猪嗜血杆菌

根据上述试验的测定结果,得出制苗用培养基为含12μg/mLNAD和5％血清的TSB培养基。按TSB培养基的总量2％分别接种副猪嗜血杆菌各菌株二级种子液，设定搅拌速度为150转/分，37℃培养10小时收获菌液，进行活菌计数。

根据上述测定结果，利用优化后的试验条件分别对副猪嗜血杆菌各菌株进行菌液培养，37℃培养10小时收获菌液，分别进行活菌计数，试验结果见表13。

表13副猪嗜血杆菌各菌株在优化条件下培养10小时后活菌计数结果

由上表可知，制苗用培养基为含12μg/mLNAD和5％血清的TSB培养基。按TSB培养基总量的2％分别接种副猪嗜血杆菌各菌株二级种子液，设定搅拌速度为100转/分，37℃培养10小时收获菌液，副猪嗜血杆菌各菌株活菌数均能达到7.0×10⁹CFU/mL以上浓度，能满足该菌的抗原生产需要

实施例5不同甲醛浓度对副猪嗜血杆菌菌株培养菌液的灭活效果试验

取副猪嗜血杆菌各菌株二级种子接种于含12μg/mLNAD和5％血清的TSB培养基，副猪嗜血杆菌各菌株二级种子接种量2％，设定搅拌速度为150转/分，37℃培养12小时，收获菌液，进行活菌计数，测定副猪嗜血杆菌各菌株培养菌液中的活菌数。

将副猪嗜血杆菌各菌株培养菌液分别分成3组，1组、2组和3组分别加入0.2％、0.3％和0.4％的甲醛溶液，经37℃灭活12、16、20、24、28小时，其间搅拌数次，然后取灭活菌液接种含12μg/mLNAD和5％血清的TSA琼脂平板，每个样品接种3个平板，每个平板接种0.2mL，37℃培养48小时，检查有无细菌生长。

①各菌株菌液浓度

副猪嗜血杆菌SD02株菌液灭活前的活菌数为7.8×10⁹CFU/m，HN02株菌液灭活前的活菌数为7.2×10⁹CFU/mL，GZ02株菌液灭活前的活菌数为7.9×10⁹CFU/mL，JX03株菌液灭活前的活菌数为7.6×10⁹CFU/mL。

②副猪嗜血杆菌各菌株菌液的灭活试验结果

分别以不同甲醛溶液浓度对副猪嗜血杆菌各菌株菌液进行灭活，灭活不同时间后取样进行灭活检验，试验结果见表14。

表14各菌株菌液在不同甲醛浓度、不同灭活时间灭活结果

注：“+”表示灭活检验有菌生长，“-”表示灭活检验无菌生长。

由上表可知，按SD02株、HN02株、GZ01株和JX03株菌液总量的0.4％加入甲醛，37℃灭活24小时，可完全灭活各菌株菌液。

实施例6灭活菌液对试验猪的安全性试验

根据试验结果确定各菌株的灭活条件后，取灭活彻底的菌液，按4.0mL/头的剂量颈部肌肉注射5周龄健康易感猪(副猪嗜血杆菌间接血凝抗体效价≤1:4)2头，连续观察14日，观察试验猪的临床表现、健康状态及其有无局部及全身反应。

根据灭活试验结果确定各菌株菌液的灭活条件后，取灭活彻底的副猪嗜血杆菌各菌株菌液，按4.0mL/头的剂量颈部肌肉注射5周龄试验猪(副猪嗜血杆菌间接血凝抗体效价≤1:4)2头，连续观察14日，试验结果见表15。

表15灭活菌液对试验猪的安全性试验结果

由上表可知，灭活后各菌株菌液4.0mL/头的剂量颈部肌肉注射5周龄试验猪，试验猪注射部位均未出现炎性反应，采食量及精神状态正常，均全部健活。试验结果表明，以0.4％终浓度甲醛溶液灭活的抗原菌液对试验猪的安全性良好。

Claims

1.一种副猪嗜血杆菌的培养方法，包括以下步骤：(1)一级种子液的制备；(2)二级种子液的制备；(3)微生物发酵罐扩大培养；其特征在于，所述的扩大培养中副猪嗜血杆菌二级种子液接入量为2％(V/V)。

2.根据权利要求1所述的一种副猪嗜血杆菌的培养方法，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌SD02株、HN02株、GZ01株和JX03株。

3.根据权利要求1所述的一种副猪嗜血杆菌的培养方法，其特征在于，所述的扩大培养所用培养基为含5％新生牛血清和12μg/mL的NAD的TSB培养基。

4.根据权利要求1或3所述的一种副猪嗜血杆菌的培养方法，其特征在于，所述的扩大培养条件为搅拌速度为100～150转/分，培养温度37℃，培养时间8～10小时。

5.根据权利要求4所述的一种副猪嗜血杆菌的培养方法，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌各菌株活菌数均≥7.0×10⁹CFU/mL。

6.一种副猪嗜血杆菌的灭活方法，其特征在于，所述的灭活方法为加入菌液总量0.4％的甲醛，37℃灭活24小时。