CN111607533B - 一株耐高温的乳酸菌及其在豆腐酸浆生产中的应用 - Google Patents

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Abstract

一株耐高温的乳酸菌及其在豆腐酸浆生产中的应用，属于乳杆菌领域。本发明的目的是为了解决现有的乳酸菌不耐高温的问题，一株耐高温的乳酸菌，鼠李唐乳杆菌HCUL 1.1901‑1912，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19309，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2020.01.07；所述乳酸菌应用于酸浆豆腐生产中豆腐酸浆水的发酵。本发明运用紫外诱变技术、温度梯度筛选和16SrRNA基因序列分析法对实验室储存从云南建水豆腐酸浆中分离的乳酸菌进行诱变及高温筛选培养鉴定。可对纯种发酵酸浆提供技术支撑，还为制备标准化酸浆和酸浆豆腐制作技术规范提供理论依据。

Description

一株耐高温的乳酸菌及其在豆腐酸浆生产中的应用
技术领域
本发明属于乳酸菌领域，具体涉及一株耐高温的乳酸菌及其在豆腐酸浆生产中的应用。
背景技术
近年来，人们越来越重视一些具有特殊功能，极端微生物的研究。其中耐高温的乳酸菌在食品、医药和化工等多种工业中的应用尤为突出，目前其主要在食品中广泛应用。酸乳、干酪、泡菜、豆豉等都是世界上各个国家广泛喜爱的一种功能性食品，它们都是以乳酸菌为发酵菌种的。在高渗和高温的条件下，利于提高底物和产物的浓度；另外，在生产中可以减少污染杂菌，降低生产风险。
酸浆豆腐作为我国传统食品以其绿色安全、口感良好等特性日益成为人们关注的热点。酸浆豆腐不添加其他凝固剂，是利用自身制作豆腐所产生的副产物——黄浆水自然发酵后作为凝固剂，而黄浆水在自然发酵成酸浆的过程中，起主要作用的有益菌就是乳酸菌。目前工业上酸浆豆腐制备中最低点浆温度为75℃，而普通乳酸菌的最适温度为37℃～42℃，对于酸浆豆腐工艺而言，如果可以获得一株优良的耐高温的菌种非常关键，因此乳酸菌的分离选育工作至关重要，但要取得优良的菌种却并非易事。
尽管现在采用基因工程等技术手段可以添加外源基因到细胞内或者删除某个基因。但就目前技术看来，获得一个具有优良性状的菌株仅靠以上的简单基因操作并不容易，并且删除某个基因或者导入外源基因可能会破坏乳酸菌胞内的代谢平衡，进而影响细胞的正常代谢生长。另外，对于食品工业而言，基因工程菌的使用可能具有高度安全隐患，在很多国家是被禁止的。因此，传统的诱变育种仍是大多数工业微生物育种最重要、最有效的技术手段。
目前用于微生物诱变育种的方法有物理和化学诱变，其中物理诱变包括紫外线、激光、X射线、γ射线、快中子等物理方法，化学诱变主要包括各种烷化剂。其中紫外诱变依据DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力，最大的吸收峰在260nm，因此波长260nm的紫外辐射是最有效的诱变剂，紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失等，可提高变异频率，加快育种进程，大幅度改良某些性状且安全无毒，适合食品上应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的乳酸菌不耐高温的问题，提供一株耐高温的乳酸菌及其在豆腐酸浆生产中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一株耐高温的乳酸菌，鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)HCUL 1.1901-1912，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19309，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2020.01.07。
一种上述的耐高温的乳酸菌的应用，所述乳酸菌应用于酸浆豆腐生产中豆腐酸浆水的发酵。
本发明相对于现有技术的有益效果为：本发明运用紫外诱变技术、温度梯度筛选和16SrRNA基因序列分析法对实验室储存从云南建水豆腐酸浆中分离的乳酸菌进行诱变及高温筛选培养鉴定。可对纯种发酵酸浆提供技术支撑，还为制备标准化酸浆和酸浆豆腐制作技术规范提供理论依据，对酸浆豆腐的规模化生产和推广具有重要意义，也为开发新型益生菌发酵豆制品提供了新的资源来源。
附图说明
图1为HCUL 1.1901-1912紫外诱变前显微镜像图；
图2为HCUL 1.1901-1912紫外诱变后显微镜像图；
图3为HCUL 1.1901-1912紫外诱变后耐60℃、70℃、80℃、90℃温度60min后显微镜像图，诱变以后菌种形态改变，由短杆菌变为长杆菌；
图4为HCUL 1.1901-1912紫外诱变后耐不同梯度温度生长曲线比较图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一株耐高温的乳酸菌，鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)HCUL 1.1901-1912，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19309，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2020.01.07。出发菌种HCUL 1.1901-1912鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)为云南建水豆腐中自然分离的乳酸菌。诱变菌种可以耐90℃高温60min以上，生长良好，传代十代稳定。出发菌种经紫外诱变以后在90℃水浴60min以后培养，重复三次的镜检观察图，如图1和2所示，诱变后的杆菌在形态上明显比出发菌种变长。
本发明植物乳杆菌采用下述流程进行选育：原始出发菌种，试管活化，扩大培养，紫外诱变，耐高温菌筛选，复筛，复壮，传代稳定性试验，豆腐酸浆发酵，有机酸检测，豆腐酸浆应用验证试验。本发明所采用的原始菌株最适发酵温度为37℃，对其进行紫外诱变，诱变后通过高温水浴进行初筛，接着对选育出来的菌株继续进行高温水浴复筛复壮，选育优良的乳杆菌株，然后做稳定传代实验，评价其遗传稳定性，并应用于豆腐酸浆发酵，用液相色谱测定发酵液中的有机酸含量，最后应用于豆腐酸浆发酵制作，进行实验效果的评价。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一株耐高温的乳酸菌，该菌株在显微镜下观察特点如下，所述乳酸菌为圆端直杆菌，宽度小于1μm，2到4个杆菌在固体培养基上易于连接在一起，该菌菌落为乳白色，表面光滑，湿润，粘稠，边缘较整齐。
具体实施方式三：具体实施方式一所述的一株耐高温的乳酸菌，与原始菌相比，该诱变菌株在形态上明显长于出发菌株。
具体实施方式四：一种具体实施方式一至三任一具体实施方式所述的一株耐高温的乳酸菌的应用，所述乳酸菌应用于酸浆豆腐生产中豆腐酸浆水的发酵，提高产酸量。
实施例1：
鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)HCUL 1.1901-1912在豆腐酸浆生产中的应用，具体步骤如下：
1、扩大培养：先配置MRS固体培养基和MRS肉汤培养基，将实验室从酸浆中分离好冷冻保藏的菌种放至室温。在无菌操作下，用沾有75％酒精的棉花擦拭接种环，并靠近火焰用接种环从解冻的菌中挑菌至MRS固体培养基上，三角划线，并用封口膜包裹；用5ml针管从已溶解的管中吸取5ml的菌液，滴入MRS肉汤培养基中(按5％的比例)，并轻微震荡，直到均匀悬浮。将接种好的两个培养基均置于37℃培养箱中培养，培养24h后观察培养基生长情况，MRS固体培养基出现菌落；MRS肉汤培养基出现浑浊且底部有菌丝出现。进一步扩培，先配置MRS肉汤培养基，在无菌操作下，以沾有75％酒精的棉花擦拭仪器，在火焰上加热针头，并靠近火焰，用20ml针管从已活化好的菌液内吸取20ml菌液，滴入MRS肉汤培养基中(按5％的比例)，并轻微震荡，直到均匀悬浮，将接种好的MRS肉汤培养基置于37℃培养箱中培养，培养24h之后将所得菌液置于4℃冰箱内保存待用。本步骤是将冷冻保藏的菌种在MRS肉汤培养基中扩培培养，在MRS固体培养基中是为了保证扩培菌种无污染。
2、紫外诱变：配置固体培养基，取已培养好的新鲜菌液，用无菌生理盐水水洗三次，接种于盛有转子的培养皿中，置于磁力搅拌器上，启动并充分搅拌10分钟，使菌体均匀分散，即为菌悬浮液。取上述菌悬浮液计数，调整菌悬浮液密度为108/毫升。吸取1毫升菌悬浮液于9毫升无菌水中，稀释后再计数一次，要求达到每平皿菌落数在300个。在黑暗条件下进行紫外线照射处理。照射处理前，先开紫外线灯20分钟，使灯的功率稳定(紫外灯的功率为20W，照射距离为20～35厘米)。将待处理的菌悬浮液放于培养皿中，置于电磁搅拌器上，放在紫外线灯正中下方，先将整个平皿照射1分钟后，打开皿盖，此时开始记时并启动电磁搅拌器，准确计算照射时间。取样浇平板，经过一定时间照射处理后取样作适当的稀释后，每皿加入0.1毫升，涂布后用纸包好，置于37℃恒温培养24～48小时，计数菌落，绘制照射时间与致死率曲线。将菌悬浮液在不同诱变时间照射(0、10、20、30、40、50、60s)，稀释至适合的倍数，取0.1ml涂布于MRS固体培养基中。为防止光修复，将平板用报纸包好，置于37℃培养箱中培养24h，再对平板上的菌进行观察和计数，选取致死率在70％-80％的照射时间为最佳诱变时间；其他因素不变，改变照射距离(20、25、30、35cm)，用同样的方法，选取致死率在70％-80％的照射距离为最佳诱变距离，确定紫外诱变最佳条件为诱变30s、诱变距离30cm、紫外灯20w。
3、耐高温复筛复壮乳酸菌：将紫外诱变得到的突变株接种于MRS液体培养基中37℃培养至对数生长期，分别放入60℃、70℃、80℃、90℃的水浴锅中水浴加热30min，在无菌条件下涂平板，置于37℃培养箱培养24h观察生长情况，如图3所示。将紫外诱变得到的耐高温突变株复壮培养。(1)建立梯度取10μl菌种，加入90μl的无菌水，得到稀释10倍的菌液，然后以稀释10倍的菌液为母液建立稀释100倍的菌液，重复上述步骤，直到得到稀释6个梯度倍数。(2)平板培养用MRS液体培养基分别将上述六个梯度的菌种在无菌条件下培养，分别记为1，2，3，4，5，6。37℃培养48小时后观察镜检，选用最适合的菌落用于下一步的操作。(3)扩大培养挑选出单菌落，分别放入MRS培养基中，在37℃条件下培养24小时，测OD值。(4)重复上述操作连续传代五次以上，得到活性好复壮后的菌株。
4、传代稳定实验：先配置好MRS肉汤培养基，在无菌条件下，按5％的比例将复壮后的菌种接种到MRS肉汤培养基中，在37℃培养箱中培养24h，观察其生长情况，再75℃高温水浴半小时，置于37℃培养箱中培养24h，观察生长情况。重复传代10次以上，保证突变株稳定遗传。图4为本发明HCUL 1.1901-1912紫外诱变后耐不同梯度温度生长曲线比较图，可以看出本发明的菌种在多次复筛复壮后耐热能力和耐热时间均得到了大幅度的提高。
5、16s检测：测定结果报告。
对本发明诱变前和诱变后的菌种进行16s鉴定，检测结果表明，诱变前后为同一种菌，菌种未发生变异，同时证实实验过程中菌种没有污染和杂菌，鉴定结果如下表：
编号 样本名称 数据库比对相似度较高的结果
诱变前 T-01 lactobacillus rhamnosus
诱变后 GRS01 lactobacillus rhamnosus
6、豆腐酸浆发酵：先配置好MRS肉汤培养基，在无菌条件下，将诱变得到的耐高温乳酸菌按5％的比例接种于肉汤里，置于37℃培养箱中培养24h。将酸浆豆腐制作时产生的黄浆水高温灭菌，冷却至室温，在无菌条件下，将培养好的乳酸菌液按20％的比例接种于酸浆中，置于37℃培养箱中培养65h，测定其酸度如下表所示。
Figure GDA0003502299490000051
7、豆腐酸浆应用验证实验：将耐完高温的乳酸菌应用于豆腐酸浆发酵制作中，可大大提高产酸量。

Claims (2)

1. 一株耐高温的乳酸菌，其特征在于：所述乳酸菌为鼠李糖乳杆菌（lactobacillusrhamnosus）HCUL 1.1901-1912，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19309，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2020.01.07。
2.一种权利要求1所述的一株耐高温的乳酸菌的应用，其特征在于：所述乳酸菌应用于酸浆豆腐生产中豆腐酸浆水的发酵。
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