CN109609399A - 一种苏云金芽孢杆菌DavⅣ及其应用 - Google Patents

一种苏云金芽孢杆菌DavⅣ及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苏云金芽孢杆菌DavⅣ及其应用，该菌株已于2018年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018626。该菌株落边缘缺刻，呈现出圆形，表面较湿润，不易挑取，经试验证明就有很好的蛋白质分解能力。

Description

一种苏云金芽孢杆菌DavⅣ及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌Dav Ⅳ及其应用。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，是蜡状芽胞杆菌群 (Bacilluscereus)中一种需氧的革兰氏阳性菌，杆状、内生芽孢菌体为短杆状，生鞭毛生长最适温度为37℃-40℃。通常在其感应到逆境的外界环境条件下就会形成内孢子，这些孢子有一层坚固的保护外壳，是可休眠的不可复制的非常坚硬的结构，可以在外界环境条件适合的情况下萌发恢复营养生长和分裂。
本发明从四川师范大学芦笋种植土壤中使用平板稀释涂布法与划线法在LB培养基上筛选分离得到一株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，经试验发现该菌株具有较强的蛋白质分解能力，目前还未见有相关的报道。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种分离得到的苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis)DavⅣ，该菌株具有较强的分解蛋白质的能力。
本发明的另一目的在于提供该苏云金芽孢杆菌DavⅣ在提高土壤总氮含量中的应用。
本发明具体通过以下技术方案实现：
该苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)DavⅣ通过在四川师范大学芦笋种植土壤中使用平板稀释涂布法与划线法筛选分离得到。
本发明所述的苏云金芽孢杆菌DavⅣ的形态特征：菌落边缘缺刻，呈现出圆形，表面较湿润，不易挑取。菌株的接触酶、淀粉水解、柠檬酸盐利用试验均呈现阳性，而乙酰甲基甲醇(V-P)、在65℃生长、从葡萄糖产酸产气系列试验则呈现阴性。
苏云金芽孢杆菌DavⅣ的分子生物学特性：利用PCR技术扩增该菌的16S rRNA基因，获得到一条大约为1.5kb特异条带，得到如 SEQ ID NO.1所示的DNA序列。将GenBank核酸序列库与所获得序列进行同源性比对，发现该菌株DavⅣ与Bacillus属关系最近，其中与Bacillus Coagulans的同源性最高，达到99％。根据16S rDNA序列同源性和形态分析将该菌鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，因此将本发明的得到的菌株DavⅣ命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)DavⅣ。
将所述的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)DavⅣ进行保藏， (保藏单位：中国典型培养物保藏中心。保藏地址：中国武汉武汉大学。保藏日期：2018年9月30日。保藏编号为CCTCC NO:M 2018626。
该菌株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)DavⅣ在分解蛋白质中的应用也在本发明的保护范围之内，包括该菌株的菌悬液或其培养液或其发酵液在分解蛋白质中的应用；还包括利用该菌株或其菌悬液或其培养液或其发酵液制备得到的制剂在分解蛋白质中的应用。
本发明的有益效果：
本发明得到一株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)DavⅣ，并对其进行了保藏，经试验发现该菌株具有较强的蛋白质分解能力。
附图说明
图1是苏云金芽孢杆菌蛋白质分解酶活温度曲线；
图2是苏云金芽孢杆菌DavⅣ第蛋白的分解能力示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1样品采集、菌株分离
菌落特征采用稀释涂布与平板划线分离法。将菌种从4℃的冰箱中拿出，用接种环挑起少量菌种并划线接于牛肉膏蛋白胨培养基上, 将牛肉膏蛋白胨培养基放在恒温培养箱内(37℃)培养48h，之后观察。菌落边缘缺刻，呈现出圆形，表面较湿润，不易挑取。
实施例2菌株的鉴定
分离纯化的菌株，经过16S rRNA基因扩增以及PCR扩增，获得到一条大约为1.5kb特异条带，得到如SEQ ID NO.1所示的DNA序列。将GenBank核酸序列库与所获得序列进行同源性比对，发现该菌株DavⅣ与Bacillus属关系最近，其中与Bacillus Coagulans的同源性最高，达到99％。根据16S rDNA序列同源性和形态分析将该菌鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，因此将本发明的得到的菌株DavⅣ命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)DavⅣ。在 TSA平板上生长的菌落呈灰白色，边缘波浪状，生长温度范围15-45℃。将菌株穿刺接种到牛肉膏蛋白胨半固体培养基，得到该菌株为需氧、运动型。
对菌株进行接触酶试验，菌株的接触酶、淀粉水解、柠檬酸盐利用试验均呈现阳性，而乙酰甲基甲醇(V-P)、在65℃生长、从葡萄糖产酸产气系列试验则呈现阴性。
基于以上特征，将菌株DavⅣ鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)DavⅣ。该菌株于2018年9月30日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2018626。
实施例3菌株的酶活性实验
酶液制备
挑取少量菌苔于50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃、 180rpm的摇床上培养24h,取上清液即得到粗酶液。
蛋白酶活力的测定
蛋白酶活力测定采用福林酚(Folin)法。取培养24h后的菌体，对其进行低速离心，并取上清液来测定蛋白酶活力。取1ml样品加入已预先30℃、40℃、50℃、60℃保温的装有1ml1％酪蛋白溶液(pH值 6.8的磷酸缓冲液)的离心管中,于40℃水浴中保温10min,快速加入 2ml且浓度为0.4mol/L的三氯乙酸以终止反应,在室温条件下静放 30min,离心后取上清液1ml置于试管中,加入5ml0.4mol/L碳酸钠溶液及1ml福林酚溶液,充分混匀后分别放于30℃、40℃、50℃、60℃的热水浴中保温20min,测定其在680nm处的吸光度。酶活力定义: 在pH值为6.8的测定条件下,每1分钟水解酪蛋白并释放1μg酪氨酸的酶量称为1个蛋白酶活力单位(U)。
酶活力(U/mI)＝A×(4/10)×N
式中A由样品测得的OD值，查标准曲线得相关的酪氨酸微克数；4ml反应液取出1ml测定；10为反应时间(min)；N为稀释倍数。
表1苏云金芽孢杆菌蛋白质分解酶活特性(U/mL)
温度 酶活性
30℃ 19.8
40℃ 25.4
50℃ 34.2
60℃ 48.7
65℃ 43.4
70℃ 44.8
75℃ 41.5
80℃ 37.2
从图1可知，当温度低于60℃时，随着温度升高苏云金芽孢杆菌DavⅣ的蛋白酶活性呈递增趋势，60℃以后，苏云金芽孢杆菌 DavⅣ的蛋白酶活性呈下降趋势。DavⅣ下降幅度较小。说明苏云金芽孢杆菌DavⅣ在小于60℃时解蛋白能力较强，DavⅣ在60℃后解蛋白能力较强，使用苏云金芽孢杆菌DavⅣ发酵后加至有机肥中，有利于加速有机肥中的蛋白质的分解，从而供给土壤营养，减少有机物污染。
实施例4对蛋白质的分解能力
解蛋白酪素平板上
酪蛋白培养基：酵母2.5g，蛋白胨5g，酪蛋白10g，KH2PO40.3g， MgSO4·7H2O0.5g，琼脂粉20g，NaCl 1g，蒸馏水1000mL，并在121℃条件下高压灭菌20分钟。
将灭菌好了的培养基到入平板中，待其凝固，在平板中心点上 DavⅣ。37℃培养3天。结果如表2和图2。
表2对蛋白质的分解能力
结果表明苏云金芽孢杆菌DavⅣ有较强的分解蛋白质的能力。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 四川师范大学
<120> 一种苏云金芽孢杆菌DavⅣ及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 949
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)
<400> 1
cctatacatg caagtcgagc gaatggatta agagcttgct cttatgaagt tagcggcgga 60
cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca taagactggg ataactccgg gaaaccgggg 120
ctaataccgg ataacatttt gaaccgcatg gttcgaaatt gaaaggcggc ttcggctgtc 180
acttatggat ggacccgcgt cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa 240
cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300
tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg 360
ccgcgtgagt gatgaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa gaacaagtgc 420
tagttgaata agctggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc 480
cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc 540
gcgcaggtgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg agggtcattg 600
gaaactggga gacttgagtg cagaagagga aagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg 660
cgtagagata tggaggaaca ccagtggcga aggcgacttt ctggtctgta actgacactg 720
aggcgcgaaa gcgtgtggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780
atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gaagttaacg cattaagcac 840
tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 900
agcggtggaa catgtgttta attcgaagca cgcgaaaacc ttaccagtc 949

Claims (4)

1.一种苏云金芽孢杆菌DavⅣ，其特征在于，该菌株已于2018年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018626。
2.根据权利要求1所述的一种苏云金芽孢杆菌DavⅣ，其特征在于，所述的苏云金芽孢杆菌DavⅣ的16S rRNA序列为：SEQ ID NO：1。
3.根据权利要求1所述的一种苏云金芽孢杆菌DavⅣ，其特征在于，该菌株菌落边缘缺刻，呈现出圆形，表面较湿润，不易挑取。
4.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌DavⅣ在分解蛋白质中的应用。
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