CN114672444A

CN114672444A - 一株苏云金芽孢杆菌及其在不饱和烯烃加氢还原中的应用

Info

Publication number: CN114672444A
Application number: CN202210521745.7A
Authority: CN
Inventors: 程扬健; 谷圆元; 李雯; 吴红良; 陈瑞杰
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2022-05-13
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2042-05-13
Also published as: CN114672444B

Abstract

本发明公开了一株苏云金芽孢杆菌FZUG‑01及其在不饱和烯烃加氢还原中的应用。所述菌株的分类命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），该菌株已于2022年1月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.24271。该菌株对含不饱和碳碳双键的马来酰亚胺及丁腈橡胶具有加氢还原效果，因此本发明为不饱和烯烃的微生物加氢还原提供了菌株资源。

Description

一株苏云金芽孢杆菌及其在不饱和烯烃加氢还原中的应用

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株苏云金芽孢杆菌FZUG-01及其在不饱和烯烃加氢还原中的应用。

背景技术

丁腈橡胶（Nitrile Butadiene Rubber，NBR）是一种具有耐油、耐热抗寒等优良性能的橡胶材料，但是由于其分子结构种残余的碳碳双键易氧化导致其抗氧化性能差，在使用过程中大大削弱了其使用性能及寿命。为了弥补NBR这一缺陷，通常选择对NBR进行选择性加氢，使其分子内的碳碳双键饱和化，制得氢化丁腈橡胶（Hydrogenated nitrilerubber，HNBR）。HNBR为一种既具有耐油、耐热抗寒等优良性能，又具有优良的抗氧化性能的特种橡胶。HNBR在航空航天、油井及汽车等行业展现出巨大的应用前景。

目前常用的NBR加氢改性方法有：溶液加氢法及乳液加氢法，溶液加氢法又分为均相加氢法和非均相加氢法。溶液加氢法是将丁腈橡胶溶于适当的有机溶剂如丙酮、氯苯等再在高温、高压和催化剂作用下与氢气反应，进行选择性加氢；乳液加氢则是直接对丁腈橡胶乳液进行加氢的方法。无论是乳液加氢还是溶液加氢，其催化剂体系都大致分为三类，分别是钌系、铑系、钯系催化剂。这些传统的化学加氢方法存在着诸多的不足：①化学法加氢的催化剂为钯、钌、铑等贵金属元素，大大提高了NBR的生产成本；②化学法加氢的反应条件多为高温高压下进行，生产能耗高，并且应用于NBR的大量生产危险系数大；③化学法加氢的反应产物中催化剂的分离及回收利用工艺复杂；④化学法加氢产物容易产生交联等；⑤溶液加氢法过程中需使用大量溶剂使得反应成本大大提升，并且会引起严重的环境污染问题。

已有研究人员通过微生物产生的老黄酶（Old yellow enzymes，OYEs）对一些简单的不饱和烯烃化合物进行加氢还原。比如徐梦宇等人从土壤中筛选出7株对碳碳双键具有加氢还原活性的菌株，均属于假单胞菌属，对柠檬酸及（Z）-乙基-3-硝基-2-苯基丙烯酸酯具有较好的还原效果。应向贤等人通过酿酒酵母表达的老黄酶催化柠檬醛不对称加氢还原生成香茅醛。微生物法加氢反应条件温和、选择性强、成本及能耗低，微生物繁殖速度快易培养，能够在较短时间内获得大量的具有催化活性的细胞，并且以水溶液为反应溶剂，对环境友好。

综上所述，目前NBR的氢化改性方法研究主要集中在化学法改性，微生物加氢还原目前仅应用于简单不饱和烯烃化合物，对于大分子聚合物的生物加氢还原尚未有人研究。因此，NBR生物法加氢还原对开发绿色温和的NBR的加氢还原研究具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一株苏云金芽孢杆菌FZUG-01及其在不饱和烯烃加氢还原中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了一株苏云金芽孢杆菌FZUG-01，所述菌株的分类命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），该菌株已于2022年1月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.24271，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述苏云金芽孢杆菌FZUG-01为革兰氏阳性菌；其在LB固体培养基中的菌落呈白色圆形，表面湿润，边缘光滑；其菌体为长直杆状，长度约为2~4 μm，宽度约为0.5~0.9 μm。

本发明还提供了上述一株苏云金芽孢杆菌FZUG-01在不饱和烯烃生物加氢还原中的应用。

进一步的，上述的不饱和烯烃选自马来酰亚胺、丁腈橡胶。

本发明还提供了一种利用苏云金芽孢杆菌FZUG-01加氢还原不饱和烯烃的方法，所述方法为：将苏云金芽孢杆菌FZUG-01扩大培养后制成休止细胞，再将休止细胞与不饱和烯烃共培养，最后将反应产物经离心、过滤清洗等步骤得到加氢还原产物。

进一步的，上述一种利用苏云金芽孢杆菌FZUG-01加氢还原不饱和烯烃的方法，包括如下步骤：

（1）苏云金芽孢杆菌FZUG-01的活化、纯化及休止细胞的制备；

（2）将步骤（1）得到的休止细胞与马来酰亚胺或丁腈橡胶共培养；

（3）将步骤（2）得到的反应液进行离心、过滤清洗得到生物加氢还原产物。

进一步的，步骤（2）中的马来酰亚胺用10 mmol/L磷酸钾缓冲液（Ph=7.0~7.2）配制浓度为1 mol/L的反应液，反应液中加入少量葡萄糖，葡萄糖浓度为0.5%（w/g）；共培养条件为35 ℃、220 rpm。

进一步的，步骤（2）中的丁腈橡胶用浓度为0.5%（w/g）的葡萄糖水溶液按0.07 g /20 mL配制；共培养条件为35 ℃、160 rpm。

进一步的，步骤（3）中苏云金芽孢杆菌FZUG-01与马来酰亚胺的反应液在12000rpm下离心5 min，取上清，将上清液用0.22 m有机滤膜过滤得到还原产物琥珀酰亚胺。

进一步的，步骤（3）中苏云金芽孢杆菌FZUG-01与丁腈橡胶的反应产物用去离子水清洗过滤，将洗净后的反应产物真空冷冻干燥得到NBR加氢还原产物。

从上述的方案可以看出，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明是使用微生物细菌对不饱和烯烃进行加氢还原，能够在短时间内获得大量的具有催化活性的细胞，相较于化学催化大大的节约了催化成本；

（2）本发明是在水溶液中进行还原反应，并且是在常温常压下进行反应，相较于传统的化学催化法无污染、对环境更加友好；

（3）本发明提供的方法过程简单，容易操作。

附图说明

图1为苏云金芽孢杆菌FZUG-01的形态图。a，菌落形态图；b，菌体形态图。

图2为苏云金芽孢杆菌FZUG-01的Biolog微生物鉴定结果。

图3为苏云金芽孢杆菌FZUG-01加氢还原马来酰亚胺的反应液的液相色谱图。

图4为苏云金芽孢杆菌FZUG-01加氢还原丁腈橡胶的产物的红外色谱图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1 FZUG-01菌株的分离

称取1 g取自福建省晋江市金井镇头触角沙滩的海滩淤泥，将其溶于9 mL无菌去离子水中，在37 ℃恒温摇床中振荡过夜，随后采用梯度稀释法用无菌去离子水分别配制10^-1、10^-2、10^-3、 10^-4、10^-5、10^-6稀释度的海滩淤泥悬浮液。分别取10^-4、10^-5、10^-6稀释度的悬浮菌液0.1mL涂布于LB固体分离培养基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂粉20g/L；pH=7.0~7.2）中，每个稀释度涂布三个平板，在37 ℃恒温生化箱箱中倒置培养24-48 h后，挑取单菌落在LB固体培养基中进行划线纯化培养3-5代，获得纯培养物，将该菌株命名为FZUG-01。

实施例2 FZUG-01菌株的鉴定

形态鉴定：

如图1(a)所示，FZUG-01菌株在LB固体培养基上形成的的菌落呈白色圆形，边缘光滑，表面湿润。

用革兰氏染色法进行显微观察，如图1(b)所示，FZUG-01菌株经革兰氏染色呈阳性，菌体为长直杆状，长度约为2~4 μm，宽度约为0.5~0.9 μm。

Biolog微生物鉴定系统鉴定：

采用Biolog微生物鉴定系统对FZUG-01菌株进行鉴定，鉴定板为GENⅢ 鉴定板，接种液为IF-B液，培养时间为24 h，培养温度为33℃。

如图2所示，FZUG-01菌株鉴定结果为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）可能性为0.912，接近于1，该菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的可能性为0.061，小于0.1。因此，认定FZUG-01菌株的鉴定结果为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）FZUG-01在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC 24271；保藏日期为2022年1月10日。

实施例3 FZUG-01菌株对马来酰亚胺的加氢还原

1) 将FZUG-01菌株用划线法在LB固体培养基上进行纯化，直至长出单菌落，然后从纯化后的LB固体平板上挑取单一菌落接种至30mL的LB液体培养基中，将接种液在35 ℃、160 rpm条件下培养；当菌液OD ₆₀₀值达到0.7~0.9之间时以3%（v/v）的接种量接种至另一干净的30mL LB液体培养基中，在35 ℃、160 rpm条件下培养12 h得到活化菌液；将活化菌液再以5%（v/v）的接种量接种至500 mL LB液体培养基中，在35 ℃、160 rpm条件下培养48h后5000 rpm离心5 min，将离心后的菌体细胞用去离子水清洗3遍，得到休止细胞。

2) 将1)到的休止细胞以菌量湿重浓度200 g/L在10 mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.0-7.2）中均匀悬浮后与用含有1 mol/L马来酰亚胺的10 mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.2）按体积比5:1混合，向混合液中加入少量葡萄糖，葡萄糖的终浓度为0.5%（w/g），然后在220 rpm、25℃条件下进行共培养50h。

3) 待步骤2)培养结束后，将反应液在12000 rpm下离心5 min，取上清，将上清液用0.22 m有机滤膜过滤后得到马来酰亚胺还原产物。

图3为FZUG-01菌株加氢还原马来酰亚胺的反应液的液相色谱图。从图中可以看到，FZUG-01菌株对马来酰亚胺具有还原加氢能力。

实施例4 FZUG-01菌株对NBR的加氢还原

1) 将FZUG-01菌株用划线法在LB固体培养基上进行纯化，直至长出单菌落，然后从纯化后的LB固体平板上挑取单一菌落接种至30mL的LB液体培养基中，将接种液在35 ℃、160 rpm条件下培养；当菌液OD ₆₀₀值达到0.7~0.9之间时以3%（v/v）的接种量接种至另一干净的30 mL LB液体培养基中，在35 ℃、160 rpm条件下培养12h得到活化菌液；将活化菌液再以5%（v/v）的接种量接种至500 mL LB液体培养基中，在35 ℃、160 rpm条件下培养48 h后5000 rpm 离心5 min，将离心后的菌体细胞用去离子水清洗3遍，得到休止细胞。

2) 将1)制备得到的FZUG-01休止细胞用20 mL浓度为0.5%（w/g）的葡萄糖水溶液均匀悬浮使菌量浓度分别为1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、10 g/L，再将0.07g NBR与20mL细菌悬浮液混合均匀，然后在35 ℃、160 rpm条件下共培养48 h。

3) 待步骤2)培养结束后，将制备得到的还原反应产物用去离子水清洗过滤，待滤出液清澈透明则表示洗净，再将洗净后的反应产物真空冷冻干燥得到NBR加氢还原产物。

图4为FZUG-01不同菌量浓度与丁腈橡胶反应后的NBR加氢还原产物的红外色谱图。从图中可以看到，当FZUG-01菌株菌量浓度达到5 g/L时，丁腈橡胶不饱和度U值开始降低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一株苏云金芽孢杆菌FZUG-01，其特征在于：所述菌株的分类命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），已于2022年 1月 10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCCNO.24271。

2.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌FZUG-01在含碳碳双键的不饱和烯烃化合物的加氢还原反应中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述含碳碳双键的不饱和烯烃化合物为马来酰亚胺。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述含碳碳双键的不饱和烯烃化合物为丁腈橡胶。

5.一种利用苏云金芽孢杆菌FZUG-01加氢还原不饱和烯烃的方法，其特征在于：将苏云金芽孢杆菌FZUG-01扩大培养后制成休止细胞，再将休止细胞与不饱和烯烃共培养。