CN115011520B - 一种蜡状芽孢杆菌及其在羰基还原中的应用 - Google Patents

一种蜡状芽孢杆菌及其在羰基还原中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种蜡状芽孢杆菌菌株及其应用，属于生物化学技术领域，该菌株为蜡状芽孢杆菌TQ‑0513‑2，已保藏于中国典型培养物中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020433，保藏日期为2020年8月18日。该菌株可以用作生物催化剂，催化还原羰基化合物制备手性醇，特别是可以高对映选择性的催化苯乙酮遵循anti‑Prelog生成(R)‑1‑苯基乙醇，并且催化活力高、对应选择性强、底物耐受性好，并且反应过程中无需添加培养基，条件温和，有利于简化后续目标产物的分离纯化工艺。与现有技术相比，采用本发明的菌株催化还原羰基化合物制备手性醇，不需要额外构建辅酶再生体系，降低了生产成本，有利于工业应用。

Description

一种蜡状芽孢杆菌及其在羰基还原中的应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一株蜡状芽孢杆菌菌株及其在羰基还原中的应用。
背景技术
手性醇是一类手性碳上连有羟基的旋光性化合物，广泛应用于手性药物和其他手性精细化学品的合成。目前，化学法制备手性醇仍是主流，主要是以金属催化剂催化羰基还原，如在铂、镍存在下加氢催化，用化学还原剂LiAlH4、NaBH4等催化，然而，化学法催化制备手性醇通常需要较高温度和压力，同时存在产物选择性和底物耐受性差的问题，并且对反应装置的气密性、材质等要求较高；催化过程中使用的贵金属催化剂价格昂贵。与传统的化学催化法相比，生物催化不对称还原酮类化合物制备手性醇具有很高的化学、立体、对映选择性，同时整个过程环境友好，可以促进能源高效利用。
生物催化羰基还原反应既可由全细胞进行，也可由分离纯化酶进行。由于全细胞生物催化剂更便宜、方便，不需要酶的纯化，因此比游离的酶更可取。此外，在细胞内酶更稳定，因此延长了生物催化剂的使用寿命(Wang,Journal of Biotechnology,2013,163(3):292-300.)。因此，人们在微生物立体选择性还原前手性酮方面做了大量的工作，并开发出了一系列优秀的生物催化反应工艺。例如，研究人员利用德氏毕赤酵母MY1569和菌毛红酵母ATCC 32762立体选择性地将酯化酮和氯化酮还原为相应的(S)醇，分别在>98％ee和>99％ee的条件下得到了所需的产物(Krulewicz,Biocatalysis,2009,19(4):267-279.)。目前，大多数情况下，在自然界中催化不对称还原的生物催化剂一般遵循Prelog规则，生成S-构型手性醇。遵循anti-Prelog的生物催化剂则比较罕见。制药工业中迫切需要具有更强特性的新型酶或微生物将前手性酮还原为anti-Prelog手性醇，而从环境中筛选出具有高活性和高选择性的理想生物催化剂是获得工业应用生物催化剂的重要途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够产生羰基还原酶菌株-蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)TQ-0513-2，其可以催化还原羰基化合物制备手性醇，并且催化活力高、对应选择性强、底物耐受性好。
本发明的技术方案为：
一种蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株TQ-0513-2，已保藏于中国典型培养物中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020433，保藏日期为2020年8月18日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
所述蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2是从土壤中分离筛选获得。经检测具有催化羰基化合物还原的性能。
上述蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2在催化还原羰基化合物制备手性醇中的应用。所述应用方法为：以蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2培养获得的湿菌体为催化剂，加入到pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，再加入羰基化合物和助溶剂，在 25-35℃下反应，得到手性醇。
进一步，所述羰基化合物选自苯乙酮、乙酰基环己烷、2,2,2-三氟苯乙酮、苄基丙酮或3-乙酰基吡啶，更优选为苯乙酮。
进一步，所述助溶剂为乙腈。
进一步，所述湿菌体的用量为0.1g/mL磷酸盐缓冲液，羰基化合物加入到磷酸盐缓冲溶液中的初始浓度为2mM，所述助溶剂的加入量为磷酸盐缓冲液体积的1％。
进一步，上述应用方法中，所述湿菌体的制备方法为：将蜡状芽孢杆菌菌株 TQ-0513-2接种至固体平板培养基，30℃培养12h，获得平板菌体，然后挑取单菌落接种至种子培养基，30℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，200rpm震荡培养12h后，在7500rpm下离心，弃上清，收集湿菌体。
所述固体平板培养基的组成为：NaCl 10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH值为7.0；所述种子培养基的组成为：NaCl 10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，溶剂为水，pH值为7.0；所述发酵培养基的组成为：NaCl 10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，溶剂为水，pH值为7.0。
与现有技术相比，本发明具有如下的优点：
1)本发明提供了一种能够产生羰基还原酶的蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2，使用其作为生物催化剂，可以催化还原羰基化合物制备anti-Prelog手性醇，适用底物范围广。
2)本发明的蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2可以高选择性地催化苯乙酮生成 (R)-1-苯基乙醇，ee值可达88％。
3)采用本发明的蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2催化还原羰基化合物制备手性醇时，反应过程简单，无需添加培养基(添加培养基会使反应体系更加复杂)，易控、条件温和，有利于简化后续目标产物的分离纯化工艺。
4)采用本发明的蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2催化还原羰基化合物制备手性醇时，不需要额外构建辅酶再生体系，即免去了昂贵的辅酶的添加，可有效降低生产成本，有利于工业应用。
附图说明
图1为蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2在LB固体培养基上培养12h后的菌落形态图；
图2为实施例3中反应24h后得到的气相转化率检测色谱图；
图3为实施例3中反应24h后得到的气相手性检测色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。值得说明的是，下述实施例仅作阐示之用，并表明本发明的精神和范围，并非限于此中的细节及其修改案。
实施例使用的生物材料蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株TQ-0513-2，从土壤中筛选分离得到，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称TQ-513-2，保藏编号为CCTCCNO:M 2020433，保藏日期为2020年8月18日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
实施例1：蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2的分离筛选
取8种来自深圳市罗湖区梧桐山附近土样各5g，分别加入500mL纯水，使泥土悬浮于水中，变成悬液，静置20min，取3mL上清加入富集培养基中，30℃， 200rpm富集培养3天后，转接2％菌液入新鲜富集培养基，如此重复2轮后，得到富集液。
将8瓶富集液用无菌水逐级稀释5个梯度，分别为100、10-2、10-4、10-6、 10-8。取上述稀释梯度的菌液各0.2mL均匀涂布在平板筛选培养基上，于30℃生化培养箱中培养。培养4天后，平板上长出单菌落，根据筛选平板上菌落大小随机选取了8种菌接入LB液体培养基，30℃、200rpm下发酵培养20h。将上述菌按编号1-8，并保藏。按2％接种量接入富集培养基，同时加入终浓度为2mM的苯乙酮和1％(体积比)乙腈作为助溶剂，200rpm，30℃，3d后气相检测苯乙酮转化生成苯基乙醇，发现上述8种菌中编号为2号，5号和8号的菌对苯乙酮有一定的转化率。接着对编号为2号的菌在LB平板上划线分离，30℃培养箱培养。
挑单菌落接种至种子培养基中，在30℃培养15h，保藏菌株并制静息细胞。加入一定体积的磷酸缓冲液(pH7.4)制成0.25g/mL菌悬液用于转化。转化条件如下：苯乙酮终浓度10mM，0.25g/mL菌悬液2mL，置于37℃金属浴转化24h。转化结束后用乙酸乙酯萃取气相检测分析。最终得到一株具有催化苯乙酮不对称还原的野生菌株，并将此菌株命名为菌株TQ-0513-2。
气相分析条件为：仪器为Agilent-8860气相，载气为N2，检测器为FID检测器；色谱柱为HP-5MS(30mx0.32mmx0.25μm)；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；升温程序：80℃(1min)；6℃/min,120℃(1min)；8℃/min， 150℃(1min)；柱流速为3mL/min；分流比为30：1；进样量为1μL。
所述富集培养基组成为(g/L)：苯乙酮1.0，(NH4)2SO45.0，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl1.0，K2HPO42.0，FeSO4·7H2O 0.01。溶剂为水，121℃，20min灭菌。
所述平板筛选培养基组成为(g/L)：苯乙酮1.0，(NH4)2SO45.0，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1.0，K2HPO42.0，FeSO4·7H2O 0.01，琼脂20。溶剂为水，121℃， 20min灭菌。冷却至50-60摄氏度时倒平板。
所述种子培养基组成为(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，溶剂为水，121℃，20min灭菌。
实施例2：菌株TQ-0513-2的鉴定
通过形态学、生理生化特征、16S rRNA序列及系统发育学分析等相结合的方法对实施例1筛选得到的菌株进行鉴定。
1)该菌株在LB固体培养基上30℃培养12h后菌落形态如图1所示，呈雪花状，质地软，表面较粗糙，扁平，边缘不规则的乳白色菌落，菌落随时间的延长而增大，1000×显微镜下细胞形态呈杆状，革兰氏染色结果鉴定为革兰氏阳性菌。
2)该菌株的生理生化特征：
表1菌株TQ-0513-2的生理生化特征-酶活、碳源氧化
Figure BDA0003693711870000051
+：阳性反应；-：阴性反应；W：为弱阳性反应
表2菌株TQ-0513-2生理生化特性-利用碳源产酸
Figure BDA0003693711870000052
Figure BDA0003693711870000061
+：阳性反应；-：阴性反应；
3)菌株的16S rRNA序列为：
tgcaagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacc tgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggataacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaag gcggcttcggctgtcacttatggatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgc gtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtaggg aatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgtta gggaagaacaagtgctagttgaataagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagca gccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgt gaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgt gtagcggtgaaatgcgtagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgc gaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttcc gccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacg ggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgaaa accctagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccatcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaa ccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaa agagctgcaagaccgcgaggtggagctaatctcataaaaccgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaa gctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacacca cgagagtttgtaacacccgaagtcggtggggtaaccttttggagccagccgcctaaggtgaca
该菌与蜡状芽孢杆菌(ATCC 14579)16S rRNA序列同源性高达99.86％。
基于形态、生理生化特征和16S rRNA序列及系统发育学分析等方面的鉴定，最终确定该菌为蜡状芽孢杆菌，命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)TQ-0513-2。
实施例3:以苯乙酮为底物的生物转化反应
制备蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2的湿菌体：将蜡状芽孢杆菌菌株 TQ-0513-2接种至固体平板培养基(NaCl 10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH值为7.0)，30℃培养12h，获得平板菌体，然后挑取单菌落接种至种子培养基(NaCl10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，溶剂为水，pH值为7.0)，30℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基(NaCl 10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，溶剂为水，pH值为7.0)中，30℃，200rpm震荡培养12h后，在7500rpm下离心，弃上清，收集湿菌体。
催化还原苯乙酮：往4.95mLpH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入0.5g蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2的湿菌体，再加入终浓度为2mM苯乙酮和0.05mL助溶剂乙腈，在30℃、600r/min下反应，利用气相色谱监控反应，24h后，得到(R) -1-苯基乙醇，苯乙酮转化率为60％，对映选择性ee值为88％。
气相转化率检测色谱图见图2，可以看出，苯乙酮的保留时间为3.945min， 1-苯基乙醇的保留时间为3.842min；气相手性检测色谱图见图3，苯乙酮的保留时间为11.052min，(R)-1-苯基乙醇的保留时间为13.713min，(S)-1-苯基乙醇的保留时间为14.119min。
其中，苯乙酮及其产物气相色谱检测转化率的方法与条件分别为：仪器为Agilent-8860气相，载气为N2，检测器为FID检测器；色谱柱为HP-5MS (30mx0.32mmx0.25μm)；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；升温程序：80℃(1min)；6℃/min,120℃(1min)；8℃/min，150℃(1min)；柱流速为3mL/min；分流比为30：1；进样量为1μL。气相色谱检测手性的方法与条件分别为：仪器为Agilent-8860气相，载气为N2，检测器为FID检测器；色谱柱为CYCLODEX(30mx0.25 mmx0.25μm)；进样口温度：220℃；检测器温度： 220℃；升温程序：80℃(0.5min)；10℃/min,110℃(5min)；10℃/min,130℃ (6min)；25℃/min，180℃(0.5min)；柱流速为1mL/min；分流比为30：1；进样量为1μL。
实施例4：以乙酰基环己烷为底物的生物转化反应
蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2的湿菌体的制备同实施例3。
催化还原乙酰基环己烷：往4.95mLpH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入0.5g蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2的湿菌体，再加入终浓度为2mM的乙酰基环己烷和 0.05mL助溶剂乙腈，在30℃、600r/min下反应，利用气相色谱监控反应，24h 后，得到1-环己基乙醇，乙酰基环己烷转化率为60％。
其中，乙酰基环己烷及其产物气相色谱检测转化率的方法与条件分别为：仪器为Agilent-8860气相，载气为N2，检测器为FID检测器；色谱柱为HP-5MS (30mx0.32mmx0.25μm)；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；升温程序：80℃(1min)；6℃/min,120℃(1min)；8℃/min，150℃(1min)；柱流速为3mL/min；分流比为30：1；进样量为1μL。乙酰基环己烷和1-环己基乙醇的保留时间分别为：3.501min，3.683min。
实施例5：以2,2,2-三氟苯乙酮为底物的生物转化反应
蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2的湿菌体的制备同实施例3。
催化还原2,2,2-三氟苯乙酮：往4.95mLpH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入0.5g 蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2的湿菌体，再加入终浓度为2mM的2,2,2-三氟苯乙酮和0.05mL助溶剂乙腈，在30℃、600r/min下反应，利用气相色谱监控反应，24h后，得到1-苯基-2,2,2-三氟乙醇，2,2,2-三氟苯乙酮转化率为100％。
其中，2,2,2-三氟苯乙酮及其产物气相色谱检测转化率的方法与条件分别为：仪器为Agilent-8860气相，载气为N2，检测器为FID检测器；色谱柱为HP-5MS(30mx0.32mmx0.25μm)；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；升温程序：80℃(1min)；6℃/min,120℃(1min)；8℃/min，150℃(1min)；柱流速为3mL/min；分流比为30：1；进样量为1μL。2,2,2-三氟苯乙酮和1-苯基-2,2,2- 三氟乙醇的保留时间分别为：2.115min，3.595min。
实施例6：以苄基丙酮为底物的生物转化反应
蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2的湿菌体的制备同实施例3。
催化还原苄基丙酮：往4.95mLpH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入0.5g蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2的湿菌体，再加入终浓度为2mM的苄基丙酮和0.05 mL助溶剂乙腈，在30℃、600r/min下反应，利用气相色谱监控反应，24h后，得到4-苯基-2-丁醇，苄基丙酮转化率为87％。
其中，苄基丙酮及其产物气相色谱检测转化率的方法与条件分别为：仪器为Agilent-8860气相，载气为N2，检测器为FID检测器；色谱柱为HP-5MS (30mx0.32mmx0.25μm)；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；升温程序：80℃(1min)；6℃/min,120℃(1min)；8℃/min，150℃(1min)；柱流速为3mL/min；分流比为30：1；进样量为1μL。苄基丙酮和4-苯基-2-丁醇的保留时间分别为：6.990min，7.256min。
实施例7：以3-乙酰基吡啶为底物的生物转化反应
蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2的湿菌体的制备同实施例3。
催化还原3-乙酰基吡啶：往4.95mLpH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入0.5g蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2的湿菌体，再加入终浓度为2mM的3-乙酰基吡啶和 0.05mL助溶剂乙腈，在30℃、600r/min下反应，利用气相色谱监控反应，24h 后，得到3-(1-羟乙基)吡啶，3-乙酰基吡啶转化率为87％。
其中，3-乙酰基吡啶及其产物气相色谱检测转化率的方法与条件分别为：仪器为Agilent-8860气相，载气为N2，检测器为FID检测器；色谱柱为HP-5MS (30mx0.32mmx0.25μm)；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；升温程序：80℃(1min)；6℃/min,120℃(1min)；8℃/min，150℃(1min)；柱流速为3mL/min；分流比为30：1；进样量为1μL。3-乙酰基吡啶和3-(1-羟乙基) 吡啶的保留时间分别为：4.604min，5.581min。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种蜡状芽孢杆菌及其在羰基还原中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1430
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcaagtcga gcgaatggat taagagcttg ctcttatgaa gttagcggcg gacgggtgag 60
taacacgtgg gtaacctgcc cataagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc 120
ggataacatt ttgaaccgca tggttcgaaa ttgaaaggcg gcttcggctg tcacttatgg 180
atggacccgc gtcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc aacgatgcgt 240
agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300
gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga 360
gtgatgaagg ctttcgggtc gtaaaactct gttgttaggg aagaacaagt gctagttgaa 420
taagctggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc 480
gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggt 540
ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat tggaaactgg 600
gagacttgag tgcagaagag gaaagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga 660
tatggaggaa caccagtggc gaaggcgact ttctggtctg taactgacac tgaggcgcga 720
aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc 780
taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgaagttaa cgcattaagc actccgcctg 840
gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 900
agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgaa 960
aaccctagag atagggcttc tccttcggga gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020
cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt 1080
tgccatcatt aagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140
gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacgg 1200
tacaaagagc tgcaagaccg cgaggtggag ctaatctcat aaaaccgttc tcagttcgga 1260
ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320
cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380
cacccgaagt cggtggggta accttttgga gccagccgcc taaggtgaca 1430

Claims (7)

1.一种蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株TQ-0513-2，已保藏于中国典型培养物中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020433，保藏日期为2020年8月18日。
2.权利要求1所述蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2在催化还原羰基化合物制备手性醇中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用方法为：以蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2培养获得的湿菌体为催化剂，加入到pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，再加入羰基化合物和助溶剂，在25-35℃下反应，得到手性醇。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述羰基化合物选自苯乙酮、乙酰基环己烷、2,2,2-三氟苯乙酮、苄基丙酮或3-乙酰基吡啶。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述助溶剂为乙腈。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述湿菌体的用量为0.1g/mL磷酸盐缓冲液，羰基化合物加入到磷酸盐缓冲溶液中的初始浓度为2mM，所述助溶剂的加入量为磷酸盐缓冲溶液体积的1％。
7.如权利要求3或4或5或6所述的应用，其特征在于所述湿菌体的制备方法为：将蜡状芽孢杆菌菌株TQ-0513-2接种至固体平板培养基，30℃培养12h，获得平板菌体，然后挑取单菌落接种至种子培养基，30℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，200rpm震荡培养12h后，在7500rpm下离心，弃上清，收集湿菌体；
所述固体平板培养基的组成为：NaCl 10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH值为7.0；所述种子培养基的组成为：NaCl 10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，溶剂为水，pH值为7.0；所述发酵培养基的组成为：NaCl 10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，溶剂为水，pH值为7.0。
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