CN112625934A

CN112625934A - 一种枯草芽孢杆菌y2菌株及使用该菌株制备拮抗库尔勒香梨黑头病抑制剂的制备方法

Info

Publication number: CN112625934A
Application number: CN201910986120.6A
Authority: CN
Inventors: 胡有贞; 关波; 穆香轶; 张璇
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2019-10-08
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2039-10-17
Also published as: CN112625934B

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Y2及其在防治库尔勒香梨黑头病中的应用。该Y2菌株，于2018年10月30日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018678。在平板拮抗实验中发现，Y2菌株具有抑制库尔勒香梨黑头病主要病原菌芸薹生链格孢菌XL2(Alternaria brassicicola XL2)活性，菌丝生长抑制率达到42.74％；且该Y2菌株的无菌滤液也具有很强的抑菌活性。在库尔勒香梨上的接种实验证明，该Y2菌株可以抑制库尔勒香梨黑头病病原菌的侵染和定植。因此，该枯草芽孢杆菌Y2能作为生防菌应用于库尔勒香梨黑头病的防治。

Description

一种枯草芽孢杆菌Y2菌株及使用该菌株制备拮抗库尔勒香梨黑头病抑制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Y2)及使用该新菌株制备拮抗库尔勒香梨黑头病的抑制剂的制备方法，属于微生物技术领域。

背景技术

库尔勒香梨为新疆特色的传统优势梨品种，是我国超市占有率高、国产梨中销售价格较高的梨品种，也是我国主要的出口梨品种之一。然而库尔勒香梨在采后贮藏过程中品质下降，且易发多种病害，黑头病是近年来新发现的一种库尔勒香梨采后病症，引起库尔勒香梨黑头病的主要致病菌为芸薹生链格孢菌XL2(Alternaria brassicicola XL2)。病原菌通过自然孔口侵入香梨果实，造成果肉呈现黑色蜂窝霉层状，且随着贮藏时间的延长，褐色霉层不断向果心延伸，并有黏稠黑汁物质流出。据调查库尔勒香梨果实黑头病最高侵染率可达20％，给香梨采后贮藏造成很大损失，是香梨产业化亟待解决的关键技术问题。目前，库尔勒香梨采后黑头病的防治仍然以化学防治为主，但防效不甚理想，而且长期使用化学杀菌剂不但会导致病菌对其产生抗药性，果蔬产品上残留农药也会对公众健康造成威胁和环境污染。因此，寻找防治库尔勒香梨黑头病的拮抗微生物具有重要意义。

在种类繁多的微生物群体中芽孢杆菌是研究最多的生防菌候选菌，已有文献证明芽孢杆菌属中的许多种都具有合成抗菌活性物质——抗菌多肽的能力，而且绝大多数对人畜无害，具有较强的抗逆性和良好的环境适应性。其中枯草芽孢杆菌由于其次级代谢产物多、对环境友好等优势受到越来越多的关注。尽管多种枯草芽孢杆菌已被开发用于制备微生物杀菌剂，但由于枯草芽孢杆菌菌株的多样性，不同地区枯草芽孢杆菌的不同菌株其抗菌谱、抗菌活性和抗菌特点均有较大差异，因此筛选具有不同作用对象的高效枯草芽孢杆菌生防菌剂仍是现在乃至今后的科研热点。

发明内容

本发明目的是提供一株用于防治库尔勒香梨黑头病的枯草芽孢杆菌Y2(Bacillussubtilis Y2)，该枯草芽孢杆菌对库尔勒香梨黑头病病菌具有持续高效拮抗作用。

本发明所采用的技术方案为：

本发明提供一株新菌株——枯草芽孢杆菌Y2(Bacillus subtilis Y2)，保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2018678，保藏日期为2018年10月30日。

所述的枯草芽孢杆菌的形态生理特征如下：菌落呈白色、圆形、边缘不整齐、有凸起、半透明，表面形成褶皱。

一种库尔勒香梨黑头病抑制剂的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

步骤(1)：将枯草芽孢杆菌Y2在LB培养基上划线培养，37℃培养14h～16h，获得活化菌株；

步骤(2)：挑取步骤(1)活化菌株单菌落，接种于LB液体培养基中，于37℃180r/min振荡培养24h，获得种子液；

步骤(3)：将步骤(2)所得种子液按体积浓度3％的接种量接种于LB液体培养基中，于37℃180r/min振荡培养48h，获得发酵液，所述发酵液为能够抑制库尔勒香梨黑头病的抑制剂。

步骤(1)、(2)、(3)中所述LB培养基组成为：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水，pH值7.2～7.4。

含有所述枯草芽孢杆菌Y2发酵液的应用，其特征在于：所述发酵液作为库尔勒香梨黑头病致病菌芸薹生链格孢菌的抑制剂。

与现有技术相比较，本发明具有以下优点：

1、本发明所述枯草芽孢杆菌来源于油桃果实表面，果实表面的微生物种类极为丰富，且通过拮抗作用、竞争作用相互制约，是优质的拮抗菌资源库。现有的生防菌大多数是从土壤中分离得来，作为果实采后生防剂在与采后病原微生物的竞争中不占优势，且不易长期定殖生存，因此实际防病效果不太理想。本申请得到的枯草芽孢杆菌Y2与其他土壤生防菌相比，能够在库尔勒香梨果实表面稳定定殖并与病原菌直接相互作用，从而给果实提供全面有效的保护。

2、本发明的枯草芽孢杆菌Y2对库尔勒香梨黑头病病原菌芸薹生链格孢菌XL2具有显著的拮抗作用，抑菌率达到42.74％，能够使致病菌出现如下变化：菌落紧致不蓬松，菌落无法延伸；菌丝生长粗细不一，扭曲变形；菌丝分枝较多，尖端多见帽状致密结构；显著抑制致病菌孢子萌发等。由此可见枯草芽孢杆菌Y2具有较大的研发潜力。

3、本发明的枯草芽孢杆菌Y2发酵液直接喷洒到果实表面即可发挥作用，能够有效持久地防控库尔勒香梨黑头病。该方法环境友好，效果显著，在果蔬采后病害的生物防治中具有十分广阔的应用前景。

附图说明

图1：菌株Y2的形态照片图；A：菌株Y2的菌落形态；B：普通光学显微镜下的菌株Y2细胞形态(1000×)。

图2：菌株Y2的分子鉴定图；A：PCR扩增16S rRNA的琼脂糖凝胶电泳图；B：基于16SrRNA序列构建的Y2系统发育树。

图3：菌株Y2与库尔勒里黑头病原菌芸薹生链格孢菌XL2(A.brassicicola XL2)的平板对峙照片图；A：空白对照；B：Y2与A.brassicicola XL2的平板对峙。

图4：菌株Y2对芸薹生链格孢菌(A.brassicicola XL2)菌丝生长的影响；A：正常生长的A.brassicicola XL2菌丝末端形态；B：菌株Y2拮抗A.brassicicola XL2菌丝末端分叉增多。

图5：菌株Y2在库尔勒香梨果实上拮抗黑头病菌芸薹生链格孢菌XL2(A.brassicicola XL2)的实验照片图；A：接种示意图；B：感病库尔勒香梨的横切面照片；C：不同接种方式的病斑直径统计。

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、枯草芽孢杆菌Y2的分离、筛选与鉴定

(1)分离

从新疆石河子市好家乡超市购买当季油桃果实3-5个，用100ml无菌水于无菌条件下清洗果实表面5min，清洗液按照平板稀释法涂布LB平板，37℃培养24h后，记录菌落直径达3mm以上的细菌并筛选涂布。将所分离细菌在LB培养基上划线培养，选取单菌落进行37℃液体LB摇瓶培养过夜，低温保存备用。

(2)筛选

采用平板对峙法将分离纯化获得的菌株在PDA培养基上进行十字划线，将活化的芸薹生链格孢菌(A.brassicicola XL2)用打孔器移取直径6mm的菌饼置于划线空白的中央，进行对峙培养，重复4次。以只接A.brassicicola XL2的平板作为对照(CK)，于28℃倒置培养4d，观察抑菌情况，测量A.brassicicola XL2菌饼生长半径，统计生长抑菌率，筛选对测试菌有显著抑制作用的菌种进行第二轮筛选。

打孔移取直径6mm的A.brassicicola XL2菌饼置于PDA培养基中央，在距离菌落边缘3cm处上下左右四个方向放置直径5mm的无菌滤纸，滴加10μL初筛拮抗菌悬液，于28℃倒置培养4d，观察抑菌情况，选择拮抗效果最好的Y2菌株作为待选拮抗菌保存备用。

(3)鉴定

将筛选到的Y2菌株进行形态学、生理生化和16S rRNA序列鉴定。

形态学观察：将菌株Y2在LB培养基平板上划线接种，37℃培养16h，观察菌落特征。菌落呈白色、半透明、有凸起，表面不光滑、边缘呈树枝状褶皱(见图1)。

生理生化鉴定：将菌株Y2按照标准方法根据《常见细菌系统鉴定手册》，《伯杰细菌鉴定手册》对生防菌进行生理生化检测，得到的结果如表1所示：

注：+，阳性；-，阴性；W，弱阳性。

16S rRNA序列分析：以菌株Y2的DNA为模板，利用细菌通用引物27-F(5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′)和1492-R(5′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3′)进行16S rDNA序列的PCR扩增。PCR扩增体系：PCR Mix(2×)10μL，上游引物(10μmol/L)0.5μL，下游引物(10μmol/L)0.5μL，模板DNA(100mg/L)1μL，ddH₂O 8μL。PCR扩增条件(20μL)如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环；72℃7min。PCR产物纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，返回测序结果后通过GenBank中核酸数据库进行比对，并利用软件MEGA6.0构建系统发育树进行同源性分析。

经测序，菌株的序列长度为1442bp，具体序列见序列表。将测序结果在NCBI Blast上进行序列比对，发现其与枯草芽孢杆菌的序列相似性高达99.93％，初步确定菌株为枯草芽孢杆菌。利用软件MEGA 6.0进行聚类分析，构建进化树。结果表明，菌株Y2与枯草芽孢杆菌沙漠亚种(Bacillus subtilis subsp.Inaquosorum)处于一个小分支。由此，结合形态特征和生理生化分析确定菌株Y2为枯草芽孢杆菌。

将菌株Y2进行生物保藏，保藏信息如下：名称为枯草芽孢杆菌Y2，于2018年10月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2018678。

2、枯草芽孢杆菌Y2发酵液对库尔勒香梨黑头病的抑制作用

(1)枯草芽孢杆菌Y2发酵液的制备

将枯草芽孢杆菌Y2在LB培养基上划线培养，37℃培养14h～16h，获得活化菌株；挑取活化菌株单菌落，接种于LB液体培养基中，于37℃180r/min振荡培养24h，获得种子液；将所得种子液按体积浓度3％的接种量接种于LB液体培养基中，于37℃180r/min振荡培养48h，获得发酵液。所述LB培养基组成：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水，pH值7.2～7.4。

(2)枯草芽孢杆菌Y2发酵液的抑菌效果

选取大小、成熟程度和健康状态一致的库尔勒香梨，用无菌水(含有0.5％次氯酸钠)浸泡3min，无菌水洗2min，超净台晾干备用。接种果实上用直径6mm的打孔器打4个5mm深的伤口，4个孔分别接种10μL A.brassicicola XL2孢子悬浮液(106CFU/mL)、20μL混合液(孢子悬浮液：Y2发酵液1：1(v：v))、10μL Y2发酵液、10μLl无菌水。处理果实置于干燥器中室温条件下[(20±2℃)，RH 65％-70％]储藏5d，每组处理4个重复，统计病斑直径和深度。

实验结果见附图5，仅接种A.brassicicola XL2孢子悬浮液的伤口病斑直径达16.86±1.21mm，深度为15.23±1.47mm；接种Y2菌株发酵液与A.brassicicola XL2孢子悬浮液的伤口病斑直径为10.51±0.29mm；深度为8.72±0.95mm。结果显示添加了Y2菌株发酵液后，库尔勒香梨黑头病病斑明显变小，由此说明Y2菌株发酵液有显著的拮抗效果。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 石河子大学

<120>一种枯草芽孢杆菌Y2菌株及使用该菌株制备拮抗库尔勒香梨黑头病抑制剂的制备方法

<141>

<160> 1

<210> 1

<211> 1442

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Y2）

<220>

<221> misc_feature

<223> 16S rRNA基因核苷酸序列

<400> 1

TGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGG

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilisY2为以保藏号CCTCC M 2018678保藏于中国典型培养物保藏中心的菌株。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌株在LB培养基或PDA培养基上生长良好，菌落呈乳白色，干燥不透明，边缘不规则，不光滑，表面呈皱褶状凸起；镜检菌体为杆状，革兰氏染色呈阳性；β-半乳糖苷酶、明胶酶、色氨酸脱氨酶测定为阳性；精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酶脱羧、尿酶测定呈阴性；苦杏仁苷、阿拉伯糖发酵/氧化反应呈阳性；密二糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、肌醇发酵/氧化反应呈阴性。

3.一种库尔勒香梨黑头病抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Y2在LB培养基上划线培养，37℃培养14h～16h，获得活化菌株；

4.如权利要求3所述的库尔勒香梨黑头病抑制剂的制备方法，其特征在于，所述LB培养基组成：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水，pH值7.2～7.4。

5.如权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，该菌株在制备库尔勒香梨黑头病抗菌剂中的应用。