CN109266572A - 生产谷氨酰胺转氨酶的干酪乳杆菌诱变菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种诱变的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain)及其生物制剂，其中该诱变菌是干酪乳杆菌KJY14(KJY‐HN001‐01‐04)，CGMCC NO.15424，保藏日期为2018年03月07日。本发明还提供该诱变菌所制备的含有谷氨酰胺转氨酶(Glutamine transaminase)的生物制剂。本发明还提供该诱变菌单独或联合其他乳酸菌制备用于酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤的凝固剂的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂领域，具体是涉及一种诱变的干酪乳杆菌，并通过该诱变菌来生产谷氨酰胺转氨酶，以及涉及通过该谷氨酰胺转氨酶来制备用于凝固作用的生物制剂的用途。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，E.C.2.3.2.13)简称TG酶，是一种具有改善蛋白质组织，风味及货架期等功能性质的生物酶。TG酶主要来源于哺乳动物的肝脏、血液、毛囊及毛皮中；工业生产中主要利用微生物生产；另外，在一些植物组织中也发现了该酶的存在。根据来源不同，一般把TG酶分为组织谷氨酰胺转氨酶(Tissue Transglutaminase，tTG)和微生物谷氨酰胺转氨酶 (Microbial Transglutaminase，MTG)。谷氨酰胺转氨酶最早在20世纪50年代由 Waeksch等从豚鼠肝脏中分离出来，早期的研究主要集中在动物组织中的谷氨酰胺转氨酶，自从1989年Ando等从轮枝霉链菌中分离出谷氨酰胺转氨酶之后， TG酶在工业中的运用研究迅速发展起来，是生产新型蛋白食品常用酶之一，并有“21世纪超级黏合剂”之美称。研究发现，微生物来源的TG酶具有其独特的优势特点，其分子量相对较小，在23kDa～45kDa时，多数为40kDa左右，催化交联程度高。TG酶是一种能够催化蛋白质分子内或分子间产生交联作用的生物酶，因此作为肉类重组加工的一种手段而得到应用。近些年来，国内外对TG酶在肉类重组制品中的应用进行了许多研究。随着消费人群对健康食品认识的提高，食品的营养价值及其安全性越来越受到人们的关注。TG酶作为新型的食品添加剂，其来源广、添加量少、不会有副产物生成，对人体是非常安全健康。
Tg酶是一种氨基转移酶，它能催化肽链中谷氨酸残基的γ-羧基酰胺和各伯胺的转氨基反应。当肽链上的赖氨酸残基上的ε-氨基作为酰基受体时会形成分子间的ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键。Tang等人还发现大豆蛋白是该酶作用的良好底物。研究都表明，Tg酶无论在内酯豆腐生产还是嫩豆腐生产中，都能发挥有效提高豆腐的凝胶强度、改善豆腐成型性和品质的作用。秦三敏以豆腐凝胶强度为考察指标，优化TG酶用作豆腐凝固剂生产豆腐的工艺条件。Fuke研究发现菠萝蛋白酶是通过水解大豆蛋白而使豆浆凝固的，其中大豆11S球蛋白是酶凝过程中引起胶凝的主要成分。巫庆华研究发现木瓜蛋白酶对蛋白质的作用使得蛋白质暴露出疏水基团，并马上利用蛋白质分子间疏水相互作用再结合成凝胶。栾广忠研究发现：大豆蛋白在碱性蛋白酶Alcalase的作用下部分水解，增加了蛋白质表面疏水性，引起大豆蛋白以11S为骨架，形成较小的蛋白球，小的蛋白球再聚集形成大的蛋白球群，最后通过分子间氢键作用这些蛋白球群相互连接形成了稳定的凝胶。
在微生物发酵生产TG的开发中，获得优良菌种是最关键的因素之一。1997 年，Junqua等人以Streptoverticillium cinnamoneum为发酵生产MTG的原始菌株，通过对发酵培养基配方的优化，提高原始菌株发酵生产MTG的能力PS1。随后, 更多的学者投入TGase生产菌发酵培养基优化的研究并取得一系列成果。
2001年，南京农业大学陆兆新及其合作者从土壤中筛选出产TGase的灰色轮丝链霉菌，但未能准确测定该菌株产谷氨醜胺转氨酶的酶活大小。在此基础上，王灼维等根据产酶微生物自身特性和酶催化反应结果的特征性质，有针对性地采集各种典型土样，筛选获得了生产MTG的链霉菌，最初酶活为0.24U/ml。接着，他们对该菌株进行亚硝基胍单独和结合经胺复合进行了多次诱变，再经初筛分析和复筛验证，获得了TG高产突变株，最高的酶活相对提高了近7.96倍。而后，研究者进一步将其搭乘神舟无人船进行空间搭载诱变育种。结果表明，搭载突变株的酶生产能力比对照提高了40％。然而，该方法过于繁琐复杂，需要额外的诱变条件。
苏小玟(微生物谷氨酰胺转氨酶生产菌株的筛选和诱变，福建师范大学硕士毕业论文，2015)从土壤中筛选得到一株高产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌，并通过基因重组方法进行改造，以提高其产量。虽然突变基因在宿主细胞中得到了表达，但与未突变的MTG在宿主细胞的表达量相差不大，后期还需要进一步的筛选突变体。同时，其表达的外源蛋白大多是包涵体形式，后期分离困难，并且没有经过发酵罐生产，因此制约其进一步的应用。
由于通过微生物来生产TG酶的现有方法，多是通过放线菌或链霉菌类等微生物生产蛋白酶，这类方法所制备的产品中难以避免地存在致癌性霉菌毒素或抗生素等副产物，因此酶产品或是只能用于化工生产，或是需要进一步精细纯化以用于医药生产，并不适宜用于需求量大、原料较为廉价且安全等级高的食品生产中。
此外，虽然上述方法制备的酶产量较高，但不能直接将发酵后的初产物直接用于食品领域中，因此需要经浸泡提取、过滤浓缩、溶析纯化、超滤、精滤的纯化步骤，导致食品领域生产步骤过于繁琐，成本难以降低。
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain)，属于乳杆菌属(Lactobacillus)，革兰氏阳性，兼性异型发酵乳糖，不液化明胶，接触酶阴性；最适生长温度为37℃， G+C含量为45.6％～47.2％；菌体长短不一，两端方形，常成链或串状，菌落粗糙，灰白色，有时呈微黄色；生化反应能发酵多种糖。干酪乳杆菌作为益生菌的一种，能够耐受有机体的防御机制，其中包括口腔中的酶，胃液中低pH值和小肠的胆汁酸等，所以干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活，可以起到调节肠内菌群平衡、促进人体的消化吸收等作用。干酪杆菌作为具有益生潜力的乳酸菌，在食品研发领域有着十分重要的用途。
陈冲等(干酪乳杆菌在乳制品中的应用研究进展，《食品与发酵科技》，2015 第51卷第4期)、赵迪等(干酪乳杆菌功能及应用的研究进展，《黑龙江畜牧兽医》科技版，2015年第2期)均综述了干酪乳杆菌可用于抑制有害菌的生长和改善肠道微生态环境，刺激免疫系统和提高免疫功能，抗肿瘤作用和抗血压作用，促进蛋白吸收消化和消除豆腥味等作用，但未报道利用干酪乳杆菌用于生产MTG 酶。
李洪波等(谷氨酰胺转氨酶在酸奶中的应用研究，《安徽农业科学》，2017 第45卷第18期)综述了谷氨酰胺转氨酶添加工艺对脱脂酸奶品质的影响，并认为通过TGase的添加可以显著改善脱脂酸奶的凝胶特性和品质，但未报道利用干酪乳杆菌用于生产MTG酶。
王齐等(微生物发酵生产谷氨酰胺转氨酶的研究进展，《齐齐哈尔医学院学报》，2013第34卷第5期)综述了近年来国内外在谷氨酰胺转氨酶菌株的选育、发酵条件的优化和分离提纯等方面的进展情况，认为目前的生产菌株仍以放线菌为主，由于目前对微生物中TG的生物合成途径及其在微生物体内的代谢调节机制尚不完全清楚。因此，在分子水平上进行代谢调控，进一步提高产量还存在一定困难，但是利用酶学修饰和改造等方式获得高效、底物特异性广的TG将是未来研究的热点。
中国发明专利申请201110081732.4、“黄瓜发酵液与谷氨酰胺转胺酶复合凝固剂加工豆腐的方法”公开了将含有干酪乳杆菌等多种乳酸菌的黄瓜发酵液，加入豆浆中点浆后，再加入TG酶，以制备豆腐，从而提高豆腐的品质和安全性。虽然该方法体现了干酪乳杆菌复配TG酶，但并没有报道利用干酪乳杆菌用于生产TG酶。
中国发明专利申请201710042201.1、“一种耐冻融益生菌酸奶及其制备方法”和发明专利申请201611259453.1、“含抗氧化干酪乳杆菌的农家干酪及其制备方法”，以及发明专利申请201710012032.7、“含有植物乳杆菌和干酪乳杆菌的抗氧化契达干酪及其制备方法”均公开了干酪乳杆菌和TG酶/或凝乳酶进行复配，来分别制备相关食品的方法。这些方法中或是单独加入TG酶/或凝乳酶，或是发挥干酪乳杆菌的益生菌作用，均没有涉及直接利用干酪乳杆菌用于生产TG酶。
综上，目前需要一种既能符合最低产量要求，又能满足用于食品领域的简便、廉价和食品安全的生产TG酶的工艺，例如通过干酪乳杆菌来生产TG酶。
发明内容
本发明原理在于，本发明选用来自人体消化道或食物(如奶酪)的干酪乳杆菌作为生产菌来生产TG酶，从而可将含有TG酶的发酵初产物直接用于食品等领域，避免了除去副产物和纯化产物工艺过于复杂的缺陷，还能发挥乳杆菌自身有益于人体的代谢产物的协同作用。另外，鉴于现有的干酪乳杆菌的筛选，主要停留在传统的自然筛选或通过选择压能进行筛选。前者难以获得高产效率的菌株，而后者所获得的诱变菌，又由于选择压的消失而遗传性能不稳定，导致菌株退化。有鉴于此，本发明首次提供了通过复合诱变技术来筛选高效表达TG酶的干酪乳杆菌，同时通过多次重复的复筛，使得诱变菌株的性能稳定。
因此，本发明第一目的提供一种通过复合诱变技术而获得的高产TG酶的干酪乳杆菌乳杆菌诱变菌株(Lactobacillus casei)KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述植物乳杆菌诱变菌株(Lactobacillus plantarum)KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述玉米乳杆菌选自玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)KJY13，保藏号为CGMCCNo.15423，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述肠膜状明串珠菌选自肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在一个实施方案中，该诱变菌株KJY11在豆清液发酵上清液中生产的TG酶活，相比于原始出发菌株，提高了约46U/ml。
本发明第二目的是提供诱变上述菌株KJY14的制备方法，步骤包括：
(1)将冻存的肠膜明串珠菌株分别在改良的MRS液体培养基中经过二次活化后，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代；
(2)将纯化后的菌株稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间为50s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，然后涂布筛选梯度培养平板上，避光培养24h；
(3)选取平板相对较厚处生长的单菌落，置于MRS液体培养基中进行培养；
(4)收集培养的菌体，并稀释成108/ml的菌悬液，加入pH7.4的醋酸钠缓冲液和终浓度为200μg/mL的亚硝基胍溶液后，于37℃培养箱中避光孵育40min 后，向各样品中加入生理盐水终止反应，然后对诱变处理后的菌液冰浴2～3h后以诱导正突变；
(5)取上述菌悬液以107/ml稀释梯度，取100ul涂布到筛选梯度培养平板37℃下培养48h，肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的单菌落；
(6)复筛：选择生化性状稳定的菌株于MRS液体培养基摇瓶培养，然后再于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选一次之后，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏；
(7)重复复合诱变：按照以上步骤(2)-(6)，再进行微波连续诱变2代- 复筛-亚硝基胍诱变2代-复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，其中微波诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液；
(8)选择生长形状最良好的多个单菌落进行MRS液体培养基发酵后，分离发酵液并获得无细菌的上清液，通过比色法测量上清液的TG酶活，其中一个突变株酶活量相比于原始出发菌株提高了约46u/ml；
(10)经生理生化试验鉴定，该突变株命名为肠膜明串珠菌KJY14，并于2018 年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15424。
本发明第三个发明目的是提供所述干酪乳杆菌诱变菌株KJY14生产食品用的 TG酶的方法，包括：
(1)将保藏的干酪乳杆菌诱变菌株于豆清液培养液中活化培养；
(2)将活化的培养液，以108CFU的浓度加入预先制备好的培养液中(豆浆、豆清液或米浆中)，于37℃下静置培养5-50h，获得终发酵液；
(3)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(4)SDS-PAGE电泳初步验证结果，然后经过硫酸铵沉淀和透析后，并通过SePhadex过柱进行纯化。
在一个实施方案中，上清液经改进的福林法分析后，确定生产的酸性蛋白酶的活力为68.80U/ml，该酶活已经满足食品生产。
在另一个实施方案中，可以将终发酵液、上清液或者纯化的酶产品作为添加剂，直接加入食品原料中用于凝固相关食品。
本发明第四个发明目的是提供所述诱变菌株与下列任意一种或多种诱变乳酸菌株进行复配，以生产TG酶的方法，步骤包括：
(1)将保藏的诱变菌株分别进行活化培养，其中，活化培养基选自MRS液体培养基，其他诱变株选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、玉米乳杆菌 (Lactobacilluszeae)、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)；
(2)将活化的诱变菌株培养液，加入预先制备的培养液(豆清液或豆浆) 中，于37℃下静置培养5-50h，获得终发酵液，其中干酪乳杆菌的加入量为108CFU 的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU的浓度。
(3)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(4)SDS-PAGE电泳初步验证结果，然后经过硫酸铵沉淀和透析后，并通过SePhadex过柱进行纯化；
本发明第五个目的是提供诱变的鼠李糖乳杆菌和/或多种诱变乳酸菌株用于制备食品凝固剂的方法，步骤包括：
(1)将干酪乳杆菌诱变株在MRS液体培养基扩大培养后，获得为活菌密度为108-109CFU/mL的种子培养液；
(2)将种子培养液按3％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下发酵12-24h，获得液体凝固剂。
在一个实施方案中，步骤还包括：(3)将所述液体凝固剂进行冷冻干燥处理，获得粉状的固体凝固剂。
在另一个实施方案中，所述食品是酸豆奶、酸奶豆腐或酸豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤。
在另一实施方案中，所述在诱变株选自鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15。在一个具体实施方案中，干酪乳杆菌KJY14、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为 (1-10):1:1:1:1。在优选的实施方案中，当所述接种比例为(5-10):1:1:1:1时，所制备的凝固剂可用于制备富含TG酶的保健食品。在上述的任一方案中，其中除干酪乳杆菌之外，可任选一种或多种其他诱变乳酸菌进行复配，且接种比例保持不变。
本发明第六个目的是提供上述方法所制备的食品凝固剂。
本发明第七个目的是提供上述食品凝固剂用于凝固液体食品的方法，步骤包括：
(1)将豆浆、豆清液或牛奶于65-72℃下进行加热，然后冷却至36-40℃；
(2)加入1-5％(v/v)液体凝固剂或0.01-0.05％(m/m)的固体凝固剂，以 80-100r/min的速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物或胶凝状物，从而制备酸豆奶、酸奶豆腐或酸豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤。
在一个实施方案中，还包括步骤(3)根据所制备的凝固食品类型，选择凝固深化的持续时间，如豆腐的持续时间为20-30min，酸汤的持续时间为72小时。
在另一实施方案中，所述在诱变株选自干酪乳杆菌KJY14、鼠李糖乳杆菌 KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、肠膜状明串珠菌KJY15。在一个具体实施方案中，干酪乳杆菌KJY14、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为 (1-10):1:1:1:1。在上述的任一方案中，其中除干酪乳杆菌之外，可任选一种或多种其他诱变乳酸菌进行复配，且接种比例保持不变。
附图说明
图1：微波辐照诱变时间与致死率变化曲线图；
图2：微波辐照诱变时间与突变率变化关系图；
图3：亚硝基胍诱变时间与致死率变化曲线图；
图4：酸性条件下，干酪乳杆菌诱变株在豆清液中发酵的生长曲线图；
图5：菌株系统发育树图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。对于所属技术领域的技术人员而言，从对本发明的详细说明中，本发明的特征和优点将显而易见。
实施例1、实验材料
出发菌株：
1、干酪乳杆菌为本公司冻藏菌株LC20170301。
2、鼠李糖乳杆菌诱变菌株KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为 2018年03月07日。
3、植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCC No.15422，保藏日期为2018 年03月07日。
4、玉米乳杆菌诱变菌株KJY13，保藏号为CGMCC No.15423，保藏日期为2018 年03月07日。
5、肠膜状明串珠菌诱变菌株KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日。
实施例2、微波诱变干酪乳杆菌
收集驯化的菌种，并稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90s，每隔10s取出用冰浴10s 消除微波的热效应，避光4℃冷藏12h后，涂布MRS固体培养基平板上，37℃培养 24h，进行菌落计数，计算致死率。
采用500功率照射乳杆菌的菌悬液，致死率与照射时间的关系如图1所示。
致死率(％)＝(未诱变处理的总菌数－诱变处理后的存活菌数)/未诱变处理的总菌数×100
可以看出，随着微波时间的增加，致死率逐渐增大，当微波处理50s时，致死率为83.7％，而当微波辐照处理60s时，致死率接近100％。
统计出发菌株(短杆或长杆状，两端钝圆，表面粗糙，灰白色，平均直径 0.5-2mm)和诱变菌株的菌落平均直径和形状不规则性，确定比出发菌株的菌落直径增加且出现不规则形状但颜色不变的诱变菌株为正突变株，从而确定菌落直径比例变大且形状出现不规则的诱变株为正向突变株。由此计算对于不同微波诱变时间下植物乳杆菌的正突变的研究。
结果如图2所示，当微波辐照50s时，正突变率较大，有利于诱变的菌株的筛选。
因此，根据诱变机制，强烈的诱变剂和较高的剂量处理诱变菌株，菌株突变可能性大，因此选用50s为下一步试验诱变辐射时间。
按照上述步骤，对已活化的菌悬液进行微波辐照处理50s，然后取辐照菌液 1ml稀释后，涂布到筛选用梯度培养平板上，于37℃培养1天。选取生长迅速、两端钝圆、边缘整齐、相对较厚处生长的灰白色或白色单菌落置于MRS液体培养基进行培养。
实施例5、亚硝基胍诱变
亚硝基胍(NTG)：取0.1g亚硝基胍加入10mL丙酮作为助溶剂，完全溶解后取 1mL亚硝基胍丙酮溶液加入9mL磷酸钠缓冲液(pH7.4，0.02mol/L)配制成NTG浓度为1mg/mL的亚硝基胍母液。
收集培养的驯化菌种，并稀释成108/ml的菌悬液。然后取8mL菌悬液，加入亚硝基胍母液2mL，NTG终浓度为200μg/mL，同时设置未诱变原液作为对照。
将上述菌液置三角瓶中，摇床振荡37℃培养分别避光孵育10、15、20、 25、30、35、40、45、50min后，分别加入生理盐水终止反应；诱变处理后的菌液冰浴2～3h以诱导正突变后，于4000r/min室温离心15min。取菌体沉淀，用 pH 6.5磷酸缓冲液离心洗涤2次后，用冷生理盐水十倍梯度稀释菌体沉淀至7倍梯度，分别取0.1mL涂布于含2％(质量分数)碳酸钙的MRS固体培养基上， 37℃恒温避光静置培养48h。观察各梯度培养皿菌落数，计算NTG诱变的致死率。
结果图3所示：当菌悬液用NTG 200μg/mL的NTG诱变处理不同时间，随诱变处理时间的延长，致死率不断增加，在处理40min时，致死率达到81.5％。
按照实施例4的方法，统计出发菌株和诱变菌株的菌落平均直径和明显溶钙圈的平均直径，确定比出发菌株的菌落直径和明显溶钙圈有增加但颜色不变的诱变菌株为正突变株。
综合致死率和正突变率的实验结果，选择200μg/mL和诱导40min作为亚硝基胍的最佳诱导参数。
按照上述步骤，对已活化的菌悬液进行200μg/mL亚硝基胍的诱导40min，然后取辐照菌液1ml稀释后，涂布到筛选用梯度培养平板上，于30℃培养2-3天。
选取生长迅速、两端钝圆、边缘整齐、相对较厚处生长的灰白色单菌落置于 MRS液体培养基进行培养。然后取对数生长期的菌液，离心收集后，再置于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选，挑选生长迅速、明显溶钙圈有增加但颜色不变的单菌落，以完成复筛。以此方法，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏。
按照以上方法，再进行微波连续诱变2代-复筛-亚硝基胍连续诱变2代-复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，虽然微波诱变率较高，但二次诱变对菌株致死率大，因此微波重复诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液。
实施例6、比色法检测TG酶活
1、试剂配制：
①底物试剂A；称取100mg Z-Gln-Gly溶解于2ml NaOH溶液(0.2M)，加入4ml Tris盐酸溶液(0.2M，pH6.0)，2mL盐酸羟胺溶液(0.2M),2mL盐酸羟胺溶液 (0.2M)，2mL还原型谷胱甘肽(0.01M)，调节pH＝6.0。
终止剂B：5％Fe Cl3·6H2O:12％三氯乙酸:3M盐酸＝1:1:1。
TG酶活单位(U)定义为:在37℃，1min生成1μM的L-谷氨酸-γ-单羟肟酸的酶量。
2、比色法测定发酵上清液的TG酶活
以Z-Gln-Gly为底物，以L-谷氨酸-γ-单羟肟酸制作酶活的标准曲线，即将Tris盐酸溶液(0.2M，pH6.0)分别配制0μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM的 L-谷氨酸-γ-单羟肟酸的标准溶液。
分别取200μl上述不同浓度的L-谷氨酸-γ-单羟肟酸的标准溶液与500μl底物试剂A混合，37℃下加热10分钟后加入200μl终止试剂B，置于37℃下加热5 分钟，然后于5000转/分钟离心，保留上清。将上清液于525nm测定吸光度值，并绘制标准曲线。
诱变前后共进行3组实验，从中选择生长形状最良好的多个菌落，将上述保藏的多个菌株分别单一接种于MRS液体培养基中，37℃下活化培养48h。
将诱变菌株的发酵液离心后，取200μl上清，与500μl底物试剂A混合，37℃下加热10分钟后加入200μl终止试剂B，置于37℃下加热5分钟，然后于5000转/分钟离心，保留上清。将上清液于525nm测定吸光度值，并通过与标准曲线进行比较计算酶活。同时设置原始出发菌株的发酵上清酶液作为对照。
3、酶活测定结果
如上表2可知，诱变株IR-NTG-2-33，其发酵液中TG酶活明显高于其他诱变株，其相比于未诱变的出发菌株，酶活量提高了约46U/ml。
实施例7、诱变株的生理生化特性测试和分子鉴定
(一)生理生化特性测试
挑取诱变株IR-NTG-2-33单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代，并通过表观判断与镜检确定其菌落形态和菌体形态，并进行4℃菌种斜面保存。
生理生化特性测试结果如下表3：
(二)分子鉴定
提取菌株细胞总DNA，以通用引物扩增菌株的16S rRNA的部分基因片段，插入测序载体后进行测序，并于NCBI数据库进行比对。
比对结果如下表4：
另外，基于16S rRNA基因序列构建的菌株系统发育树如下图5和表5：根据上述测定结果，表明其与上述多个干酪乳杆菌的部分序列均保持一致，且与生理生化特征结果相一致，故将该诱变菌株定名为(Lactobacillus casei strai)KJY14，简写为KJY14。2018年03月07日，将该KJY14进行保藏，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
(三)菌种在豆清液中的生长
在模拟口腔等消化道的低酸性条件(pH2.0-5.0)下，将诱变菌种在豆清液中进行发酵培养，每2h检测OD值，以确定菌种活菌数。
如图4所示，随着时间的增长，诱变菌种的活菌数逐渐增加，在14h达到峰值，随后进入平稳的生长期。这表明，诱变的干酪乳杆菌能够适应消化道的酸性环境，有利于表达TG酶。
实施例8、诱变株生产食品用的TG酶
将活化的培养液，以108CFU的浓度加入预先制备好的豆清液培养液中，于 37℃下静置培养5-50h，获得终发酵液；
离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
SDS-PAGE电泳初步验证结果：将含有酶液的上清液进行SDS-PAGE胶分离(浓缩胶5，分离胶8％)，考马斯亮蓝染色30min，用脱色液过夜脱色至背景清晰，割下含有目的蛋白条带和标准蛋白的胶条，依据蛋白Marker各条带表示的分子量，收集约37kD大小的预期胶带。
将预期TG酶上清液，经过硫酸铵沉淀和透析后，浓缩液加到预先用 0.02M/pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液中平滑的Sephadex G-75层析柱，分离单独的洗脱峰。
收集洗脱峰的酶液并进行浓缩，按照实施例6的方法检测上清液中酶活为48.478U/ml。推测由于豆清液培养基的发酵效率低于MRS培养基，因此其上清液酶活相应下降，但该酶活值已经满足食品生产，或者可以进一步冻干浓缩，获得更高酶活的干粉制剂(U/g)。
实施例9、多种诱变菌株工业化协同生产TG酶
复配菌株：
鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日。
植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018 年03月07日。
玉米乳杆菌选自玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCC No.15423，保藏日期为2018年03月07日。
干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日。
肠膜状明串珠菌选自肠膜明串珠菌KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日。
将活化的诱变菌株培养液，分别单独加入预先制备的豆清液培养液中，于 37℃下静置培养48h，获得终发酵液。
根据实施例8的方法，测试各个菌株的生产TG酶能力，结果如下表6所示。
由表6可知，5种乳酸菌均能在豆清液发酵液中产生TG酶，其中本发明的干酪乳杆菌诱变菌的产酶活性更高，由此可以在复配菌株中主要发挥生产TG酶的作用。
按照以上方法，将上述菌株进行混合复配后(其中干酪乳杆菌的加入量为108CFU/ml的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU/ml的浓度)，分别一起接种到豆清发酵液、豆酸奶中，所测得发酵液的TG酶的总酶活为71.324U/ml、81.965 U/ml。复配混合发酵的TG酶产量并未呈现如表6所示的产量叠加的结果，可能原因是5种乳酸菌的产物之间存在竞争性，另外因豆酸奶的营养成分强于豆清液培养液而产量优于后者产量。
实施例10、诱变菌种生产用于食品的凝固剂
分别取鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜明串珠菌KJY15，接种于20mL MRS液体培养基中，37℃活化培养24h。
然后，按接种量3％(v/v)接种至500ml的MRS液体培养基中，37℃扩大培养至获得为活菌密度为108-109CFU/mL的种子培养液；
将种子培养液按1％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下发酵 12-24，而后加入无菌的醋酸，将pH调至2.5-5.0、优选3.50-4.0，即获得液体凝固剂。
考虑到种子培养液中活菌密度为108-109CFU/mL为菌种最佳生长时期，在相同培养条件下，各种诱变菌种的生长的活菌密度并不完全一致，因此调整干酪乳杆菌KJY14、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为10:1:1:1:1，或1:1:1:1:1，以确保分别获得用于生产主要富含TG酶的凝固食品的凝固剂，和生产主要富含多种益生菌的食品的凝固剂。其中，在保留干酪乳杆菌KJY14的情况下，也可以复配一种或任意几种其他的诱变菌进行组合，其接种比例仍然保持不变。
将获得的液体凝固剂中，通过离心分离菌体，然后用适量的无菌生理盐水重悬浮后，重新分离纯化菌体后，在重悬液中加入终浓度为7.5％(m/v)的葡萄糖或麦芽糊精作为保护剂，先放入4℃平衡30min，然后放置-40℃中进行预冷冻20h。冷冻完成后放入真空冷冻干燥机中，设置温度-50℃，抽真空(20～40Pa)，干燥 24h，制得粉状固体凝固剂。使用时，重新复水溶解即可。
实施例11、诱变菌种用于凝固液体食品的生产方法
1、制作豆花或酸豆浆
将优质黄豆清洗后，充分泡涨。通过使用浆渣分离器磨浆，并加热，获得熟豆浆。
熟豆浆冷却至36-40℃，然后在无菌条件下匀速流加加入3％(v/v)液体凝固剂，以80r/min的速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物。然后降低搅拌速度，直至出现大面积的絮状物或碎花状物。低温保存，即得豆花。或持续发酵1-4小时，以制备酸豆浆。
2、制作豆腐
在方法1的基础上，继续搅拌豆浆25min以便凝固深化，直至块状增大至不变且水固分离时，保温养浆20min，再大火加热至微沸1min，用重物压制蹲脑 20-30min。
然后将蹲脑后豆腐倒入铺好豆腐布的型框中，包严网布、覆平、自沥后重物压力下加压3h，确保豆腐良好的外形和质构，压制成形后即为豆腐成品，其中豆腐的质构状况如下表。
| 样品 | 硬度(N) | 弹性 | 持水率(％) |
| 豆腐 | 0.47±0.03 | 0.72±0.03 | 72.32±0.24 |
| 对照豆腐 | 0.28±0.02 | 0.43±0.04 | 67.38±0.29 |
注：对照豆腐为用普通卤水点样的豆腐。
由上表可知，该酸豆腐块型完整，表面弹性更好，断面整齐，表面光滑。并且口感细腻爽滑，没有对照豆腐残留的淡苦涩味，且有独特风味。
3、制作豆酸奶
将新鲜牛奶于70度左右加热杀菌后，冷却至40度，然后按照15-20％(v/v) 将牛奶加入熟豆浆中，并加入5％蔗糖。
然后，在无菌条件下匀速流加加入0.02％(m/m)的固体凝固剂，以90r/min的速度搅拌，直至产生凝胶状物。然后降低搅拌速度，直至出现大量凝胶。低温保存，即得豆酸奶。
其中，所制备的豆酸奶产品的质构状况如下表：
| 样品 | 硬度(gf) | 粘度指数(N) | 韧性(gf) |
| 豆酸奶 | 6.56±0.09 | 0.19±0.05 | 6.39±0.34 |
| 对照样 | 3.58±0.04 | 0.13±0.01 | 3.38±0.32 |
注：对照样为添加了由原始干酪乳杆菌制备的凝固剂。
由上表可知，相比于对照样，豆酸奶的凝固性更好，表面无裂痕，颗粒感更少，表面无明显乳清析出。并且色泽均匀有光泽，酸奶风味丰富可口。
4、制作苗侗族酸汤
在方法1的基础上，将含有絮状物或碎花状物的豆浆液，于38℃下深化发酵 72小时，即可得到酸汤原液。
预先制备西红柿浆、辣椒粉、食盐、白酒的混合溶液，加入适量1-5％(v/v) 酸汤原液，厌氧发酵5-10天。即可制得食用的苗侗族酸汤。
相对于普通豆花、豆酸奶、酸豆腐等，本发明的凝固剂制备出的食品，具有保水性好、质地细腻(如益生菌豆腐、酸奶味豆腐或酸浆豆腐)、口味清淡略带酸甜(如豆酸奶、酸奶)，香味浓厚(如酸汤)，营养丰富。
另外，由于含有多种益生菌，能够提高胃肠道的免疫力。
应当理解，本发明虽然已通过以上实施例进行了清楚说明，然而在不背离本发明精神及其实质的情况下，所属技术领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的变化和修正，但这些相应的变化和修正都应属于本发明的权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种通过复合诱变技术而获得的高产TG酶的干酪乳杆菌诱变菌株KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.用于诱变权利要求1所述菌株KJY14的方法，步骤包括：
(1)将冻存的干酪乳杆菌在改良的MRS液体培养基中经过二次活化后，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代；
(2)将纯化后的菌株稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间为50s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，然后涂布筛选梯度培养平板上，避光培养24h；
(3)选取平板相对较厚处生长的单菌落，置于MRS液体培养基中进行培养；
(4)收集培养的菌体，并稀释成108/ml的菌悬液，加入pH7.4的醋酸钠缓冲液和终浓度为200μg/mL的亚硝基胍溶液后，于37℃培养箱中避光孵育40min后，向各样品中加入生理盐水终止反应，然后对诱变处理后的菌液冰浴2～3h后以诱导正突变；
(5)取上述菌悬液以107/ml稀释梯度，取100ul涂布到筛选梯度培养平板37℃下培养48h，肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的单菌落；
(6)复筛：选择生化性状稳定的菌株于MRS液体培养基摇瓶培养，然后再于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选一次之后，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏；
(7)重复复合诱变：按照以上步骤(2)‐(6)，再进行微波连续诱变2代‐复筛‐亚硝基胍诱变2代‐复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，其中微波诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液；
(8)选择生长形状最良好的多个单菌落进行MRS液体培养基发酵后，分离发酵液并获得无细菌的上清液，通过比色法测量上清液的TG酶活，其中一个突变株酶活量相比于原始出发菌株提高了约46u/ml；
(10)经生理生化试验鉴定，该突变株命名为干酪乳杆菌KJY14，并于2018年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15424。
3.通过权利要求1所述的诱变菌，或通过权利要求2所制备的诱变菌，用于生产谷氨酰胺转氨酶(Glutamine transaminase)的方法，包括：
(1)将保藏的干酪乳杆菌诱变菌株于豆清液培养液中活化培养；
(2)将活化的培养液，以108CFU的浓度加入预先制备好的培养液中(豆浆、豆清液或米浆中)，于37℃下静置培养5‐50h，获得终发酵液；
(3)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(4)SDS‐PAGE电泳初步验证结果，然后经过硫酸铵沉淀和透析后，并通过SePhadex过柱进行纯化。
4.权利要求3的方法，其中可以将终发酵液、上清液或者纯化的TG酶产品作为生物制剂添加剂，直接加入食品原料中用于凝固相关食品。
5.通过权利要求1所述的乳杆菌，或通过权利要求2所制备的乳杆菌与下列任意一种或多种诱变乳酸菌株进行复配，以生产TG酶的方法，步骤包括：
(1)将保藏的诱变菌株分别进行活化培养，其中，活化培养基选自MRS液体培养基，其他诱变株选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain)、玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae strain)、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides strain)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；
(2)将活化的诱变菌株培养液，加入预先制备的培养液(豆清液或豆浆)中，于37℃下静置培养5‐50h，获得终发酵液，其中干酪乳杆菌的加入量为108CFU的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU的浓度。
(3)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(4)SDS‐PAGE电泳初步验证结果，然后经过硫酸铵沉淀和透析后，并通过SePhadex过柱进行纯化，
其中所述鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日；
所述植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日；
所述玉米乳杆菌选自玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCC No.15423，保藏日期为2018年03月07日；
所述干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain)KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日；
所述肠膜状明串珠菌选自肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides strain)KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日。
6.通过权利要求1所述的乳杆菌，或通过权利要求2所制备的乳杆菌与下列任意一种或多种诱变乳酸菌株进行复配，以制备食品凝固剂的方法，步骤包括：
(1)将干酪乳杆菌诱变株在MRS液体培养基扩大培养后，获得为活菌密度为108‐109CFU/mL的种子培养液；
(2)将种子培养液按3％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下发酵12‐24h，获得液体凝固剂；
其中所述诱变株选自鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15，并且干酪乳杆菌KJY14、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为(1‐10):1:1:1:1，以及
所述食品是酸豆奶、酸奶豆腐或酸豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤。
7.权利要求6的方法，其中步骤还包括：(3)将所述液体凝固剂进行冷冻干燥处理，获得粉状的固体凝固剂。
8.权利要求6或7的方法，其中当所述干酪乳杆菌KJY14、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例为(5‐10):1:1:1:1时，所制备的凝固剂可用于制备富含TG酶的保健食品。
9.通过权利要求6‐7的方法所制备的食品凝固剂。
10.通过权利要求9的食品凝固剂用于凝固液体食品的方法，步骤包括：
(1)将豆浆、豆清液或牛奶于65‐72℃下进行加热，然后冷却至36‐40℃；
(2)加入1‐5％(v/v)液体凝固剂或0.01‐0.05％(m/m)的固体凝固剂，以80‐100r/min的速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物或胶凝状物，从而制备酸豆奶、酸奶豆腐或酸豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤；
(3)根据所制备的凝固食品类型，选择凝固深化的持续时间，如豆腐的持续时间为20‐30min，酸汤的持续时间为72小时。
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