CN109851514B - 一种l-异亮氨酸的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种L‑异亮氨酸的分离纯化方法，属于生物工程领域。该方法包括以下步骤：(1)发酵液除杂：于L‑异亮氨酸发酵液中加入离子去除剂，加热后离心处理，得到上清液；(2)初步纯化：将步骤(1)所得上清液通过超滤膜进行超滤处理，得到滤清液；(3)高度纯化：将步骤(2)所得滤清液酸化处理后，加入001×7型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂动态吸附后，用洗脱剂洗脱，得到洗脱液；(4)结晶：调节步骤(3)所得洗脱液的pH值至7.5，加入乙醇进行结晶，真空干燥后得到L‑异亮氨酸。本发明能有效去除发酵液中的杂质，提高L‑异亮氨酸的提取率和品质，可广泛应用于L‑异亮氨酸的工业制备中。

Description

一种L-异亮氨酸的分离纯化方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种L-异亮氨酸的分离纯化方法。

背景技术

异亮氨酸，属于疏水性支链氨基酸。根据其α和β位对应碳原子分布的不对称性，分为四类异构体。其中，自然界中存在的仅为L-异亮氨酸是人体八大必需氨基酸之一，又是三大复合支链氨基酸之一。自20世纪初异亮氨酸被首次发现以来，其生理功能也慢慢被人们熟知，为其应用奠定了基础。在食品方面，L-异亮氨酸作为食品添加剂，保证人体获取充足的物质含量；还可作为饮料添加剂，促进人体肌肉发育、增强肝脏免疫力、缓解疲劳、增强能量。在医药方面，L-异亮氨基酸可以加入到营养输液和药物制取中，能促进人体肝脏正常作业，缓解和治疗肝脏疾病，提高人体免疫力。在饲料方面，将L-异亮氨酸添加到饲料中，增强动物生长代谢功能、改善机体神经作用、提高免疫力，甚至能增强动物泌乳能力。

L-异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、发酵法。工业生产上最常用的为直接发酵法。由于L-异亮氨酸的生物合成受到乙醛酸循环、苏氨酸合成水平和分支链氨基酸合成水平的调节控制，通常借助诱变处理的微生物合成自身所需物质的能力选择性地大量合成和积累L-异亮氨酸。已报道使用的菌种有黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌等。

目前，从发酵液中分离L-异亮氨酸的方法一般采用沉淀法、离子交换法及膜法等。沉淀法是利用加入试剂或改变条件使发酵产物离开溶液，到浓缩和分离的双重作用，生成不溶性颗粒，沉降析出，这是历史最悠久的分离纯化方法。离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征，以及目的氨基酸与杂质氨基酸pI值的差异，利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。膜法分离是物质透过或被截留于膜的过程，依据滤膜孔径的大小而达到物质分离的目的。

比如，中国专利CN106278919B公开了一种制备L-异亮氨酸的方法，其包括微滤膜过滤和絮凝除杂、超滤膜过滤和浓缩结晶，通过该方法得到的L-异亮氨酸纯度达到99.1％，提取率为82.9％。该方法通过微滤膜和特殊絮凝剂对发酵液进行除杂，却忽视了对L-异亮氨酸分离影响较大的高价离子的处理。

再如，中国专利CN103409476B公开了一种L-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法，以突变后的高产乳糖发酵短杆菌JHI4-102为菌种，经优化培养基发酵、壳聚糖预处理和超滤等步骤获得L-异亮氨酸，得到的L-异亮氨酸的产酸率≥31.0g/L、纯度≥98.5％。但是该专利所使用的超滤膜几乎不能截留无机离子，且滤膜截留分子量为10000-50000，较高的截留分子量无法有效地过滤溶液，进而造成实际的生产效率较低、提取率较低。

因此，亟需一种提取率较高的L-异亮氨酸分离纯化方法。

发明内容

针对现有技术中L-异亮氨酸分离纯化提取率较低的问题，本发明提供了一种L-异亮氨酸分离纯化方法，该方法通过发酵液除杂、离子交换、膜分离等纯化分离技术，提取过程高效且污染较少，获得的L-异亮氨酸纯度可达98％、提取率可达85％。

一方面，本发明提供了一种L-异亮氨酸的分离纯化方法，所述的分离纯化方法包括以下步骤：

所述的分离纯化方法包括以下步骤：

(1)发酵液除杂：于L-异亮氨酸发酵液中加入离子去除剂，加热后离心处理，得到上清液；

(2)初步纯化：将步骤(1)所得上清液通过超滤膜进行超滤处理，得到滤清液；

(3)高度纯化：将步骤(2)所得滤清液酸化处理后，加入001×7型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂动态吸附后，用洗脱剂洗脱，得到洗脱液；

(4)结晶：将步骤(3)所得洗脱液浓缩至原体积的50％，用无水乙醇进行结晶，真空干燥后得到L-异亮氨酸。

其中，L-异亮氨酸发酵液是由工业上常用L-异亮氨酸生产菌株与原料发酵后获得的。

优选地，所述步骤(1)中的离子去除剂为1.5-2.5g/L草酸铵和2.0-3.0g/L三聚磷酸钠组成的溶液；所述离子去除剂的用量为L-异亮氨酸发酵液体积的0.4％。

优选地，所述步骤(1)中的加热温度为50-70℃，保温5-10分钟；进一步优选地，所述的加热温度为60℃，保温8分钟。

优选地，所述步骤(1)中的离心条件为使用沉降式离心机10000转/分钟离心10分钟。

优选地，所述步骤(2)中的超滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为5000。

优选地，所述步骤(2)中的超滤处理条件包括：操作温度为30-40℃，操作压力为0.10-0.14MPa；进一步优选地，所述的操作温度为35℃，操作压力为0.12MPa。

优选地，所述步骤(3)中的酸化处理为用草酸铵溶液调节滤清液pH值至2.5。

优选地，所述步骤(3)中的洗脱剂为含氨0.5-1.0wt％的氨水。

优选地，所述步骤(4)中结晶的条件包括结晶温度为0-3℃，结晶时间为24-36小时；进一步优选地，所述的结晶温度为2℃，结晶时间为30小时。

以上技术方案均能够实现本发明所述的技术效果，但在一些优选的实施方案中，所达到的技术效果优于其他方案。

例如：当步骤(1)中所述的离子去除剂中草酸铵和三聚磷酸钠的比例为4:5，所达到的技术效果更佳。其中一个优选的离子去除剂为1.6g/L草酸铵和2.0g/L三聚磷酸钠组成的溶液。

最优选地，所述离子去除剂为2.0g/L草酸铵和2.5g/L三聚磷酸钠组成的溶液。

另一方面，本发明提供了一种L-异亮氨酸的分离纯化方法在制备L-异亮氨酸中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明使用由草酸铵和三聚磷酸钠组成的离子去除剂，能够有效地去除对L-异亮氨酸分离影响较大的高价离子。

(2)本发明采用超滤分离技术与离子交换树脂吸附技术相结合，有效地去除了非目标氨基酸等杂质。

(3)本发明提供的L-异亮氨酸的分离纯化方法制备得到的L-异亮氨酸纯度达到98％以上，提取率达85％以上。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

基础实施例

一种L-异亮氨酸的分离纯化方法，以500L发酵液为例，具体步骤如下：

(1)发酵液除杂：于L-异亮氨酸发酵液中，加入用量为L-异亮氨酸发酵液体积0.4％的离子去除剂，加热后使用沉降式离心机10000转/分钟离心10分钟，得到上清液；其中，L-异亮氨酸发酵液是由工业上常用L-异亮氨酸生产菌株与原料发酵后获得的。

(2)初步纯化：将步骤(1)所得上清液通过无机陶瓷膜，截留分子量为5000，进行超滤处理，得到滤清液。

(3)高度纯化：用常规方法处理001×7型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，使树脂转化为R-SO₃H(H⁺型)；将步骤(2)所得滤清液用草酸铵溶液调节滤清液pH值至2.5，上001×7型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂动态吸附后，用洗脱剂洗脱，得到洗脱液。

(4)结晶：调节步骤(3)所得洗脱液的pH值至5.5-6.0，用常规方法浓缩至原体积的50％，得到浓缩液；用常规方法按照浓缩液与无水乙醇体积比为1:4进行结晶，用常规方法真空干燥后得到L-异亮氨酸。

使用上述基础实施例分离纯化L-异亮氨酸，各步骤中关键条件的参数如表1所示。

表1各步骤中关键条件的参数

对比例1

与实施例3相比，仅缺少步骤(1)的离子去除剂中的草酸铵。

对比例2

与实施例3相比，仅缺少步骤(1)的离子去除剂中的三聚磷酸钠。

对比例3

与实施例3相比，仅缺少步骤(1)的离子去除剂。

对比例4

使用中国专利CN106278919B所述方法分离纯化L-异亮氨酸。

实验例1发酵液中初始L-异亮氨酸含量测定

将发酵液样品经氨基酸自动分析仪进行检测分析，对发酵液中L-异亮氨酸含量进行精确测定。

实验例2L-异亮氨酸提取率的计算

提取率＝L-异亮氨酸终质量(kg)/[初始L-异亮氨酸含量(kg/L)*发酵液体积(L)]×100％

实验例3L-异亮氨酸纯度的测定

使用高效液相色谱法进行纯度测定。

实验结果

表2实施例结果

使用基础实施例所述方法、结合表1列举的各步骤关键条件的参数提取L-异亮氨酸，实施例1-4提取的L-异亮氨酸纯度达到98％以上。实施例1和实施例2的L-异亮氨酸提取率均为85％以上；优选地，当步骤(1)所述的离子去除剂中草酸铵和三聚磷酸钠的比例为4:5且步骤(3)中所述的洗脱液中氨水和碳酸氢钠的比例为10:1时(实施例4)，L-异亮氨酸提取率优于实施例1和实施例2；最优选地，实施例3的提取率为87.82％。与实施例3相比，对比例1-3缺少离子去除剂组分中的一种或几种，提取率分别为78.25％、79.12％和74.38％，远不如实施例1和实施例2的效果，更不如实施例3的效果。综上所述，使用本发明所述的L-异亮氨酸分离纯化方法，制备得到的L-异亮氨酸纯度达到98％以上，提取率达85％以上，优于现有技术。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种L-异亮氨酸的分离纯化方法，其特征在于：所述的分离纯化方法包括以下步骤：

(1)发酵液除杂：于L-异亮氨酸发酵液中加入离子去除剂，加热后离心处理，得到上清液；

(2)初步纯化：将步骤(1)所得上清液通过超滤膜进行超滤处理，得到滤清液；

(3)高度纯化：将步骤(2)所得滤清液酸化处理后，加入001×7型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂动态吸附后，用洗脱剂洗脱，得到洗脱液；

(4)结晶：将步骤(3)所得洗脱液浓缩至原体积的50％，用无水乙醇进行结晶，真空干燥后得到L-异亮氨酸；

所述步骤(1)中的离子去除剂为1.5-2.5g/L草酸铵和2.0-3.0g/L三聚磷酸钠组成的溶液；所述离子去除剂的用量为L-异亮氨酸发酵液体积的0.4％；

所述的离子去除剂中草酸铵和三聚磷酸钠的比例为4:5；

所述步骤(1)中的加热的温度为50-70℃，保温5-10分钟；

所述步骤(3)中的酸化处理为用草酸铵溶液调节滤清液pH值至2.5；

所述步骤(3)中的洗脱剂为含氨0.5-1.0wt％的氨水；

步骤(3)中所述的洗脱液中氨水和碳酸氢钠的比例为10:1；

所述步骤(4)中结晶的条件包括结晶温度为0-3℃，结晶时间为24-36小时。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中的离心的条件为使用沉降式离心机10000转/分钟离心10分钟。

3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中的超滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为5000。

4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中的超滤处理条件包括：操作温度为30-40℃，操作压力为0.10-0.14MPa。

5.一种如权利要求1-4任意一项所述的L-异亮氨酸的分离纯化方法在制备L-异亮氨酸中的应用。