CN110713509A - 采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于甾体类药物中间体的生产方法,具体涉及一种采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法。本发明包括以下步骤:(1)3位保护;(2)生长细胞转化;(3)提取;(4)水解;(5)精制。本发明的制备方法成本较低,路线更短,省掉了许多反应步骤和后处理步骤,反应路线的缩短也有利于反应收率的提高,减少中间损耗。本发明采取3位羟基保护的步骤在前,生长细胞生物发酵反应在后,直接加大了发酵底物在发酵液中的溶解度,有利于发酵的进行,可提高产物的收率,减少杂质的产生。本发明的制备方法还能减少化学试剂的使用,有利于环境保护。
Description
技术领域
本发明属于甾体类药物中间体的生产方法,具体涉及一种采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法。
背景技术
中间体3β-羟基雄甾-5,7-二烯-17-酮的结构式如下所示,该产品为甾体合成中重要的中间体,传统的制备方法中是使用3位酮基的类似结构,并使用化学方法选择性还原3位酮基为β羟基,但使用化学方法得到的产品常常带有一定量的3位α羟基异构体,且需要通过多步化学反应来完成,其中需用到多种价格贵且不利于环保的试剂,成本较高,同时收率低,产品质量差。
菌株Mycobacterium sp.B-NRRL 3683记载在美国专利号为4755463的文献中,一般只用来进行植物甾醇到4-AD和ADD的发酵,目前普遍的研究是通过控制反应条件来提高4-AD和ADD的收率。
发明内容
针对以上技术问题,本发明的目的是提供一种采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体3β-羟基雄甾-5,7-二烯-17-酮的方法,能够解决该中间体合成过程中步骤复杂、易产生3位α羟基异构体杂质,且成本较高、收率较低的问题。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体3β-羟基雄甾-5,7-二烯 -17-酮的方法,包括以下步骤:
(1)3位保护:利用甲缩醛作为保护剂,将麦角固醇的3位羟基进行保护,得到麦角固醇醚化物,反应过程中加入催化剂和助滤剂,所述催化剂为五氧化二磷,所述助滤剂为硅藻土;
(2)生长细胞转化:将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683诱变菌种经过斜面培养和种子培养后接种至转化培养基中,对步骤(1)得到的所述麦角固醇醚化物进行发酵转化;
(3)提取:转化结束后对步骤(2)所得的发酵产物进行提取,得到固体产物;
(4)水解:将步骤(3)所得的固体产物用乙酸乙酯溶解,搅拌后抽滤,合并滤液,减压浓缩后加入2-5倍体积的质量分数为5-20%的盐酸进行水解;
(5)精制:将步骤(4)所得的水解产物进行精制提纯。
优选地,所述步骤(1)中甲缩醛与麦角固醇的质量比为3-20:1。
为了推动反应向正向进行,需要除去反应产生的甲醇和体系中少量的水分,因此需要加入催化剂五氧化二磷,五氧化二磷吸收甲醇或水分变成磷酸酯或磷酸,在甲缩醛中溶解度较低,呈油状物,可通过加入助滤剂吸附后过滤除去,助滤剂优选硅藻土。助滤剂和催化剂的加入量以能达到目的为标准,经过研究人员常规的实验即可得到,本发明优选的助滤剂加入量为麦角固醇重量的1倍,催化剂的加入量为麦角固醇重量的0.5倍。
进一步地,所述步骤(2)中B-NRRL 3683诱变菌种的制备方法为:
a.以分枝杆菌B-NRRL 3683为出发菌种,于M1+2%琼脂的固体培养基中斜面培养,将斜面种子接种于M1液体种子培养基中活化,30℃,200rpm摇床振荡培养48h;取活化好的一级种子按体积比10%接入新的M1液体种子培养基中进行二级种子培养,30℃,200rpm摇床振荡培养48h;
b.将生长好的二级种子10000rpm离心5min,收集菌体,用pH=6.0的磷酸钾缓冲液离心洗涤两次,再用pH=6.0的无菌磷酸钾缓冲溶液制成菌悬液,并将浓度稀释至108-109个/ml;
c.取上述菌悬液2ml,0.1mol/L亚硝基胍溶液1ml,0.2mol/L pH=6.0的磷酸钾缓冲液2ml,加入离心管中充分混匀,置于30℃水浴避光振荡处理25-35min,优选30min,离心收集菌体,用PBS冲洗3次,向离心管中加入5ml无菌生理盐水,摇匀后取出一定的菌悬液,用生理盐水稀释,取100ul上述稀释菌悬液涂布于固体平板培养基上,30℃避光培养,挑选生长良好的突变菌株单菌落进行麦角固醇发酵,并检测3β-羟基雄甾-5,7-二烯-17-酮产量,得到能产生该中间体的目标诱变菌种。
进一步地,所述步骤(2)中B-NRRL 3683诱变菌种种子培养的方法包括以下步骤:
(1)斜面培养:培养基配方:蛋白胨0.1-10g/L,酵母膏0.1-10g/L,葡萄糖0.1-10g/L,磷酸氢二钠0.1-10g/L,琼脂20g/L,pH=7.5-8.0,121℃灭菌30min;接种后,30℃培养4-5d;
(2)一级种子培养:培养基配方:蛋白胨0.1-10g/L,酵母膏0.1-10g/L,葡萄糖0.1-10g/L,磷酸氢二钠0.1-10g/L,pH=7.5-8.0,121℃灭菌30min;接种后,于30℃,200rpm摇床培养48h;
(3)二级种子培养:培养基配方:蛋白胨0.1-10g/L,酵母膏0.1-10g/L,葡萄糖0.1-10g/L,磷酸氢二钠0.1-10g/L,pH=7.5-8.0,121℃灭菌30min;将一级种子液按体积比10%接种至二级种子培养基,接种后,于30℃,200rpm摇床培养48h。
在本发明的一些具体实施例中,所述步骤(2)中转化培养基的配方包括以质量百分比计的以下成分:玉米浆1-6%,硝酸钠0.1-0.6%,磷酸氢二铵 0.01-0.08%,PPE 0.1-0.2%,麦角固醇醚化物1-10%,羟丙基环糊精0.1-5%, pH=7.5-8.0。
进一步地,若步骤(2)中使用上述转化培养基,则步骤(3)中的提取方法具体为:转化结束后将发酵产物静置2h分层,上层菌液加入氯仿常温搅拌萃取30min,静置,分出下层氯仿层,减压浓缩至干,下层固体抽滤干,收集滤饼,滤液用氯仿萃取,合并得固体产物。
优选地,上述转化培养基中的麦角固醇醚化物粉碎至200目。
在本发明的另一些具体实施例中,所述步骤(2)中转化培养基的配方包括以质量百分比计的以下成分:玉米浆1-6%,硝酸钠0.1-0.6%,磷酸氢二铵 0.01-0.08%,PPE0.1-0.2%,麦角固醇醚化物1-10%,大豆油6-16%,pH=7.5-8.0。
进一步地,若步骤(2)中使用上述转化培养基,则步骤(3)中的提取方法具体为:转化结束后将发酵产物加热到80℃,静置1h分层,上层油相降至常温后使用甲醇萃取3次,每次使用3L甲醇;提取完毕,减压浓缩后加水,再次减压浓缩,带干水分后抽滤,得固体产物。
进一步地,所述步骤(2)中的生长细胞转化具体为:按所述配方配制转化培养基,121℃灭菌30min,冷却至室温,于无菌条件下接种1-20%B-NRRL 3683 诱变菌种二级种子液,于28-32℃,空气流量0.1-1.0vvm,罐压0.01-0.1MPa条件下转化。
步骤(4)的水解反应为常规实验,其过程可为:将抽滤及减压浓缩得到的固体产物用乙酸乙酯溶解,搅拌1h,抽滤,合并滤液,45℃减压浓缩至无馏分,加入2-5倍体积的质量分数为5-20%的盐酸,升温至60℃,水解1-2h。
步骤(5)的精制提纯方法为常规实验。精制提纯的方法可为:将水解得到的滤饼70℃烘干,使用10倍甲醇(相对于最初麦角固醇的投量,单位g/ml或 kg/L)溶解,抽滤,滤液减压浓缩至小体积,降温至4℃左右,抽滤,烘干。得到的产品加入石油醚,70℃回流打浆2-3h,降至25℃,过滤得类白色固体,烘干,加入20倍甲醇,升温至70℃溶解,减压浓缩至糊状,缓慢降温到0-4℃,养晶2小时,抽滤,烘干,得类白色晶体。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)通过3位羟基保护、将菌株B-NRRL 3683进行特异性诱变得到诱变菌株,再发酵麦角固醇醚化物,能够对17位侧链进行专一性切除,而不对3位羟基进行切除。同时对3位羟基进行保护后,产物的极性变小,其在植物油中的溶解度变大,有利于发酵反应的进行,增大发酵反应的效率和产品收率。底物麦角固醇粉碎后进行转化同样有利于提高发酵速度。
(2)本发明提供了一种从麦角固醇制备中间体3β-羟基雄甾-5,7-二烯-17- 酮的新的路径。该甾体药物中间体的制备方法成本较低,相对于常规需要经过多步合成步骤的化学制备方法,本发明的路线更短,省掉了许多反应步骤和后处理步骤,反应路线的缩短也有利于反应收率的提高,减少中间损耗。本发明采取3位羟基保护的步骤在前,生长细胞生物发酵反应在后,直接加大了发酵底物在发酵液中的溶解度,有利于发酵的进行,可提高产物的收率,减少杂质的产生。本发明的制备方法还能减少化学试剂的使用,有利于环境保护。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所使用的材料均可自常规途径购买得到。
实施例1菌种诱变
出发菌种:Mycobacterium sp.B-NRRL 3683
(1)菌种培养:
固体斜面培养基:M1+2%琼脂。
液体种子培养基:M1。
在固体斜面培养基中培养菌株B-NRRL 3683,接一环生长良好的斜面种子在装有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中活化,30℃,200rpm摇床振荡培养48h;取活化好的一级液体种子10ml,接入装有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中进行二级种子培养,30℃,200rpm摇床振荡培养48h。
(2)菌悬液制备
将生长好的二级种子装入10ml离心管中10000rpm离心5min,弃上清液,收集菌体,用ph6.0的磷酸钾缓冲液离心洗涤两次,再用无菌磷酸钾缓冲溶液 (pH6.0)制成菌悬液,并将浓度稀释至108-109个/ml。
(3)亚硝基胍(NTG)诱变处理
取上述菌悬液2ml,0.1mol/L亚硝基胍溶液1ml,0.2mol/Lph6.0的磷酸钾缓冲液2ml,加入离心管中,充分混匀,立即置于30℃水浴分别振荡(避光条件下)处理25-35分钟后,离心收集菌体,用PBS冲洗3次以去除NTG残留,最后向离心管中加入5ml无菌生理盐水,摇匀后取出一定的菌悬液,用生理盐水稀释至一定浓度备用。取100ul上述菌悬液涂布到固体平板培养基上,30℃避光培养,并计算致死率。
致死率=(0s时的菌落数-不同诱变时间的菌落数)/0s时的菌落数*100%
经计算得出,25-35分钟平均致死率分别为:65.2%、82.1%、91.7%。当致死率在80%时,细菌诱变效果最好,30min为最佳处理时间。
将30min作为试验中最佳诱变时间,按上述方法对出发菌株的菌悬液进行诱变处理,在1200个单菌落中选出8个生长良好的单菌落,用筛选出的8支突变菌株和出发菌株进行麦角固醇发酵,并检测3β-羟基雄甾-5,7-二烯-17-酮产量,得到目标诱变菌种。
实施例2种子培养
菌种名称:Mycobacterium sp.B-NRRL 3683诱变菌种
(1)斜面培养
配方:蛋白胨0.1-10g/L,酵母膏0.1-10g/L,葡萄糖0.1-10g/L,磷酸氢二钠 0.1-10g/L,,琼脂20g/L,pH=7.5-8.0。
121℃灭菌30min。凝固成型后,在无菌条件下接种。
接种后,30℃培养4d,入4℃冰箱保存,保存时间不超过1个月。
(2)摇瓶种子培养
配方:蛋白胨0.1-10g/L,酵母膏0.1-10g/L,葡萄糖0.1-10g/L,磷酸氢二钠 0.1-10g/L,pH=7.5-8.0。
121℃灭菌30min。冷却至室温。
1.一级种子培养
在无菌条件下接种,接种量:每100ml刮取1环。接种后,30℃,200rpm 摇床培养48h。
2.二级种子培养
在无菌条件下接种,接种量:10%。接种后,30℃,200rpm摇床培养48h。
实施例3麦角固醇3位醚化保护
物料配比:甲缩醛1500g,麦角固醇100g,硅藻土100g,五氧化二磷50g,碳酸钠4g(配成1%水溶液使用),水200g。
反应瓶中按比例投入麦角固醇和甲缩醛,升温到25℃,搅拌至完全溶清,加入硅藻土,再缓慢加入五氧化二磷,加入过程中控制温度不超过30℃,25℃左右搅拌1-1.5小时,薄层色谱检测反应完全,升温至30℃以上,趁热过滤,滤饼和反应瓶用少量水洗,50℃烘干。得淡黄色固体,在烘箱中于40-50℃烘干至恒重,重量122g,即得到所述麦角固醇醚化物粗品。
得到的醚化物粗品,加入2倍体积的丙酮,升温至50-60℃,搅拌回流30min,冷却至-10℃,抽滤,滤饼使用-10℃丙酮淋洗,滤饼40-50℃烘干至恒重,收白色粉末100g,即得到所述麦角固醇醚化物。
3位醚化保护的反应式如下所示:
实施例4发酵转化
(1)按照实施例2进行种子培养;
(2)按照实施例3进行底物制备;
物料配比:甲缩醛1500g,麦角固醇100g,硅藻土100g,五氧化二磷50g,碳酸钠4g(配成1%水溶液使用),水200g。
(3)10L罐发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积:6L。接种后体积:6L。
转化培养基配方:玉米浆1%,硝酸钠0.1%,磷酸氢二铵0.01%,PPE 0.1%, 200目麦角固醇醚化物1%,羟丙基环糊精0.1%,pH=7.5-8.0。
121℃灭菌30min,冷却至室温,于无菌条件下接种,接种量:20%。
转化条件:30℃,200rpm,空气流量0.1vvm,罐压0.05MPa,转化时间88h, TLC点板监控转化情况,待转化完毕。
生物转化的反应式如下所示:
(4)提取
转化结束,停搅拌,静置分层2h。
上层菌液抽入烧杯中,加入500ml氯仿,常温搅拌萃取30min,静置8h以上,分出下层氯仿层,减压浓缩至干。
下层固体抽滤干,滤出液与上层分出的水相合并处理。
(5)水解
物料配比:乙酸乙酯1L,5%盐酸1.5L。
抽滤及减压浓缩得到的固体产物在用乙酸乙酯溶解,搅拌1h,抽滤,滤饼淋洗,作为固废,合并滤液,45℃减压浓缩至无馏分,加入5%盐酸,升温至60℃,水解1-2h,HPLC跟踪至反应完全,抽滤,弃滤液,收集滤饼。
水解反应的反应式如下所示:
(6)精制工序
物料配比:甲醇3L,石油醚0.5L。
水解得到的滤饼70℃烘干,使用甲醇1L溶解,抽滤,滤液减压浓缩至小体积,降温至4℃左右,抽滤,烘干。得到的产品加入石油醚,70℃回流打浆2-3h,降至25℃,过滤得类白色固体,烘干,加入2L甲醇,升温至70℃溶解,减压浓缩至糊状,缓慢降温到0-4℃,养晶2h,抽滤,烘干,得产物精品20.3g,液相归一含量:98.52%。
实施例5发酵转化
(1)按照实施例2进行种子培养;
(2)按照实施例3进行底物制备;
物料配比:甲缩醛2200g,麦角固醇200g,硅藻土300g,五氧化二磷200g,碳酸钠9g(配成1%水溶液使用),水400g。
(3)10L罐发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积:6L。接种后体积:6L。
转化培养基配方:玉米浆3%,硝酸钠0.3%,磷酸氢二铵0.04%,PPE 0.2%, 200目麦角固醇醚化物2%,羟丙基环糊精1%,pH=7.5-8.0。
121℃灭菌30min,冷却至室温,于无菌条件下接种,接种量:10%。
转化条件:30℃,200rpm,空气流量0.5vvm,罐压0.01MPa,转化时间120h, TLC点板监控转化情况,待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理,提取步骤使用的氯仿的量与实施例4相同,其他相关试剂用量为实施例4用量的2倍,得产物41.8g,液相归一含量:98.29%。
实施例6发酵转化
(1)按照实施例2进行种子培养;
(2)按照实施例3进行底物制备;
物料配比:甲缩醛20000g,麦角固醇1000g,硅藻土1300g,五氧化二磷 1500g,碳酸钠50g(配成1%水溶液使用),水2000g。
(3)10L罐发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积:6L。接种后体积:6L。
转化培养基配方:玉米浆6%,硝酸钠0.6%,磷酸氢二铵0.08%,PPE 0.2%, 200目麦角固醇醚化物10%,羟丙基环糊精5%,pH=7.5-8.0。
121℃灭菌30min,冷却至室温,于无菌条件下接种,接种量:15%。
转化条件:32℃,200rpm,空气流量1vvm,罐压0.1MPa,转化时间144h, TLC点板监控转化情况,待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理,提取步骤使用的氯仿的量与实施例4相同,其他相关试剂用量为实施例4用量的10倍,得产物204.7g,液相归一含量:98.10%。
实施例7发酵转化
(1)按照实施例2进行种子培养;
(2)按照实施例3进行底物制备;
物料配比:甲缩醛1400g,麦角固醇200g,硅藻土200g,五氧化二磷100g,碳酸钠8g(配成1%水溶液使用),水400g。
(3)10L罐发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积:6L。接种后体积:6L。
转化培养基配方:玉米浆1%,硝酸钠0.1%,磷酸氢二铵0.06%,PPE 0.1%,麦角固醇醚化物2%,大豆油6%,pH=7.5-8.0。
121℃灭菌30分钟min,冷却至室温,于无菌条件下接种,接种量:20%。
转化条件:30℃,200rpm,空气流量0.1vvm,罐压0.05MPa,转化时间120h, TLC点板监控转化情况,待转化完毕。
(4)提取
转化结束,加热到80℃,静置1h,分出上层油相,油相降温至常温,使用甲醇萃取三次,每次使用3L甲醇。提取完毕,减压浓缩至小体积,加入适量水,继续减压浓缩,带干其中的水分,抽滤,得黄色固体。
(5)水解
物料配比:乙酸乙酯1L,5%盐酸1.5L。
抽滤得到的固体产物在烧杯中用乙酸乙酯萃取,搅拌1h,抽滤,滤饼淋洗,作为固废,合并滤液,45℃减压浓缩至无馏分,加入5%盐酸,升温至60℃,水解1-2h,HPLC跟踪至反应完全,抽滤,弃滤液,收集滤饼。
(6)精制
物料配比:甲醇3L,石油醚0.5L。
水解得到的滤饼70℃烘干,使用甲醇1L溶解,抽滤,滤液减压浓缩至小体积,降温至4℃左右,抽滤,烘干。得到的产品加入石油醚,70℃回流打浆2-3h,降至25℃,过滤淡黄色固体,烘干,加入2L甲醇,升温至60℃溶解,降温至 40℃,过滤,滤饼淋洗,滤液减压浓缩至糊状,缓慢降温到0-4℃,养晶2h,抽滤,烘干,得产物精品42.5g,液相归一含量:98.17%。
实施例8
(1)按照实例2进行种子培养;
(2)按照实例3进行底物制备;
物料配比:甲缩醛1500g,麦角固醇100g,硅藻土130g,五氧化二磷140g,碳酸钠4.5g(配成1%水溶液使用),水200g。
(3)10L罐发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积:6L。接种后体积:6L。
转化培养基配方:玉米浆5%,硝酸钠0.5%,磷酸氢二铵0.01%,PPE 0.2%,麦角固醇醚化物1%,大豆油8%,pH=7.5-8.0。
121℃灭菌30min,冷却至室温,于无菌条件下接种,接种量:1%。
转化条件:28℃,200rpm,空气流量0.5vvm,罐压0.01MPa,转化时间144h, TLC点板监控转化情况,待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例7提取、水解及精制方法进行后处理,提取步骤使用的甲醇的量与实施例7相同,其他相关试剂用量为实施例7用量的0.5倍,得产物22.4g,液相归一含量:99.15%。
实施例9
(1)按照实例2进行种子培养;
(2)按照实例3进行底物制备;
物料配比:甲缩醛3000g,麦角固醇1000g,硅藻土1000g,五氧化二磷500g,碳酸钠50g(配成1%水溶液使用),水2000g。
(3)10L罐发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积:6L。接种后体积:6L。
转化培养基配方:玉米浆6%,硝酸钠0.6%,磷酸氢二铵0.08%,PPE 0.2%,麦角固醇醚化物10%,大豆油16%,pH=7.5-8.0。
121℃灭菌30min,冷却至室温,于无菌条件下接种,接种量:5%。
转化条件:32℃,200rpm,空气流量1vvm,罐压0.1MPa,转化时间180h, TLC点板监控转化情况,待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例7提取、水解及精制方法进行后处理,提取步骤使用的甲醇的量与实施例7相同,其他相关试剂用量为实施例7用量的5倍,得产物210.1g,液相归一含量:98.03%。
Claims (10)
1.采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法,其特征在于,所述中间体为3β-羟基雄甾-5,7-二烯-17-酮,所述制备方法包括以下步骤:
(1)3位保护:利用甲缩醛作为保护剂,将麦角固醇的3位羟基进行保护,得到麦角固醇醚化物,反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂;
(2)生长细胞转化:将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683诱变菌种经过斜面培养和种子培养后接种至转化培养基中,对所述麦角固醇醚化物进行发酵转化;所述B-NRRL 3683诱变菌种的制备方法为:以分枝杆菌B-NRRL3683为出发菌种,经过斜面培养和二级种子培养,收集菌体制备菌悬液,加入亚硝基胍进行诱变处理,将诱变后的菌悬液稀释后涂布于固体平板培养基上,挑选单菌落进行麦角固醇发酵,并检测3β-羟基雄甾-5,7-二烯-17-酮产量,得到能产生该中间体的目标诱变菌种;
(3)提取:转化结束后对步骤(2)所得的发酵产物进行提取,得到固体产物;
(4)水解:将步骤(3)所得的固体产物用乙酸乙酯溶解,搅拌后抽滤,合并滤液,减压浓缩后加入盐酸进行水解;
(5)精制:将步骤(4)所得的水解产物进行精制提纯。
2.根据权利要求1所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法,其特征在于,所述步骤(1)中甲缩醛与麦角固醇的质量比为3-20:1。
3.根据权利要求1所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法,其特征在于,所述步骤(2)中B-NRRL 3683诱变菌种的制备方法具体为:
a.以分枝杆菌B-NRRL 3683为出发菌种,在加入2%质量比琼脂的M1固体培养基中斜面培养,将斜面种子接种于M1液体种子培养基中活化,30℃,200rpm摇床振荡培养48h;取活化好的一级种子按体积比10%接入新的M1液体种子培养基中进行二级种子培养,30℃,200rpm摇床振荡培养48h;
b.将生长好的二级种子10000rpm离心5min,收集菌体,用pH=6.0的磷酸钾缓冲液离心洗涤两次,再用pH=6.0的无菌磷酸钾缓冲溶液制成菌悬液,并将浓度稀释至108-109个/ml;
c.取上述菌悬液2ml,0.1mol/L亚硝基胍溶液1ml,0.2mol/L pH=6.0的磷酸钾缓冲液2ml,加入离心管中充分混匀,置于30℃水浴避光振荡处理25-35min,离心收集菌体,用PBS冲洗3次,向离心管中加入5ml无菌生理盐水,摇匀后取出一定的菌悬液,用生理盐水稀释,取100ul上述稀释菌悬液涂布于固体平板培养基上,30℃避光培养,挑选生长良好的突变菌株单菌落进行麦角固醇发酵,并检测3β-羟基雄甾-5,7-二烯-17-酮产量,得到能产生该中间体的目标诱变菌种。
4.根据权利要求1或3所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法,其特征在于,所述步骤(2)中B-NRRL 3683诱变菌种种子培养的方法包括以下步骤:
(1)斜面培养:培养基配方:蛋白胨0.1-10g/L,酵母膏0.1-10g/L,葡萄糖0.1-10g/L,磷酸氢二钠0.1-10g/L,琼脂20g/L,pH=7.5-8.0,121℃灭菌30min;接种后,30℃培养4-5d;
(2)一级种子培养:培养基配方:蛋白胨0.1-10g/L,酵母膏0.1-10g/L,葡萄糖0.1-10g/L,磷酸氢二钠0.1-10g/L,pH=7.5-8.0,121℃灭菌30min;接种后,于30℃,200rpm摇床培养48h;
(3)二级种子培养:培养基配方:蛋白胨0.1-10g/L,酵母膏0.1-10g/L,葡萄糖0.1-10g/L,磷酸氢二钠0.1-10g/L,pH=7.5-8.0,121℃灭菌30min;将一级种子液按体积比10%接种至二级种子培养基,接种后,于30℃,200rpm摇床培养48h。
5.根据权利要求1所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法,其特征在于,所述步骤(2)中转化培养基的配方包括以质量百分比计的以下成分:玉米浆1-6%,硝酸钠0.1-0.6%,磷酸氢二铵0.01-0.08%,PPE0.1-0.2%,麦角固醇醚化物1-10%,羟丙基环糊精0.1-5%,pH=7.5-8.0。
6.根据权利要求1所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法,其特征在于,所述步骤(2)中转化培养基的配方包括以质量百分比计的以下成分:玉米浆1-6%,硝酸钠0.1-0.6%,磷酸氢二铵0.01-0.08%,PPE0.1-0.2%,麦角固醇醚化物1-10%,大豆油6-16%,pH=7.5-8.0。
7.根据权利要求5所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法,其特征在于,所述麦角固醇醚化物粉碎至200目。
8.根据权利要求1所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法,其特征在于,所述步骤(2)中的生长细胞转化具体为:按所述配方配制转化培养基,121℃灭菌30min,冷却至室温,于无菌条件下接种1-20%B-NRRL 3683诱变菌种二级种子液,于28-32℃,空气流量0.1-1.0vvm,罐压0.01-0.1MPa条件下转化。
9.根据权利要求1或5所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法,其特征在于,所述步骤(3)中的提取方法具体为:转化结束后将发酵产物静置2h分层,上层菌液加入氯仿常温搅拌萃取30min,静置,分出下层氯仿层,减压浓缩至干,下层固体抽滤干,收集滤饼,滤液用氯仿萃取,合并得固体产物。
10.根据权利要求1或6所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法,其特征在于,所述步骤(3)中的提取方法具体为:转化结束后将发酵产物加热到80℃,静置1h分层,上层油相降至常温后使用甲醇萃取3次,每次使用3L甲醇;提取完毕,减压浓缩后加水,再次减压浓缩,带干水分后抽滤,得固体产物。
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