BR112020003854A2 - aditivo de ração animal, formulação líquida, ração animal, métodos para melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho de um animal, para preparação de uma ração animal, para o tratamento de proteínas, para aumento da digestibilidade e/ou solubilidade de proteína, para melhoria do valor nutricional de uma ração animal, para produção de um polipeptídeo, e, uso do aditivo de ração animal e da formulação líquida. - Google Patents

aditivo de ração animal, formulação líquida, ração animal, métodos para melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho de um animal, para preparação de uma ração animal, para o tratamento de proteínas, para aumento da digestibilidade e/ou solubilidade de proteína, para melhoria do valor nutricional de uma ração animal, para produção de um polipeptídeo, e, uso do aditivo de ração animal e da formulação líquida. Download PDF

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seq
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animal feed
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protease
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Laerke Tvedebrink Haahr
Tine Hoff
Peter Rahbek Oestergaard
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Novozymes A/S
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Abstract

A presente invenção se relaciona com ração animal ou aditivos de ração animal compreendendo polipeptídeos tendo atividade de protease e seus usos. Se relaciona também com os métodos para produção das proteases e para uso das proteases para melhorar o desempenho animal e o valor nutricional de uma ração animal.

Description

1 / 175 ADITIVO DE RAÇÃO ANIMAL, FORMULAÇÃO LÍQUIDA, RAÇÃO ANIMAL, MÉTODOS PARA MELHORIA DE UM OU MAIS PARÂMETROS DE DESEMPENHO DE UM ANIMAL, PARA PREPARAÇÃO DE UMA RAÇÃO ANIMAL, PARA O TRATAMENTO DE PROTEÍNAS, PARA AUMENTO DA DIGESTIBILIDADE E/OU SOLUBILIDADE DE PROTEÍNA, PARA MELHORIA DO VALOR NUTRICIONAL DE UMA RAÇÃO ANIMAL, PARA PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, E, USO DO ADITIVO DE RAÇÃO ANIMAL E DA
FORMULAÇÃO LÍQUIDA REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada aqui por referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção
[002] A presente invenção se relaciona com ração animal ou aditivos de ração animal compreendendo polipeptídeos tendo atividade de protease e seus usos. Se relaciona também com os métodos para produção das proteases e para uso das proteases para melhorar o desempenho animal e o valor nutricional de uma ração animal. Antecedentes da Invenção
[003] No uso de proteases em ração animal (in vivo) e/ou no uso de tais proteases para tratamento de proteínas vegetais (in vitro) se notou que as proteínas são fatores nutricionais essenciais para animais e humanos. A maioria do gado e muitos seres humanos adquirem as proteínas necessárias a partir de fontes de proteínas vegetais. Fontes de proteínas vegetais importantes são, por exemplo, culturas oleaginosas, leguminosas e cereais.
[004] Quando uma fonte de proteína tal como farelo de soja é incluída na ração de animais monogástricos tais como porcos e aves domésticas, uma proporção significativa do farelo de soja não é digerida
2 / 175 eficientemente (a digestibilidade de nitrogênio ileal aparente em leitões, porcos em crescimento e aves domésticas tais como frangos de corte, galinhas poedeiras e galos é somente em torno de 80%). Por melhoria da digestibilidade de proteína, o animal pode ingerir mais da proteína melhorando deste modo o desempenho, tal como ganho de peso corporal aumentado.
[005] O trato gastrointestinal de animais consiste em uma série de segmentos, cada um representando diferentes ambientes de pH. Em animais monogástricos tais como porcos e aves domésticas e muitos tipos de peixes, o estômago é fortemente ácido com um pH potencialmente tão baixo quanto 2- 3, enquanto o intestino tem um pH mais neutro em torno de 6-7,5. Para além do estômago e intestino, as aves domésticas têm também um papo precedendo o estômago. O pH do papo é maioritariamente determinado pela ração ingerida e consequentemente reside tipicamente na gama de pH 4-6. A digestão de proteínas por uma protease pode ocorrer ao longo de todo o trato digestivo, desde que a protease esteja ativa e sobreviva às condições do trato digestivo. Consequentemente, proteases que sejam altamente estáveis que consigam sobreviver no ambiente gástrico e ao mesmo tempo sejam eficazmente ativas na ampla gama de pH fisiológico do trato digestivo no animal alvo são especialmente desejáveis.
[006] Um modo de se determinar se uma protease pode melhorar a ingestão de proteína é por investigação se a digestibilidade de nitrogênio ileal é melhorada quando a protease é adicionada à dieta animal. A execução de ensaios in vivo pode tanto confirmar a estabilidade gástrica da protease bem como a eficácia da protease na degradação da proteína. É um objetivo da presente invenção proporcionar proteases que mostrem desempenho de crescimento melhorado aumentado, tal como por digestibilidade de nitrogênio ileal aparente.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
3 / 175
[007] A invenção se relaciona com um aditivo de ração animal compreendendo um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease, em que o polipeptídeo é uma protease S8 selecionada do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3; (d) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos
4 / 175
88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 5; (f) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 9; (j) uma variante de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem
5 / 175 atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (k) uma variante de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (l) uma variante de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (m) uma variante de SEQ ID NO: 5, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (n) uma variante de SEQ ID NO: 6, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições;
6 / 175 (o) uma variante de SEQ ID NO: 7, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (p) uma variante de SEQ ID NO: 8, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (q) uma variante de SEQ ID NO: 9, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (r) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), ou (i) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N- terminal e/ou C-terminal; (s) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), ou (i) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos; e (t) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), ou (i) tendo atividade de protease e tendo pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.
[008] A invenção se relaciona adicionalmente com ração animal e formulação líquida compreendendo o aditivo de ração animal; métodos de
7 / 175 melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho de um animal; métodos de preparação de uma ração animal; métodos para o tratamento de proteínas; métodos para aumento da digestibilidade e/ou solubilidade de proteína e métodos para melhoria do valor nutricional de uma ração animal usando o aditivo de ração animal e seus usos. A presente invenção se relaciona adicionalmente com métodos de produção de um polipeptídeo da invenção em uma célula hospedeira de Bacillus recombinante.
[009] A invenção se relaciona adicionalmente com um uso da invenção do aditivo de ração animal ou da formulação líquida na preparação de uma composição para uso em ração animal; para melhoria do valor nutricional de uma ração animal; para aumento da proteína digerível e/ou solúvel em ração animal; para aumento do grau de hidrólise de proteínas em dietas animais; para melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho em um animal; e/ou para o tratamento de proteínas.
VISÃO GERAL DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0010] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos da protease S8 madura de Bacillus horneckiae.
[0011] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos da protease S8 madura de Bacillus sp. TY145.
[0012] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos de uma protease S8 variante de Bacillus sp. TY145.
[0013] SEQ ID NO: 4 é o motivo conservado TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG.
[0014] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos da protease S8 madura de Bacillus sp. 13380 (também divulgada em WO2017064253) e tem aproximadamente 78% de identidade com SEQ ID NO: 1
[0015] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos da protease S8 madura de Bacillus idriensis (também divulgada em WO2015091989) e tem 80% de identidade com SEQ ID NO: 1.
8 / 175
[0016] SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácidos da protease S8 madura de Bacillus sp. 13380 (também divulgada em WO2015091989) e tem 89% de identidade com SEQ ID NO: 1.
[0017] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos da protease S8 madura de Bacillus sp. 62451 (também divulgada em WO2015091989) e tem 90% de identidade com SEQ ID NO: 1.
[0018] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos da protease S8 madura de Bacillus oceanisediminis e tem 87% de identidade com SEQ ID NO: 1.
[0019] SEQ ID NO:10 A sequência de DNA codificando as proteases S8 de Bacillus oceanisediminis
DEFINIÇÕES
[0020] Atividade do polipeptídeo em farelo de soja-maís: O termo “atividade do polipeptídeo em farelo de soja-maís” significa que a atividade de protease da enzima foi determinada em farelo de soja-farelo de maís misturados em uma razão de 30:70 usando o ensaio de o-Ftaldialdeído (OPA) como descrito aqui. Exemplos de valores de pH de ensaio são pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 e 7,0. Exemplos de temperaturas de ensaio são 30, 35, 40, 45 e 50 °C. Exemplos de tempos de ensaio são 2, 3 e 4 horas. Exemplos de concentrações de enzima são 50, 100, 150, 200, 250 e 300 mg de proteína de enzima/kg de matéria seca de substrato.
[0021] Em uma modalidade preferencial, a atividade do polipeptídeo em farelo de soja-maís foi determinada por adição de farelo de soja-farelo de maís misturados em uma razão de 30:70 (2 g) a tampões contendo ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CAPS a 100 mM, CaCl2 a 12,5 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01% (10 mL) que haviam sido preparados e ajustados usando HCl ou NaOH até um valor de pH tal que, após o substrato de farelo de soja-maís ter sido misturado com tampão do ensaio, o pH final da pasta fosse pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 ou 7,0; depois, mistura
9 / 175 de uma alíquota da pasta de substrato (2 mL) durante 30 min a 40 ºC; adição de protease (200 mg de proteína de enzima/kg de substrato) dissolvida em 100 μL de tampão de acetato de sódio a 100 mM (NaOAc a 9,565 g/L, ácido acético a 1,75 g/L, CaCl2 a 5 mM, BSA a 0,01%, Tween20 a 0,01%, pH 6,0); incubação das amostras durante 3 horas a 40 °C (agitação magnética); centrifugação das amostras (10 min., 4000 rpm, 0 °C); e coleta dos sobrenadantes para análise usando o ensaio de o-Ftaldialdeído (OPA) (aqui chamado “ensaio de farelo de soja-maís”). Em outra modalidade preferencial, a atividade do polipeptídeo em farelo de soja-maís é determinada como descrito no exemplo 4 aqui.
[0022] Em uma modalidade, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou, pelo menos 100% de atividade em farelo de soja-maís a pH 4 que o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.
[0023] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.
[0024] Animal: O termo “ração animal” se refere a todos os animais exceto humanos. Exemplos de animais são não ruminantes e ruminantes. Os animais ruminantes incluem, por exemplo, animais tais como ovelhas, cabras, gado, por exemplo, gado de corte, vacas e bezerros, cervo, iaque, camelo, lhama e canguru. Os animais não ruminantes incluem animais monogástricos, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas não se limitando a, leitões, porcos em fase de crescimento e porcas); aves domésticas tais como perus,
10 / 175 patos e galinhas (incluindo mas não se limitando a frangos de corte, galinhas poedeiras); cavalos (incluindo mas não se limitando a de sangue quente, de sangue frio e sangues mistos), bezerros jovens; peixe (incluindo mas não se limitando a olho de boi, pirarucu, barbo, robalo, anchova, bagre pintado, dourado, caboz, tambaqui, carpa, bagre, catla, peixe-leite, truta-de-lago, ciclídeo, cobia, bacalhau, crappie, dourada, miraguaia, enguia, gobi, peixinho-dourado, gourami, garoupa, ciclídeo lobo, halibute, java, labeo, lai, peixe cobrinha, sarda, peixe-leite, sagro, peixe pulmonado que se enterra na lama, tainha, paco, mexirica listrada, peixe-rei, perca, peixe pike, peixe pompano, pardelha-dos-Alpes, salmão, peixe-gato gitante, sauger, robalo, dourada, peixe-gato, sleeper, cabeça-de-cobra, pargo, falso-robalo, linguado, macua, esturjão, peixe-lua, ayu, tenca, terror, tilápia, truta, atum, pregado, coregono-branco, picão-verde e coregono); e crustáceos (incluindo mas não se limitando a camarões e pitus).
[0025] Ração animal: O termo “ração animal” se refere a qualquer composto, preparação ou mistura adequada para, ou destinada à ingestão por, um animal. A ração animal para um animal monogástrico compreende tipicamente concentrados bem como vitaminas, minerais, enzimas, alimento direto microbiano, aminoácidos e/ou outros ingredientes de ração (tais como em uma pré-mistura), enquanto a ração animal para os ruminantes compreende geralmente forragem (incluindo alimento grosseiro e silagem) e pode adicionalmente compreender concentrados bem como vitaminas, minerais, enzimas, alimento direto microbiano, aminoácido e/ou outros ingredientes de ração (tais como em uma pré-mistura).
[0026] Ganho de Peso Corporal: O termo “ganho de peso corporal” significa um aumento no peso vivo de um animal durante um dado período de tempo, por exemplo, o aumento no peso do dia 1 ao dia 21.
[0027] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa a partir de uma molécula de
11 / 175 mRNA, processada, madura, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA processado maduro.
[0028] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinados por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma sua combinação.
[0029] Composição: O termo “composição” se refere a uma composição compreendendo um transportador e pelo menos uma enzima da presente invenção. As composições descritas aqui podem ser misturadas com uma ração animal e referidas como uma “ração em purê”.
[0030] Concentrados: O termo “concentrados” significa ração com elevadas concentrações de proteína e energia, tal como farelo de peixe, melaços, oligossacarídeos, sorgo, sementes e grãos (inteiros ou preparados por esmagamento, moagem, etc. de, por exemplo, milho, aveia, centeio, cevada, trigo), bagaço oleaginoso (por exemplo, de semente de algodão, cártamo, girassol, soja, colza/canola, amendoim ou noz), bagaço de palmiste, material derivado de levedura e grãos de destilação (tais como grãos destilados úmidos (WDS) e grãos secos destilados com solúveis (DDGS)).
[0031] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa sequências de ácidos nucleicos necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (i.e., do mesmo gene) ou estranha
12 / 175 (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró- peptídeo, promotor, sequência de peptídeo-sinal e terminador da transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de paragem transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando ligação das sequências de controle com a região codificante do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo.
[0032] Fator de Eficácia de Produção Europeu (EPEF): O termo “Fator de Eficácia de Produção Europeu” é um termo que determina a eficiência de produção e tem em consideração a conversão de ração, mortalidade e ganho diário. O EEF é calculado como [(taxa de sobrevivência (%) x ganho de peso corporal (kg))/(Duração do estudo em dias x FCR)] x
100.
[0033] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer passo envolvido na produção de um polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional e secreção.
[0034] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam sua expressão.
[0035] Razão de Conversão de Ração: O termo “razão de conversão de ração” significa a quantidade de ração alimentada a um animal para aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada. Uma razão de conversão de ração melhorada significa uma razão de conversão de ração mais baixa. Por “taxa de conversão de ração inferior” ou “taxa de conversão de ração melhorada” se entende que o uso de uma composição de aditivo de
13 / 175 ração em ração resulta em uma quantidade menor de ração sendo requerida para ser alimentada a um animal para aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada em comparação com a quantidade de ração requerida para aumentar o peso do animal na mesma quantidade quando a ração não compreende a referida composição de aditivo de ração.
[0036] Eficiência de ração: O termo “eficiência de ração” significa a quantidade de ganho de peso por unidade de ração quando o animal é alimentado ad libitum ou uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo. Por “eficiência de ração aumentada” se entende que o uso de uma composição de aditivo de reação de acordo com a presente invenção em ração resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de ingestão de ração em comparação com um animal alimentado sem que a referida composição de aditivo de ração esteja presente.
[0037] Forragem: O termo “forragem” como definido aqui, inclui também alimento grosseiro. A forragem é material vegetal fresco tal como feno e silagem de plantas de forragem, grama e outras plantas de forragem, alga marinha, grãos germinados e leguminosas ou qualquer sua combinação. Exemplos de plantas forrageiras são Alfalfa (luzerna), cornichão, brássica (por exemplo, couve, colza (canola), rutabaga (couve-nabo), nabo), trevo (por exemplo, trevo híbrido, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco), grama (por exemplo, grama Bermuda, bromus, aveia-perene, festuca, grama verde, poa, capim dos pomares, azevém, erva-dos-prados), milho (maís), milhete, cevada, aveia, centeio, sorgo, grãos de soja e trigo e legumes e hortaliças tais como beterrabas. Forragem inclui adicionalmente resíduos de cultura da produção de grãos (tais como palha de milho; palha de trigo, cevada, aveia, centeio e outros grãos); resíduos de legumes e hortaliças como folhas de beterraba; resíduos de produção de oleaginosas como caules e folhas de soja, colza e outras leguminosas; e frações da refinação de grãos para consumo animal ou humano ou da produção de combustível ou outras
14 / 175 indústrias.
[0038] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo tendo um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de protease.
[0039] Em um aspecto, o fragmento compreende pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro, tal como pelo menos 283 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, pelo menos 279 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 279 aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[0040] Em um aspecto, o fragmento compreende pelo menos 92% do comprimento do polipeptídeo maduro, tal como pelo menos 290 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, pelo menos 286 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 286 aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[0041] Em um aspecto, o fragmento compreende pelo menos 94% do comprimento do polipeptídeo maduro, tal como pelo menos 295 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, pelo menos 292 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 292 aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[0042] Em um aspecto, o fragmento compreende pelo menos 96% do comprimento do polipeptídeo maduro, tal como pelo menos 301 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, pelo menos 298 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 298 aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[0043] Em um aspecto, o fragmento compreende pelo menos 98% do comprimento do polipeptídeo maduro, tal como pelo menos 308 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, pelo menos 304 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 304 aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[0044] Em um aspecto, o fragmento compreende pelo menos 99% do comprimento do polipeptídeo maduro, tal como pelo menos 311 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, pelo menos 307 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 307 aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
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[0045] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução ou similar com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.
[0046] Digestibilidade de nitrogênio ileal aparente: O termo “digestibilidade de nitrogênio ileal aparente” (ou AIDN) é a percentagem de diferença na concentração de nitrogênio entre digerido ileal e ração, quando se toma o desaparecimento aparente de matéria seca no final do intestino delgado (íleo) em consideração. A AIDN é usada como uma estimativa de digestibilidade de proteína em bruto no intestino delgado, sem tomar a liberação de proteína endógena no intestino delgado em consideração. Isto significa que a verdadeira digestibilidade de proteína em bruto é sempre maior em comparação com a AIDN. Uma AIDN aumentada está em geral correlacionada com uma absorção no intestino delgado aumentada de aminoácidos e é um marcador de desempenho melhorado em animais. A digestibilidade de nitrogênio ileal aparente (AIDN) é calculada usando a fórmula: AIDN (%) = 100 - [(CMf/CMe) x (CNe/CNf)] x 100; em que CMf = concentração de marcador na ração; CMe = concentração de marcador no digerido ileal; CNf = concentração de nutriente na ração; CNe = concentração de nutriente no digerido ileal.
[0047] O termo “melhora a digestibilidade de nitrogênio ileal em pelo menos x% (por exemplo, 4%) em comparação com controle negativo” significa que, se a percentagem de digestibilidade de nitrogênio ileal aparente
16 / 175 para o controle negativo (i.e., a mesma ração mas sem uma protease adicionada à dieta) for y% (por exemplo, 75%), então a percentagem de digestibilidade de nitrogênio ileal aparente para o grupo com a protease é pelo menos y% + x% (logo em este exemplo >79%).
[0048] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; múltiplas cópias de um gene codificando a substância; e uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância).
[0049] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 314 de SEQ ID NO: 1 com base em dados de sequenciamento N-terminal de EDMAN e dados de MS intato. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 311 de SEQ ID NO: 2 com base em dados de sequenciamento N-terminal de EDMAN e dados de MS intato. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 311 de SEQ ID NO: 3 com base em dados de sequenciamento N-terminal de EDMAN e dados de MS intato.
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[0050] É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. Também é conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos diferentemente e, assim, uma célula hospedeira expressando um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (por exemplo, tendo um aminoácido C- terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira expressando o mesmo polinucleotídeo.
[0051] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada a partir de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria de outro modo na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.
[0052] Obtido ou obtenível a partir de: O termo “obtido ou obtenível a partir de” significa que o polipeptídeo pode ser encontrado em um organismo a partir de uma classificação taxonômica específica. Em uma modalidade, o polipeptídeo é obtido ou obtenível a partir da ordem Bacillales em que o termo ordem é a classificação taxonômica. Em outra modalidade preferencial, o polipeptídeo é obtido ou obtenível a partir da família Bacillaceae, Planococcaceae ou Paenibacillaceae, em que o termo família é a classificação taxonômica. Em outra modalidade preferencial, o polipeptídeo é obtido ou obtenível a partir do gênero Bacillus, em que o termo gênero é a classificação taxonômica.
[0053] Se a classificação taxonômica de um polipeptídeo não for conhecida pode ser facilmente determinada por um perito na técnica por realização de uma pesquisa BLASTP do polipeptídeo (usando, por exemplo, o website do National Center for Biotechnology Information (NCIB) -
18 / 175 www.ncbi.nlm.nih.gov/) e sua comparação com os homólogos mais próximos. Um polipeptídeo desconhecido que é um fragmento de um polipeptídeo conhecido é considerado como sendo da mesma espécie taxonômica. Um polipeptídeo natural desconhecido ou variante artificial que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção em até 10 posições é considerado como sendo da mesma espécie taxonômica que o polipeptídeo conhecido.
[0054] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.
[0055] Pélete: Os termos “pélete” e/ou “peletização” se referem a comprimidos ou péletes arredondados, esféricos e/ou cilíndricos sólidos e aos processos para formação de tais formas sólidas, particularmente péletes de ração e ração animal extrudada sólida. Como usados aqui, os termos “extrusão” ou "extrudando” são termos bem conhecidos na técnica e se referem a um processo de forçar uma composição, como descrito aqui, a passar através de um orifício sob pressão.
[0056] Parâmetros de desempenho:: o termo "parâmetros de desempenho " significa um ou mais dos termos selecionados a partir da lista consistindo em ganho de peso corporal, Fator de Eficiência de Produção Europeu (EPEF), Fator de Eficácia de Produção Europeu (FEP) e FCR. O termo “melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho” significa que existem um aumento no ganho de peso corporal, um aumento no Fator de Eficiência de Produção Europeu (EPEF), um aumento no Fator de Eficácia de Produção Europeu (FEP) e/ou uma diminuição em FCR em um ou mais animais.
[0057] Protease: O termo “protease” é definido aqui como uma
19 / 175 enzima que hidrolisa ligações de peptídeo. Inclui qualquer enzima pertencendo ao grupo de enzimas EC 3.4 (incluindo cada uma das suas treze subclasses, en.wikipedia.org/wiki/Category:EC_3.4). O número EC se refere à Nomenclatura de Enzimas de 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo os suplementos 1-5 publicados em Eur. J. Biochem. 223: 1-5 (1994); Eur. J. Biochem. 232: 1-6 (1995); Eur. J. Biochem. 237: 1-5 (1996); Eur. J. Biochem. 250: 1-6 (1997); e Eur. J. Biochem. 264: 610-650 (1999); respectivamente. O termo “subtilases” se refere a um subgrupo de serina protease de acordo com Siezen et al., 1991, Protein Engng. 4: 719-737 e Siezen et al., 1997, Protein Science 6: 501-523. As serina proteases ou serina peptidases são um subgrupo de proteases caracterizadas por terem uma serina no local ativo, que forma um aduto covalente com o substrato. Adicionalmente, as subtilases (e as serina proteases) são caracterizadas por terem dois resíduos de aminoácidos de local ativo separados da serina, nomeadamente um resíduo de histidina e ácido aspártico. As subtilases podem ser divididas em 6 subdivisões, i.e., a família das Subtilisinas, a família das Termitases, a família das Proteinases K, a família das Peptidases lantibióticas, a família das Quexinas e a família das Pirolisinas.
[0058] Atividade de protease: O termo “atividade da protease” significa atividade proteolítica (EC 3.4). Os polipeptídeos tendo atividade de protease, ou proteases, são por vezes também designados peptidases, proteinases, peptídeo hidrolases ou enzimas proteolíticas. As proteases podem ser do tipo exo que hidrolisam peptídeos começando em qualquer uma das suas extremidades ou do tipo endo que atuam internamente em cadeias de polipeptídeos (endopeptidases). As endopeptidases mostram atividade em substratos de peptídeo N- e C-terminalmente bloqueados que são relevantes para a especificidade da protease em questão.
[0059] Existem vários tipos de atividade de protease tais como
20 / 175 proteases tipo tripsina clivando no lado do terminal carbóxi de resíduos Arg e Lys e proteases tipo quimotripsina clivando no lado do terminal carbóxi de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. As proteases da invenção são serina endopeptidases (EC 3.4.21) com um pH ótimo ligeiramente alcalino (pH ótimo 8-9,5).
[0060] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações de peptídeo relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio são do mesmo modo para serem adaptados à protease em questão. Exemplos de valores de pH do ensaio são pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12. Exemplos de temperatura do ensaio são 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, ou 95°C. Exemplos de substratos de protease gerais são caseína, albumina do soro bovino e hemoglobina. No método clássico de Anson e Mirsky é usada hemoglobina desnaturada como substrato e, após a incubação do ensaio com a protease em questão, a quantidade de hemoglobina solúvel em ácido tricloroacético é determinada como uma medição da atividade de protease (Anson e Mirsky, 1932, J. Gen. Physiol. 16: 59 e Anson, 1938, J. Gen. Physiol. 22: 79).
[0061] Para propósitos da presente invenção, a atividade de protease foi determinada usando ensaios que são descritos nos “Materiais e Métodos”, tais como o ensaio de Suc-AAPF-pNA e o ensaio de Protazyme AK. Para o ensaio de Protazyme AK, o substrato insolúvel de Protazyme AK (Caseína Reticulada com Azurina) libera uma cor azul quando incubado com a protease e a cor é determinada como uma medida da atividade de protease. Para o ensaio de Suc-AAPF-pNA, o substrato incolor de Suc-AAPF-pNA libera para-nitroanilina amarela quando incubado com a protease e a cor amarela é determinada como uma medida da atividade de protease.
[0062] Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo
21 / 175 menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e pelo menos 100% da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.
[0063] Alimento grosseiro: O termo “alimento grosseiro” significa material vegetal seco com elevados níveis de fibra, tais como fibra, farelo, cascas de sementes e grãos e resíduos de cultura (tais como palha de milho, copra, palha, joio, resíduo de beterraba-sacarina).
[0064] Identidade de Sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”.
[0065] Para propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 3.0.0 ou posterior. Foi usada a versão 6.1.0. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento – Número Total de Intervalos no Alinhamento)
[0066] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequências entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente a versão 3.0.0 ou posterior. Foi usada a
22 / 175 versão 6.1.0. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção – nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento – Número Total de Intervalos no Alinhamento)
[0067] Silagem: O termo “silagem” significa forragem fermentada, armazenada com elevada umidade que pode ser alimentada a ruminantes (animais com segunda mastigação tais como gado bovino e ovino) ou usada como uma matéria-prima para biocombustível para digestores anaeróbicos. É fermentado e armazenado em um processo chamado ensilagem, ensilamento ou silagem e é usualmente produzido a partir de grama ou culturas de cereal (por exemplo, maís, sorgo, aveia, centeio, erva-dos-prados, etc. plantas de grama forrageira) ou culturas de leguminosas como trevos/comichões, alfalfa, ervilhacas, usando a planta verde inteira (não apenas o grão). A silagem pode ser preparada a partir de muitas culturas, e termos especiais podem ser usados dependendo do tipo (oatlage para aveia, haylage para alfafa). A silagem é preparada por colocação de vegetação verde cortada em um silo, por seu empilhamento em um grande monte coberto com folha de plástico ou por embalamento de grandes fardos em filme de plástico.
[0068] Polipeptídeo substancialmente puro: O termo “polipeptídeo substancialmente puro” significa uma preparação que contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1% e no máximo 0,5% em peso de outro material de polipeptídeo ao qual está nativamente ou recombinantemente associado. Preferencialmente, o polipeptídeo é pelo menos 92% puro, por exemplo, pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro,
23 / 175 pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puro, pelo menos 99,5% puro e 100% puro em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por preparação do polipeptídeo por métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.
[0069] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade de protease compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção e/ou deleção de um ou mais (vários) resíduos de aminoácidos em uma ou mais (várias) posições. Uma substituição significa uma substituição de um aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção de um aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de 1-3 aminoácidos adjacentes a um aminoácido ocupando uma posição. As variantes da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de protease de SEQ ID NO: 1. Nomenclatura
[0070] Para propósitos da presente invenção, a nomenclatura [E/Q] significa que o aminoácido em esta posição pode ser um ácido glutâmico (Glu, E) ou uma glutamina (Gln, Q). Do mesmo modo, a nomenclatura [V/G/A/I] significa que o aminoácido em esta posição pode ser uma valina (Val, V), glicina (Gly, G), alanina (Ala, A) ou isoleucina (Ile, I) e assim por diante para outras combinações como descrito aqui. A não ser que de outro modo limitado adicionalmente, o aminoácido X é definido tal que possa ser qualquer um dos 20 aminoácidos naturais.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Aditivos de Ração Animal Compreendendo Polipeptídeos Tendo Atividade de Protease
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[0071] As proteases funcionam por degradação de proteína em fragmentos mais pequenos que são mais facilmente digeridos e utilizados pelo animal. As dietas animais compreendem maioritariamente uma fonte de carboidratos (por exemplo, maís, trigo, centeio) e uma fonte de proteína (tipicamente farelo de soja) que são depois suplementadas com uma pequena quantidade de gordura e uma pré-mistura contendo, por exemplo, vitaminas e minerais. A protease ajudará maioritariamente a digerir a fonte de proteína e um modo de medir esta utilização é determinar a digestibilidade de nitrogênio ileal em um animal, tal como frangos de corte. Quanto mais elevada a digestibilidade de nitrogênio ileal, melhor a proteína foi degradada o que levaria tipicamente a ganho de peso corporal e FCR melhorados no animal.
[0072] De modo a se determinar se a proteína melhorou de fato a digestibilidade de nitrogênio ileal é desejável executar o ensaio in vivo com um controle tanto positivo como negativo. A enzima é adicionada em cima do controle negativo enquanto o controle positivo troca algum do farelo de soja por uma fonte de proteína mais digerível, tal como concentrado de proteína de soja. O PC mostrará normalmente uma digestibilidade de nitrogênio ileal melhorada em comparação com o NC, embora, se o teor de proteína no NC for altamente digerível, então a diferença pode ser deveras pequena. No entanto, as proteases de interesse, tais como aquelas da presente invenção, mostrarão uma digestibilidade de nitrogênio ileal melhorada em comparação com NC e preferencialmente também PC.
[0073] Assim, em um primeiro aspecto, a invenção se relaciona com um aditivo de ração animal compreendendo um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease, em que o polipeptídeo é uma protease S8 e tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de
25 / 175 identidade de sequências com SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, os polipeptídeos diferem em até 50 aminoácidos, por exemplo, entre 1 e 50 aminoácidos, tais como 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5 aminoácidos ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0074] O aditivo de ração animal preferencialmente compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante alélica; compreende SEQ ID NO: 1 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C- terminal; compreende SEQ ID NO: 1 e uma extensão N-terminal e/ou C- terminal de entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um seu fragmento tendo atividade de protease e tendo pelo menos 90% tal como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento de SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o aditivo de ração animal compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 314 de SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o aditivo de ração animal compreende os ou consiste nos aminoácidos 2 a 314 de SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o aditivo de ração animal compreende os ou consiste nos aminoácidos 4 a 314 de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o polipeptídeo foi isolado.
[0075] Em uma continuação do primeiro aspecto, a invenção se relaciona com um aditivo de ração animal compreendendo uma ou mais variantes de SEQ ID NO: 1, em que a variante é uma protease S8 tendo atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou deleções e/ou inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma substituição e/ou deleção e/ou inserção ou qualquer sua combinação em SEQ
26 / 175 ID NO: 1 é entre 1 e 50, tal como 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1- 10 ou 1-5 posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma substituição e/ou deleção e/ou inserção ou qualquer sua combinação em SEQ ID NO: 1 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra modalidade, o número de substituições e/o deleções e/ou inserções em SEQ ID NO: 1 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 1 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou
10.
[0076] Como afirmado, uma modalidade da invenção se relaciona com uma ração animal ou aditivo de ração animal compreendendo uma variante de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 9, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições. Um número de variantes de mutação única e mutações múltiplas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, e SEQ ID NO: 9 foi preparado. Os exemplos 12, 14 e 15 ilustram a estabilidade gástrica e seu desempenho in vivo de SEQ ID NO: 1. As variantes de mutação única (dados não mostrados) e mutações múltiplas foram testadas e foi descoberto que tinham melhor estabilidade a ácidos, estabilidade gástrica e atividade residual em comparação com o polipeptídeo genitor de SEQ ID NO:
1. Conformemente, uma modalidade da invenção se relaciona com um aditivo de ração animal ou composição de ração animal compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
27 / 175 NO: 7, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições, tipicamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30, mais tipicamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 posições ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 posições ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 posições.
[0077] A variante com a combinação de mutações S173P,S175P,T297P melhorou a estabilidade a ácidos em comparação com SEQ ID NO: 1 e foi usada como o ponto de partida para mutações adicionais. Conformemente, em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo tem pelo menos 80%, tal como pelo menos 85% tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com qualquer um de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 9 compreendendo as mutações S173P,S175P,T297P. É interessante notar que SEQ ID NO:3, que é uma forma mutada de SEQ ID NO:2, compreende as mutações S173P,S175P,T297P. Como mostrado nos Exemplos, o aditivo de ração animal compreende adequadamente uma protease S8 tendo pelo menos 90% de identidade com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9, mais tipicamente consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9, em que o polipeptídeo compreende nenhuma, uma ou mais das mutações selecionadas do grupo consistindo em S173P, S175P, T297P;
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L61P,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; H39D,L61P, S173P, S175P, T297P; L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; L61P,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; H123W,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; N59D,H83T, S173P, S175P, T297P; N59D,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; L61Y,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; N59D,L61P,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,H83T, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61Y, S173P, S175P, T297P; H39D,H83T,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,L61Y,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; H39D,L61Y,H83T, S173P, S175P, T297P; L61Y,H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61Y,H83T, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P, S173P, S175P, T297P; H83T,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; L61Y,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,N59D, S173P, S175P, T297P; H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; L61P,H123W,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61P, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; L61P,H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; I43P,H83T,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,L61Y,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,N59D,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; N59D,H83T,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; N59D,L61Y,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; I43P,L61Y,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; I43P,N59D,L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; H39D,I43P,N59D,L61Y, S173P, S175P, T297P e L61Y,H83T, S173P, S175P, T297P.
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[0078] O aditivo de ração animal, em uma modalidade da invenção, compreende tipicamente um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em que uma ou mais substituições são mutações múltiplas compreendendo mutações selecionadas do grupo consistindo em S173P, S175P, T297P; L61P,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; H39D,L61P, S173P, S175P, T297P; L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; L61P,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; H123W,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; N59D,H83T, S173P, S175P, T297P; N59D,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; L61Y,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; N59D,L61P,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,H83T, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61Y, S173P, S175P, T297P; H39D,H83T,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,L61Y,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; H39D,L61Y,H83T, S173P, S175P, T297P; L61Y,H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61Y,H83T, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P, S173P, S175P, T297P; H83T,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; L61Y,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,N59D, S173P, S175P, T297P; H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; L61P,H123W,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61P, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; L61P,H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P;
30 / 175 I43P,H83T,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,L61Y,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,N59D,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; N59D,H83T,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; N59D,L61Y,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; I43P,L61Y,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; I43P,N59D,L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; H39D,I43P,N59D,L61Y, S173P, S175P, T297P e L61Y,H83T, S173P, S175P, T297P.
[0079] Além do mais, um número de homólogos foi preparado. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9 São homólogos uns dos outros.
SEQ ID NO: 5 S8, Bacillus sp.-13380 (78% com SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 6 S8, Bacillus idriensis (80% com SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 7 S8, Bacillus sp.-13380 (89% com SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 8 S8, Bacillus sp.-62451 (90% com SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 9 S8, Bacillus oceanisediminis (87% com SEQ ID NO: 1)
[0080] Uma modalidade da invenção se relaciona com o aditivo de ração animal da invenção em que o polipeptídeo é uma protease S8 selecionada do grupo consistindo em uma protease S8 de Bacillus sp,-13380 tendo pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, pelo menos 77%, tal como pelo menos 78% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1, uma protease S8 de Bacillus idriensis tendo pelo 80% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1, uma protease S8 de Bacillus sp.-62451 tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 e uma protease S8 de Bacillus oceanisediminis tendo pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87% com SEQ ID NO: 1. Uma modalidade adicional da invenção se relaciona com um aditivo de ração animal compreendendo uma
31 / 175 protease S8 tendo pelo menos 90% de identidade com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9.
[0081] Em uma modalidade de qualquer parte do primeiro aspecto, o polipeptídeo (ou variante) compreende um ou mais motivos TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG (SEQ ID NO: 4). Em uma modalidade de qualquer parte do primeiro aspecto, o polipeptídeo (ou variante) é obtido ou obtenível a partir da ordem taxonômica Bacillales, preferencialmente da família taxonômica Bacillaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Bacillus.
[0082] Em uma modalidade de qualquer parte do primeiro aspecto, o polipeptídeo (ou variante) tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade de qualquer parte do primeiro aspecto, o polipeptídeo (ou variante) melhora a digestibilidade de nitrogênio ileal em pelo menos 1%, tal como pelo menos 1,5%, pelo menos 2,0%, pelo menos 2,5%, pelo menos 3,0%, pelo menos 3,5% ou pelo menos 4,0% em comparação com controle negativo onde nenhuma protease (variante) é adicionada à dieta.
[0083] As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões amino- ou carboxila-terminais, tais como um resíduo de metionina amino- terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.
[0084] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos
32 / 175 grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que geralmente não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly. Outros exemplos de substituições conservativas são G por A; A por G, S; V por I, L, A, T, S; I por V, L, M; L por I, M, V; M por L, I, V; P por A, S, N; F por Y, W, H; Y por F, W, H; W por Y, F, H; R por K, E, D; K por R, E, D; H por Q, N, S; D por N, E, K, R, Q; E por Q, D, K, R, N; S por T, A; T por S, V, A; C por S, T, A; N por D, Q, H, S; Q por E, N, H, K, R.
[0085] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na especialidade, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Em esta última técnica, mutações de alanina únicas são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de protease para se identificarem resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al.,
33 / 175 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.
[0086] A família S8 de peptidases contém serina endopeptidases e é a segunda maior família de serina peptidases, tanto em termos de número de sequências como peptidases caracterizadas. Na subfamília S8A, os resíduos de local ativo ocorrem frequentemente nos motivos Asp-Thr/Ser-Gly, His- Gly-Thr-His e Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro. A partir disto, os resíduos catalíticos foram identificados como Asp-35, His-72 e Ser-251 e o quarto aminoácido de local ativo foi identificado como Asn-170 para SEQ ID NO: 1, 2 e 3. A mutação de qualquer um dos aminoácidos dos resíduos catalíticos resultará em uma mudança ou perda de atividade de enzima.
[0087] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções simples ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreamento relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição em fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente dos E.U.A. N.º 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese dirigida a regiões (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
[0088] Podem ser combinados métodos de mutagênese/ embaralhamento com métodos de rastreamento automatizados, de elevada produtividade para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que
34 / 175 codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.
[0089] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.
[0090] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável no qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo que codifica outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem ligação das sequências codificantes que codificam os polipeptídeos tal que fiquem em fase de leitura e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual os polipeptídeos de fusão são criados pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
[0091] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology
35 / 175 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
[0092] Em um segundo aspecto, a invenção se relaciona com um aditivo de ração animal compreendendo um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease, em que o polipeptídeo é uma protease S8 e tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, os polipeptídeos diferem em até 50 aminoácidos, por exemplo, entre 1 e 50 aminoácidos, tais como 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5 aminoácidos ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
[0093] O aditivo de ração animal preferencialmente compreende ou consiste em SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante alélica; compreende SEQ ID NO: 2 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C- terminal; compreende SEQ ID NO: 2 e uma extensão N-terminal e/ou C- terminal de entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um seu fragmento tendo atividade de protease e tendo pelo menos 90% tal como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento de SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, o aditivo de ração animal compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 311 de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o polipeptídeo foi isolado.
[0094] Em uma continuação do segundo aspecto, a invenção se relaciona com um aditivo de ração animal compreendendo uma ou mais variantes de SEQ ID NO: 2, em que a variante é uma protease S8 tendo
36 / 175 atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou deleções e/ou inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma substituição e/ou deleção e/ou inserção ou qualquer sua combinação em SEQ ID NO: 2 é entre 1 e 50, tal como 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1- 10 ou 1-5 posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma substituição e/ou deleção e/ou inserção ou qualquer sua combinação em SEQ ID NO: 2 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra modalidade, o número de substituições e/o deleções e/ou inserções em SEQ ID NO: 2 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 2 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou
10. Exemplos de mudanças de aminoácidos, substituições conservativas e peptídeos de fusão são descritos no segundo aspecto aqui.
[0095] Em uma modalidade de qualquer parte do segundo aspecto, o polipeptídeo (ou variante) compreende um ou mais motivos TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG (SEQ ID NO: 4). Em uma modalidade de qualquer parte do segundo aspecto, o polipeptídeo (ou variante) é obtido ou obtenível a partir da ordem taxonômica Bacillales, preferencialmente da família taxonômica Bacillaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Bacillus.
[0096] Em uma modalidade de qualquer parte do segundo aspecto, o polipeptídeo (ou variante) tem pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade
37 / 175 de qualquer parte do segundo aspecto, o polipeptídeo (ou variante) melhora a digestibilidade de nitrogênio ileal em pelo menos 1%, tal como pelo menos 1,5%, pelo menos 2,0%, pelo menos 2,5%, pelo menos 3,0%, pelo menos 3,5% ou pelo menos 4,0% em comparação com controle negativo onde nenhuma protease (variante) é adicionada à dieta.
[0097] Em um terceiro aspecto, a invenção se relaciona com um aditivo de ração animal compreendendo um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease, em que o polipeptídeo é uma protease S8 e tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, os polipeptídeos diferem em até 50 aminoácidos, por exemplo, entre 1 e 50 aminoácidos, tais como 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5 aminoácidos ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[0098] O aditivo de ração animal preferencialmente compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3 ou uma sua variante alélica; compreende SEQ ID NO: 3 e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C- terminal; compreende SEQ ID NO: 3 e uma extensão N-terminal e/ou C- terminal de entre 1 e 10 aminoácidos; ou é um seu fragmento tendo atividade de protease e tendo pelo menos 90% tal como pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento de SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, o aditivo de ração animal compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 311 de SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, o polipeptídeo foi isolado.
38 / 175
[0099] Em uma continuação do terceiro aspecto, a invenção se relaciona com um aditivo de ração animal compreendendo uma ou mais variantes de SEQ ID NO: 3, em que a variante é uma protease S8 tendo atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou deleções e/ou inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma substituição e/ou deleção e/ou inserção ou qualquer sua combinação em SEQ ID NO: 3 é entre 1 e 50, tal como 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1- 10 ou 1-5 posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma substituição e/ou deleção e/ou inserção ou qualquer sua combinação em SEQ ID NO: 3 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outra modalidade, o número de substituições e/o deleções e/ou inserções em SEQ ID NO: 3 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substituições conservativas, em SEQ ID NO: 3 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou
10. Exemplos de mudanças de aminoácidos, substituições conservativas e peptídeos de fusão são descritos no segundo aspecto aqui.
[00100] Um aspecto interessante adicional da invenção está dirigido a um aditivo de ração compreendendo uma protease S8 tendo pelo menos 90% de identidade tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3. As sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3 diferem em 13 posições. Conformemente, uma modalidade da invenção se relaciona com um aditivo de ração compreendendo uma protease S8 tendo pelo menos 90% de identidade tal como pelo menos 95%, tal como
39 / 175 pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, particularmente SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3 em que o polipeptídeo compreende uma mutação em nenhuma, uma ou mais das posições 27, 109, 111, 171, 173, 174, 175, 180, 182, 184, 198, 199 e 297. O aditivo de ração animal da invenção compreende preferencialmente uma protease S8 tendo pelo menos 90% de identidade com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, ou em que a protease S8 é um polipeptídeo compreendendo uma mutação em nenhuma, uma ou mais das posições 27, 109, 111, 171, 173, 174, 175, 180, 182, 184, 198, 199 e 297 de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3. Uma modalidade da invenção se relaciona com um aditivo de ração compreendendo uma protease S8 tendo pelo menos 90% de identidade tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, tipicamente SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, em que o polipeptídeo compreende nenhuma, uma ou mais das mutações selecionadas do grupo consistindo em S27K, N109K, S111E, S171E, S173P, G174K, S175P, F180Y, G182A, L184F, Q198E, N199K e T297P.
[00101] Uma modalidade da invenção se relaciona com um aditivo de ração compreendendo uma protease S8 tendo pelo menos 90% de identidade tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, tipicamente SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, em que o polipeptídeo compreende nenhuma, uma ou mais das mutações selecionadas do grupo consistindo em S27K+N109K, S27K+S111E, S27K+S171E,
40 / 175 S27K+S173P, S27K+G174K, S27K+S175P, S27K+F180Y, S27K+G182A, S27K+L184F, S27K+Q198E, S27K+N199K, N109K+S111E, N109K+S171E, N109K+S173P, N109K+G174K, N109K+S175P, N109K+F180Y, N109K+G182A, N109K+L184F, N109K+Q198E, N109K+N199K, S111E+S171E, S111E+S173P, S111E+G174K, S111E+S175P, S111E+F180Y, S111E+G182A, S111E+L184F, S111E+Q198E, S111E+N199K, S171E+S173P, S171E+G174K, S171E+S175P, S171E+F180Y, S171E+G182A, S171E+L184F, S171E+Q198E, S171E+N199K, S173P+G174K, S173P+S175P, S173P+F180Y, S173P+G182A, S173P+L184F, S173P+Q198E, S173P+N199K, G174K+S175P, G174K+F180Y, G174K+G182A, G174K+L184F, G174K+Q198E, G174K+N199K, S175P+F180Y, S175P+G182A, S175P+L184F, S175P+Q198E, S175P+N199K, F180Y+G182A, F180Y+L184F, F180Y+Q198E, F180Y+N199K, G182A+L184F, G182A+Q198E, G182A+N199K, L184F+Q198E, L184F+N199K, e Q198E+N199K.
[00102] Uma modalidade da invenção se relaciona com um aditivo de ração compreendendo uma protease S8 tendo pelo menos 90% de identidade com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, tipicamente SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, em que o polipeptídeo compreende nenhuma, uma ou mais das mutações selecionadas do grupo consistindo em S27K+N109K+S111E, S27K+N109K+S171E, S27K+N109K+S173P, S27K+N109K+G174K, S27K+N109K+S175P, S27K+N109K+F180Y, S27K+N109K+G182A, S27K+N109K+L184F, S27K+N109K+Q198E, S27K+N109K+N199K, S27K+S111E+S171E, S27K+S111E+S173P, S27K+S111E+G174K, S27K+S111E+S175P, S27K+S111E+F180Y, S27K+S111E+G182A, S27K+S111E+L184F, S27K+S111E+Q198E, S27K+S111E+N199K, S27K+S171E+S173P, S27K+S171E+G174K, S27K+S171E+S175P,
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[00103] Uma modalidade da invenção se relaciona com um aditivo de ração compreendendo uma protease S8 tendo pelo menos 90% de identidade com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, tipicamente SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, em que o polipeptídeo compreende nenhuma, uma ou mais das mutações selecionadas do grupo consistindo em S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+L184F, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+Q198E, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+N199K, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+G182A+L184F, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+G182A+Q198E, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+G182A+N199K, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+L184F+Q198E, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+L184F+N199K, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+Q198E+N199K, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+F180Y+G182A+L184F, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+F180Y+G182A+Q198E, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+F180Y+G182A+N199K, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+F180Y+L184F+Q198E, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+F180Y+L184F+N199K,
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51 / 175 S111E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q198E+N199K e S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q198E+N199K
[00104] Uma modalidade da invenção se relaciona com um aditivo de ração compreendendo uma protease S8 tendo pelo menos 90% de identidade com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, tipicamente SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, em que o polipeptídeo compreende nenhuma, uma ou mais das mutações selecionadas do grupo consistindo em S27K+ N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F, S27K+ N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ Q198E, S27K+ N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ N199K, S27K+ N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ L184F+ Q198E, S27K+ N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ L184F+ N199K, S27K+ N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ Q198E+ N199K, S27K+ N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ G182A+ L184F+ Q198E, S27K+ N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ G182A+ L184F+ N199K, S27K+ N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ G182A+ Q198E+ N199K, S27K+ N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ L184F+ Q198E+ N199K, S27K+ N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ F180Y+ G182A+
52 / 175
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53 / 175
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54 / 175
Q198E+ N199K, S27K+ N109K+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, S27K+ N109K+ S171E+ S173P+ G174K+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, S27K+ N109K+ S171E+ S173P+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, S27K+ N109K+ S171E+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, S27K+ N109K+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, S27K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E, S27K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ N199K, S27K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ Q198E+ N199K, S27K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ L184F+ Q198E+ N199K, S27K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, S27K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, S27K+ S111E+ S171E+ S173P+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, S27K+ S111E+ S171E+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, S27K+ S111E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K,
55 / 175 S27K+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E, N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ N199K, N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ Q198E+ N199K, N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ L184F+ Q198E+ N199K, N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, N109K+ S111E+ S171E+ S173P+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, N109K+ S111E+ S171E+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, N109K+ S111E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K, N109K+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K e S111E+ S171E+ S173P+ G174K+ S175P+ F180Y+ G182A+ L184F+ Q198E+ N199K
[00105] Uma modalidade da invenção se relaciona com um aditivo de ração compreendendo uma protease S8 tendo pelo menos 90% de identidade com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, tipicamente SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, em que o polipeptídeo compreende nenhuma, uma ou
56 / 175 mais das mutações selecionadas do grupo consistindo em S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L18 4F+Q198E, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L18 4F+N199K, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+Q19 8E+N199K, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+L184F+Q19 8E+N199K, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+G182A+L184F+Q19 8E+N199K, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+F180Y+G182A+L184F+Q19 8E+N199K, S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q19 8E+N199K, S27K+N109K+S111E+S171E+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q19 8E+N199K, S27K+N109K+S111E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q19 8E+N199K, S27K+N109K+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q19 8E+N199K, S27K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q19 8E+N199K e N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q1 98E+N199K.
[00106] Em uma modalidade de qualquer parte do terceiro aspecto, o polipeptídeo (ou variante) compreende um ou mais motivos TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG (SEQ ID NO: 4). Em uma modalidade de qualquer parte do terceiro aspecto, o polipeptídeo (ou variante) é obtido ou
57 / 175 obtenível a partir da ordem taxonômica Bacillales, preferencialmente da família taxonômica Bacillaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Bacillus.
[00107] Em uma modalidade de qualquer parte do terceiro aspecto, o polipeptídeo (ou variante) tem pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade de qualquer parte do terceiro aspecto, o polipeptídeo (ou variante) melhora a digestibilidade de nitrogênio ileal em pelo menos 1%, tal como pelo menos 1,5%, pelo menos 2,0%, pelo menos 2,5%, pelo menos 3,0%, pelo menos 3,5% ou pelo menos 4,0% em comparação com controle negativo onde nenhuma protease (variante) é adicionada à dieta.
[00108] O aditivo de ração animal de qualquer um dos aspectos um, dois ou três pode compreender adicionalmente um ou mais componentes selecionados da lista consistindo em: um ou mais agentes de formulação; uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais micróbios; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; um ou mais prebióticos; um ou mais fitogênicos; um ou mais ácidos orgânicos; e um ou mais outros ingredientes de ração.
[00109] O aditivo de ração animal de qualquer um dos aspectos um, dois ou três pode compreender adicionalmente um ou mais agentes de formulação, como discutido em baixo na seção de formulação. Agentes de formulação preferenciais são glicerol, etilenoglicol, 1,2-propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glucose, sacarose, sorbitol, lactose, amido e celulose ou qualquer sua combinação.
[00110] O aditivo de ração animal de qualquer um dos aspectos um,
58 / 175 dois ou três pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais, como discutido em baixo na seção de enzimas. Enzimas preferenciais são acetilxilana esterase, acilglicerol lipase, amilase, alfa- amilase, beta-amilase, arabinofuranosidase, celobio-hidrolases, celulase, feruloil esterase, galactanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, beta- glucanase, beta-glucosidase, lisofosfolipase, lisozima, alfa-manosidase, beta- manosidase (mananase), fitase, fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase D, protease, pululanase, pectinesterase, triacilglicerol lipase, xilanase, beta- xilosidase ou qualquer sua combinação.
[00111] O aditivo de ração animal de qualquer um dos aspectos um, dois ou três pode compreender adicionalmente um ou mais micróbios, como discutido em baixo na seção de probióticos. Micróbios preferenciais são de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium sp., Carnobacterium sp., Clostridium butyricum, Clostridium sp., Enterococcus faecium, Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Lactococcus sp., Leuconostoc sp., Megasphaera elsdenii, Megasphaera sp., Pediococsus acidilactici, Pediococcus sp., Propionibacterium thoenii, Propionibacterium sp., Streptococcus sp. ou qualquer sua combinação.
[00112] O aditivo de ração animal de qualquer um dos aspectos um, dois ou três pode compreender adicionalmente uma ou mais vitaminas, como discutido em baixo na seção de vitaminais e minerais. O aditivo de ração animal de qualquer um dos aspectos um, dois ou três pode compreender adicionalmente um ou mais minerais, como discutido em baixo na seção de vitaminais e minerais. O aditivo de ração animal de qualquer um dos aspectos um, dois ou três pode compreender adicionalmente um ou mais
59 / 175 aminoácidos, como discutido em baixo na seção de aminoácidos. O aditivo de ração animal de qualquer um dos aspectos um, dois ou três pode compreender adicionalmente um ou mais prebióticos, como discutido em baixo na seção de prebióticos. O aditivo de ração animal de qualquer um dos aspectos um, dois ou três pode compreender adicionalmente um ou mais fitogênicos, como discutido em baixo na seção de fitogênicos. O aditivo de ração animal de qualquer um dos aspectos um, dois ou três pode compreender adicionalmente um ou mais ácidos orgânicos, como discutido em baixo na seção de ácidos orgânicos.
[00113] Em uma modalidade, a protease S8 no aditivo de ração animal é formulada como um grânulo. Em uma modalidade, a protease S8 no aditivo de ração animal é formulada como um grânulo, em que o grânulo compreende uma partícula de núcleo e um ou mais revestimentos. Em uma modalidade, a protease S8 no aditivo de ração animal é formulada como um grânulo compreendendo uma partícula de núcleo e um ou mais revestimentos, em que o revestimento compreende um sal e/ou cera e/ou farinha.
[00114] Em uma modalidade, o aditivo de ração animal está na forma de uma formulação líquida. Em uma modalidade, o aditivo de ração animal está na forma de uma formulação líquida, em que a protease S8 é doseada entre 0,001% e 25% p/p da formulação líquida, preferencialmente 0,01% e 25% p/p, mais preferencialmente 0,05% e 20% p/p, mais preferencialmente 0,2% e 15% p/p, ainda mais preferencialmente 0,5% e 15% p/p ou o mais preferencialmente 1,0% e 10% p/p de polipeptídeo.
[00115] Em uma modalidade, o aditivo de ração animal está na forma de uma formulação líquida, em que a formulação líquida compreende 20% a 80% p/p de poliol. Em uma modalidade, o aditivo de ração animal está na forma de uma formulação líquida compreendendo 20% a 80% p/p de poliol, em que o poliol é selecionado do grupo consistindo em glicerol, sorbitol, propilenoglicol (MPG), etilenoglicol, dietilenoglicol, trietilenoglicol, 1,2-
60 / 175 propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, dipropilenoglicol, polietilenoglicol (PEG) tendo um peso molecular médio abaixo de cerca de 600 e polipropilenoglicol (PPG) tendo um peso molecular médio abaixo de cerca de 600 ou qualquer sua combinação.
[00116] Em uma modalidade, o aditivo de ração animal está na forma de uma formulação líquida, em que a formulação líquida compreende 0,01% a 2,0% p/p de conservante. Em uma modalidade, o aditivo de ração animal está na forma de uma formulação líquida compreendendo 0,01% a 2,0% p/p de conservante, em que o conservante é selecionado do grupo consistindo em sorbato de sódio, sorbato de potássio, benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer sua combinação.
[00117] Em uma modalidade, o aditivo de ração animal está na forma de uma formulação líquida compreendendo: (A) 0,001% a 25% p/p de uma protease S8 da invenção (como descrito nos aspectos um, dois ou três acima); (B) 20% a 80% p/p de poliol; (C) 0,001% a 2,0% p/p de conservante; e (D) água.
[00118] Exemplos preferenciais de polióis e conservantes são descritos nos parágrafos em baixo. Grânulos Compreendendo Polipeptídeos Tendo Atividade de Protease
[00119] Em um quarto aspecto, a invenção se relaciona com um grânulo compreendendo um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease, em que o polipeptídeo é uma protease S8 selecionada do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo
61 / 175 menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3; (d) uma variante de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (e) uma variante de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (f) uma variante de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1,
62 / 175 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (g) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; (h) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos; e (i) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) tendo atividade de protease e tendo pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.
[00120] Em uma modalidade de qualquer parte do quarto aspecto, o polipeptídeo (ou variante) compreende um ou mais motivos TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG (SEQ ID NO: 4). Em uma modalidade de qualquer parte do quarto aspecto, o polipeptídeo (ou variante) é obtido ou obtenível a partir da ordem taxonômica Bacillales, preferencialmente da família taxonômica Bacillaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Bacillus.
[00121] Em uma modalidade de qualquer parte do quarto aspecto, o polipeptídeo (ou variante) tem pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade de qualquer parte do quarto aspecto, o polipeptídeo (ou variante) melhora a digestibilidade de nitrogênio ileal em pelo menos 1%, tal como pelo menos 1,5%, pelo menos 2,0%, pelo menos 2,5%, pelo menos 3,0%, pelo menos 3,5% ou pelo menos 4,0% em comparação com controle negativo onde nenhuma protease (variante) é adicionada à dieta.
63 / 175
[00122] Em uma modalidade do quarto aspecto, o grânulo compreende uma partícula de núcleo e um ou mais revestimentos. Em uma modalidade, o grânulo compreende uma partícula de núcleo e um ou mais revestimentos, em que o revestimento compreende um sal e/ou cera e/ou farinha.
[00123] O grânulo do quarto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais componentes selecionados do grupo consistindo em: um ou mais agentes de formulação; uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais micróbios; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; um ou mais prebióticos; um ou mais fitogênicos; um ou mais ácidos orgânicos; e um ou mais outros ingredientes de ração.
[00124] O grânulo do quarto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais agentes de formulação, como discutido em baixo na seção de formulação. Agentes de formulação preferenciais são glicerol, etilenoglicol, 1,2-propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glucose, sacarose, sorbitol, lactose, amido e celulose ou qualquer sua combinação.
[00125] O grânulo do quarto aspecto pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais, como discutido em baixo na seção de enzimas. Enzimas preferenciais são acetilxilana esterase, acilglicerol lipase, amilase, alfa-amilase, beta-amilase, arabinofuranosidase, celobio- hidrolases, celulase, feruloil esterase, galactanase, alfa-galactosidase, beta- galactosidase, beta-glucanase, beta-glucosidase, lisofosfolipase, lisozima, alfa-manosidase, beta-manosidase (mananase), fitase, fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase D, protease, pululanase, pectinesterase, triacilglicerol lipase, xilanase, beta-xilosidase ou qualquer sua combinação.
[00126] O grânulo do quarto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais micróbios, como discutido em baixo na seção de
64 / 175 probióticos. Micróbios preferenciais são de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium sp., Carnobacterium sp., Clostridium butyricum, Clostridium sp., Enterococcus faecium, Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Lactococcus sp., Leuconostoc sp., Megasphaera elsdenii, Megasphaera sp., Pediococsus acidilactici, Pediococcus sp., Propionibacterium thoenii, Propionibacterium sp., Streptococcus sp. ou qualquer sua combinação.
[00127] O grânulo do quarto aspecto pode compreender adicionalmente uma ou mais vitaminas, como discutido em baixo na seção de vitaminas e minerais. O grânulo do quarto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais minerais, como discutido em baixo na seção de vitaminas e minerais. O grânulo do quarto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais aminoácidos, como discutido em baixo na seção de aminoácidos. O grânulo do quarto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais prebióticos, como discutido em baixo na seção de prebióticos. O grânulo do quarto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais fitogênicos, como discutido em baixo na seção de fitogênicos. O grânulo do quarto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais ácidos orgânicos, como discutido em baixo na seção de ácidos orgânicos. Formulações Líquidas Compreendendo Polipeptídeos Tendo Atividade de Protease
[00128] Em um quinto aspecto, a presente invenção se relaciona com formulações líquidas compreendendo: (A) 0,001% a 25% p/p de um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease, em que o polipeptídeo é uma protease S8 selecionada
65 / 175 da lista consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3; (d) uma variante de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (e) uma variante de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
66 / 175 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (f) uma variante de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (g) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; (h) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos; e (i) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) tendo atividade de protease e tendo pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro; e (B) água.
[00129] Em uma modalidade do quinto aspecto, a invenção se relaciona com formulações líquidas compreendendo: (A) 0,001% a 25% p/p de um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease, em que o polipeptídeo é uma protease S8 selecionada da lista consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1;
67 / 175
(b) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3; (d) uma variante de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (e) uma variante de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (f) uma variante de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
68 / 175 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (g) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; (h) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos; e (i) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) tendo atividade de protease e tendo pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro; (B) 20% a 80% p/p de poliol; (C) opcionalmente 0,001% a 2,0% p/p de conservante; e (D) água.
[00130] Em uma modalidade do quinto aspecto, a invenção se relaciona com formulações líquidas compreendendo: (A) 0,001% a 25% p/p de um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease, em que o polipeptídeo é uma protease S8 selecionada da lista consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de
69 / 175 sequências com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3; (d) uma variante de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (e) uma variante de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (f) uma variante de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (g) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal; (h) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b),
70 / 175 (c), (d), (e) ou (f) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos; e (i) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) tendo atividade de protease e tendo pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro; (B) 0,001% a 2,0% p/p de conservante; (C) opcionalmente 20% a 80% p/p de poliol; e (D) água.
[00131] Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, o polipeptídeo (ou variante) compreende um ou mais motivos TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG (SEQ ID NO: 4). Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, o polipeptídeo (ou variante) é obtido ou obtenível a partir da ordem taxonômica Bacillales, preferencialmente da família taxonômica Bacillaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Bacillus.
[00132] Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, o polipeptídeo (ou variante) tem pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, o polipeptídeo (ou variante) melhora a digestibilidade de nitrogênio ileal em pelo menos 1%, tal como pelo menos 1,5%, pelo menos 2,0%, pelo menos 2,5%, pelo menos 3,0%, pelo menos 3,5% ou pelo menos 4,0% em comparação com controle negativo onde nenhuma protease (variante) é adicionada à dieta.
[00133] Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, a formulação líquida compreende um ou mais polióis, preferencialmente um poliol selecionado do grupo consistindo em glicerol, sorbitol, propilenoglicol (MPG), etilenoglicol, dietilenoglicol, trietilenoglicol, 1,2-propilenoglicol ou
71 / 175 1,3-propilenoglicol, dipropilenoglicol, polietilenoglicol (PEG) tendo um peso molecular médio abaixo de cerca de 600 e polipropilenoglicol (PPG) tendo um peso molecular médio abaixo de cerca de 600, mais preferencialmente selecionado do grupo consistindo em glicerol, sorbitol e propilenoglicol (MPG) ou qualquer sua combinação.
[00134] Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, a formulação líquida compreende 20%-80% de poliol (i.e., quantidade total de poliol), preferencialmente 25%-75% de poliol, mais preferencialmente 30%- 70% de poliol, mais preferencialmente 35%-65% de poliol ou o mais preferencialmente 40%-60% de poliol. Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, a formulação líquida compreende 20%-80% de poliol, preferencialmente 25%-75% de poliol, mais preferencialmente 30%-70% de poliol, mais preferencialmente 35%-65% de poliol ou o mais preferencialmente 40%-60% de poliol em que o poliol é selecionado do grupo consistindo em glicerol, sorbitol, propilenoglicol (MPG), etilenoglicol, dietilenoglicol, trietilenoglicol, 1,2-propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, dipropilenoglicol, polietilenoglicol (PEG) tendo um peso molecular médio abaixo de cerca de 600 e polipropilenoglicol (PPG) tendo um peso molecular médio abaixo de cerca de 600. Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, a formulação líquida compreende 20%-80% de poliol (i.e., quantidade total de poliol), preferencialmente 25%-75% de poliol, mais preferencialmente 30%-70% de poliol, mais preferencialmente 35%-65% de poliol ou o mais preferencialmente 40%-60% de poliol em que o poliol é selecionado do grupo consistindo em glicerol, sorbitol e propilenoglicol (MPG).
[00135] Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, o conservante é selecionado do grupo consistindo em sorbato de sódio, sorbato de potássio, benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer sua combinação. Em uma modalidade, a formulação líquida compreende 0,02% a
72 / 175 1,5% p/p de conservante, mais preferencialmente 0,05% a 1,0% p/p de conservante ou o mais preferencialmente 0,1% a 0,5% p/p de conservante. Em uma modalidade, a formulação líquida compreende 0,001% a 2,0% p/p de conservante (i.e., quantidade total de conservante), preferencialmente 0,02% a 1,5% p/p de conservante, mais preferencialmente 0,05% a 1,0% p/p de conservante ou o mais preferencialmente 0,1% a 0,5% p/p de conservante em que o conservante é selecionado do grupo consistindo em sorbato de sódio, sorbato de potássio, benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer sua combinação.
[00136] Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, a protease S8 é doseada entre 0,001% e 25% p/p de formulação líquida, preferencialmente 0,01% e 25% p/p, mais preferencialmente 0,05% e 20% p/p, mais preferencialmente 0,2% e 15% p/p, ainda mais preferencialmente 0,5% e 15% p/p ou o mais preferencialmente 1,0% e 10% p/p de polipeptídeo.
[00137] A formulação líquida de qualquer uma parte do quinto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais componentes selecionados da lista consistindo em: um ou mais agentes de formulação; uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais micróbios; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; um ou mais prebióticos; um ou mais fitogênicos; um ou mais ácidos orgânicos; e um ou mais outros ingredientes de ração.
[00138] Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, a formulação líquida compreende um ou mais agentes de formulação (tais como aqueles descritos aqui), preferencialmente um agente de formulação selecionado da lista consistindo em glicerol, etilenoglicol, 1,2-propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, PVA, acetato e fosfato, preferencialmente
73 / 175 selecionado da lista consistindo em 1,2-propilenoglicol, 1,3-propilenoglicol, sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, caulim e carbonato de cálcio.
[00139] Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, a formulação líquida compreende uma ou mais enzimas adicionais. A uma ou mais enzimas adicionais são preferencialmente selecionadas do grupo consistindo em acetilxilana esterase, acilglicerol lipase, amilase, alfa-amilase, beta-amilase, arabinofuranosidase, celobio-hidrolases, celulase, feruloil esterase, galactanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, beta-glucanase, beta-glucosidase, lisofosfolipase, lisozima, alfa-manosidase, beta-manosidase (mananase), fitase, fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase D, protease, pululanase, pectina esterase, triacilglicerol lipase, xilanase, beta-xilosidase ou qualquer sua combinação.
[00140] Em uma modalidade de qualquer parte do quinto aspecto, a formulação líquida compreende um ou mais probióticos. O um ou mais probióticos são preferencialmente selecionados do grupo consistindo em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium sp., Carnobacterium sp., Clostridium butyricum, Clostridium sp., Enterococcus faecium, Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Lactococcus sp., Leuconostoc sp., Megasphaera elsdenii, Megasphaera sp., Pediococsus acidilactici, Pediococcus sp., Propionibacterium thoenii, Propionibacterium sp. e Streptococcus sp. ou qualquer sua combinação.
[00141] A formulação líquida de qualquer uma parte do quinto aspecto pode compreender adicionalmente uma ou mais vitaminas, como discutido em baixo na seção de vitaminais e minerais. A formulação líquida de
74 / 175 qualquer parte do quinto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais minerais, como discutido em baixo na seção de vitaminais e minerais. A formulação líquida de qualquer parte do quinto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais aminoácidos, como discutido em baixo na seção de aminoácidos. A formulação líquida de qualquer uma parte do quinto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais prebióticos, como discutido em baixo na seção de prebióticos. A formulação líquida de qualquer parte do quinto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais fitogênicos, como discutido em baixo na seção de fitogênicos. A formulação líquida de qualquer parte do quinto aspecto pode compreender adicionalmente um ou mais ácidos orgânicos, como discutido em baixo na seção de ácidos orgânicos. Propriedades pH-atividade
[00142] O perfil de pH-atividade da protease pode ser determinado como descrito no ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA. A atividade a um pH mais baixo (por exemplo, 4-7) pode ser vantajosa para a digestão de proteínas em um animal. pH-estabilidade
[00143] O perfil de pH-estabilidade da protease pode ser determinado como descrito no ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA. A estabilidade a um pH mais baixo (por exemplo, pH 3) pode ser vantajosa para a protease para sobreviver às condições do trato GI do animal. Termoestabilidade
[00144] A termoestabilidade pode ser determinada como descrito no Exemplo 5, i.e., usando medições de DSC para se determinar a temperatura de desnaturação, Td, da proteína protease purificada. A Td é indicativa da termoestabilidade da proteína: Quanto mais elevada a Td, mais elevada a termoestabilidade. Conformemente, em uma modalidade preferencial, a
75 / 175 protease da invenção tem uma Td que é mais elevada do que a Td de uma protease de referência, em que a Td é determinada em amostras de protease purificadas (preferencialmente com uma pureza de pelo menos 90% ou 95%, como determinado por SDS-PAGE).
[00145] Em modalidades preferenciais, as propriedades térmicas tais como estabilidade ao calor, estabilidade à temperatura, termoestabilidade, estabilidade ao vapor, e/ou estabilidade à peletização como proporcionadas pela atividade residual, temperatura de desnaturação Td, ou outro parâmetro da protease da invenção são mais elevadas do que o valor correspondente, tal como a atividade residual ou Td, da protease de SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente 101% do mesmo ou pelo menos 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, ou pelo menos 110% do mesmo. Ainda mais preferencialmente, o valor do parâmetro, tal como atividade residual ou Td, da protease da invenção é pelo menos 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, ou pelo menos 190% do valor para a protease de SEQ ID NO: 1.
[00146] Ainda em modalidades particulares adicionais, a protease termoestável da invenção tem uma temperatura de fusão, Tm (ou uma temperatura de desnaturação, Td), como determinada usando Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) como descrito no exemplo 5 (i.e., em acetato de sódio a 20 mM, pH 4,0), de pelo menos 50 ºC. Ainda em modalidades particulares adicionais, a Tm é pelo menos 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou pelo menos 100 °C. Estabilidade ao vapor
[00147] A estabilidade ao vapor pode ser determinada como descrito no Exemplo 6 por determinação da atividade residual de moléculas de protease após tratamento com vapor a 85 °C ou 90 °C durante um tempo
76 / 175 curto. Estabilidade à peletização
[00148] A estabilidade à peletização pode ser determinada como descrito no Exemplo 7 por uso de granulado de enzima pré-misturado com ração. A partir do misturador, a ração é condicionada com vapor até 95 °C. Após condicionamento, a ração é comprimida até péletes e a atividade residual determinada. Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de Protease
[00149] Um polipeptídeo tendo atividade de protease de acordo com a presente invenção pode ser obtido a partir de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo “obtido a partir de”, como usado no presente documento em conexão com uma dada fonte, significará que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido a partir de uma dada fonte é secretado extracelularmente.
[00150] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo tendo atividade de protease de uma bactéria Gram-positiva dentro de um filo tal como Actinobacteria ou de uma bactéria Gram-negativa dentro de um filo tal como Proteobacteria.
[00151] Em um aspecto, o polipeptídeo é uma protease de uma bactéria da ordem Bacillales ou da família Bacillaceae ou do gênero Bacillus.
[00152] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Os peritos na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.
[00153] Estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de cultura, tal como a American Type
77 / 175 Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[00154] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido a partir de outras fontes incluindo microrganismos isolados a partir da natureza (por exemplo, solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente a partir de materiais naturais (por exemplo, solo, adubos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para o isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser depois obtido por rastreamento similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Logo que um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tenha sido detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas daqueles peritos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Polinucleotídeos
[00155] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando um polipeptídeo da presente invenção, como descrito aqui. Em uma modalidade, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo da presente invenção foi isolado.
[00156] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento a partir de DNA genômico ou cDNA ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, por uso da bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou rastreio de anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonado com características estruturais partilhadas. Ver, por exemplo Innis et al., 1990,
78 / 175 PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma estirpe de Bacillus ou um organismo relacionado de Bacillales e, assim, por exemplo, podem ser uma variante alélica ou de espécies da região codificante do polipeptídeo do polinucleotídeo. Construtos de Ácido Nucleico
[00157] A presente invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.
[00158] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modos para proporcionar expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.
[00159] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos e pode ser obtido a partir de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.
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[00160] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos a partir do gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em “Useful proteins from recombinant bacteria” em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados em WO 99/43835.
[00161] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são promotores obtidos a partir dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácidos de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma
80 / 175 reesei, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta- xilosidase de Trichoderma reesei e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados e híbridos. Outros promotores são descritos na Patente dos E.U.A. N.º 6,011,147.
[00162] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos a partir dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae e 3- fosfogliceratocinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
[00163] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador está operacionalmente ligado ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira pode ser usado na presente invenção.
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[00164] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.
[00165] Os terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease tipo tripsina de Fusarium oxisporum, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei.
[00166] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.
[00167] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizante de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.
[00168] Exemplos de regiões estabilizantes de mRNA adequadas são obtidas a partir de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology
82 / 175 177: 3465-3471).
[00169] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado ao terminal 5' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira pode ser usado.
[00170] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes da amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.
[00171] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidas a partir dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.
[00172] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira pode ser usada.
[00173] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa- glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae e protease tipo tripsina de Fusarium oxisporum.
[00174] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
[00175] A sequência de controle pode ser também uma região
83 / 175 codificante do peptídeo-sinal que codifica um peptídeo-sinal ligado ao terminal N de um polipeptídeo e dirige o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo-sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução com o segmento da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante do peptídeo-sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo-sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do peptídeo-sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo-sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo- sinal natural para intensificar a secreção do polipeptídeo. No entanto, qualquer sequência codificante do peptídeo-sinal que dirija o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira pode ser usada.
[00176] Sequências codificantes do peptídeo-sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes do peptídeo-sinal obtidas a partir dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos- sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
[00177] Sequências codificantes do peptídeo-sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes do peptídeo- sinal obtidas a partir dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.
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[00178] Peptídeos-sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes do peptídeo-sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.
[00179] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante do pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida a partir dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.
[00180] Onde estiverem presentes sequências tanto do peptídeo-sinal como do pró-peptídeo, a sequência do pró-peptídeo está posicionada próxima do terminal N de um polipeptídeo e a sequência do peptídeo-sinal está posicionada próxima do terminal N da sequência do pró-peptídeo.
[00181] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sequências reguladoras são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. As sequências reguladoras em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae e promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae,
85 / 175 promotor de celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei e promotor de celobio- hidrolase II de Trichoderma reesei. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem a amplificação gênica. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene da di-hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato e os genes da metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Em estes casos, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora. Vetores de Expressão
[00182] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou de uma construção de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor de modo que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada com as sequências de controle apropriadas para expressão.
[00183] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa provocar expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.
[00184] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, i.e., um
86 / 175 vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) no qual foi integrado. Além do mais pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transpóson.
[00185] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores de seleção que permitam seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similar. Um marcador de seleção é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos e similares.
[00186] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis ou marcadores que conferem resistência a antibióticos, tal como resistência à ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura incluem, mas não estão limitados a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não estão limitados a, adeA (fosforribosilaminoimidazol- succinocarboxamida sintase), adeB (fosforribosil-aminoimidazol sintase), amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de
87 / 175 Streptomyces hygroscopicus são preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus. Os genes adeA, adeB, amdS, hph e pyrG são preferenciais para uso em uma célula de Trichoderma.
[00187] O marcador selecionável pode ser um sistema de marcador selecionável dual como descrito em WO 2010/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável dual é um sistema de marcador selecionável dual hph-tk.
[00188] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.
[00189] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para dirigir a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localização(ões) precisa(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter uma quantidade suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequências com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.
[00190] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique
88 / 175 autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.
[00191] Exemplos de origens bacterianas de replicação são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo replicação em E. coli e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMß1 permitindo replicação em Bacillus.
[00192] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.
[00193] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.
[00194] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento do número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador de seleção amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador de seleção e, deste modo, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultura das células na presença do agente selecionável apropriado.
[00195] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente
89 / 175 invenção são bem conhecidos de um perito na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Células Hospedeiras
[00196] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande parte do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.
[00197] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procariota ou um eucariota.
[00198] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.
[00199] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus,
90 / 175 Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.
[00200] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.
[00201] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não se limitando a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.
[00202] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de células competentes (ver, por exemplo Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823- 829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, por exemplo Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação de protoplastos, eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) ou transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl.
91 / 175 Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.
[00203] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fúngica.
[00204] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos” como usado aqui, inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota assim como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definidos por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ª edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).
[00205] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura” como usada aqui, inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena e levedura pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de leveduras pode variar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deverá ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series N.º 9, 1980).
[00206] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia
92 / 175 lipolytica.
[00207] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas das subdivisões Eumycota e Oomycota (como definidas por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.
[00208] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.
[00209] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium
93 / 175 graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.
[00210] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474 e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adequados para transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147- 156 e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920. Métodos de Produção
[00211] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultura de uma célula, que na sua forma de tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; (b)
94 / 175 opcionalmente isolamento do polipeptídeo; e (c) recuperação do polipeptídeo. Em um aspeto, a célula é uma célula de Bacillus. Em outro aspecto, a célula é uma célula de Bacillus horneckiae.
[00212] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo o referido método os passos de: (a) cultura de uma célula hospedeira de Bacillus recombinante compreendendo um polinucleotídeo exógeno codificando o polipeptídeo da presente invenção, em que o polinucleotídeo é expresso e o polipeptídeo é produzido; (b) opcionalmente isolamento do polipeptídeo; e (c) opcionalmente recuperação do polipeptídeo.
[00213] Em uma modalidade, a célula hospedeira de Bacillus recombinante é selecionada da lista consistindo em Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis. Em uma modalidade preferencial, a célula hospedeira de Bacillus recombinante é selecionada da lista consistindo em Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens e Bacillus subtilis.
[00214] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultura em frasco agitado ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, descontínuas, descontínuas alimentadas ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. A cultura tem lugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de
95 / 175 carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado para o meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente a partir do meio. Se o polipeptídeo não for secretado pode ser recuperado a partir de lisados celulares.
[00215] O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzima para se determinar a atividade do polipeptídeo.
[00216] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado a partir do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas sem limitação, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação. Em um aspecto é recuperado um caldo de fermentação compreendendo o polipeptídeo.
[00217] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (por exemplo, permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanhos), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterem polipeptídeos substancialmente puros.
[00218] Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas ao invés disso uma célula hospedeira da presente invenção expressando o
96 / 175 polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo. Plantas
[00219] A presente invenção se relaciona também com plantas isoladas, por exemplo, uma planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção de modo a expressar e produzir um polipeptídeo ou domínio em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo ou domínio pode ser recuperado a partir da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo ou domínio pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas ou para destruir um fator antinutritivo.
[00220] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocots são gramíneas, tais como poa (capim do campo, Poa), forragem tal como Festuca, Lolium, grama temperada, tal como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e maís (milho).
[00221] Exemplos de plantas dicot são tabaco, leguminosas, tais como tremoços, batata, beterraba-sacarina, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, colza, e o organismo modelo relacionado de perto Arabidopsis thaliana.
[00222] Exemplos de partes de plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutos, sementes e tubérculos bem como os tecidos individuais compreendendo estas partes, por exemplo, epiderme, mesofilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas.
[00223] Compartimentos específicos de células de plantas, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomos e citoplasma, são também considerados uma parte de planta.
[00224] Também incluída dentro do escopo da presente invenção é a
97 / 175 descendência de tais plantas, partes de plantas e células de plantas.
[00225] A planta ou célula de planta transgênica expressando o polipeptídeo ou domínio pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[00226] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo ou domínio da presente invenção compreendendo (a) cultura de uma planta ou uma célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou domínio sob condições conducentes à produção do polipeptídeo ou domínio; e (b) recuperação do polipeptídeo ou domínio. Formulações de Caldo de Fermentação ou Composições de Células
[00227] A presente invenção se relaciona também com uma formulação de caldo de fermentação ou uma composição de células compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. O produto de caldo de fermentação compreende adicionalmente ingredientes adicionais usados no processo de fermentação, tais como, por exemplo, células (incluindo as células hospedeiras contendo o gene codificando o polipeptídeo da presente invenção que são usadas para produzir o polipeptídeo de interesse), detritos celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. Em algumas modalidades, a composição é um caldo inteiro de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou detritos celulares e meio de cultura.
[00228] O termo “caldo de fermentação” como usado aqui se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que sofre recuperação e/ou purificação nulas ou mínimas. Por exemplo são produzidos caldos de fermentação quando culturas microbianas são cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir síntese de proteínas (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção de proteínas no meio de cultura de células. O caldo de fermentação
98 / 175 pode conter conteúdos tanto não fracionados como fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação não é fracionado e compreende o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) serem removidas, por exemplo, por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.
[00229] Em uma modalidade, a formulação de caldo de fermentação e composições de células compreendem um primeiro componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 1-5 carbonos e/ou um seu sal e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 6 ou mais carbonos e/ou um seu sal. Em uma modalidade específica, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um seu sal, ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um seu sal ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores.
[00230] Em um aspecto, a composição contém um ácido(s) orgânico(s) e, opcionalmente, contém adicionalmente células mortas e/ou detritos celulares. Em uma modalidade, as células mortas e/ou detritos celulares são removidos de um caldo inteiro de células mortas para proporcionar uma composição que está isenta destes componentes. As formulação e composições de células do caldo de fermentação podem compreender adicionalmente um conservante e/ou agente antimicrobiano (por exemplo, bacteriostático), incluindo, mas não se limitando a, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio e outros conhecidos na técnica.
[00231] O caldo inteiro ou composição de células mortas pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo inteiro ou composição de células mortas
99 / 175 contém o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) serem cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas. Em algumas modalidades, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células fúngicas filamentosas mortas. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo inteiro ou composição de células mortas podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.
[00232] Um caldo inteiro ou composição de células como descrito aqui é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, detritos celulares, componentes de meios de cultura e/ou enzima(s) insolúvel(eis). Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para proporcionarem uma composição líquida clarificada.
[00233] As formulações de caldo inteiro e composições de células da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673. Composições de Enzimas
[00234] A presente invenção se relaciona também com composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Preferencialmente, as composições são enriquecidas no polipeptídeo da invenção. O termo “enriquecido” indica que a atividade de protease da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1, tal como pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 2,0, pelo menos 3,0, pelo menos 4,0, pelo menos 5,0, pelo menos
10. Formulação
[00235] A enzima da invenção pode ser formulada como um líquido ou
100 / 175 um sólido. Para uma formulação líquida, o agente de formulação pode compreender um poliol (tal como, por exemplo, glicerol, etilenoglicol ou propilenoglicol), um sal (tal como, por exemplo, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio) ou um açúcar ou derivado de açúcar (tal como, por exemplo, dextrina, glicose, sacarose e sorbitol). Assim, em uma modalidade, a composição é uma composição líquida compreendendo o polipeptídeo da invenção e um ou mais agentes de formulação selecionados da lista consistindo em glicerol, etilenoglicol, 1,2-propilenoglicol, 1,3- propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, dextrina, glucose, sacarose e sorbitol. A formulação líquida pode ser pulverizada na ração após ter sido peletizada ou pode ser adicionada à água potável dada aos animais.
[00236] Para uma formulação sólida, a formulação pode ser por exemplo como um grânulo, pó seco por pulverização ou aglomerado (por exemplo, como divulgado em WO 00/70034). O agente de formulação pode compreender um sal (sais orgânicos ou inorgânicos de zinco, sódio, potássio ou cálcio tais como, por exemplo, acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açúcar ou derivado de açúcar (tal como, por exemplo, sacarose, dextrina, glucose, lactose, sorbitol).
[00237] Em uma modalidade, a composição é uma composição sólida, tal como uma composição seca por pulverização, compreendendo a protease da invenção e um ou mais agentes de formulação selecionados da lista consistindo em cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio,
101 / 175 sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glucose, sacarose, sorbitol, lactose, amido e celulose. Em uma modalidade preferencial, o agente de formulação é selecionado de um ou mais dos seguintes compostos: sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, sulfato de magnésio e carbonato de cálcio.
[00238] A presente invenção se relaciona também com grânulos/partículas de enzima compreendendo a protease da invenção opcionalmente combinada com uma ou mais enzimas adicionais. O grânulo é composto por um núcleo e, opcionalmente, um ou mais revestimentos (camadas externas) rodeando o núcleo.
[00239] Tipicamente, o tamanho do grânulo/partícula, medido como diâmetro esférico equivalente (tamanho médio das partículas baseado em volume), do grânulo é 20-2000 µm, particularmente 50-1500 µm, 100-1500 µm ou 250-1200 µm.
[00240] O núcleo pode ser preparado por granulação de uma combinação dos ingredientes, por exemplo, por um método compreendendo técnicas de granulação tais como cristalização, precipitação, pan- revestimento, revestimento de leito fluidizado, aglomeração de leito fluidizado, atomização rotativa, extrusão, perolização, esferonização, métodos de redução do tamanho, granulação de tambor e/ou granulação de elevado cisalhamento.
[00241] Métodos para preparação do núcleo podem ser encontrados em Handbook of Powder Technology; Particle size enlargement por C. E. Capes; Volume 1; 1980; Elsevier. Os métodos de preparação incluem tecnologias conhecidas de formulação de ração e grânulo, por exemplo: a) produtos secos por pulverização, em que uma solução contendo enzima líquida é atomizada em uma torre de secagem por pulverização para formar gotículas pequenas que durante o seu trajeto para
102 / 175 baixo na torre de secagem seca para formar um material particulado contendo enzima; b) produtos em camada, em que a enzima é revestida como uma camada em torno de uma partícula de núcleo inerte pré-formada, em que uma solução contendo enzima é atomizada, tipicamente em um aparelho de leito fluidizado em que as partículas de núcleo pré-formadas são fluidizadas, e a solução contendo enzima adere às partículas de núcleo e seca para deixar uma camada de enzima seca na superfície da partícula de núcleo.
As partículas de um tamanho desejado podem ser obtidas deste modo se uma partícula de núcleo útil do tamanho desejado puder ser encontrada.
Este tipo de produto é descrito em, por exemplo, WO 97/23606; c) partículas de núcleo absorvidas, em que, em vez do revestimento da enzima como uma camada em torno do núcleo, a enzima é absorvida sobre a e/ou na superfície do núcleo.
Um tal processo é descrito em WO 97/39116. d) produtos de extrusão ou peletizados, em que uma pasta contendo enzima é pressionada em péletes ou sob pressão é extrudada através de uma pequena abertura e cortada em partículas que são subsequentemente secas.
Tais partículas têm usualmente um tamanho considerável devido ao material no qual a abertura de extrusão é feita (geralmente uma placa com orifícios perfurados) define um limite na queda de pressão permissível em relação à abertura de extrusão.
Adicionalmente, pressões de extrusão muito elevadas quando se usa uma abertura pequena aumentam a geração de calor na pasta de enzima, que é nociva à enzima; e) produtos perolizados, em que um pó contendo enzima é suspenso em cera fundida e a suspensão é pulverizada, por exemplo, através de um atomizador de disco rotativo, em uma câmara de resfriamento onde as gotículas solidificam rapidamente (Michael S.
Showell (editor); Powdered detergents; Surfactant Science Series; 1998; volume 71; páginas 140-142;
103 / 175
Marcel Dekker). O produto obtido é um em que a enzima está uniformemente distribuída ao longo de um material inerte em vez de estar concentrada em sua superfície.
US 4,016,040 e US 4,713,245 se relacionam também com esta técnica; f) produtos de granulação de misturador, em que um líquido é adicionado a uma composição de pó seco de, por exemplo, componentes de granulação convencionais, sendo a enzima introduzida através do líquido ou do pó ou ambos.
O líquido e o pó são misturados e, à medida em que a umidade do líquido é absorvida no pó seco, os componentes do pó seco começarão a aderir e aglomerar e partículas serão acumuladas, formando granulados compreendendo a enzima.
Um tal processo é descrito em US 4,106,991 e documentos relacionados EP 170360, EP 304332, EP 304331, WO 90/09440 e WO 90/09428. Em um produto particular deste processo em que vários misturadores de elevado cisalhamento podem ser usados como granuladores, granulados consistindo em enzima, enchimentos e aglutinantes, etc. são misturados com fibras de celulose para reforçar as partículas para dar o assim chamado granulado T.
As partículas reforçadas, sendo mais robustas, liberam menos poeira enzimática. g) redução de tamanho, em que os núcleos são produzidos por moagem ou trituração de partículas maiores, péletes, tabletes, briquetes, etc. contendo a enzima.
A fração de partícula de núcleo desejada é obtida por peneiração do produto moído ou triturado.
As partículas sobre e subdimensionadas podem ser recicladas.
A redução de tamanho é descrita em (Martin Rhodes (editor); Principles of Powder Technology; 1990; Capítulo 10; John Wiley & Sons); h) granulação de leito fluidizado, que envolve suspensão de particulados em uma corrente de ar e pulverização de um líquido nas partículas fluidizadas através de bocais.
As partículas acertadas por gotículas de pulverização se tornam úmidas e se tornam pegajosas.
As partículas
104 / 175 pegajosas colidem com outras partículas e aderem às mesmas e formam um grânulo; i) os núcleos podem ser sujeitos a secagem, tal como em um secador de leito fluidizado. Outros métodos conhecidos para secagem de grânulos na indústria de rações ou detergentes podem ser usados pelo perito. A secagem tem lugar preferencialmente a uma temperatura de produto de 25 a 90 °C. Para algumas enzimas é importante que os núcleos compreendendo a enzima contenham uma baixa quantidade de água antes do revestimento. Se enzimas sensíveis à água forem revestidas antes de a água excessiva ser removida, a mesma será retida no núcleo e pode afetar a atividade da enzima negativamente. Após secagem, os núcleos contêm preferencialmente 0,1-10% p/p de água.
[00242] O núcleo pode incluir materiais adicionais tais como enchimentos, materiais de fibra (celulose ou fibras sintéticas), agentes estabilizantes, agentes solubilizantes, agentes de suspensão, agentes reguladores da viscosidade, esferas de luz, plastificantes, sais, lubrificantes e fragrâncias.
[00243] O núcleo pode incluir um aglutinante, tal como polímero sintético, cera, gordura ou carboidrato.
[00244] O núcleo pode incluir um sal de um cátion multivalente, um agente redutor, um antioxidante, um catalisador de decomposição de peróxido e/ou um componente de tampão ácido, tipicamente como uma combinação homogênea.
[00245] Em uma modalidade, o núcleo compreende um material selecionado do grupo consistindo em sais (tais como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, potássio citrato, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato
105 / 175 de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açúcar ou derivado de açúcar (tal como, por exemplo, sacarose, dextrina, glucose, lactose, sorbitol), açúcar ou derivado de açúcar (tal como, por exemplo, sacarose, dextrina, glucose, lactose, sorbitol), moléculas orgânicas pequenas, amido, farinha, celulose e minerais e minerais de argila (também conhecidos como filossilicatos de alumínio hidratados). Em uma modalidade, o núcleo compreende um mineral de argila tal como caulinita ou caulim.
[00246] O núcleo pode incluir uma partícula inerte com a enzima absorvida na mesma ou aplicada na superfície, por exemplo, por revestimento em leito fluidizado.
[00247] O núcleo pode ter um diâmetro de 20-2000 µm, particularmente 50-1500 µm, 100-1500 µm ou 250-1200 µm.
[00248] O núcleo pode ser rodeado por pelo menos um revestimento, por exemplo, para aprimorar a estabilidade no armazenamento, para reduzir formação de poeira durante o manuseamento ou para colorir o grânulo. O(s) revestimento(s) opcional(ais) pode(m) incluir um sal e/ou cera e/ou revestimento de farinha ou outros materiais de revestimento adequados.
[00249] O revestimento pode ser aplicado em uma quantidade de pelo menos 0,1% em peso do núcleo, por exemplo, pelo menos 0,5%, 1% ou 5%. A quantidade pode ser no máximo 100%, 70%, 50%, 40% ou 30%.
[00250] O revestimento tem preferencialmente pelo menos 0,1 µm de espessura, particularmente pelo menos 0,5 µm, pelo menos 1 µm ou pelo menos 5 µm. Em algumas modalidades, a espessura do revestimento é abaixo de 100 µm, como abaixo de 60 µm ou abaixo de 40 µm.
[00251] O revestimento deve encapsular a unidade de núcleo por formação de uma camada substancialmente contínua. Uma camada substancialmente contínua é ser entendida como um revestimento tendo
106 / 175 poucos ou nenhuns orifícios, tal que a unidade de núcleo seja encapsulada ou encerrada com poucas ou nenhumas áreas não revestidas. Em uma modalidade particular, a camada ou revestimento deve ser homogêneo em espessura.
[00252] O revestimento pode conter adicionalmente outros materiais como conhecido na técnica, por exemplo, enchimentos, agentes antiaderentes, pigmentos, corantes, plastificantes e/ou aglutinantes, tais como dióxido de titânio, caulim, carbonato de cálcio ou talco.
[00253] Um revestimento de sal pode compreender pelo menos 60% em peso de um sal, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% em peso.
[00254] O sal pode ser adicionado a partir de uma solução de sal onde o sal é completamente dissolvido ou a partir de uma suspensão de sal em que as partículas finas são menores do que 50 µm, tal como menores do que 10 µm ou menores do que 5 μm.
[00255] O revestimento de sal pode compreender um único sal ou uma mistura de dois ou mais sais. O sal pode ser solúvel em água, em particular tendo uma solubilidade pelo menos 0,1 g em 100 g de água a 20 °C, preferencialmente pelo menos 0,5 g por 100 g de água, por exemplo, pelo menos 1 g por 100 g de água, por exemplo, pelo menos 5 g por 100 g de água.
[00256] O sal pode ser um sal inorgânico, por exemplo, sais de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples (menos do que 10 átomos de carbono, por exemplo, 6 ou menos átomos de carbono) tais como citrato, malonato ou acetato. Exemplos de cátions em estes sais são íons de metais alcalinos ou metais alcalinoterrosos, o íon de amônio ou íons de metais da primeira série de transição, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio, zinco ou alumínio. Exemplos de ânions incluem cloreto, brometo, iodeto, sulfato, sulfito,
107 / 175 bissulfito, tiossulfato, fosfato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, hipofosfito, pirofosfato de di-hidrogênio, tetraborato, borato, carbonato, bicarbonato, metassilicato, citrato, malato, maleato, malonato, succinato, sorbato, lactato, formato, acetato, butirato, propionato, benzoato, tartarato, ascorbato ou gluconato. Em particular podem ser usados sais de metais alcalinos ou metais alcalinoterrosos de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples tais como citrato, malonato ou acetato.
[00257] O sal no revestimento pode ter uma umidade constante a 20 °C acima de 60%, particularmente acima de 70%, acima de 80% ou acima de 85% ou pode ser outra forma hidratada de um tal sal (por exemplo, anidrato). O revestimento de sal pode ser como descrito em WO 97/05245, WO 98/54980, WO 98/55599, WO 00/70034, WO 2006/034710, WO 2008/017661, WO 2008/017659, WO 00/20569, WO 01/004279, WO 97/05245, WO 00/01793, WO 2003/059086, WO 2003/059087, WO 2007/031483, WO 2007/031485, WO 2007/044968, WO 2013/192043, WO 2014/014647 e WO 2015/197719 ou revestimento de polímero tal como descrito em WO 01/00042.
[00258] Exemplos específicos de sais adequados são NaCl (CH20 °C = 76%), Na2CO3 (CH20 °C = 92%), NaNO3 (CH20 °C = 73%), Na2HPO4 (CH20 °C = 95%), Na3PO4 (CH25 °C = 92%), NH4Cl (CH20 °C = 79,5%), (NH4)2HPO4 (CH20 °C = 93,0%), NH4H2PO4 (CH20 °C = 93,1%), (NH4)2SO4 (CH20 °C = 81,1%), KCl (CH20 °C = 85%), K2HPO4 (CH20 °C = 92%), KH2PO4 (CH20 °C = 96,5%), KNO3 (CH20 °C = 93,5%), Na2SO4 (CH20 °C = 93%), K2SO4 (CH20 °C = 98%), KHSO4 (CH20 °C = 86%), MgSO4 (CH20 °C = 90%), ZnSO4 (CH20 °C = 90%) e citrato de sódio (CH25 °C = 86%). Outros exemplos incluem NaH2PO4, (NH4)H2PO4, CuSO4, Mg(NO3)2, acetato de magnésio, acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato
108 / 175 de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, potássio citrato, sorbato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco e sorbato de zinco.
[00259] O sal pode estar em forma anidra ou pode ser um sal hidratado, i.e., um sal cristalino hidratado com água(s) de cristalização ligada(s), tal como descrito em WO 99/32595. Exemplos específicos incluem sulfato de sódio anidro (Na2SO4), sulfato de magnésio anidro (MgSO4), sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgSO4.7H2O), sulfato de zinco hepta-hidratado (ZnSO4.7H2O), fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado (Na2HPO4.7H2O), nitrato de magnésio hexa-hidratado (Mg(NO3)2(6H2O)), citrato de sódio di- hidratado e acetato de magnésio tetra-hidratado.
[00260] Preferencialmente, o sal é aplicado como uma solução do sal, por exemplo, usando um leito fluidizado.
[00261] Um revestimento de cera pode compreender pelo menos 60% em peso de uma cera, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% em peso.
[00262] Exemplos específicos de ceras são polietilenoglicóis; polipropilenos; cera de Carnaúba; cera de Candelila; cera de abelha; óleo vegetal hidrogenado ou sebo animal tal como polietilenoglicol (PEG), celulose de metila e hidróxi-propila (MHPC), álcool de polivinila (PVA), sebo de boi hidrogenado, óleo de palma hidrogenado, óleo de sementes de algodão hidrogenado e/ou de soja hidrogenado; álcoois de ácidos graxos; monoglicerídeos e/ou diglicerídeos, tais como estearato de glicerila, em que o estearato é uma mistura de ácido esteárico e palmítico; cera microcristalina; parafinas; e ácidos graxos, tais como ácidos graxos de cadeia longa linear hidrogenados e seus derivados. Uma cera preferencial é óleo de palma ou óleo de palma hidrogenado.
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[00263] O grânulo pode compreender um núcleo compreendendo a protease da invenção, um ou mais revestimentos de sal e um ou mais revestimentos de cera. Exemplos de grânulos de enzimas com múltiplos revestimentos são mostrados em WO 93/07263, WO 97/23606 e WO 2016/149636.
[00264] Os granulados sem formação de poeira podem ser produzidos, por exemplo, como divulgado nas Patentes dos E.U.A. Nos. 4,106,991 e 4,661,452 e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na técnica. Os materiais de revestimento podem ser materiais de revestimento cerosos e materiais de revestimento formadores de filme. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e nos quais existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de filme adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dados em GB 1483591.
[00265] O granulado pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais. Cada enzima estará então presente em mais grânulos assegurando uma distribuição mais uniforme das enzimas e também reduz a segregação física de diferentes enzimas devido a diferentes tamanhos de partículas. Métodos para produzir os cogranulados com várias enzimas são divulgados na divulgação ip.com IPCOM000200739D.
[00266] Outro exemplo de formulação de enzimas pelo uso de cogranulados é divulgado em WO 2013/188331.
[00267] A presente invenção se relaciona também com enzimas protegidas preparadas de acordo com o método divulgado em EP 238.216.
[00268] Assim, em um outro aspecto, a presente invenção fornece um
110 / 175 grânulo que compreende: (a) um núcleo compreendendo uma protease de acordo com a invenção e (b) um revestimento consistindo em uma ou mais camada(s) rodeando o núcleo.
[00269] Em uma modalidade, o revestimento compreende um revestimento de sal como descrito aqui. Em uma modalidade, o revestimento compreende um revestimento de cera como descrito aqui. Em uma modalidade, o revestimento compreende um revestimento de sal seguido por um revestimento de cera, conforme descrito no presente documento. Ração Animal
[00270] A presente invenção se relaciona também com ração animal compreendendo uma ou mais proteases da invenção. Em uma modalidade, a invenção se relaciona com ração animal compreendendo o aditivo de ração do aspecto um, dois ou três e material à base de planta. Em uma modalidade, a invenção se relaciona com ração animal compreendendo o grânulo do aspecto quatro e material à base de planta. Em uma modalidade, a invenção se relaciona com ração animal compreendendo a formulação líquida do aspecto cinco e material à base de planta.
[00271] A invenção se relaciona adicionalmente com ração animal peletizada. A ração animal peletizada pode ser preparada por peletização da ração animal como descrito no parágrafo acima. Assim, em uma modalidade, a invenção se relaciona com ração animal peletizada compreendendo o aditivo de ração do aspecto um, dois ou três e material à base de planta. Em uma modalidade, a invenção se relaciona com ração animal peletizada compreendendo o grânulo do aspecto quatro e material à base de planta. Em uma modalidade, a invenção se relaciona com ração animal peletizada compreendendo a formulação líquida do aspecto cinco e material à base de planta.
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[00272] Em uma modalidade, o material à base de planta compreende leguminosas, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, maís, milho, sorgo, gramínea, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão-tropeiro, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, feijão francês, feijão largo (feijão-fava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba-sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma sua forma processada (tal como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer sua combinação. Em uma modalidade preferencial, o material à base de planta é farelo de soja.
[00273] As composições ou dietas de rações animais têm um teor de proteína relativamente elevado. As dietas de aves domésticas e porcos podem ser caracterizadas como indicado na Tabela B de WO 01/58275, colunas 2-3. As dietas de peixes podem ser caracterizadas como indicado na coluna 4 desta Tabela B. Além do mais, tais dietas de peixes têm um teor de gordura em bruto de 200-310 g/kg.
[00274] Uma composição de ração animal de acordo com a invenção tem um teor de proteína em bruto de 50-800 g/kg e, além do mais, compreende pelo menos uma protease como reivindicado aqui.
[00275] Além do mais, ou alternativamente (ao teor de proteína em bruto indicado acima), a composição de ração animal da invenção tem um teor de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg; e/ou um teor de cálcio de 0,1- 200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1- 150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5-50 g/kg.
[00276] Em modalidades particulares, o teor de energia metabolizável, proteína em bruto, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína e/ou lisina está dentro de qualquer uma das gamas 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B de WO 01/58275 (R. 2-5).
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[00277] A proteína em bruto é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator 6,25, i.e., proteína em bruto (g/kg) = N (g/kg) x 6,25. O teor de nitrogênio é determinado pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14a ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).
[00278] A energia metabolizável pode ser calculada com base na publicação NRC Nutrient requirements in swine, nona edição revista 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6 e a European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Holanda. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN, 90- 71463-12-5.
[00279] O teor na dieta de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos em dietas animais completas é calculado com base em tabelas de rações tais como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN, 90-72839-13-7.
[00280] Em uma modalidade particular, a composição de ração animal da invenção contém pelo menos uma proteína vegetal como definido acima.
[00281] A composição de ração animal da invenção pode também conter proteína animal, tal como Farelo de Carne e Ossos, Farelo de penas e/ou Farelo de Peixe, tipicamente em uma quantidade de 0-25%. A composição de ração animal da invenção pode também compreender Grãos Secos Destilados com Solúveis (DDGS), tipicamente em quantidades de 0- 30%.
[00282] Ainda em modalidades adicionais particulares, a composição de ração animal da invenção contém 0-80% de maís; e/ou 0-80% de sorgo; e/ou 0-70% de trigo; e/ou 0-70% de Cevada; e/ou 0-30% de aveia; e/ou 0-
113 / 175 40% de farelo de soja; e/ou 0-25% de farelo de peixe; e/ou 0-25% de farelo de carne e ossos; e/ou 0-20% de trigo.
[00283] A ração animal pode compreender proteínas vegetais. Em modalidades particulares, o teor de proteína das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% (p/p). As proteínas vegetais podem ser derivadas a partir de fontes de proteínas vegetais, como leguminosas e cereais, por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, tais como farelo de soja, farelo de tremoço, farelo de colza e suas combinações.
[00284] Em uma modalidade particular, a fonte de proteína vegetais é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo, soja, tremoço, ervilha ou feijão. Em outra modalidade, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo, beterraba, beterraba-sacarina, espinafre ou quinoa. Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são colza e couve. Em outra modalidade, a soja é uma fonte de proteína vegetal preferencial. Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são cereais tais como cevada, trigo, centeio, aveia, maís (milho), arroz e sorgo.
[00285] As dietas animais podem, por exemplo, ser fabricadas como ração em purê (não peletizada) ou ração peletizada. Tipicamente, os gêneros alimentares moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminais e minerais essenciais são adicionadas de acordo com as especificações para a espécie em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações de enzimas sólidas ou líquidas. Por exemplo, para ração em purê uma formulação de enzima sólida ou líquida pode ser adicionada antes do ou durante o passo de mistura de ingredientes. Para ração peletizada, a preparação de protease/enzimas (líquida ou sólida) pode ser também adicionada antes do ou durante o passo de ingredientes da ração. Tipicamente, uma preparação de protease/enzima líquida compreende a protease da
114 / 175 invenção opcionalmente com um poliol, tal como glicerol, etilenoglicol ou propilenoglicol, e é adicionada após o passo de peletização, tal como por pulverização da formulação líquida nos péletes. A enzima pode ser também incorporada em um aditivo ou pré-mistura de ração.
[00286] Alternativamente, a protease pode ser preparada por congelação de uma mistura de solução de enzima líquida com um agente de volume tal como farelo de soja moída e, depois, liofilização da mistura.
[00287] A concentração de enzima final na dieta está dentro da gama de 0,01-200 mg de proteína de enzima por kg de dieta, preferencialmente entre 0,05-100 mg/kg de dieta, mais preferencialmente 0,1-50 mg, ainda mais preferencialmente 0,2-20 mg de proteína de enzima por kg de dieta animal.
[00288] Está presentemente contemplado que a enzima seja administrada em uma ou mais das seguintes quantidades (gamas de dosagem): 0,01-200; 0,05-100; 0,1-50; 0,2-20; 0,1-1; 0,2-2; 0,5-5; ou 1-10; – sendo todas estas gamas em mg de proteína de protease por kg de ração (ppm).
[00289] Para determinação de mg de proteína protease por kg de ração, a protease é purificada a partir da composição de ração, e a atividade específica da protease purificada é determinada usando um ensaio relevante (ver sob atividade de protease). A atividade de protease da composição de ração como tal é também determinada usando o mesmo ensaio e, com base em estas duas determinações, a dosagem em mg de proteína protease por kg de ração é calculada.
[00290] Em uma modalidade particular, o aditivo de ração animal da invenção se destina a estar incluído (ou prescrito como tendo de estar incluído) em dietas ou ração animais a níveis de 0,01 a 10,0%; mais particularmente 0,05 a 5,0%; ou 0,2 a 1,0% (significando % g de aditivo por 100 g de ração). Isto é assim em particular para pré-misturas.
[00291] Os mesmos princípios se aplicam para determinação de mg de proteína protease em aditivos de ração. Obviamente, se uma amostra da
115 / 175 protease usada para preparação do aditivo de ração ou da ração estiver disponível, a atividade específica é determinada a partir desta amostra (nenhuma necessidade de purificar a protease a partir da composição ou aditivo de ração). Enzimas Adicionais
[00292] Em outra modalidade, as composições descritas aqui incluem opcionalmente uma ou mais enzimas. As enzimas podem ser classificadas com base no manual Enzyme Nomenclature de NC-IUBMB, 1992, ver também o site ENZYME na internet: www.expasy.ch/enzyme/. ENZYME é um repositório de informação em relação à nomenclatura de enzimas. O mesmo é maioritariamente com base nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB), Academic Press, Inc., 1992, e descreve cada tipo de enzima caracterizada para a qual um número de EC (Comissão de Enzima) foi proporcionado (Bairoch, 2000, The ENZYME database, Nucleic Acids Res. 28: 304-305). Esta nomenclatura de IUB-MB Enzyme é baseada na sua especificidade pelo substrato e ocasionalmente no seu mecanismo molecular; uma tal classificação não reflete as características estruturais destas enzimas.
[00293] Outra classificação de certas enzimas glicosídeo hidrolases, tais como endoglucanase, galactanase, mananase, dextranase, lisozima e galactosidase, é descrita em Henrissat et al, “The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013”, Nucl. Acids Res. (1 de janeiro de 2014) 42 (D1): D490-D495; ver também www.cazy.org.
[00294] Assim, a composição da invenção pode também compreender pelo menos uma outra enzima selecionada do grupo compreendendo acetilxilana esterase (EC 3.1.1.23), acilglicerol lipase (EC 3.1.1.72), alfa- amilase (EC 3.2.1.1), beta-amilase (EC 3.2.1.2), arabinofuranosidase (EC
3.2.1.55), celobio-hidrolase (EC 3.2.1.91), celulase (EC 3.2.1.4), feruloil esterase (EC 3.1.1.73), galactanase (EC 3.2.1.89), alfa-galactosidase (EC
116 / 175
3.2.1.22), beta-galactosidase (EC 3.2.1.23), beta-glucanase (EC 3.2.1.6), beta- glucosidase (EC 3.2.1.21), triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3), lisofosfolipase (EC 3.1.1.5), lisozima (EC 3.2.1.17), alfa-manosidase (EC 3.2.1.24), beta- manosidase (mananase) (EC 3.2.1.25), fitase (EC 3.1.3.8, EC 3.1.3.26, EC
3.1.3.72), fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32), fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4), fosfolipase D (EC 3.1.4.4), protease (EC 3.4), pululanase (EC 3.2.1.41), pectina esterase (EC 3.1.1.11), xilanase (EC 3.2.1.8, EC 3.2.1.136), beta- xilosidase (EC 3.2.1.37) ou qualquer sua combinação.
[00295] Em uma modalidade, a composição da invenção compreende uma galactanase (EC 3.2.1.89) e uma beta-galactosidase (EC 3.2.1.23).
[00296] Em uma modalidade, a composição da invenção compreende uma fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26). Exemplos de fitases comercialmente disponíveis incluem Bio-FeedTM Phytase (Novozymes), Ronozyme® P, Ronozyme® NP e Ronozyme® HiPhos (DSM Nutritional Products), NatuphosTM (BASF), NatuphosTM E (BASF), Finase® e Quantum® Blue (AB Enzymes), OptiPhos® (Huvepharma), AveMix® Phytase (Aveve Biochem), Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) e Axtra® PHY (DuPont). Outras fitases preferenciais incluem aquelas descritas em, por exemplo, WO 98/28408, WO 00/43503 e WO 03/066847.
[00297] Em uma modalidade, a composição da invenção compreende uma xilanase (EC 3.2.1.8). Exemplos de xilanases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® WX (DSM Nutritional Products), Econase® XT e Cevada (AB Vista), Xylathin® (Verenium), Hostazym® X (Huvepharma), Axtra® XB (Xilanase/beta-glucanase, DuPont) e Axtra® XAP (Xilanase/amilase/protease, DuPont), AveMix® XG 10 (xilanase/glucanase) e AveMix® 02 CS (xilanase/glucanase/pectinase, Aveve Biochem) e Naturgrain (BASF).
[00298] Em uma modalidade, a composição da invenção compreende uma protease (EC 3.4). Exemplos de proteases comercialmente disponíveis
117 / 175 incluem Ronozyme® ProAct (DSM Nutritional Products), Winzyme Pro Plus® (Suntaq International Limited) e Cibenza® DP100 (Novus International).
[00299] Em uma modalidade, a composição da invenção compreende uma alfa-amilase (EC 3.2.1.1). Exemplos de alfa-amilases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® A e RONOZYME® RumiStar™ (DSM Nutritional Products).
[00300] Em uma modalidade, a composição da invenção compreende um produto de enzima com múltiplos componentes, tal como FRA® Octazyme (Framelco), Ronozyme® G2, Ronozyme® VP e Ronozyme® MultiGrain (DSM Nutritional Products), Rovabio® Excel ou Rovabio® Advance (Adisseo), Endofeed® DC (Endo-1,3(4)-β-glucanase e endo-1,4-β- xilanase, Andres Pintaluba SA) ou Amylofeed® (endo-1,3(4)-β-glucanase e endo-1,4-β-xilanase e α-amilase, Andres Pintaluba SA). Eubióticos
[00301] Os eubióticos são compostos que são desenhados para dar um equilíbrio saudável da microflora no trato gastrointestinal. Os eubióticos abrangem um número de aditivos de ração diferentes, tais como probióticos, prebióticos, fitogênicos (óleos essenciais) e ácidos orgânicos que são descritos em mais detalhe em baixo. Probióticos
[00302] Em uma modalidade, a composição de ração animal compreende adicionalmente um ou mais probióticos adicionais. Em uma modalidade, a composição de ração animal compreende adicionalmente uma bactéria de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera ou qualquer sua combinação.
[00303] Em uma modalidade, a composição de ração animal compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes
118 / 175 estirpes: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp.
[00304] Em uma modalidade, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes estirpes de Bacillus subtilis: 3A-P4 (PTA-6506), 15A-P4 (PTA- 6507), 22C-P1 (PTA-6508), 2084 (NRRL B-500130), LSSA01 (NRRL-B- 50104), BS27 (NRRL B-501 05), BS 18 (NRRL B-50633), BS 278 (NRRL B-50634), DSM 29870, DSM 29871, DSM 32315, NRRL B-50136, NRRL B-50605, NRRL B-50606, NRRL B-50622 e PTA-7547.
[00305] Em uma modalidade, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes estirpes de Bacillus pumilus: NRRL B-50016, ATCC 700385, NRRL B-50885 ou NRRL B-50886.
[00306] Em uma modalidade, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes estirpes de Bacillus lichenformis: NRRL B-50015, NRRL B- 50621 ou NRRL B-50623.
[00307] Em uma modalidade, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes estirpes de Bacillus amyloliquefaciens: DSM 29869, DSM 29869, NRRL B 50607, PTA-7543, PTA-7549, NRRL B-50349, NRRL B- 50606, NRRL B-50013, NRRL B-50151, NRRL B-50141, NRRL B-50147
119 / 175 ou NRRL B-50888.
[00308] A contagem bacteriana de cada uma das estirpes bacterianas na composição de ração animal é entre 1x104 e 1x1014 CFU/kg de matéria seca, preferencialmente entre 1x106 e 1x1012 CFU/kg de matéria seca e, mais preferencialmente, entre 1x107 e 1x1011 CFU/kg de matéria seca. Em uma modalidade, a contagem bacteriana de cada uma das estirpes bacterianas na composição de ração animal é entre 1x108 e 1x1010 CFU/kg de matéria seca.
[00309] A contagem bacteriana de cada uma das estirpes bacterianas na composição de ração animal é entre 1x105 e 1x1015 CFU/animal/dia, preferencialmente entre 1x107 e 1x1013 CFU/animal/dia e, mais preferencialmente, entre 1x108 e 1x1012 CFU/animal/dia. Em uma modalidade, a contagem bacteriana de cada uma das estirpes bacterianas na composição de ração animal é entre 1x109 e 1x1011 CFU/animal/dia. Em uma modalidade, a quantidade de probióticos é 0,001% a 10% em peso da composição.
[00310] Em outra modalidade, a uma ou mais estirpes bacterianas estão presentes na forma de um esporo estável.
[00311] Exemplos de produtos comerciais são Cylactin® (DSM Nutritional Products), Alterion (Adisseo), Enviva PRO (DuPont Animal Nutrition), Syncra® (enzima + probiótico misturados, DuPont Animal Nutrition), Ecobiol® e Fecinor® (Norel/Evonik) e GutCare® PY1 (Evonik). Prebióticos
[00312] Os prebióticos são substâncias que induzem o crescimento ou atividade de microrganismos (por exemplo, bactérias e fungos) que contribuem para o bem-estar do seu hospedeiro. Os prebióticos são tipicamente compostos de fibra não digeríveis que passam não digeridos através da parte superior do trato gastrointestinal e estimulam o crescimento ou atividade de bactérias vantajosas que colonizam o intestino grosso por atuando como substrato para os mesmos. Normalmente, os prebióticos
120 / 175 aumentam o número ou atividade de bifidobactérias e bactérias do ácido láctico no trato GI.
[00313] Os derivados de levedura (leveduras totais desativadas ou paredes de célula de levedura) podem ser também considerados como prebióticos. Compreendem adicionalmente manano-oligossacarídeos, beta- glucanas de levedura ou conteúdos de proteína e são normalmente derivados a partir da parede de célula da levedura, Saccharomyces cerevisiae.
[00314] Em uma modalidade, a quantidade de prebióticos é 0,001% a 10% em peso da composição. Exemplos de produtos de levedura são Yang® e Agrimos (Lallemand Animal Nutrition). Fitogênicos
[00315] Os fitogênicos são um grupo de promotores de crescimento natural ou promotores de crescimento não antibióticos usados como aditivos de ração, derivados de ervas, especiarias ou outras plantas. Os fitogênicos podem ser substâncias únicas preparadas a partir de óleos essenciais/extratos, óleos essenciais/extratos, plantas únicas e mistura de plantas (produtos herbáceos) ou mistura de óleos essenciais/extratos/plantas (produtos especializados).
[00316] Exemplos de fitogênicos são alecrim, sálvia, orégano, tomilho, cravo e erva-limão. Exemplos de óleos essenciais são timol, eugenol, metacresol, vanilina, salicilato, resorcina, guajacol, gingerol, óleo de lavanda, iononas, irona, eucaliptol, mentol, óleo de hortelã-pimenta, alfa-pineno; limoneno, anetol, linalol, di-hidrojasmonato de metila, carvacrol, ácido propiônico/propionato, ácido acético/acetato, ácido butírico/butirato, óleo de alecrim, óleo de cravo, geraniol, terpineol, citronelol, salicilato de amila e/ou benzila, cinamaldeído, polifenol de planta (tanino), extrato de açafrão e curcuma.
[00317] Em uma modalidade, a quantidade de fitogênicos é 0,001% a 10% em peso da composição. Exemplos de produtos comerciais são Crina®
121 / 175 (DSM Nutritional Products); CinergyTM, BiacidTM, ProHacidTM Classic e ProHacidTM AdvanceTM (todos Promivi/Cargill) e Envivo EO (DuPont Animal Nutrition). Ácidos Orgânicos
[00318] Os ácidos orgânicos (C1-C7) são amplamente distribuídos na natureza como constituintes normais de plantas ou tecidos animais. São também formados através de fermentação microbiana de carboidratos maioritariamente no intestino grosso. São frequentemente usados na produção de suínos e aves domésticas como uma substituição de promotores de crescimento antibiótico uma vez que têm um efeito preventivo nos problemas intestinais como enterite necrótica em galinhas e infecção por Escherichia coli em porcos jovens. Os ácidos orgânicos podem ser vendidos como monocomponentes ou misturas de tipicamente 2 ou 3 ácidos orgânicos diferentes. Exemplos de ácidos orgânicos são ácidos graxos de cadeia curta (por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico), ácidos graxos de cadeia média (por exemplo, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico), ácidos di/tri-carboxílicos (por exemplo, ácido fumárico), hidroxiácidos (por exemplo, ácido láctico), ácidos aromáticos (por exemplo, ácido benzoico), ácido cítrico, ácido sórbico, ácido málico e ácido tartárico ou seu sal (tipicamente sal de sódio ou potássio tal como diformato de potássio ou butirato de sódio).
[00319] Em uma modalidade, a quantidade de ácido orgânico é 0,001% a 10% em peso da composição. Exemplos de produtos comerciais são VevoVitall® (DSM Nutritional Products), Amasil®, Luprisil®, Lupro-Grain®, Lupro-Cid®, Lupro-Mix® (BASF), n-Butyric Acid AF (OXEA) e Adimix Precision (Nutriad). Pré-mistura
[00320] A incorporação da composição de aditivos de ração como exemplificado anteriormente a rações animais, por exemplo rações de aves
122 / 175 domésticas, é na prática levada a cabo usando um concentrado ou uma pré- mistura. Uma pré-mistura designa uma mistura preferencialmente uniforme de um ou mais microingredientes com diluente e/ou transportador. As pré- misturas são usadas para facilitar a dispersão uniforme de microingredientes em uma mistura maior. Uma pré-mistura de acordo com a invenção pode ser adicionada aos ingredientes de ração ou à água potável como sólidos (por exemplo como pó solúvel em água) ou líquidos. Aminoácidos
[00321] A composição da invenção pode compreender adicionalmente um ou mais aminoácidos. Exemplos de aminoácidos que são usados em ração animal são lisina, alanina, beta-alanina, treonina, metionina e triptofano. Em uma modalidade, a quantidade de aminoácido é 0,001% a 10% em peso da composição. Vitaminas e Minerais
[00322] Em outra modalidade, a ração animal pode incluir uma ou mais vitaminas, tal como uma ou mais vitaminas solúveis em gordura e/ou uma ou mais vitaminas solúveis em água. Em outra modalidade, a ração animal pode incluir opcionalmente um ou mais minerais, tal como um ou mais minerais vestigiais e/ou um ou mais macrominerais.
[00323] Usualmente, as vitaminas solúveis em gordura e água, bem como minerais vestigiais, formam parte de uma assim chamada pré-mistura destinada à adição à ração, ao passo que os macrominerais são usualmente adicionados separadamente à ração.
[00324] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em gordura incluem vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo, vitamina K3.
[00325] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em água incluem vitamina C, vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D-
123 / 175 pantotenato.
[00326] Exemplos não limitantes de minerais vestigiais incluem boro, cobalto, cloreto, crômio, cobre, flúor, iodo, ferro, manganês, molibdênio, iodo, selênio e zinco.
[00327] Exemplos não limitantes de macrominerais incluem cálcio, magnésio, fósforo, potássio e sódio.
[00328] Em uma modalidade, a quantidade de vitaminas é 0,001% a 10% em peso da composição. Em uma modalidade, a quantidade de minerais é 0,001% a 10% em peso da composição.
[00329] Os requisitos nutricionais destes componentes (exemplificadas com ave domésticas e leitões/porcos) são listados na Tabela A de WO 01/58275. Requisito nutricional significa que estes componentes devem ser proporcionados na dieta nas concentrações indicadas.
[00330] Em alternativa, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A de WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um de, um ou mais do que, um ou dois ou três ou quatro e assim por diante até todos os treze, ou até todos os quinze, componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual é incluído no aditivo da invenção em uma tal quantidade de modo a proporcionar uma concentração na ração dentro da gama indicada na coluna quatro ou coluna cinco ou coluna seis da Tabela A.
[00331] Em uma modalidade ainda adicional, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos uma das vitaminas em baixo, preferencialmente para proporcionar uma concentração em ração dentro das gamas especificadas na Tabela 1 em baixo (para dietas de leitões e dietas de frangos de corte, respectivamente). Tabela 1: Recomendações típicas de vitaminas Vitamina Dieta de leitões Dieta de frangos de corte
124 / 175 Vitamina A 10.000-15.000 IU/kg de ração 8-12.500 IU/kg de ração Vitamina D3 1800-2000 IU/kg de ração 3000-5000 IU/kg de ração Vitamina E 60-100 mg/kg de ração 150-240 mg/kg de ração Vitamina K3 2-4 mg/kg de ração 2-4 mg/kg de ração Vitamina B1 2-4 mg/kg de ração 2-3 mg/kg de ração Vitamina B2 6-10 mg/kg de ração 7-9 mg/kg de ração Vitamina B6 4-8 mg/kg de ração 3-6 mg/kg de ração Vitamina B12 0,03-0,05 mg/kg de ração 0,015-0,04 mg/kg de ração Niacina (Vitamina B3) 30-50 mg/kg de ração 50-80 mg/kg de ração Ácido pantotênico 20-40 mg/kg de ração 10-18 mg/kg de ração Ácido fólico 1-2 mg/kg de ração 1-2 mg/kg de ração Biotina 0,15-0,4 mg/kg de ração 0,15-0,3 mg/kg de ração Cloreto de colina 200-400 mg/kg de ração 300-600 mg/kg de ração Outros ingredientes de ração
[00332] A composição da invenção pode compreender adicionalmente agentes corantes, estabilizantes, aditivos de melhoramento do crescimento e compostos de aroma/aromatizantes, ácidos graxos polinsaturados (PUFA); espécies geradoras de oxigênio reativo, antioxidantes, peptídeos antimicrobianos, polipeptídeos antifúngicos e compostos de gestão de micotoxina.
[00333] Exemplos de agentes corantes são carotenoides tais como beta- caroteno, astaxantina e luteína.
[00334] Exemplos de compostos de aroma/aromatizantes são creosol, anetol, deca-, undeca- e/ou dodeca-lactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, ftalídeo de propilideno, ftalídeo de butilideno, capsaícina e tanina.
[00335] Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina e Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas e Estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos divulgados em WO 03/044049 e WO 03/048148, bem como variantes ou fragmentos do supracitado que retêm atividade antimicrobiana.
[00336] Exemplos de polipeptídeos antifúngicos (AFP) são os peptídeos de Aspergillus giganteus e Aspergillus niger, bem como suas variantes e fragmentos que retêm atividade antifúngica, como divulgado em WO 94/01459 e WO 02/90384.
[00337] Exemplos de ácidos graxos polinsaturados são ácidos graxos
125 / 175 polinsaturados C18, C20 e C22, tais como ácido araquidônico, ácido docoso- hexenoico, ácido eicosapentenoico e ácido gama-linoleico.
[00338] Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são químicos tais como perborato, persulfato ou percarbonato; e enzimas tais como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.
[00339] Os antioxidantes podem ser usados para limitar o número de espécies reativas de oxigênio que podem ser geradas tal que o nível de espécies reativas de oxigênio esteja em equilíbrio com os antioxidantes.
[00340] As micotoxinas, tais como desóxinivalenol, aflatoxina, zearalenona e fumonisina, podem ser encontradas em ração animal e podem resultar em desempenho animal negativo ou doença. Compostos que podem gerir os níveis de micotoxina, tal como através de desativação da micotoxina ou através da ligação da micotoxina, podem ser adicionados à ração para melhorar estes efeitos negativos. Exemplos de compostos de gestão de micotoxina são Vitafix®, Vitafix Ultra (Nuscience), Mycofix®, Mycofix® Secure, FUMzyme®, Biomin® BBSH, Biomin® MTV (Biomin), Mold-Nil®, Toxi-Nil® e Unike® Plus (Nutriad). Métodos de Preparação de uma Ração Animal
[00341] A invenção se relaciona adicionalmente com um método de preparação de uma ração animal, compreendendo mistura do aditivo de ração animal do aspecto um, dois ou três com pelo menos uma proteína ou fonte de proteína. A invenção se relaciona adicionalmente com um método de preparação de uma ração animal, compreendendo mistura do grânulo do aspecto quatro com pelo menos uma proteína ou fonte de proteína. A invenção se relaciona adicionalmente com um método de preparação de uma ração animal, compreendendo mistura da formulação líquida do aspecto cinco com pelo menos uma proteína ou fonte de proteína.
[00342] Em uma modalidade, a proteína ou fonte de proteína compreende leguminosas, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, maís, milho,
126 / 175 sorgo, gramínea, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão-tropeiro, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, feijão francês, feijão largo (feijão-fava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba-sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma sua forma processada (tal como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer sua combinação. Em uma modalidade preferencial, a proteína ou fonte de proteína é farelo de soja.
[00343] A invenção se relaciona adicionalmente com um método de preparação de uma ração animal compreendendo aplicação da formulação líquida do aspecto cinco em material à base de planta. Em uma modalidade, a formulação líquida é aplicada através de uma pulverização. Em uma modalidade adicional, o material à base de planta compreende leguminosas, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, maís, milho, sorgo, gramínea, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão- tropeiro, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, feijão francês, feijão largo (feijão-fava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba-sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma sua forma processada (tal como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer sua combinação. Em uma modalidade preferencial, o material à base de planta é farelo de soja. Métodos de Melhoria do Desempenho Animal
[00344] A invenção se relaciona adicionalmente com um método de melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho de um animal, compreendendo administração a um ou mais animais do aditivo de ração animal do aspecto um, dois ou três. A invenção se relaciona adicionalmente com um método de melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho de um animal, compreendendo administração a um ou mais animais do grânulo do aspecto quatro. A invenção se relaciona adicionalmente com um método
127 / 175 de melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho de um animal, compreendendo administração a um ou mais animais da formulação líquida do aspecto cinco.
[00345] Em uma modalidade, uma ração animal é preparada a partir do aditivo de ração animal, grânulo ou formulação líquida como descrito aqui e administrada ao animal. A invenção se relaciona adicionalmente com um método de melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho de um animal, compreendendo administração a um ou mais animais de uma ração animal ou ração animal peletizada compreendendo a protease S8 da invenção.
[00346] Em uma modalidade, “melhoria do desempenho de um animal” significa que existe um aumento no ganho de peso corporal. Em outra modalidade, “melhoria do desempenho de um animal” significa que existe uma taxa de conversão de ração melhorada. Em uma modalidade adicional, “melhoria do desempenho de um animal” significa que existe uma eficiência de ração aumentada. Em uma modalidade adicional, “melhoria do desempenho de um animal” significa que existe um aumento no ganho de peso corporal e/ou uma taxa de conversão de ração melhorada e/ou uma eficiência de ração aumentada. Método para melhoria do valor nutricional de ração animal
[00347] O termo melhoria do valor nutricional de uma ração animal significa melhoria da disponibilidade de nutrientes na ração. Em esta invenção, melhoria dos valores nutricionais se refere em particular à melhoria da disponibilidade da fração de proteína da ração, levando deste modo a extração de proteínas aumentada, rendimentos de proteínas mais elevados e/ou utilização de proteínas melhorada. Quando o valor nutricional da ração é aumentado, a digestibilidade das proteínas e/ou aminoácidos é aumentada e a taxa de crescimento e/ou ganho de peso e/ou conversão de ração (i.e., o peso de ração ingerida em relação ao ganho de peso) do animal poderiam ser melhorados.
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[00348] Assim, a invenção se relaciona adicionalmente com um método de melhoria do valor nutricional de uma ração animal, compreendendo adição do aditivo de ração animal do aspecto um, dois ou três à ração. Assim, a invenção se relaciona adicionalmente com um método de melhoria do valor nutricional de uma ração animal, compreendendo adição do grânulo do aspecto quatro à ração. Assim, a invenção se relaciona adicionalmente com um método de melhoria do valor nutricional de uma ração animal, compreendendo adição da formulação líquida do aspecto cinco à ração.
[00349] Em uma modalidade, a ração compreende leguminosas, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, maís, milho, sorgo, gramínea, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão- tropeiro, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, feijão francês, feijão largo (feijão-fava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba-sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma sua forma processada (tal como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer sua combinação. Em uma modalidade preferencial, a ração compreende farelo de soja. Usos
[00350] A presente invenção está também dirigida a métodos para uso dos polipeptídeos tendo atividade de protease, ou suas composições, para, por exemplo, ração animal. Uso em Ração Animal
[00351] Uma protease da invenção pode ser também usada em ração animal. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um método para preparação de uma composição de ração animal compreendendo adição de uma ou mais proteases da presente invenção a um ou mais ingredientes de ração animal.
[00352] A uma ou mais proteases da presente invenção podem ser
129 / 175 também usadas em ração animal como enzimas intensificadoras da ração que melhoram a digestibilidade da ração para melhorar a eficácia de sua utilização de acordo com WO 00/21381 e WO 2004/026334.
[00353] Em uma modalidade adicional, uma protease da presente invenção pode ser usada em uma ração animal ou como um aditivo de ração, onde pode proporcionar um efeito positivo no trato digestivo animal e deste modo melhorar o desempenho animal de acordo com ganho de peso, razão de conversão de ração (FCR), Fator de Eficiência de Produção Europeu (EPEF), Fator de Eficácia de Produção Europeu (FEP) ou saúde animal melhorada tal como taxa de mortalidade diminuída. A FCR é calculada como a ingestão de ração em g/animal em relação ao ganho de peso em g/animal.
[00354] No uso de acordo com a invenção, as proteases podem ser alimentadas ao animal antes da, após a ou simultaneamente com a dieta. Esta última é preferencial.
[00355] Em uma modalidade, a forma da protease quando é adicionada à ração ou quando é incluída em um aditivo de ração está bem definida. Bem definida significa que a preparação de protease é pelo menos 50% pura como determinado por Cromatografia de exclusão por tamanhos (ver Exemplo 12 de WO 01/58275). Em outras modalidades, a preparação de protease é pelo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 ou pelo menos 95% pura como determinado por este método.
[00356] Uma preparação de protease bem definida é vantajosa. Por exemplo é muito mais fácil dosear corretamente na ração uma protease que esteja essencialmente isenta de interferir ou contaminar outras proteases. O termo dosar corretamente se refere em particular ao objetivo de se obterem resultados consistentes e constantes e à capacidade de otimização da dosagem com base no efeito desejado.
[00357] Para o uso em ração animal, no entanto, a protease não necessita de ser pura; pode, por exemplo, incluir outras enzimas, caso esse em
130 / 175 que poderia ser denominada uma preparação de protease.
[00358] A preparação de protease pode ser (a) diretamente adicionada à ração ou (b) pode ser usada na produção de uma ou mais composições intermediárias tais como aditivos ou pré-misturas de ração que são subsequentemente adicionadas à ração (ou usados em um processo de tratamento). O grau de pureza descrito acima se refere à pureza da preparação de protease original, usada de acordo com (a) ou (b) acima.
[00359] As preparações de protease com purezas desta ordem de magnitude são em particular obteníveis usando métodos recombinantes de produção, ao passo que não são tão facilmente obtidas e também sujeitas a uma variação lote-para-lote muito mais elevada quando a protease é produzida por métodos de fermentação tradicionais.
[00360] Tal preparação de protease pode obviamente ser misturada com outras enzimas.
[00361] A proteína pode ser uma proteína animal, tal como farelo de carne e ossos, farelo de penas e/ou farelo de peixe; ou pode ser uma proteína vegetal.
[00362] O termo proteínas vegetais como usado aqui se refere a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclua pelo menos uma proteína derivada de ou tendo origem em um legume ou hortaliça, incluindo proteínas modificadas e derivados de proteína. Em modalidades, o teor de proteína das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50 ou 60% (p/p).
[00363] As proteínas vegetais podem ser derivadas a partir de fontes de proteínas vegetais, tais como leguminosas e cereais, por exemplo materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae e Poaceae, tais como farelo de soja, farelo de tremoço e farelo de colza.
[00364] Em uma modalidade particular, a fonte de proteína vegetais é
131 / 175 material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo, soja, tremoço, ervilha ou feijão.
[00365] Em outra modalidade, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo, beterraba, beterraba-sacarina, espinafre ou quinoa.
[00366] Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são colza, semente de girassol, semente de algodão e couve. Soja é uma fonte de proteína vegetal preferencial.
[00367] Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são cereais tais como cevada, trigo, centeio, aveia, maís (milho), arroz, triticale e sorgo.
[00368] Em uma modalidade de um processo de tratamento, a(s) protease(s) em questão está(ão) afetando as (ou atuando nas ou exercendo sua influência de hidrólise ou degradação nas) proteínas, tais como proteínas ou fontes de proteínas vegetais. Para alcançar isto, a proteína ou fonte de proteína é tipicamente suspensa em um solvente, por exemplo, um solvente aquoso tal como água, e os valores de pH e temperatura são ajustados prestando a devida atenção às características da enzima em questão. Por exemplo, o tratamento pode ter lugar a um valor de pH ao qual a atividade da protease real é pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou pelo menos 90%. Do mesmo modo, por exemplo, o tratamento pode ter lugar a uma temperatura à qual a atividade da protease real é pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou pelo menos 90%. As indicações de percentagens de atividade acima são em relação às atividades máximas. A reação enzimática é continuada até ser alcançado o resultado desejado, após o que pode ou não ser parada por inativação da enzima, por exemplo, por um passo de tratamento com calor.
[00369] Em outra modalidade de um processo de tratamento da invenção, a ação de protease é sustentada, significando, por exemplo, que a protease é adicionada às proteínas, mas sua influência de hidrólise não é por
132 / 175 assim dizer ligada até mais tarde quando desejado, logo que sejam estabelecidas condições de hidrólise adequadas ou logo que sejam inativados quaisquer inibidores de enzima ou quaisquer outros meios que possam ter sido aplicados para adiar a ação da enzima.
[00370] Em uma modalidade, o tratamento é um pré-tratamento de ração animal ou proteínas para uso em ração animal, i.e., as proteínas são hidrolisadas antes da toma.
[00371] O termo melhoria do valor nutricional de uma ração animal significa melhoria da disponibilidade de nutrientes na ração. Em esta invenção, melhoria dos valores nutricionais se refere em particular à melhoria da disponibilidade da fração de proteína da ração, levando deste modo a extração de proteínas aumentada, rendimentos de proteínas mais elevados e/ou utilização de proteínas melhorada. Quando o valor nutricional da ração é aumentado, a digestibilidade das proteínas e/ou aminoácidos é aumentada e a taxa de crescimento e/ou ganho de peso e/ou conversão de ração (i.e., o peso de ração ingerida em relação ao ganho de peso) do animal poderiam ser melhorados.
[00372] A protease pode ser adicionada à ração em qualquer forma, seja uma protease relativamente pura ou em mistura com adição com outros componentes destinados à adição à ração animal, i.e., na forma de aditivos de ração animal, tal como as assim chamadas pré-misturas para ração animal. Modalidades Adequadas da Invenção
[00373] Modalidades preferenciais da invenção são descritas no conjunto de itens em baixo.
[00374] 1. Um aditivo de ração animal compreendendo uma ou mais vitaminas e um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease, em que o polipeptídeo é uma protease S8 selecionada do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos
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88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3; (d) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 5; (f) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo
134 / 175 menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 9; (j) uma variante de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições;
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(k) uma variante de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (l) uma variante de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (m) uma variante de SEQ ID NO: 5, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (n) uma variante de SEQ ID NO: 6, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (o) uma variante de SEQ ID NO: 7, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
136 / 175 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (p) uma variante de SEQ ID NO: 8, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (q) uma variante de SEQ ID NO: 9, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (r) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), ou (i) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N- terminal e/ou C-terminal; (s) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), ou (i) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos; e (t) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), ou (i) tendo atividade de protease e tendo pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.
[00375] 2. O aditivo de ração animal do item 1, em que a protease S8 é obtida ou obtenível a partir da ordem taxonômica Bacillales, preferencialmente da família taxonômica Bacillaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Bacillus.
[00376] 3. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 ou 2, em que a protease S8 compreende o motivo TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG (SEQ ID NO: 4).
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[00377] 4. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 3, em que o aditivo de ração animal não compreende um tensoativo.
[00378] 5. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 4, em que a protease S8 tem pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.
[00379] 6. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 4, em que a protease S8 melhora a digestibilidade de nitrogênio ileal em pelo menos 1%, tal como pelo menos 1,5%, pelo menos 2,0%, pelo menos 2,5%, pelo menos 3,0%, pelo menos 3,5% ou pelo menos 4,0% em comparação com controle negativo.
[00380] 7. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 6, em que o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 314 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 311 de SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos 1 a 311 de SEQ ID NO: 3.
[00381] 8. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 7, compreendendo adicionalmente um ou mais componentes selecionados da lista consistindo em: uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; um ou mais prebióticos; um ou mais fitogênicos; um ou mais ácidos orgânicos; e um ou mais outros ingredientes de ração.
[00382] 9. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 8, compreendendo adicionalmente um ou mais agentes de formulação.
[00383] 10. O aditivo de ração animal do item 9, em que o um ou mais
138 / 175 agentes de formulação são selecionados do grupo consistindo em glicerol, etilenoglicol, 1,2-propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glucose, sacarose, sorbitol, lactose, amido e celulose ou qualquer sua combinação.
[00384] 11. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 10, compreendendo adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais.
[00385] 12. O aditivo de ração animal do item 11 em que a uma ou mais enzimas adicionais são selecionadas do grupo consistindo em acetilxilana esterase, acilglicerol lipase, amilase, alfa-amilase, beta-amilase, arabinofuranosidase, celobio-hidrolases, celulase, feruloil esterase, galactanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, beta-glucanase, beta- glucosidase, lisofosfolipase, lisozima, alfa-manosidase, beta-manosidase (mananase), fitase, fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase D, protease, pululanase, pectinesterase, triacilglicerol lipase, xilanase, beta-xilosidase ou qualquer sua combinação.
[00386] 13 O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 12, compreendendo adicionalmente um ou mais micróbios.
[00387] 14. O aditivo de ração animal do item 13, em que o um ou mais micróbios são selecionados do grupo consistindo em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium sp., Carnobacterium sp., Clostridium butyricum, Clostridium sp., Enterococcus faecium, Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Lactococcus sp., Leuconostoc sp., Megasphaera elsdenii, Megasphaera sp.,
139 / 175 Pediococsus acidilactici, Pediococcus sp., Propionibacterium thoenii, Propionibacterium sp. e Streptococcus sp. ou qualquer sua combinação.
[00388] 15. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 14, em que a protease S8 é formulada como um grânulo.
[00389] 16. O aditivo de ração animal do item 15, em que o grânulo compreende uma partícula de núcleo e um ou mais revestimentos.
[00390] 17. O aditivo de ração animal do item 16, em que o revestimento compreende um sal e/ou cera e/ou farinha.
[00391] 18. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 14, em que o aditivo está na forma de uma formulação líquida.
[00392] 19. O aditivo de ração animal do item 18, em que a protease S8 é doseada entre 0,001% e 25% p/p de formulação líquida, preferencialmente 0,01% e 25% p/p, mais preferencialmente 0,05% e 20% p/p, mais preferencialmente 0,2% e 15% p/p, ainda mais preferencialmente 0,5% e 15% p/p ou o mais preferencialmente 1,0% e 10% p/p de polipeptídeo.
[00393] 20. O aditivo de ração animal do item 18 ou 19, em que a formulação compreende adicionalmente 20% a 80% p/p de poliol.
[00394] 21. O aditivo de ração animal do item 20, em que o poliol é selecionado do grupo consistindo em glicerol, sorbitol, propilenoglicol (MPG), etilenoglicol, dietilenoglicol, trietilenoglicol, 1,2-propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, dipropilenoglicol, polietilenoglicol (PEG) tendo um peso molecular médio abaixo de cerca de 600 e polipropilenoglicol (PPG) tendo um peso molecular médio abaixo de cerca de 600 ou qualquer sua combinação.
[00395] 22. O aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 18 a 21, em que a formulação compreende adicionalmente 0,01% a 2,0% p/p de conservante.
[00396] 23. O aditivo de ração animal do item 22, em que o conservante é selecionado do grupo consistindo em sorbato de sódio, sorbato
140 / 175 de potássio, benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer sua combinação.
[00397] 24. Um grânulo compreendendo o aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 14.
[00398] 25. O grânulo do item 24, em que o grânulo compreende uma partícula de núcleo e um ou mais revestimentos.
[00399] 26. O grânulo do item 25, em que o revestimento compreende um sal e/ou cera e/ou uma farinha.
[00400] 27. Uma formulação líquida compreendendo o aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 14.
[00401] 28. A formulação líquida do item 27, em que a protease S8 é doseada entre 0,001% e 25% p/p de formulação líquida, preferencialmente 0,01% e 25% p/p, mais preferencialmente 0,05% e 20% p/p, mais preferencialmente 0,2% e 15% p/p, ainda mais preferencialmente 0,5% e 15% p/p ou o mais preferencialmente 1,0% e 10% p/p de polipeptídeo.
[00402] 29. A formulação líquida dos itens 27 ou 28, em que a formulação compreende adicionalmente 20% a 80% p/p de poliol.
[00403] 30. A formulação líquida do item 29, em que o poliol é selecionado do grupo consistindo em glicerol, sorbitol, propilenoglicol (MPG), etilenoglicol, dietilenoglicol, trietilenoglicol, 1,2-propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, dipropilenoglicol, polietilenoglicol (PEG) tendo um peso molecular médio abaixo de cerca de 600 e polipropilenoglicol (PPG) tendo um peso molecular médio abaixo de cerca de 600 ou qualquer sua combinação.
[00404] 31. A formulação líquida de qualquer um dos itens 27 a 30, em que a formulação compreende adicionalmente 0,01% a 2,0% p/p de conservante.
[00405] 32. A formulação líquida do item 31, em que o conservante é selecionado do grupo consistindo em sorbato de sódio, sorbato de potássio,
141 / 175 benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer sua combinação.
[00406] 33. Um método de preparação de uma ração animal compreendendo aplicação da formulação líquida de qualquer um dos itens 27 a 32 a material à base de planta.
[00407] 34. O método do item 33, em que a formulação líquida é aplicada através de uma pulverização.
[00408] 35. O método do item 33 ou 34, em que o material à base de planta compreende leguminosas, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, maís, milho, sorgo, gramínea, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão-tropeiro, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, feijão francês, feijão largo (feijão-fava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba-sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma sua forma processada (tal como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer sua combinação.
[00409] 36. O método de qualquer um dos itens 33 a 35, em que o material à base de planta está em forma peletizada.
[00410] 37. Uma ração animal compreendendo o aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 23, o grânulo de qualquer um dos itens 24 a 26 ou a formulação líquida de qualquer um dos itens 27 a 32 e material à base de planta.
[00411] 38. A ração animal do item 37, em que o material à base de planta compreende leguminosas, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, maís, milho, sorgo, gramínea, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão-tropeiro, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, feijão francês, feijão largo (feijão-fava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba-sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma sua forma processada (tal como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer
142 / 175 sua combinação.
[00412] 39. Uma ração animal peletizada preparada usando método de qualquer um dos itens 33 a 36 ou por peletização da ração animal do item 37 ou 38.
[00413] 40. Um método de melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho de um animal compreendendo administração a um ou mais animais do aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 23, do grânulo de qualquer um dos itens 24 a 26, da formulação líquida de qualquer um dos itens 27 a 32, da ração animal do item 37 ou 38 ou da ração animal peletizada do item 39.
[00414] 41. O método do item 40, em que a melhoria do desempenho de um animal significa ganho de peso corporal melhorado, Fator de Eficiência de Produção Europeu (EPEF) melhorado e/ou FCR melhorada.
[00415] 42. Um método de preparação de uma ração animal compreendendo mistura do aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 23, o grânulo de qualquer um dos itens 24 a 26 ou a formulação líquida de qualquer um dos itens 27 a 32 com pelo menos uma proteína ou fonte de proteína.
[00416] 43. Um método para o tratamento de proteínas, compreendendo o passo de adição do aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 23, o grânulo de qualquer um dos itens 24 a 26 ou a formulação líquida de qualquer um dos itens 27 a 32 a pelo menos uma proteína ou fonte de proteína.
[00417] 44. Um método para aumento da digestibilidade e/ou solubilidade de proteína, compreendendo mistura do aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 23, o grânulo de qualquer um dos itens 24 a 26 ou a formulação líquida de qualquer um dos itens 27 a 32 com pelo menos uma proteína ou fonte de proteína.
[00418] 45. O método de qualquer um dos itens 40 a 44, em que a
143 / 175 proteína ou fonte de proteína compreende leguminosas, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, maís, milho, sorgo, gramínea, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão-tropeiro, feijão- da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, feijão francês, feijão largo (feijão- fava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba-sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma sua forma processada (tal como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer sua combinação.
[00419] 46. Um método para melhoria do valor nutricional de uma ração animal, compreendendo adição do aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 23, o grânulo de qualquer um dos itens 24 a 26 ou a formulação líquida de qualquer um dos itens 27 a 32 à ração.
[00420] 47. O método do item 46, em que a ração animal compreende leguminosas, cereais, aveia, centeio, cevada, trigo, maís, milho, sorgo, gramínea, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail, soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão-tropeiro, feijão-da-espanha, feijão fino, feijão-de-lima, feijão francês, feijão largo (feijão-fava), grão-de-bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, colza (colza oleaginosa), arroz, beterraba, repolho, beterraba-sacarina, espinafre, quinoa ou ervilha, em uma sua forma processada (tal como farelo de soja, farelo de colza) ou qualquer sua combinação.
[00421] 48. Uso do aditivo de ração animal de qualquer um dos itens 1 a 23, o grânulo de qualquer um dos itens 24 a 26 ou a formulação líquida de qualquer um dos itens 27 a 32. na preparação de uma composição para uso em ração animal; para melhoria do valor nutricional de uma ração animal; para aumento da proteína digestível e/ou solúvel em ração animal; para aumento do grau de hidrólise de proteínas em dietas
144 / 175 animais; para melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho em um animal; e/ou para o tratamento de proteínas.
[00422] 49. Um método de produção de um polipeptídeo, compreendendo os passos de: (a) cultura de uma célula hospedeira de Bacillus recombinante compreendendo um polinucleotídeo exógeno codificando o polipeptídeo como definido no item 1, em que o polinucleotídeo é expresso e o polipeptídeo é produzido; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo.
[00423] 50. O método do item 49, em que o polinucleotídeo exógeno é integrado no cromossomo da célula hospedeira e está operacionalmente ligado com um promotor.
EXEMPLOS Estirpes
[00424] Uma estirpe de Bacillus horneckiae foi isolada a partir de uma amostra ambiental na Turquia em ou antes de 1995 como divulgado em WO 2015/091990.
[00425] Bacillus sp. TY145 foi isolada a partir de uma amostra de solo antártico ca. 1989 como divulgado em WO 92/17577. Ensaios de protease 1) Ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA:
[00426] Substrato de pNA: Suc-AAPF-pNA (L-1400 da Bachem).
[00427] Temperatura: Temperatura ambiente (25 °C) Tampões do ensaio: ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01% ajustados até valores de pH 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 e 11,0 com HCl ou NaOH.
145 / 175 20 µL de protease (diluídos em Triton X-100 a 0,01%) foram misturados com 100 µL de tampão do ensaio. O ensaio foi iniciado por adição de 100 µL de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e adicionalmente diluídos 45x com Triton X-100 a 0,01%). O aumento na OD405 foi monitorizado como uma medida da atividade de protease. 2) Ensaio de Ponto final de Suc-AAPF-pNA:
[00428] Substrato de pNA: Suc-AAPF-pNA (L-1400 da Bachem).
[00429] Temperatura: controlada (temperatura do ensaio).
[00430] Tampões do ensaio: ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01%, pH 7,0.
[00431] 200 µL de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e adicionalmente diluídos 50x com os Tampões do ensaio) foram pipetados em um tubo Eppendorf e colocados em gelo. Amostra de peptidase de 20 µL (diluída em Triton X-100 a 0,01%) foi adicionada. O ensaio foi iniciado por transferência do tubo Eppendorf para um termomisturador Eppendorf, que estava definido para a temperatura do ensaio. O tubo foi incubado durante 15 minutos no termomisturador Eppendorf à sua taxa de agitação mais elevada (1400 rpm). A incubação foi parada por transferência do tubo de volta para o banho de gelo e adição de 600 μL de ácido succínico a 500 mM, pH 3,5. 200 µL de sobrenadante foram transferidos para uma placa de microtitulação. A OD405 foi lida como uma medida da atividade de peptidase. Um tampão cego foi incluído no ensaio (em vez da enzima). 2) Ensaio de Protazyme AK:
[00432] Substrato: Comprimido de Protazyme AK (caseína reticulada e corada; da Megazyme)
[00433] Temperatura: controlada (temperatura do ensaio).
[00434] Tampão do ensaio: ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 mM,
146 / 175 Triton X-100 a 0,01%, pH 9,0.
[00435] Um comprimido de Protazyme AK foi suspenso em 2,0 mL de Triton X-100 a 0,01% por agitação suave. 500 µL desta suspensão e 500 µL de tampão do ensaio foram dispensados em um tubo Eppendorf e colocados em gelo. 20 µL de amostra de protease (diluída em Triton X-100 a 0,01%) foram adicionados. O ensaio foi iniciado por transferência do tubo Eppendorf para um termomisturador Eppendorf, que estava definido para a temperatura do ensaio. O tubo foi incubado durante 15 minutos no termomisturador Eppendorf à sua taxa de agitação mais elevada (1400 rpm). A incubação foi parada por transferência do tubo de volta para o banho de gelo. Depois, o tubo foi centrifugado em uma centrífuga gelada durante alguns minutos e 200 µL de sobrenadante foram transferidos para uma placa de microtitulação. A OD650 foi lida como uma medida da atividade de protease. Um tampão cego foi incluído no ensaio (em vez da enzima). 3) Ensaio de O-Ftaldialdeído (OPA):
[00436] Este ensaio detecta aminas primárias e consequentemente a clivagem de ligações de peptídeo por uma protease pode ser medida como a diferença na absorvância entre uma amostra tratada com protease e uma amostra de controle. O ensaio foi conduzido essencialmente de acordo com Nielsen et al. (Nielsen et al., 2001, “Improved method for determining food protein degree of hydrolysis”, J. Food Sci. 66: 642-646).
[00437] 0,5 mL de amostra foram filtrados através de uma placa de filtro com 96 poços PALL PN8175 (10 min, 2700 rpm, 5 °C). As amostras foram diluídas apropriadamente (por exemplo, 10, 50 ou 100 vezes) em água desionizada e 25 µL de cada amostra foram carregados em uma placa de microtitulação com 96 poços (5 réplicas). 200 µL de reagente OPA (tetraborato dissódico deca-hidratado a 100 mM, dodecil sulfato de sódio (SDS) a 3,5 mM, di-tiotreitol (DDT) a 5,7 mM, o-ftaldialdeído a 6 mM) foram dispensados em todos os poços, a placa foi agitada (60 seg, 650 rpm) e
147 / 175 a absorvância medida a 340 nm. Exemplo 1: Expressão e purificação da protease S8 de Bacillus horneckiae
[00438] A protease S8 de Bacillus horneckiae (SEQ ID NO: 1) foi expressa e purificada como descrito no Exemplo 1 de WO 2015/091990. Um ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA foi usado para se obterem o perfil de pH- atividade e o perfil de pH-estabilidade. Um ensaio de ponto final de Suc- AAPF-pNA foi usado para se obter o perfil de temp-atividade a pH 7. Características para a protease S8 de Bacillus horneckiae (SEQ ID NO: 1)
[00439] O peso molecular relativo como determinado por SDS-PAGE foi aprox. Mr = 35 kDa.
[00440] A sequência N-terminal determinada pela degradação de EDMAN foi: EVTATPS.
[00441] O peso molecular do pico principal (ca. 50%) determinado por análise de peso molecular intato foi 32132,0 Da.
[00442] A sequência madura do pico principal (a partir dos dados do sequenciamento N-terminal de EDMAN e dados de MS intato):
EVTATPSTQTPWGIKSIYNDQSITKTTGGSGIKVAVLDTGVHTGHIDLA GSSEQCKDFTQSNPLVNGSCTDRQGHGTHVAGTVLAHGGSDGQGVY GVAPQAKLWAYKVLGDNGSGYSDDIAAAIRHVADEASRTGSKVVIN MSLGSSGKDSLIASAVDYAYGKGVLIVAAAGNSGSGSNTIGYPAALV NAVAVAALENVQQNGTYRVANFSSRGNPATAGDFRIQERDVEVSAP
GASVESTWYNGGYNTISGTSMATPHVAGLAAKIWSSNSSLSHSQLRT ELQNRAKVYDIKGGIGAGTGDDYASGFGYPRVK (SEQ ID NO: 1)
[00443] O peso molecular calculado a partir desta sequência madura é 32132,0 Da.
[00444] A análise de peso molecular intato mostrou que ca. 10% do produto era os aminoácidos 2-314 e ca. 40% do produto era os aminoácidos 4-314.
148 / 175 Exemplo 2.1: Expressão e purificação da protease S8 de Bacillus sp. TY145
[00445] A protease S8 de Bacillus sp. TY145 (SEQ ID NO: 2) foi expressa e purificada como descrito no Exemplo 1 de WO 92/17577. Um ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA foi usado para se obterem o perfil de pH- atividade e o perfil de pH-estabilidade. Um ensaio de Protazyme AK foi usado para se obter o perfil de temp-atividade a pH 9. Características para a protease S8 de Bacillus sp. TY145 (SEQ ID NO: 2)
[00446] O peso molecular relativo como determinado por SDS-PAGE foi aprox. Mr = 34 kDa.
[00447] A sequência N-terminal determinada pela degradação de EDMAN foi: AVPSTQT.
[00448] O peso molecular determinado por análise de peso molecular intacto foi 31784 Da.
[00449] A sequência madura (dos dados do sequenciamento N-terminal de EDMAN e dados de MS Intato):
AVPSTQTPWGIKSIYNDQSITKTTGGSGIKVAVLDTGVYTSHLDLAGS AEQCKDFTQSNPLVDGSCTDRQGHGTHVAGTVLAHGGSNGQGVYG VAPQAKLWAYKVLGDNGSGYSDDIAAAIRHVADEASRTGSKVVINM SLGSSAKDSLIASAVDYAYGKGVLIVAAAGNSGSGSNTIGFPGGLVNA VAVAALENVQQNGTYRVADFSSRGNPATAGDYIIQERDIEVSAPGAS VESTWYTGGYNTISGTSMATPHVAGLAAKIWSANTSLSHSQLRTELQ
NRAKVYDIKGGIGAGTGDDYASGFGYPRVK (SEQ ID NO: 2)
[00450] O peso molecular calculado a partir desta sequência madura é 31783,7 Da.
[00451] A análise de peso molecular intato mostrou também que ca. 10% do produto compreendia um EVT extra no terminal N. Exemplo 2.2 Exemplo de expressão para cinco proteases S8 de Bacillus
149 / 175 (homólogos de SEQ ID NO: 1)
[00452] Cinco proteases S8 adicionais foram expressas em Bacillus subtilis. Expressão de SEQ ID NO: 5: a protease S8 1 de Bacillus sp.-13380 (Bacillus sp.-1, GENESEQP: BDV61032) é descrita em WO2017064253-A1. Expressão de SEQ ID NO: 6, a protease S8 de Bacillus idriensis (GENESEQP: BCB40142). Expressão de SEQ ID NO: 7: a protease S8 2 de Bacillus sp.-13380 (Bacillus sp.-1, GENESEQP: BCB40140); Expressão de SEQ ID NO: 8: a protease S8 de Bacillus sp.-62451 (Bacillus sp.-2, GENESEQP: BCB40144) são descritas na patente WO2015091989-A1.
[00453] A expressão da protease S8 de Bacillus oceanisediminis (SEQ ID NO:9) foi feita do seguinte modo. O gene codificando as proteases S8 de Bacillus oceanisediminis (SEQ ID NO:10) sofreu otimização dos códons e foi sintetizado pela Integrated DNA Technologies (Interleuvenlaan 12A, B-3001 Leuven, Bélgica). O gene foi expresso como uma enzima secretada onde o sinal de secreção nativo do gene foi substituído por um sinal de secreção de Bacillus clausii (com a seguinte sequência de aminoácidos: MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA). O construto foi feito como um construto de integração linear, onde os genes sintéticos foram fundidos por PCR entre duas regiões cromossômicas homólogas de Bacillus subtilis em conjunto com um promotor forte e um marcador de resistência ao cloranfenicol. A fusão foi feita por SOE PCR (Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K. e Pease, L. R. (1989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes, gene splicing by overlap extension Gene 77: 61-68). O método de SOE PCR é também descrito no pedido de patente WO 2003095658. Em ambos os construtos, o gene foi expresso sob o controle de um sistema promotor triplo (como descrito em WO 99/43835), consistindo nos promotores do gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens e no promotor cryIIIA de Bacillus thuringiensis incluindo sequência
150 / 175 estabilizante. O construto de PCR linear foi transformado em Bacillus subtilis. Os transformantes foram selecionados em placas LB suplementadas com 6 µg de cloranfenicol por mL. Um clone de Bacillus subtilis recombinante foi cultivado em cultura líquida. A enzima recombinante foi acumulada no sobrenadante após lise natural das células. O sobrenadante contendo enzima foi coletado e as enzimas purificadas como descrito no Exemplo 1. Exemplo 3: Construção, expressão e purificação de variante de protease S8 (SEQ ID NO: 3)
[00454] Uma variante da protease TY145 (SEQ ID NO: 3) foi construída, expressa e purificada como descrito no Exemplo 1 de WO 2016/097354. Um ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA foi usado para se obterem o perfil de pH-atividade e o perfil de pH-estabilidade. Um ensaio de Protazyme AK foi usado para se obter o perfil de temp-atividade a pH 9. Características para a variante de protease S8 (SEQ ID NO: 3)
[00455] O peso molecular relativo como determinado por SDS-PAGE foi aprox. Mr = 37 kDa.
[00456] A sequência N-terminal determinada pela degradação de EDMAN foi: AVPSTQT.
[00457] O peso molecular determinado por análise de peso molecular intacto foi 32089,1 Da.
[00458] A sequência madura (dos dados do sequenciamento N-terminal de EDMAN e dados de MS Intato):
AVPSTQTPWGIKSIYNDQSITKTTGGKGIKVAVLDTGVYTSHLDLAGS AEQCKDFTQSNPLVDGSCTDRQGHGTHVAGTVLAHGGSNGQGVYG VAPQAKLWAYKVLGDKGEGYSDDIAAAIRHVADEASRTGSKVVINM SLGSSAKDSLIASAVDYAYGKGVLIVAAAGNEGPKPNTIGYPAGFVN AVAVAALENVQEKGTYRVADFSSRGNPATAGDYIIQERDIEVSAPGA SVESTWYTGGYNTISGTSMATPHVAGLAAKIWSANTSLSHSQLRTEL QNRAKVYDIKGGIGAGPGDDYASGFGYPRVK
151 / 175 (SEQ ID NO: 3)
[00459] O peso molecular calculado a partir desta sequência madura é 32089,3 Da.
[00460] A análise de peso molecular intato mostrou também que ca. 10% do produto compreendia um EVT ou VT extra no terminal N. Exemplos 4: curvas de pH em pastas de SBM-maís
[00461] As curvas de pH atividade da protease S8 da invenção em uma pasta de maís-farelo de soja foram determinadas de acordo com o método em baixo.
[00462] Substrato: SBM-maís (30:70)
[00463] Temperatura: 40 °C
[00464] Tampões do ensaio: ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, tampão de CABS a 100 mM, CaCl2 a 12,5 mM, KCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,01%, ajustados até ao pH desejado (3, 4, 5, 6, 7) com NaOH ou HCl.
[00465] A 2 g de substrato de SBM-maís (30:70) foram adicionados 20 mL de tampão do ensaio que foi ajustado até ao pH desejado com NaOH ou HCl. A pasta foi agitada durante 5 min e porções de 2 mL da pasta foram transferidas para cada poço em uma placa com 24 poços em um misturador de placas com aquecimento e mistura magnética combinados. As amostras foram pré-incubadas durante 30 min a 40 °C. A protease foi diluída até 100 uL em tampão de acetato de sódio a 100 mM (NaOAc a 9,565 g/L, ácido acético a 1,75 g/L, CaCl2 a 5 mM, BSA a 0,01%, Tween20 a 0,01%, pH 6,0) para se alcançar uma concentração final de 200 de mg EP/kg de substrato e adicionada aos poços. Após 3 horas a 40 °C sob agitação magnética, a placa foi centrifugada (10 min, 4000 rpm, 0 °C) e o sobrenadante foi analisado usando o ensaio de OPA (o-ftaldialdeído). A atividade das proteases é a quantidade de extremidades de α-amino livres como determinado pela absorvância a 340 nm menos o branco (amostra operada sem enzima) e é dada
152 / 175 na Tabela 4 em baixo. Tabela 4: pH-atividade de diferentes proteases em maís-SBM Protease pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 Bacillus horneckiae 0,01 0,15 1,38 1,5 0,94 (SEQ ID NO: 1) Bacillus sp. TY145 0,00 0,77 2,08 3,26 4,54 (SEQ ID NO: 2) variante de Bacillus sp. 0,00 0,69 1,28 1,96 2,76 (SEQ ID NO: 3) Exemplo 5: Termoestabilidade
[00466] Uma alíquota da amostra de proteína de protease é dessalinizada ou submetida a troca de tampões em acetato de Na a 20 mM, pH 4,0 usando uma coluna PD-10 pré-empacotada ou dialisada contra 2 x 500 mL de acetato de Na a 20 mM, pH 4,0 a 4 °C em um passo de 2-3 horas seguido por um passo durante a noite. A amostra é filtrada com 0,45 μm e diluída com tampão até aprox. 2 unidades A280. O tampão de diálise é usado como referência na Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC). As amostras são desgaseificadas usando sucção por vácuo e agitação durante aprox. 10 minutos.
[00467] Uma varredura de DSC é realizada em um MicroCal VP-DSC a uma taxa de varredura constante de 1,5 °C/min a partir de 20-90 °C. O manuseamento dos dados é realizado usando o software MicroCal Origin (versão 4.10), e a temperatura de desnaturação, Td (também chamada a temperatura de fusão, Tm), é definida como a temperatura no vértice do pico no termograma. Exemplo 6: Estabilidade ao vapor
[00468] A atividade residual da protease após tratamento com vapor pode ser avaliada usando o seguinte ensaio.
[00469] Em estas experiências é usado um cenário modificado por meio do qual o vapor é proporcionado a partir de um gerador de vapor e conduzido para a caixa. As amostras colocadas em uma placa são inseridas na caixa através de uma gaveta quando a temperatura tiver alcançado ca. 93-94 °C. Após a inserção das amostras, a temperatura cai 4 °C. A incubação é
153 / 175 realizada durante 30 segundos enquanto a temperatura permanece aproximadamente constante a 90 °C. Subsequentemente, a placa é rapidamente removida da caixa, as amostras colocadas em gelo, ressuspensas e avaliadas no que diz respeito à atividade de protease usando, por exemplo, ensaio de Suc-AAPF-pNA ou o-Ftaldialdeído (OPA). Cada amostra de enzima é comparada com uma amostra similar que não havia sido tratada com vapor para se calcular a atividade residual. Exemplo 7: Testes de estabilidade à peletização
[00470] A enzima é granulada de uma maneira como descrita na Patente dos E.U.A. N.º 4,106,991, Exemplo 1. O granulado obtido é seco em um leito fluidizado até um teor de água abaixo de 1% e peneirado para se obter um produto com a gama de partículas 250 µm a 850 µm. Finalmente, o produto é revestido com óleo de palma e carbonato de cálcio de uma maneira como descrito na Patente dos E.U.A. N.º 4,106,991, Exemplo 22.
[00471] Aproximadamente 50 g de granulado de enzima são pré- misturados com 10 kg de ração durante 10 minutos em um pequeno misturador horizontal. Esta pré-mistura é misturada com 90 kg de ração durante 10 minutos em um misturador horizontal maior. A partir do misturador, a ração é levada até ao condicionador (um misturador em cascata com injeção de vapor) a uma taxa de aproximadamente 300 kg/hora. O condicionador aquece a ração até 95 °C (medida à saída) por injeção de vapor. O tempo de residência no condicionador é 30 segundos. A partir do condicionador, a ração é levada até uma prensa Simon Heesen equipada com uma matriz horizontal de 3,0 x 35 mm e comprimida até péletes com um comprimento de em torno de 15 mm. Após a prensa, os péletes são colocados em um refrigerador de ar e resfriados durante 15 minutos.
[00472] A atividade de protease é medida usando o ensaio de Suc- AAPF-pNA antes da peletização e nos péletes de ração após peletização. A estabilidade à peletização é determinada por comparação da atividade de
154 / 175 protease em ração peletizada em relação à atividade em ração não peletizada. Exemplo 8: Ensaio de digestibilidade de nitrogênio ileal em frangos de corte usando a protease S8 de Bacillus horneckiae (SEQ ID NO: 1) Animal e alimentação
[00473] Foram usadas galinhas com um dia de idade (Cobb500) obtidas a partir de um centro de incubação comercial (Accouvoir multiplicateur Grelier, La Bohardière, França). As galinhas foram alojadas em gaiolas em bateria com piso de arame (0,75 m2/gaiola, 6 galinhas/gaiola) com acesso ad libitum a ração e água. A alimentação foi dividida em duas fases, Principiadora e Multiplicadora (1-7 e 8-21, respectivamente) de acordo com a necessidade nutricional das galinhas. A alocação das galinhas às gaiolas foi baseada no peso corporal ao dia 1, de modo a minimizar as variações de pesos corporais entre gaiolas. Todos os pássaros foram sujeitos à mesma estratégia de alimentação durante os primeiros 16 dias de idade seguido por um período experimental de cinco dias a partir dos dias 17-21. Durante o período experimental, as gaiolas foram alocadas em uma dieta de controle negativo (NC), dieta de controle positivo (PC) ou tratamento com enzima, construído a partir do NC pulverizado com solução líquida de protease, ver Tabela 5. O PC foi formulado para manter a mesma energia metabolizável, proteína em bruto, concentração de lisina e metionina que o NC, usando no entanto fontes de proteínas de uma digestibilidade maior em comparação com o NC. Todas as dietas continham TiO2 como um marcador da digestibilidade. Tabela 5: Composição e análise química das dietas Ingrediente g/100 g de ração NC NC + protease PC Milho 55,73 55,73 57,79 Farelo de soja 37,30 37,30 30,89 Concentrado de proteína de soja - - 4,50 Óleo vegetal 2,00 2,00 2,00 Calcário 1,00 1,00 1,00 Fosfato de dicálcio 1,86 1,86 1,74 Pré-mistura de vitaminas 1,00 1,00 1,00 TiO2 0,10 0,10 0,10 Avatec® (Coccidiostato) 0,06 0,06 0,06 NaCl 0,50 0,50 0,50 DL-Metionina 0,28 0,28 0,28 Lisina HCl 0,15 0,15 0,14 Treonina 0,01 0,01 -
155 / 175 Ingrediente g/100 g de ração NC NC + protease PC Protease, ppm - 15 - ME, Kcal/kg de ração 3085 3085 3085 CP 22,0 22,0 22,0 D Lisina 1,19 1,19 1,19 D Metionina 0,55 0,55 0,55 Cálcio 0,90 0,90 1,18 Fósforo 0,75 0,75 0,73 Fósforo disponível 0,45 0,45 0,45 Coleta de dados e amostras
[00474] O peso corporal e consumo de ração totais das gaiolas foram obtidos entre os dias 16 e 21. Ao dia 21, todas as galinhas foram sacrificadas através de deslocação cervical. As galinhas foram dissecadas e o teor do íleo terminal foi coletado. O íleo terminal foi definido como 17 cm proximais a um ponto 2 cm antes da junção íleocecal como descrito por Jallier et al. (2003, Influence of the methodology of sampling content from different parts of the ileum on the values of apparent ileal digestibility in broiler chickens, Br. Poult. Sci. 44: 807–809). Os digeridos ileais foram agrupados dentro de gaiola, liofilizados e triturados para análise química. As concentrações de proteína em bruto e TiO2 foram determinadas tanto em digeridos como em amostras de ração para estimativa posterior da digestibilidade de nitrogênio ileal aparente AIDN (%) que é dada na Tabela 6: AIDN (%) = 100 - [(CMf/CMe) x (CNe/CNf)] x 100 em que CMf = concentração de marcador na ração; CMe = concentração de marcador no digerido ileal; CNf = concentração de nutriente na ração; CNe = concentração de nutriente no digerido ileal.
[00475] O teor de nitrogênio foi determinado por um dispositivo LECO FP-528 (LECO® Corporation) de acordo com o método de Dumas (Dumas, 1831, Procedes de l'Analyse Organique, Ann. Chim. Phys. 247: 198-213). O teor de nitrogênio foi transformado em proteína em bruto usando um fator de 6,25.
156 / 175
[00476] As concentrações de dióxido de titânio na ração e digeridos foram determinadas pelo dispositivo de plasma acoplado induzido (ICP) ICP- OES 5100 (Agilent Technologies) de acordo com DIN EN ISO 11885: 1997 (DIN EN ISO 1998) após mineralização de H2SO4 das amostras. Tabela 6: Resultados de AIDN a partir de ensaio in vivo em frangos de corte Tratamento % de digestibilidade de nitrogênio ileal aparente, média NC 75,8 PC 78,8 Bacillus horneckiae 84,2 (SEQ ID NO: 1)
[00477] A protease de Bacillus horneckiae aumentou significativamente (P<0,01 em comparação com o NC) a digestibilidade de nitrogênio ileal aparente em comparação tanto com o NC como com o PC. Exemplo 9: Ensaio de digestibilidade de nitrogênio ileal em frangos de corte usando a protease S8 de Bacillus horneckiae (SEQ ID NO: 1) e uma protease S8 variante de Bacillus sp.
[00478] O ensaio foi executado como descrito no Exemplo 8 e os resultados de AIDN são apresentados na Tabela 7 em baixo. Tabela 7: Resultados de AIDN a partir de ensaio in vivo em frangos de corte Tratamento % de digestibilidade de nitrogênio ileal aparente, média NC 80,4 PC 80,5 Bacillus horneckiae 83,3 (SEQ ID NO: 1) Variante de Bacillus sp. 81,9 (SEQ ID NO: 3)
[00479] Tanto a protease de Bacillus horneckiae como a variante de protease de Bacillus sp. aumentaram a digestibilidade de nitrogênio ileal aparente em comparação tanto com o NC como com o PC. Em este ensaio in vivo, a digestibilidade de proteína inerente dos ingredientes de ração foi inesperadamente elevada, significando que o PC mostrou somente um aumento mínimo na digestibilidade em comparação com o NC. Mesmo assim, as proteases aumentaram ainda a digestibilidade de nitrogênio ileal aparente em comparação com o PC, mostrando que as proteases podem funcionar mesmo em dietas com boa qualidade. Exemplo 10: Ração animal e aditivos de ração animal
157 / 175 Grânulo
[00480] O grânulo é preparado por granulação de uma protease da invenção com um enchimento tal como sulfato de sódio, sulfato de magnésio, carbonato de cálcio e/ou celulose e depois opcionalmente revestimento do grânulo com um revestimento de cera (por exemplo, óleo de palma hidrogenado) ou um revestimento de sal (por exemplo, sulfato de sódio e/ou sulfato de magnésio).
[00481] Alternativamente, o grânulo é preparado por absorção de uma solução líquida de uma protease da invenção em um núcleo inerte e depois opcionalmente revestimento do grânulo com um revestimento de cera (por exemplo, óleo de palma hidrogenado) ou um revestimento de sal (por exemplo, sulfato de sódio e/ou sulfato de magnésio). Formulação Líquida
[00482] Uma formulação líquida de uma protease da invenção compreende 0,1% a 10 p/p de proteína de enzima, 40-60% de glicerol, 0,1 a 0,5% de benzoato de sódio e água. A formulação líquida é pulverizada na ração animal peletizada descrita acima ou em ração em purê. Aditivo de Ração Animal
[00483] Uma formulação de pré-mistura de uma protease da invenção contendo 0,01 g a 10 g de proteína de enzima por quilo de pré-mistura (opcionalmente formulada como um grânulo revestido) é adicionada à seguinte pré-mistura: 5000000 IE Vitamina A 1000000 IE Vitamina D3 13333 mg Vitamina E 1000 mg Vitamina K3 750 mg Vitamina B1 2500 mg Vitamina B2 1500 mg Vitamina B6
158 / 175 7666 mcg Vitamina B12 12333 mg Niacina 33333 mcg Biotina 300 mg Ácido Fólico 3000 mg Ca-D-Pantotenato 1666 mg Cu 16666 mg Fe 16666 mg Zn 23333 mg Mn 133 mg Co 66 mg I 66 mg Se 5,8 % Cálcio 25 % Sódio Exemplos de Ração Animal
[00484] Este é um exemplo de uma ração de frangos de corte compreendendo o aditivo de ração animal como descrito acima: 62,55% de Maís 33,8% de Farelo de seja (50% de proteína em bruto) 1,0% de Óleo de soja 0,2% de DL-Metionina 0,22% de DCP (fosfato dicálcico) 0,76% de CaCO3 (carbonato de cálcio) 0,32% de Areia 0,15% de NaCl (cloreto de sódio) 1% do aditivo de ração animal acima (pré-mistura).
[00485] Os ingredientes são misturados, e a ração é peletizada à temperatura desejada, por exemplo, 60, 65, 75, 80, 85, 90 ou mesmo 95 °C.
[00486] Somente a título de exemplo, um alimento de animais para
159 / 175 galinhas, por exemplo, galinhas de corte, pode compreender um ou mais dos ingredientes listados nas percentagens exemplificativas dadas na Tabela 8.1 em baixo. Tabela 8.1: Exemplo de dieta de frangos de corte em fase principiadora e consumadora Ingredientes Principiadora (%) Consumadora (%) Maís 46,2 46,7 Sêmeas de trigo 6,7 10,0 DDGS de maís 7,0 7,0 Farelo de Soja 48% de CP 32,8 26,2 Combinação de gorduras animais/veg 3,0 5,8 L-Lisina HCI 0,3 0,3 DL-Metionina 0,3 0,3 L-Treonina 0,1 0,1 Sal 0,3 0,4 Calcário 1,1 1,1 Fosfato de dicálcio 1,2 1,2 Pré-mistura de vitaminas e minerais 0,3 0,3
[00487] Somente a título de exemplo, a especificação de dieta para galinhas, tais como galinhas de corte, pode ser como apresentada como dada na Tabela 8.2 em baixo. Tabela 8.2: Exemplo de especificação de dieta para galinhas em fase principiadora e consumadora Especificação de dieta Principiadora Consumadora Proteína em bruto (%) 23,00 20,40 Energia metabolizável (kcal/kg) 2950 3100 Cálcio (%) 0,85 0,85 Fósforo disponível (%) 0,38 0,38 Sódio (%) 0,18 0,19 Lisina digerível (%) 1,21 1,07 Metionina digerível (%) 0,62 0,57 Metionina + cisteína digeríveis (%) 0,86 0,78 Treonina digerível (%) 0,76 0,68
[00488] Somente a título de exemplo, um alimento de animais para galinhas poedeiras pode compreender um ou mais dos ingredientes listados nas percentagens exemplificativas dadas na Tabela 8.3 em baixo. Tabela 8.3: Exemplo de dieta de poedeiras na fase de postura Ingrediente Fase de postura (%) Maís 10,0 Trigo 53,6 DDGS de maís 5,0 Farelo de soja 48% de CP 14,9 Sêmeas de trigo 3,0 Óleo de soja 1,8 L-Lisina HCI 0,2 DL-Metionina 0,2
160 / 175 Ingrediente Fase de postura (%) L-Treonina 0,1 Sal 0,3 Fosfato de dicálcio 1,6 Calcário 8,9 Pré-mistura de vitaminas e minerais 0,6
[00489] Somente a título de exemplo, a especificação de dieta para galinhas poedeiras pode ser como apresentada como dada na Tabela 8.4 em baixo. Tabela 8.4: Exemplo de especificação de dieta para poedeiras em fase de postura Especificação de dieta Fase de postura Proteína em bruto (%) 16,10 Energia metabolizável (kcal/kg) 2700 Lisina (%) 0,85 Metionina (%) 0,42 Metionina + cisteína (%) 0,71 Treonina (%) 0,60 Cálcio (%) 3,85 Fósforo disponível (%) 0,42 Sódio (%) 0,16
[00490] Somente a título de exemplo, um alimento de animais para perus pode compreender um ou mais dos ingredientes listados nas percentagens exemplificativas dadas na Tabela 8.5 em baixo. Tabela 8.5: Exemplo de dieta de perus nas fases 1 a 4 Ingrediente Fase 1 (%) Fase 2 (%) Fase 3 (%) Fase 4 (%) Trigo 33,6 42,3 52,4 61,6 DDGS de maís 7,0 7,0 7,0 7,0 Farelo de soja 48% de CP 44,6 36,6 27,2 19,2 Farelo de colza 4,0 4,0 4,0 4,0 Óleo de soja 4,4 4,2 3,9 3,6 L-Lisina HCI 0,5 0,5 0,4 0,4 DL-Metionina 0,4 0,4 0,3 0,2 L-Treonina 0,2 0,2 0,1 0,1 Sal 0,3 0,3 0,3 0,3 Calcário 1,0 1,1 1,1 1,0 Fosfato de dicálcio 3,5 3,0 2,7 2,0 Pré-mistura de vitaminas e 0,4 0,4 0,4 0,4 minerais Somente a título de exemplo, a especificação de dieta para perus pode ser como apresentada como dada na Tabela 8.6 em baixo. Tabela 8.6: Exemplo de especificação de dieta para perus nas fases 1 a 4 Especificação de dieta Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4 Proteína em bruto (%) 29,35 26,37 22,93 20,00 Energia metabolizável (kcal/kg) 2,850 2,900 2,950 3,001 Cálcio (%) 1,43 1,33 1,22 1,02 Fósforo disponível (%) 0,80 0,71 0,65 0,53 Sódio (%) 0,16 0,17 0,17 0,17 Lisina digerível (%) 1,77 1,53 1,27 1,04
161 / 175 Especificação de dieta Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4 Metionina digerível (%) 0,79 0,71 0,62 0,48 Metionina + cisteína digeríveis (%) 1,12 1,02 0,90 0,74 Treonina digerível (%) 1,03 0,89 0,73 0,59
[00491] Somente a título de exemplo, um alimento de animais para leitões pode compreender um ou mais dos ingredientes listados nas percentagens exemplificativas dadas na Tabela 8.7 em baixo. Tabela 8.7: Exemplo de dieta de leitões nas fases 1 e 2 Ingrediente Fase 1 (%) Fase 2 (%) Maís 20,0 7,0 Trigo 25,9 46,6 Centeio 4,0 10,0 Sêmeas de trigo 4,0 4,0 DDGS de maís 6,0 8,0 Farelo de soja 48% de CP 25,7 19,9 Trigo seco 10,0 0,0 Óleo de soja 1,0 0,7 L-Lisina HCI 0,4 0,5 DL-Metionina 0,2 0,2 L-Treonina 0,1 0,2 L-Triptofano 0,03 0,04 Calcário 0,6 0,7 Fosfato de dicálcio 1,6 1,6 Pré-mistura de vitaminas e minerais 0,2 0,2 Sal 0,2 0,4
[00492] Somente a título de exemplo, a especificação de dieta para leitões pode ser como apresentada como dada na Tabela 8.8 em baixo. Tabela 8.8: Exemplo de especificação de dieta para leitões nas fases 1 a 2 Especificação de dieta Fase 1 Fase 2 Proteína em bruto (%) 21,50 20,00 Energia digerível (kcal/kg) 3380 3320 Energia líquida de suínos (kcal/kg) 2270 2230 Cálcio (%) 0,80 0,75 Fósforo digerível (%) 0,40 0,35 Sódio (%) 0,20 0,20 Lisina digerível (%) 1,23 1,14 Metionina digerível (%) 0,49 0,44 Metionina + cisteína digeríveis (%) 0,74 0,68 Treonina digerível (%) 0,80 0,74
[00493] Somente a título de exemplo, um alimento de animais para porcos multiplicadores/consumadores pode compreender um ou mais dos ingredientes listados nas percentagens exemplificativas dadas na Tabela 8.9 em baixo. Tabela 8.9: Exemplo de dieta de multiplicadores/consumadores Ingrediente Multiplicadores/Consumadores (%) Maís 27,5 Farelo de soja 48% de CP 15,4 DDGS de maís 20,0 Farelo de trigo 11,1
162 / 175 Ingrediente Multiplicadores/Consumadores (%) Farelo de arroz 12,0 Farelo de semente de canola 10,0 Calcário 1,6 Fosfato de dicálcio 0,01 Sal 0,4 Pré-mistura de vitaminas e minerais 0,3 Lisina HCI 0,2 Óleo vegetal 0,5
[00494] Somente a título de exemplo, a especificação de dieta para porcos multiplicadores/consumadores pode ser como apresentada como dada na Tabela 8.10 em baixo. Tabela 8.10: Exemplo de especificação de dieta para porcos multiplicadores/consumadores Especificação de dieta Multiplicador/Consumador Proteína em bruto (%) 22,60 Energia metabolizável (kcal/kg) 3030 Cálcio (%) 0,75 Fósforo disponível (%) 0,29 Lisina digerível (%) 1,01 Metionina + cisteína digeríveis (%) 0,73 Treonina digerível (%) 0,66 Exemplo 11: Ensaio de digestibilidade de nitrogênio jejunal aparente em frangos de corte para novas proteases em comparação com referência (Cibenza) Animal e alimentação
[00495] Foram usadas galinhas com um dia de idade (Cobb500) obtidas a partir de um centro de incubação comercial (Accouvoir multiplicateur Grelier, La Bohardière, França). As galinhas foram alojadas em gaiolas em bateria com piso de arame (0,75 m2/gaiola, 6 galinhas/gaiola). Foram proporcionadas com acesso ad libitum à ração proporcionada na Tabela 9 e água até ao dia 7. Os pássaros foram pesados ao dia 7 e alocados a um dos 6 tratamentos usando peso corporal como o critério. A mesma dieta foi alimentada aos pássaros até ao dia 16. O período experimental operou depois a partir dos 16 a 21 dias da vida das galinhas. Durante o período experimental, os pássaros foram alimentados com uma dieta de controle positiva (PC), dieta de controle negativo (NC) ou NC + enzima de teste (Tabela 9). As enzimas de teste usadas na experiência são SEQ ID NO: 1 (S8,
163 / 175 B. hornechiae) e SEQ ID NO:3 (S8, Bacillus sp.-11238)
[00496] As enzimas foram proporcionadas em forma líquida e foram aplicadas aos tratamentos por pulverização usando um sistema de pressão ultrabaixa acoplado a um misturador Forberg F60. O PC foi formulado para proporcionar a mesma energia metabolizável, proteína em bruto, concentração de lisina e metionina que o NC, no entanto continha fontes de proteínas de uma digestibilidade maior em comparação com o NC. Todas as dietas continham TiO2 como um marcador da digestibilidade. Tabela 9: Composição e análise química das dietas Ingrediente g/100 g de ração NC NC + protease PC Milho 55,73 55,73 57,79 Farelo de soja 37,30 37,30 30,89 Concentrado de proteína de soja - - 4,50 Óleo vegetal 2,00 2,00 2,00 Calcário 1,00 1,00 1,00 Fosfato de dicálcio 1,86 1,86 1,74 Pré-mistura de vitaminas 1,00 1,00 1,00 TiO2 0,10 0,10 0,10 Avatec® (Coccidiostato) 0,06 0,06 0,06 NaCl 0,50 0,50 0,50 DL-Metionina 0,28 0,28 0,28 Lisina HCl 0,15 0,15 0,14 Treonina 0,01 0,01 - Protease, ppm - 15 - Valores visados de energia, aminoácidos e minerais ME, Kcal/kg de ração 3085 3085 3085 CP 22,0 22,0 22,0 D Lisina 1,19 1,19 1,19 D Metionina 0,55 0,55 0,55 Cálcio 0,90 0,90 1,18 Fósforo 0,75 0,75 0,73 Disponibilidade de fósforo 0,45 0,45 0,45 Coleta de dados e amostras
[00497] O peso corporal e consumo de ração médios por gaiola e por tratamento foram obtidos entre os dias 16 e 21. Ao dia 21, todas as galinhas foram sacrificadas através de deslocação cervical. As galinhas foram dissecadas e o teor do jejuno foi coletado. O jejuno foi definido como o segmento do intestino delgado começando no final da alça pancreática (duodeno) e terminando distalmente aos 1 cm proximais do divertículo de Meckel. Os digeridos jejunais foram agrupados dentro de gaiola, liofilizados e triturados para análise química. As concentrações de proteína em bruto e TiO2
164 / 175 foram determinadas tanto em digeridos como em amostras de ração para estimativa posterior da digestibilidade de nitrogênio jejunal aparente AJDN (%) que é dada na Tabela 10: AJDN (%) = 100 - [(CMf/CMe) x (CNe/CNf)] x 100 em que CMf = concentração de marcador na ração; CMe = concentração de marcador no digerido jejunal; CNf = concentração de nutriente na ração; CNe = concentração de nutriente no digerido jejunal.
[00498] O teor de nitrogênio foi determinado usando um dispositivo LECO FP-528 (LECO® Corporation) de acordo com o método de Dumas (Dumas, 1831, Procedes de l'Analyse Organique, Ann. Chim. Phys. 247: 198– 213). O teor de nitrogênio foi transformado em proteína em bruto usando um fator de 6,25.
[00499] As concentrações de dióxido de titânio na ração e digeridos foram determinadas usando um instrumento ICP-OES 5100 (Agilent Technologies) de acordo com DIN EN ISO 11885: 1997 (DIN EN ISO 1998) após mineralização de H2SO4 das amostras. Tabela 10: Resultados de primeiro ensaio in vivo Tratamento % de Digestibilidade de nitrogênio jejunal aparente, média NC 57,88 PC 60,44 SEQ ID NO: 1 62,61 SEQ ID NO: 2 61,26 SEQ ID NO: 3 62,04 Cibenza 57,18
[00500] Os resultados demonstram que as proteases aumentaram a digestibilidade de nitrogênio jejunal aparente em comparação com tanto o NC como o PC e com a referência (Cibenza). Exemplo 12: Ensaio de digestibilidade de nitrogênio jejunal aparente em frangos de corte para novos homólogos de protease em comparação com referência (Cibenza)
165 / 175 Animal e alimentação
[00501] Foram usadas galinhas com um dia de idade (Cobb500) obtidas a partir de um centro de incubação comercial (Accouvoir multiplicateur Grelier, La Bohardière, França). As galinhas foram alojadas em gaiolas em bateria com piso de arame (0,75 m2/gaiola, 6 galinhas/gaiola). Foram proporcionadas com acesso ad libitum à ração [Que tipo de ração?] e água até ao dia 7. Os pássaros foram pesados ao dia 7 e alocados a um dos 8 tratamentos usando peso corporal como o critério. Uma dieta similar [Descrever dieta?] foi alimentada aos pássaros até ao dia 16. O período experimental operou depois a partir dos 16 a 21 dias da vida das galinhas. Durante o período experimental, os pássaros foram alimentados com uma dieta de controle positiva (PC), dieta de controle negativo (NC) ou NC + enzima de teste (Tabela 11). As enzimas de teste usadas na experiência foram: SEQ ID NO: 5 S8, Bacillus sp.-13380 (78% com SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 6 S8, Bacillus idriensis (80% com SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 7 S8, Bacillus sp.-13380 (89% com SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 8 S8, Bacillus sp.-62451 (90% com SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 9 S8, Bacillus oceanisediminis (87% com SEQ ID NO: 1)
[00502] As enzimas foram proporcionadas em forma líquida e foram aplicadas aos tratamentos por pulverização usando um sistema de pressão ultrabaixa acoplado a um misturador Forberg F60. O PC foi formulado para proporcionar a mesma energia metabolizável, proteína em bruto, concentração de lisina e metionina que o NC, no entanto continha fontes de proteínas de uma digestibilidade maior em comparação com o NC. Todas as dietas continham TiO2 como um marcador da digestibilidade. Tabela 11: Composição e análise química das dietas Ingrediente g/100 g de ração NC NC + protease PC Milho 55,73 55,73 57,79 Farelo de soja 37,30 37,30 30,89 Concentrado de proteína de soja - - 4,50 Óleo vegetal 2,00 2,00 2,00 Calcário 1,00 1,00 1,00 Fosfato de dicálcio 1,86 1,86 1,74
166 / 175 Ingrediente g/100 g de ração NC NC + protease PC Pré-mistura de vitaminas 1,00 1,00 1,00 TiO2 0,10 0,10 0,10 Avatec® (Coccidiostato) 0,06 0,06 0,06 NaCl 0,50 0,50 0,50 DL-Metionina 0,28 0,28 0,28 Lisina HCl 0,15 0,15 0,14 Treonina 0,01 0,01 - Protease, ppm - 15 - Valores visados de energia, aminoácidos e minerais ME, Kcal/kg de ração 3085 3085 3085 CP 22,0 22,0 22,0 D Lisina 1,19 1,19 1,19 D Metionina 0,55 0,55 0,55 Cálcio 0,90 0,90 1,18 Fósforo 0,75 0,75 0,73 Disponibilidade de fósforo 0,45 0,45 0,45 Coleta de dados e amostras
[00503] O peso corporal e consumo de ração médios por gaiola e por tratamento foram obtidos entre os dias 16 e 21. Ao dia 21, todas as galinhas foram sacrificadas através de deslocação cervical. As galinhas foram dissecadas e o teor do jejuno foi coletado. O jejuno foi definido como o segmento do intestino delgado começando no final da alça pancreática (duodeno) e terminando distalmente aos 1 cm proximais do divertículo de Meckel. Os digeridos jejunais foram agrupados dentro de gaiola, liofilizados e triturados para análise química. As concentrações de proteína em bruto e TiO2 foram determinadas tanto em digeridos como em amostras de ração para estimativa posterior da digestibilidade de nitrogênio jejunal aparente AJDN (%) que é dada na Tabela 12: AJDN (%) = 100 - [(CMf/CMe) x (CNe/CNf)] x 100 em que CMf = concentração de marcador na ração; CMe = concentração de marcador no digerido jejunal; CNf = concentração de nutriente na ração; CNe = concentração de nutriente no digerido jejunal.
[00504] O teor de nitrogênio foi determinado usando um dispositivo LECO FP-528 (LECO® Corporation) de acordo com o método de Dumas (Dumas, J.B.A, Procedes de l'Analyse Organique, Ann. Chim. Phys. 247:
167 / 175 198–213 (1831)). O teor de nitrogênio foi transformado em proteína em bruto usando o fator 6,25.
[00505] As concentrações de dióxido de titânio na ração e digeridos foram determinadas usando um instrumento ICP-OES 5100 (Agilent Technologies) de acordo com DIN EN ISO 11885: 1997 (DIN EN ISO 1998) após mineralização de H2SO4 das amostras. Tabela 12: Resultados de primeiro ensaio in vivo Tratamento % de Digestibilidade de nitrogênio jejunal aparente, média NC 53,50 SEQ ID NO: 5 55,67 SEQ ID NO: 7 54,23 SEQ ID NO: 6 54,14 SEQ ID NO: 9 53,83 Cibenza 53,82
[00506] Os resultados demonstram que as proteases aumentaram a digestibilidade de nitrogênio jejunal aparente em comparação com tanto o NC e a referência (Cibenza).
[00507] A invenção descrita e reivindicada aqui não é para ser limitada no escopo pelos aspectos específicos divulgados aqui, uma vez que estes aspectos se destinam a servir como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão evidentes para os peritos na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições prevalecerá. Exemplo 12. Atividade de 10 PE-variantes de SEQ ID NO: 1 em material relevante de ração (SBM/milho) a pH 7
[00508] As proteases são incubadas com uma pasta de SBM-milho a pH 7 a 40 ºC sob agitação. Após incubação, o efeito da protease é medido pelo método de OPA.
[00509] Um estoque de tampão (ácido succínico a 100 mM, HEPES a
168 / 175 100 mM, CHES a 100 mM, CAPS a 100 mM, CaCl2*2H2O a 12,5 mM, KCl a 306 mM, Triton X-100 a 0,01%) é feito e ajustado até pH 7,36 com NaOH a 10 M ou HCl a 37%. A mistura de 1,4 g de SBM (farelo de soja) moído, 0,6 g de milho moído com 20 mL de estoque de tampão dá uma pasta com pH 7 resultante. A pasta é pré-misturada durante 5 min à temperatura ambiente em um agitador magnético.
[00510] Placas com 24 poços (com ímãs cruzados) são colocadas em um dispositivo de aquecimento e agitação combinados para pré-aquecimento a 40 ° C. 2 mL de pasta com pH 7 são transferidos para cada poço, e a placa é fechada com fita isolante e pré-incubada durante 30 min. 100 uL de tampão (branco) ou solução de enzima são adicionados aos poços (correspondendo a 200 mg de enzima/kg de alimentação), a fita isolante é fechada e as placas são incubadas durante 3 horas. A placa é centrifugada durante 10 min a 4000 rpm (2500 x g) a 0 °C. O sobrenadante é transferido para tubos Eppendorf e analisado usando a metodologia de OPA descrita acima.
[00511] Todas as variantes de PE testadas têm atividade mais elevada do que o tipo selvagem a pH 7 em SBM:milho. SEQ ID NO: 1 Variante Atividade (pH 7) Desvio padrão S173P,S175P,T297P H39D,N59D,L61Y 2,74 0,33 S173P,S175P,T297P H39D,L61P 2,74 0,60 S173P,S175P,T297P I43P,L61P,H123W,V124A 2,28 0,28 S173P,S175P,T297P H39D,N59D,L61Y,H83T 2,53 0,02 S173P,S175P,T297P L61Y,V124A,R130D 2,79 0,50 S173P,S175P,T297P H39D,I43P,N59D,L61Y 2,79 0,35 S173P,S175P,T297P H83T,V124A,R130D 2,00 0,51 S173P,S175P,T297P I43P,L61P,E127N,S129M 3,03 0,10 S173P,S175P,T297P I43P,L61P,V124A,R130D 1,62 0,07 S173P,S175P,T297P I43P,N59D,H123W,V124A 1,89 0,05 (nenhum) SEQ ID NO 1 0,85 0,04 Exemplo 13. SEQ ID NO: 3. Dados in vitro sobre material relevante de ração
[00512] Mesmo procedimento que acima. Protease Atividade pH 7 ProAct 3,27 SEQ ID NO: 3 4,25
[00513] A pH 7, SEQ ID NO: 3 tem atividade mais elevada em
169 / 175 SBM:milho do que ProAct®. Exemplo 14 Exemplos de clonagem e expressão para variantes de PE de SEQ ID NO 1 Exemplo 14.1: Construção de variantes por mutagênese sítio-dirigida
[00514] Foram construídas variantes sítio-dirigidas da serina protease S8A de Bacillus horneckiae (SEQ ID NO: 1), compreendendo substituições específicas de acordo com a invenção. As variantes foram preparadas por clonagem tradicional de fragmentos de DNA (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor, 1989) usando PCR em conjunto com oligonucleotídeos mutagênicos apropriadamente desenhados que introduziram as mutações desejadas na sequência resultante e podem ser repetidos por toda a gente perita na técnica.
[00515] Foram desenhados oligos mutagênicos correspondendo à sequência de DNA flanqueando o(s) local(ais) de mutação desejado(s), separados pelos pares de bases de DNA definindo as inserções/deleções/substituições e adquiridos a partir de um vendedor de oligos tal como Integrated DNA Technologies (IDT). Para testar as variantes de protease da invenção, o DNA mutado compreendendo uma variante da invenção é integrado em uma Estirpe de B. subtilis competente por recombinação homóloga, fermentado usando protocolos padrão (meios à base de extrato de levedura, 4 dias, 30 °C) e rastreado por ensaio de atividade. Exemplo 14.2: Expressão para ensaio de atividade
[00516] As variantes construídas foram plaqueadas em ágar LB suplementado com cloranfenicol a 6 ug/mL e cultivadas durante 37 °C durante um dia. Após cultura, as colônias foram escolhidas para poços individuais de placas com 24 poços profundos (DWP) padrão contendo 3 mL de caldo TBgly suplementado com cloranfenicol a 6 ug/mL e metais vestigiais (FeCl3 a 50 mM, CaCl2 a 20 mM, MnCl2 a 10 mM, ZnSO4 a 10 mM, CuCl2 a 2 mM e NiCl2 a 2 mM (F. William Studier, “Protein production
170 / 175 by auto-induction in high-density shaking cultures”, Protein Expression and Purification, 41 (2005) 207-234)).
[00517] A serina protease S8A de Bacillus horneckiae de tipo selvagem foi também inoculada como referência em quatro poços em cada placa. As placas DWP foram cultivadas durante quatro dias a 30 °C com agitação a 220 rpm. Após cultura, as placas foram centrifugadas a 2500 rpm durante 10 minutos e os sobrenadantes redistribuídos em placas de microtitulação com 96 poços que foram depois usadas para rastreio quanto à atividade residual. Exemplo 14.3: Fermentação para purificação
[00518] A fermentação pode ser realizada por métodos bem conhecidos na técnica ou como se segue. As diferentes estirpes de B. subtilis albergando as variantes foram cultivadas em estrias em placas de ágar LB e cultivadas durante a noite a 37 °C. As colônias foram transferidas para 100 mL de meio PS-1 (PS-1: Sacarose a 100 g/L(n.º de cat. da Danisco 109-0429), casca de soja (farinha de soja) a 40 g/L, Na2HPO4.12H2O a 10 g/L (N.º de cat. da Merck 6579), replace- Dowfax63N10 a 0,1 mL/L (Dow) em frascos de agitação de 500 mL. A cultura leva tipicamente 4 dias a 30 ºC se agitando com 270 rpm. Células e outro material não dissolvido foram removidos do caldo de fermentação por centrifugação a 4500 rpm durante 20-25 minutos. Exemplo 15 Descrição de ensaio para rastreio de variantes de SEQ ID NO 1 quanto à estabilidade gástrica melhorada Meios e solução
[00519] Um litro de tampão de Acetato a 100 mM/MES/HEPES/Glicina era composto por 8,2 g de Acetato de Sódio, 19,5 g de MES, 23,8 g de HEPES, 7,5 g de Glicina. Este tampão foi suplementado com 1 mL de CaCl2 (1 M), 50 mL de SDS a 20%, 1 mL de Triton-X a 10% e o pH ajustado até pH 7 com NaOH a 5 N.
[00520] Tampão de Desafio Gástrico pH 3,4 foi preparado por mistura
171 / 175 de 715 mL de Ácido Cítrico a 0,1 M e 285 mL de Na2HPO4 a 0,2 M.
[00521] O Reagente de Paragem era composto por Na2HPO4 a 0,2 M.
[00522] Placa de ensaio de Protazyme AK pH 7 foi preparada em placas com 96 poços de 0,5 mL Nunc U96PP de fundo em V. Cem comprimidos de Protazyme AK (Megazyme T-PRAK-200T) (em torno de 10,825 g) foram dissolvidos em 200 mL de Acetato/MES/HEPES/Glicina/ CaCl2/SDS/Triton-X100 por agitação durante 10 minutos à temperatura ambiente. 180 µL desta solução foram aliquotados em placas com 96 poços de fundo em V MTP (Nunc U96PP 0,5 mL) usando pipeta com 8 canais e pontas de furo largo. As placas de ensaio foram seladas e congeladas até ao uso.
[00523] Caldos de Bacillus de variantes de SEQ ID NO: 1 foram aliquotados em duas grelhas idênticas. Cada grelha estava contendo amostras em duplicado e dois esqueletos de referência estavam também presentes em cada grelha de todas as placas. Descrição do ensaio
[00524] O ensaio foi executado em um Biomek FXp (Beckman Coulter). O ensaio estava consistindo em uma queda de pH até pH 3,4 (desafio gástrico) durante 10 minutos (rastreio primário) e 15 minutos (rastreio secundário feito em mutações combinadas a partir do rastreio primário) a 23°C para as diferentes variantes de SEQ ID NO: 1. Durante esse tempo de incubação, as estabilidades dos esqueletos das diferentes variantes foram diferentemente afetadas pela queda de pH. O ensaio de desafio gástrico foi parado por adição de reagente de paragem para neutralizar a reação na grelha de desafio. Para evitar variações interplacas, as amostras testadas quanto a este ensaio de desafio gástrico foram divididas em duas grelhas dentro da placa com 96 poços: uma grelha de controle, que não foi submetida à queda de pH, e uma grelha de desafio que foi estressada pela queda de pH.
[00525] A segunda parte do ensaio estava consistindo na revelação da
172 / 175 atividade residual por uma incubação em placas de Protazyme AK pH 7 após o ensaio de desafio gástrico. O ensaio de Protazyme AK foi incubado durante 15 minutos a 23 °C sob uma agitação de 500 rpm. A reação foi parada por centrifugação e os sobrenadantes transferidos para uma placa de espectrofotômetro de leitura. Uma razão de Atividade Residual (RA) foi calculada para cada variante por cálculo da razão de (Variante de Absorvância média da grelha de desafio)/(Variante de Absorvância média da grelha de controle)*100. Este número RA foi usado para classificar as variantes quanto à sua estabilidade gástrica melhorada. Foram feitas duas rondas de rastreio: uma primeira ronda para se identificarem as mutações primárias mais promissoras e uma segunda para se identificarem as variantes mais estabilizadas feitas a partir das mutações primárias combinadas. A absorvância das placas de espectrofotômetro foi analisada a 590 nm. Exemplo 16 Purificação de PE-variantes de protease Ensaio de atividade Ensaio de Suc-AAPF-pNA: Substrato de pNA: Suc-AAPF-pNA (L-1400 da Bachem). Temperatura: Temperatura ambiente (25 °C) Tampão do ensaio: ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl2 a 1 mM, KCl a 150 Mm, Triton X-100 a 0,01%, pH 9,0.
[00526] 20 μL de protease (diluída em Triton X-100 a 0,01%) foram misturados com 100 μL de tampão do ensaio. O ensaio foi iniciado por adição de 100 μL de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 mL de DMSO e adicionalmente diluídos 45x com Triton X-100 a 0,01%). O aumento na OD405 foi monitorizado como uma medida da atividade de protease. Purificação de PE-variantes de SEQ ID NO 1
[00527] As PE-variantes foram expressas em B. subtilis. O caldo de cultura foi centrifugado (26000 x g, 20 min) e o sobrenadante foi
173 / 175 cuidadosamente decantado a partir do precipitado. O sobrenadante foi filtrado através de uma unidade de filtração de 0,2 µm da Nalgene para remover o resto das células hospedeiras de Bacillus. O filtrado de 0,2 µm foi misturado 1:1 com (NH4)2SO4 a 3,0 M e a mistura foi aplicada a uma coluna Phenyl- sepharose FF (elevada sub) (da GE Healthcare) equilibrada em H3BO3 a 50 mM, MES/NaOH a 10 mM, CaCl2 a 2 mM, (NH4)2SO4 a 1,5 M, pH 6,0. Após lavagem da coluna com o tampão de equilíbrio, a protease foi eluída em passos com H3BO3 a 50 mM, MES a 10 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 6,0. O pico eluído (contendo a atividade de protease) foi coletado e aplicado a uma coluna de agarose de Bacitricina (da Upfront chromatography) equilibrada em H3BO3 a 50 mM, MES a 10 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 6,0. Após lavagem da coluna extensivamente com o tampão de equilíbrio, a protease foi eluída com H3BO3 a 50 mM, MES a 10 mM, CaCl2 a 2 mM, NaCl a 1 M, pH 6,0 com 2-propanol a 25% (v/v). O pico de eluição (contendo a atividade de protease) foi transferido para MES a 20 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 6,0 em uma coluna G25 sephadex (da GE Healthcare). O pico transferido para G25 era a preparação purificada e foi usada para experiências adicionais.
[00528] Quando as preparações de protease PE-variante purificadas foram analisadas por SDS-PAGE não redutora e o gel foi corado com Coomassie, as proteases PE-variantes foram vistas como uma banda dominante principal a aprox. 34-37 kDa. Exemplo 17. Ensaios com frangos de corte in vivo Materiais e Métodos
[00529] Foram realizados quatro ensaios com galinheiros independentes e um estudo com frangos de corte de galinheiro para se avaliar o desempenho do crescimento e a digestibilidade ileal aparente do nitrogênio. Animais e Alojamento
[00530] No dia da chegada (dia 1), as galinhas (Ross 308/708, Cobb 500) foram divididas por peso em grupos de 18 – 25 pássaros. Cada grupo foi colocado em um galinheiro cheio de aparas de madeira e alocado a um dos
174 / 175 diferentes tratamentos. Na sequência de galinheiros, 5 pássaros foram usados por réplica.
[00531] Cada tratamento foi replicado com 8-12 grupos. As galinhas foram alojadas em um quarto ambientalmente controlado. A temperatura ambiente foi adaptada à idade dos pássaros. Os pássaros tinham acesso livre a ração e água. Composição de ração, tratamentos e duração de ração Fase de alimentação: • Principiadora (0-14) • Multiplicadora (dias 14-28) • Consumadora (dias 28-35) Dieta experimental com suplementação de enzima: Dias 0-35 Distribuição de ração: Pós-peletização ou Purê
[00532] As enzimas foram proporcionadas em forma líquida e foram aplicadas pós-peletização ou sobre o purê.
[00533] Volume final da solução de produto: 300 a 500 mL para dieta de ~200 kg.
[00534] As dietas experimentais (Principiadora e Multiplicadora) foram baseadas em maís-farelo de soja (ver Tabela em baixo). As dietas foram formuladas para conterem 215 - 220 g de proteína em bruto e 12,9 MJ/kg de MEN para o período principiador e 190 - 195 g de proteína em bruto e 13,4 MJ/kg de MEN para o período multiplicador. As dietas basais continham coccidiostato de acordo com a prática local. Ingredientes (%) Principiador (d 1-14) Multiplicador (d 14-35) Milho 8,0% 51,30 – 52,70 58,76 – 60,20 Soja O/C 44% 38,50 - 39,70 31,00 - 32,30 Óleo de Soja 3,70 – 3,90 4,20 – 4,50 Pré-mistura1 1,00 1,00 Outros 2,7 – 5,5 2,0 - 5,04 teor calculado Proteína em bruto (g/kg) 215 - 220 190-195 Energia metabolizável (MJ/kg)2 12,9 13,4 1 Pré-mistura de vitaminais-minerais proporcionada por quilograma de dieta: Vitamina A: 10'000 I.U.; vitamina E: 40 I.U.; vitamina K3: 3,0 mg; vitamina C: 100 mg; vitamina B1: 2,50 mg; vitamina B2: 8,00 mg; vitamina B6: 5,00 mg; vitamina B12: 0,03 mg; niacina: 50,0 mg; cálcio de pantotenato: 12,0 mg; ácido fólico: 1,50 mg; biotina 0,15 mg; colina: 450 mg; etoxiquina: 54 mg; Na: 1,17 g; Mg: 0,8 g; Mn: 80 mg; Fe: 60 mg; Cu: 30 mg; Zn: 54 mg; I: 1,24 mg; Co: 0,6 mg; Se: 0,3 mg
175 / 175
[00535] As dietas foram alimentadas não suplementadas (controle negativo, C) ou suplemento com
1. SEQ ID NO: 1 a 10 mg de Proteína de enzima por kg de ração ou
2. SEQ ID NO: 2 a 10 mg de Proteína de enzima por kg de ração ou
3. aminoácidos sintéticos em um controle positivo.
[00536] Para aplicações pós-peletização, quantidade apropriada das preparações líquidas das proteases foram diluídas em água e pulverizadas na respectiva ração peletizada para se obterem as concentrações finais na ração correspondendo aos diferentes tratamentos. Para equilíbrio processual de todos os tratamentos, o mesmo volume de água foi também pulverizado nos péletes das dietas de controle. Parâmetros e análises experimentais
[00537] Para as experiências, os pássaros foram pesados (como grupo de réplica) nos dias 1, 24, 28 e 35. O consumo de ração para os períodos intermediários foi determinado. O ganho de peso corporal e a razão de conversão de ração (ração/ganho) foram calculados. Adicionalmente, o teor ileal foi coletado no final do ensaio (dia 35) para a determinação da digestibilidade ileal aparente de Nitrogênio. Resultados e Conclusão
[00538] Os resultados obtidos nos estudos mostraram que a inclusão das proteases foi eficaz na melhoria da taxa de conversão de ração de frangos de corte alimentados com dietas. Em particular, os resultados mostraram que os tratamentos com enzima melhoram consistentemente o desempenho ao longo de todas as enzimas testadas da invenção. Esta consistência e o nível de melhoria são procurados na indústria.

Claims (23)

1 / 14 REIVINDICAÇÕES
1. Aditivo de ração animal caracterizado pelo fato de compreender um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease, em que o polipeptídeo é uma protease S8 selecionada do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3; (d) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo
2 / 14 menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 5; (f) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo tendo pelo menos 75%, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 9;
3 / 14
(j) uma variante de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (k) uma variante de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (l) uma variante de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (m) uma variante de SEQ ID NO: 5, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (n) uma variante de SEQ ID NO: 6, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
4 / 14 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (o) uma variante de SEQ ID NO: 7, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (p) uma variante de SEQ ID NO: 8, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (q) uma variante de SEQ ID NO: 9, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; (r) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), ou (i) e um marcador de His e/ou marcador de HQ N- terminal e/ou C-terminal; (s) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), ou (i) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos; e (t) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), ou (i) tendo atividade de protease e tendo pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.
2. Aditivo de ração animal de acordo com a reivindicação 1,
5 / 14 caracterizado pelo fato de que a protease S8 compreende o motivo TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG (SEQ ID NO: 4).
3. Aditivo de ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente uma ou mais vitaminas.
4. Aditivo de ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de compreender um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease, em que o polipeptídeo é uma protease S8 selecionada do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3; (d) um polipeptídeo que tem pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo tendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 5;
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(f) um polipeptídeo que tem pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo tendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo tendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo tendo pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 9; (j) uma variante de SEQ ID NO: 1, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 posições; (k) uma variante de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 posições; (l) uma variante de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1,
7 / 14 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 posições; (m) uma variante de SEQ ID NO: 5, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 posições; (n) uma variante de SEQ ID NO: 6, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 posições; (o) uma variante de SEQ ID NO: 7, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 posições; (p) uma variante de SEQ ID NO: 8, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 30 posições; (q) uma variante de SEQ ID NO: 9, em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 posições.
5. Aditivo de ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de compreender SEQ ID
8 / 14 NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante em que a variante tem atividade de protease e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições, tipicamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30, mais tipicamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 posições ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 posições ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 posições.
6. Aditivo de ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que as substituições são mutações múltiplas compreendendo mutações selecionadas do grupo consistindo em S173P, S175P, T297P; L61P,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; H39D,L61P, S173P, S175P, T297P; L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; L61P,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; H123W,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; N59D,H83T, S173P, S175P, T297P; N59D,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; L61Y,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; N59D,L61P,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,H83T, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61Y, S173P, S175P, T297P; H39D,H83T,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,L61Y,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; H39D,L61Y,H83T, S173P, S175P, T297P; L61Y,H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61Y,H83T, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P, S173P, S175P, T297P; H83T,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; L61Y,V124A,R130D,
9 / 14 S173P, S175P, T297P; I43P,N59D, S173P, S175P, T297P; H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; L61P,H123W,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61P, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; L61P,H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; I43P,H83T,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,L61Y,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,N59D,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; N59D,H83T,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; N59D,L61Y,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; I43P,L61Y,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; I43P,N59D,L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; H39D,I43P,N59D,L61Y, S173P, S175P, T297P; e L61Y,H83T, S173P, S175P, T297P.
7. Aditivo de ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a protease S8 tem pelo menos 90% de identidade, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, em que o polipeptídeo compreende nenhuma, uma ou mais das mutações selecionadas do grupo consistindo em S27K, N109K, S111E, S171E, S173P, G174K, S175P, F180Y, G182A, L184F, Q198E, N199K e T297P.
8. Aditivo de ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de compreender uma protease S8 tendo pelo menos 90% de identidade tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com um polipeptídeo selecionado do grupo
10 / 14 consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9, em que o polipeptídeo compreende nenhuma, uma ou mais das mutações selecionadas do grupo consistindo em S173P, S175P, T297P; L61P,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; H39D,L61P, S173P, S175P, T297P; L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; L61P,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; H123W,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; N59D,H83T, S173P, S175P, T297P; N59D,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; L61Y,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; N59D,L61P,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,H83T, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61Y, S173P, S175P, T297P; H39D,H83T,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,L61Y,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; H39D,L61Y,H83T, S173P, S175P, T297P; L61Y,H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61Y,H83T, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P, S173P, S175P, T297P; H83T,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; L61Y,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,N59D, S173P, S175P, T297P; H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; L61P,H123W,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,L61P, S173P, S175P, T297P; I43P,L61P,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; L61P,H83T,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; I43P,H83T,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,L61Y,V124A,R130D, S173P, S175P, T297P; I43P,N59D,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; N59D,H83T,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; N59D,L61Y,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P; H39D,N59D,E127N,S129M, S173P, S175P, T297P; I43P,L61Y,H123W,V124A, S173P, S175P, T297P;
11 / 14 H39D,N59D,L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; I43P,N59D,L61P,H83T, S173P, S175P, T297P; H39D,I43P,N59D,L61Y, S173P, S175P, T297P e L61Y,H83T, S173P, S175P, T297P.
9. Aditivo de ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de compreender uma protease S8 tendo pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, em que o polipeptídeo compreende uma mutação em nenhuma, uma ou mais das posições 27, 109, 111, 171, 173, 174, 175, 180, 182, 184, 198, 199 e 297 de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3.
10. Aditivo de ração animal de acordo com a reivindicação 9, compreendendo uma protease S8 tendo pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, ou em que a protease S8 é um polipeptídeo compreendendo uma mutação em nenhuma, uma ou mais das posições 27, 109, 111, 171, 173, 174, 175, 180, 182, 184, 198, 199 e 297 de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3.
11. Aditivo de ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma protease S8 selecionada do grupo consistindo em uma protease S8 de Bacillus sp.-13380 tendo pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, pelo menos 77%, tal como pelo menos 78% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1, uma protease S8 de Bacillus idriensis tendo pelo menos 80% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1, uma protease S8 de Bacillus sp.-62451 tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 e uma protease S8 de Bacillus oceanisediminis tendo pelo menos 85%,
12 / 14 tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87% com SEQ ID NO: 1.
12. Aditivo de ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o aditivo de ração animal não compreende um tensoativo.
13. Aditivo de ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente um ou mais componentes selecionados da lista consistindo em: um ou mais agentes de formulação; uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais micróbios; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; um ou mais prebióticos; um ou mais fitogênicos; um ou mais ácidos orgânicos; e um ou mais outros ingredientes de ração.
14. Aditivo de ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a protease S8 é formulada como um grânulo.
15. Formulação líquida, caracterizado pelo fato de compreender o aditivo de ração animal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, e 20% a 80% p/p de poliol.
16. Ração animal, caracterizado pelo fato de compreender o aditivo de ração animal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, ou a formulação líquida, conforme definida na reivindicação 15, e material à base de planta.
17. Método para melhoria de um ou mais parâmetros de
13 / 14 desempenho de um animal, caracterizado pelo fato de compreender administração a um ou mais animais do aditivo de ração animal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, da formulação líquida, conforme definida na reivindicação 15, ou da ração animal, conforme definida na reivindicação 16.
18. Método para preparação de uma ração animal, caracterizado pelo fato de compreender mistura do aditivo de ração animal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, ou da formulação líquida, como definida na reivindicação 15, com pelo menos uma proteína ou fonte de proteína.
19. Método para o tratamento de proteínas, caracterizado pelo fato de compreender adição do aditivo de ração animal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, ou da formulação líquida, conforme definida na reivindicação 15, a pelo menos uma proteína ou fonte de proteína.
20. Método para aumento da digestibilidade e/ou solubilidade de proteína, caracterizado pelo fato de compreender mistura do aditivo de ração animal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, ou da formulação líquida, conforme definida na reivindicação 15, com pelo menos uma proteína ou fonte de proteína.
21. Método para melhoria do valor nutricional de uma ração animal, caracterizado pelo fato de compreender adição do aditivo de ração animal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, ou da formulação líquida, conforme definida na reivindicação 15, à ração.
22. Uso do aditivo de ração animal como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, ou da formulação líquida como definida na reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ser: na preparação de uma composição para uso em ração animal;
14 / 14 para melhoria do valor nutricional de uma ração animal; para aumento da proteína digestível e/ou solúvel em ração animal; para aumento do grau de hidrólise de proteínas em dietas animais; para melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho em um animal; e/ou para o tratamento de proteínas.
23. Método para produção de um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de compreender os passos de: (a) cultura de uma célula hospedeira de Bacillus recombinante compreendendo um polinucleotídeo exógeno codificando o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, em que o polinucleotídeo é expresso e o polipeptídeo é produzido; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo.
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