CN111050566A

CN111050566A - 包含具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料添加剂及其用途

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Publication number: CN111050566A
Application number: CN201880055471.9A
Authority: CN
Inventors: L·T·哈哈尔; T·霍夫; P·R·厄斯特高
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2017-09-01
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2020-04-21
Also published as: WO2019043191A1; US11744263B2; US20200229463A1; EP3675647A1; AU2018322867A1; US20230309577A1; CA3070193A1; MX2020002177A; CL2020000466A1; BR112020003854A2; JP2020531037A; AU2018322867B2; AR112955A1

Abstract

本发明涉及包含具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂及其用途。它还涉及用于生产这些蛋白酶以及使用这些蛋白酶来改善动物性能和动物饲料营养价值的方法。

Description

包含具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料添加剂及其用途

序列表的引用

本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。

发明背景

技术领域

背景技术

在动物饲料中使用蛋白酶(体内)，和/或这类的蛋白酶用于处理植物性蛋白质(体外)的用途中，应注意蛋白质对于动物和人是必需营养因子。大部分家畜和许多人从植物性蛋白质源获得这些必需蛋白质。重要的植物性蛋白质源是，例如，油籽作物、豆类和谷类。

当蛋白质源(例如大豆粉)包含在单胃动物(如猪和家禽)的饲料中时，相当比例的大豆粉未被有效地消化(在小猪、生长猪和家禽如肉仔鸡、蛋鸡和公鸡中的表观回肠氮消化率仅是80％左右)。通过改善蛋白质的消化率，动物可以吸收更多的蛋白质从而改善性能，例如增加的体增重。

动物的胃肠道是由一系列各自呈现不同pH环境的区段组成。在单胃动物如猪和家禽以及许多类型的鱼中，胃是具有潜在地低至2-3的pH的强酸性，而肠具有6-7.5左右的更中性的pH。除胃和肠之外，家禽在胃之前还具有嗉囊。嗉囊中的pH主要由消化的饲料决定并且因此典型地位于pH 4-6的范围内。通过蛋白酶消化蛋白可发生在整个消化道中，其条件是该蛋白酶是有活性的并于该消化道的条件下存活。因此，以下的蛋白酶是特别令人希望的：它们是高度地酸稳定的，可以在胃环境中存活，并且同时在靶动物的消化道的宽范围的生理pH下是有效地有活性的。

决定蛋白酶是否可以改善蛋白质吸收的一个方法是通过研究当蛋白酶添加至动物饮食中时回肠氮消化率是否得到改善。运行体内试验可以确认蛋白酶的胃稳定性以及蛋白酶在降解蛋白质方面的有效性。本发明的一个目的是提供显示改善的生长性能增加的蛋白酶，例如通过表观回肠氮消化率实现的。

发明内容

本发明涉及一种动物饲料添加剂，其包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽，其中该多肽是选自下组的S8蛋白酶，该组由以下组成：

(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:1具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

(b)多肽，该多肽与SEQ ID NO:2具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

(c)多肽，该多肽与SEQ ID NO:3具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

(d)多肽，该多肽与SEQ ID NO:4具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

(e)多肽，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

(f)多肽，该多肽与SEQ ID NO:6具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

(g)多肽，该多肽与SEQ ID NO:7具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

(h)多肽，该多肽与SEQ ID NO:8具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

(i)多肽，该多肽与SEQ ID NO:9具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

(j)SEQ ID NO:1的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(k)SEQ ID NO:2的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(l)SEQ ID NO:3的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(m)SEQ ID NO:5的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(n)SEQ ID NO:6的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(o)SEQ ID NO:7的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(p)SEQ ID NO:8的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(q)SEQ ID NO:9的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(r)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；

(s)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、或(i)的多肽以及多至10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的N-末端和/或C-末端延伸；以及

(t)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、或(i)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性并且具有成熟多肽的至少90％的长度。

本发明进一步涉及动物饲料和包含动物饲料添加剂的液体配制品；改善动物的一个或多个性能参数的方法；制备动物饲料的方法；处理蛋白质的方法；使用动物饲料添加剂用于增加蛋白质的消化率和/或溶解度的方法和用于改善动物饲料的营养价值的方法及其用途。本发明进一步涉及在重组芽孢杆菌属宿主细胞中生产本发明多肽的方法。

本发明进一步涉及动物饲料添加剂发明或液体配制品在制备以下组合物中的用途，该组合物用于在动物饲料中使用；用于改善动物饲料的营养价值；用于增加动物饲料中的可消化和/或可溶性蛋白质；用于增加动物饮食中的蛋白质的水解程度；用于改善动物的一个或多个性能参数；和/或用于处理蛋白质。

序列表说明

SEQ ID NO:1是来自霍耐克芽孢杆菌(Bacillus horneckiae)的成熟S8蛋白酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2是来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)TY145的成熟S8蛋白酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是来自芽孢杆菌属物种TY145的变体S8蛋白酶的氨基酸序列

SEQ ID NO:4是保守基序TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG。

SEQ ID NO:5是来自芽孢杆菌属物种13380(还披露于WO 2017064253)的成熟S8蛋白酶的氨基酸序列且与SEQ ID NO:1具有大约78％的同一性。

SEQ ID NO:6是来自病研所芽孢杆菌(Bacillus idriensis)(还披露于WO2015091989)的成熟S8蛋白酶的氨基酸序列且与SEQ ID NO:1具有80％的同一性。

SEQ ID NO:7是来自芽孢杆菌属物种13380(还披露于WO 2015091989)的成熟S8蛋白酶的氨基酸序列且与SEQ ID NO:1具有89％的同一性。

SEQ ID NO:8是来自芽孢杆菌属物种62451(还披露于WO 2015091989)的成熟S8蛋白酶的氨基酸序列且与SEQ ID NO:1具有90％的同一性。

SEQ ID NO:9是来自海泥芽孢杆菌(Bacillus oceanisediminis)的成熟S8蛋白酶的氨基酸序列且与SEQ ID NO:1具有87％的同一性。

SEQ ID NO:10是编码海泥芽孢杆菌S8蛋白酶的DNA序列。

定义

多肽对大豆-玉米粉的活性：术语“多肽对大豆-玉米粉的活性”是指使用如本文所述的邻苯二甲醛(OPA)测定，确定酶对以30:70的比率混合的大豆粉-玉米粉的蛋白酶活性。pH值测定的实例是pH 3.0、4.0、5.0、6.0和7.0。温度测定的实例是30℃、35℃、40℃、45℃和50℃。时间测定的实例是2、3和4小时。酶浓度的实例是50、100、150、200、250和300mg酶蛋白/kg干物质的底物。

在一个优选的实施例中，通过以下来确定多肽对大豆-玉米粉的活性：将以30:70的比率混合的大豆粉-玉米粉(2g)添加至包含100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CAPS、12.5mM CaCl₂、150mM KCl、0.01％Triton X-100(10mL)的缓冲液中，这些缓冲液已被制备并且使用HCl或NaOH调节至这样的pH值，使得大豆-玉米粉底物已经与测定缓冲液混合后，浆液的最终pH为pH 3.0、4.0、5.0、6.0或7.0；然后将一个等分试样的底物浆液(2mL)在40℃下混合30min；添加溶解于100μl 100mM乙酸钠缓冲液(9.565g/L NaOAc、1.75g/L乙酸、5mM CaCl₂、0.01％BSA、0.01％吐温20，pH 6.0)中的蛋白酶(200mg酶蛋白/kg底物)；在40℃(磁力搅拌)下孵育样品3小时；离心样品(10min，4000rpm，0℃)；并使用邻苯二甲醛(OPA)测定(本文称为“大豆-玉米粉测定法”)收集上清液进行分析。在另一个优选的实施例中，如本文实例4所描述的，确定多肽对大豆-玉米粉的活性。

在实施例中，如SEQ ID NO:4的多肽，在pH 1下，本发明的多肽对大豆-玉米粉具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的活性。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体位点的基因的两种或多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可能导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可能编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

动物：术语“动物饲料”是指除人以外的所有动物。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如以下动物，如绵羊、山羊、牛(例如，肉牛、奶牛和牛犊)、鹿、牦牛、骆驼、美洲驼和袋鼠。非反刍动物包括单胃动物，例如猪或生猪(包括但不限于小猪、成长猪和母猪)；家禽，如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡和蛋鸡)；马(包括但不限于热血马、冷血马和温血马)、小牛；鱼(包括但不限于琥珀鱼、巨滑舌鱼、魮鱼、鲈鱼、蓝鱼、菖鲉(bocachico)、鲤科鱼、鲶鱼、卡叉马鱼(cachama)、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉鱼、遮目鱼、嘉鱼、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、小翻车鱼、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、瓜波特鱼(guapote)、大比目鱼、爪哇鱼(java)、野鲮属鱼、莱鱼(lai)、泥鳅、鲭鱼、牛奶鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕高鱼(paco)、珍珠斑点鱼(pearlspot)、佩杰瑞鱼(pejerrey)、河鲈鱼、狗鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、鲑鱼、虾米鱼(sampa)、加拿大鰤鲈、黑鲈、海鲤、发光鱼(shiner)、睡鲨(sleeper)、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、比目鱼、刺足鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼(sweetfish)、丁鲷、特罗尔鱼(terror)、罗非鱼、鳟鱼、鲔鱼、多宝鱼、白鳟鱼、白斑鱼和白鱼)；以及甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。

动物饲料：术语“动物饲料”是指适合于或旨在用于由动物摄入的任何化合物、制剂或混合物。单胃动物的动物饲料典型地包含浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲养的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(如在预混物中)，而反刍动物的动物饲料通常包含饲草(包括粗粮和青贮)，并且可以进一步包含浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲养的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(如在预混物中)。

体增重：术语“体增重(body weight gain)”意指在给定时间段期间动物的活重的增加，例如从第1天到第21天的体增重。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，所述可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

组合物：术语“组合物”是指包含载体和本发明的至少一种酶的组合物。可以将在此所描述的组合物与动物饲料混合，并且可以将其称为“粉状饲料”。

浓缩物：术语“浓缩物”意指具有高蛋白和能量浓度的饲料，例如鱼粉、糖蜜、低聚糖、高粱、种子和谷物(例如来自玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦的整体或由破碎、碾磨等制备的)、油籽滤饼(例如从棉籽、红花、向日葵、大豆、油菜籽/卡诺拉、花生或落花生)、棕榈仁饼、酵母衍生材料和酒糟(例如湿酒糟(WDS)和具有可溶物的干酒糟(DDGS))。

控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码所述多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，所述控制序列可以提供有多个接头。

欧洲生产效能因子(EPEF)：术语“欧洲生产效能因子”是决定生产效率并考虑到饲料转化率、死亡率和日增重的一个术语。EEF计算为[(存活率(％)×体增重(kg))/(以天计的研究持续时间)×FCR)]×100。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

饲料转化率：术语“饲料转化率”是指用来将动物的体重增加一个指定量的喂给动物的饲料量。改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意味着当饲料不包含所述饲料添加剂组合物时，与以将动物体重增加到相同量所需的饲料量相比，在饲料中使用饲料添加剂组合物导致需要将更少量的饲料喂给动物，以将动物的体重增加一个指定量。

饲料效率：术语“饲料效率”意指当动物在一段时间内被任意喂养或喂养指定量的食物时每单位饲料的增重的量。“增加的饲料效率”意味着根据本发明的饲料添加剂组合物在饲料中的使用导致与不用所存在的所述饲料添加剂组合物喂养的动物相比，每单位饲料摄入的增加的增重。

草料：如本文定义的术语“草料”还包括粗粮。草料是新鲜的植物物料，例如来自草料植物(禾草)和其他草料植物(海草、发芽谷物和豆类植物)或其任何组合的干草和青贮。草料植物的实例是紫花苜蓿(Alfalfa、lucerne)、百脉根、芸苔属植物(例如，羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉、芜菁甘蓝(瑞典芜菁)、萝卜)、三叶草(例如，杂三叶、红三叶、地三叶、白三叶)、禾草(例如，百慕大草、雀麦、伪燕麦草、羊茅、石南草(heath grass)、草地早熟禾、鸭茅(orchard grass)、黑麦草、梯牧草(Timothy-grass))、玉米(玉蜀黍)、小米、大麦、燕麦、黑麦、高粱、大豆和小麦和蔬菜(例如甜菜)。草料进一步包括来自谷物生产的作物残余物(例如玉米秸秆；来自小麦、大麦、燕麦、黑麦和其他谷物的秸秆)；来自蔬菜像甜菜缨(beettop)的残余物；来自油籽生产像来自大豆、油菜籽和其他豆科作物的茎和叶的残余物；以及来自用于动物或人消耗的谷物精制或来自燃料生产或其他行业的部分。

片段：术语“片段”意指具有在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。

在一方面，该片段包含成熟多肽的长度的至少90％，例如SEQ ID NO:1的至少283个氨基酸，SEQ ID NO:2的至少279个氨基酸，或SEQ ID NO:3的至少279个氨基酸。

在一方面，该片段包含成熟多肽的长度的至少92％，例如SEQ ID NO:1的至少290个氨基酸，SEQ ID NO:2的至少286个氨基酸或SEQ ID NO:3的至少286个氨基酸。

在一方面，该片段包含成熟多肽的长度的至少94％，例如SEQ ID NO:1的至少295个氨基酸，SEQ ID NO:2的至少292氨基酸或SEQ ID NO:3的至少292氨基酸。

在一方面，该片段包含成熟多肽的长度的至少96％，例如SEQ ID NO:1的至少301个氨基酸，SEQ ID NO:2的至少298个氨基酸或SEQ ID NO:3的至少298个氨基酸。

在一方面，该片段包含成熟多肽的长度的至少98％，例如SEQ ID NO:1的至少308个氨基酸，SEQ ID NO:2的至少304个氨基酸或SEQ ID NO:3的至少304个氨基酸。

在一方面，该片段包含成熟多肽的长度的至少99％，例如SEQ ID NO:1的至少311个氨基酸，SEQ ID NO:2的至少307个氨基酸或SEQ ID NO:3的至少307个氨基酸。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。

表观回肠氮消化率:术语“表观回肠氮消化率”(或AIDN)是当考虑到小肠末端(回肠)干物质的表观消失时，回肠消化物和饲料之间的氮浓度百分比差异。AIDN被用作小肠粗蛋白质消化率的估计，而不考虑小肠内源性蛋白的释放。这意味着与AIDN相比，真正的粗蛋白质消化率总是更大。AIDN的增加通常与小肠对氨基酸的吸收增加有关，并且是改善的动物性能的标记。使用以下公式计算表观回肠氮消化率(AIDN)：

AIDN(％)＝100-[(CMf/CMe)x(CNe/CNf)]x 100；

其中

CMf＝饲料中标记的浓度；CMe＝回肠消化物中标记的浓度；

CNf＝饲料中营养素的浓度；CNe＝回肠消化物中营养素的浓度。

术语“与阴性对照相比，使回肠氮消化率提高至少x％(例如，4％)”意味着如果阴性对照(即，相同饲料，但不向饮食中添加蛋白酶)的表观回肠氮消化率为y％(例如，75％)，则蛋白酶组的表观回肠氮消化率的百分比至少为y％+x％(因此在此实例中>79％)。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码所述物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码所述物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，基于埃德曼(EDMAN)N-末端测序数据和完整MS数据，该成熟多肽是SEQ ID NO:1的氨基酸1至314。在一方面，基于埃德曼N-末端测序数据和完整MS数据，该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至311。在一方面，基于埃德曼N-末端测序数据和完整MS数据，该成熟多肽是SEQ ID NO:3的氨基酸1至311。

在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞以不同的方式加工多肽，并且因此表达多核苷酸的一种宿主细胞当与表达相同多核苷酸的另一种宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的、或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段、或是合成的，其含有一个或多个控制序列。

获得自或可获得自：术语“获得自或可获得自”是指多肽可以在来自特定分类等级的生物中发现。在一个实施例中，该多肽获得自或可获得自芽孢杆菌目，其中术语目是分类等级。在另一个优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自芽孢杆菌科(Bacillaceae)、动性球菌科(Planococcaceae)或芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)，其中术语科是分类等级。在另一个优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自芽孢杆菌属，其中术语属是分类等级。

如果多肽的分类等级未知，则它可以容易地由本领域普通技术人员通过进行多肽的BLASTP检索(使用例如国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCIB)网站-www.ncbi.nlm.nih.gov/)并将其与最接近的同系物进行比较来确定。作为已知多肽的片段的未知多肽被认为是属于相同的分类物种。包含在多达10个位置中的取代、缺失和/或插入的未知天然多肽或人工变体被认为来自与已知多肽相同的分类物种。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构型，在所述构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得所述控制序列引导所述编码序列的表达。

丸粒：术语“丸粒”和/或“造粒”是指固体圆形、球形和/或圆柱形片或丸粒，以及用于形成此类固体形状的过程，特别是饲料丸粒和固体挤出的动物饲料。如在此使用的，术语“挤出(extrusion或extruding)”是本领域众所周知的术语，并且是指如此处所描述的，在压力下使组合物通过一个孔口的过程。

性能参数：术语“性能参数”是指选自以下列表的许多项中的一项，该列表由以下各项组成：体增重、欧洲生产效率因子(EPEF)、欧洲生产效能因子(EFF)以及FCR。术语“改善一个或多个性能参数”意指在一种或多种动物中体增重的增加、欧洲生产效率因子(EPEF)的增加、欧洲生产效能因子(EFF)的增加和/或FCR的降低。

蛋白酶：术语“蛋白酶”在本文中定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的每一种，en.wikipedia.org/wiki/Category:EC_3.4)。EC编号参考来自NC-IUBMB的Enzyme Nomenclature 1992[1992年酶命名法],Academic Press[学术出版社],圣地亚哥,加利福尼亚州，分别包括在Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],223:1-5(1994)；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],232:1-6(1995)；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],237:1-5(1996)；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],250:1-6(1997)；以及Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],264:610-650(1999)中出版的增刊1-5。术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人,1991,Protein Engng.[蛋白质工程]4:719-737和Siezen等人,1997,Protein Science[蛋白质科学]6:501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是蛋白酶的子组，该蛋白酶特征在于在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)特征在于除了具有丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白质水解活性(EC 3.4)。具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白质水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-封端的肽底物显示出活性，这些底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。

存在若干种蛋白酶活性类型，例如在Arg和Lys残基的羧基末端侧切割的胰蛋白酶样蛋白酶以及在疏水性氨基酸残基的羧基末端侧切割的糜蛋白酶样蛋白酶。本发明的蛋白酶是具有轻微碱性最适pH(最适pH 8-9.5)的丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)。

可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。测定温度的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。普通蛋白酶底物的实例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的Anson和Mirsky方法中，将变性的血红蛋白用作底物并且在用所讨论的蛋白酶孵育测定后，确定三氯乙酸可溶的血红蛋白的量用作蛋白酶活性的量度(Anson和Mirsky,1932,J.Gen.Physiol.[普通生理学杂志]16:59以及Anson,1938,J.Gen.Physiol.[普通生理学杂志]22:79)。

出于本发明的目的，使用描述于“材料与方法”中的测定来确定蛋白酶活性，如Suc-AAPF-pNA测定和普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定。对于普罗塔酶AK测定，当用该蛋白酶孵育时，不可溶普罗塔酶AK(天青精-交联的酪蛋白)底物释放蓝色并且确定该颜色作为蛋白酶活性的量度。对于Suc-AAPF-pNA测定，当用该蛋白酶孵育时，无色的Suc-AAPF-pNA底物释放黄色的对硝基苯胺并且确定该黄色作为蛋白酶活性的量度。

本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:1的多肽的至少20％，例如至少40％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。

粗粮：术语“粗粮”意指具有高水平纤维的干植物物料，例如来自种子和谷物以及作物残余物(例如秸秆、干椰肉(copra)、稻草、谷壳、甜菜废料)的纤维、麸、苞叶。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,(1970),J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)。使用6.1.0版本。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。Needle标注的“最长同一性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比同一性，并且如下计算：

(相同的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性的程度，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,同上)(优选3.0.0版本或更新版本)。使用6.1.0版本。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。Needle标注的“最长同一性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比同一性，并且如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)

青贮：术语“青贮”是指可以喂养反刍动物(反刍-咀嚼(cud-chewing)动物，如牛和绵羊)或用作厌氧消化器的生物燃料原料的发酵的、高水分储存饲料。它被发酵并储存在称为青贮(ensilage、ensiling或silaging)的过程中，并且通常由草或谷类作物(例如玉米、高粱、燕麦、黑麦、梯牧草等饲草植物)或豆类作物(如三叶草(clovers/trefoils)、苜蓿、野豌豆)使用整个绿色植物(不仅是谷物)制成。青贮可以由许多大田作物制成，并且取决于类型可以使用特殊术语(针对燕麦的燕麦青贮(oatlage)、针对苜蓿的半干青贮(haylage))。通过将切割的绿色植被放在青贮窖中，通过将其堆积在用塑料片覆盖的大堆中，抑或通过将大包包裹在塑料膜中来制造青贮。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指含有按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％和至多0.5％的与其天然或重组地相关的其他多肽材料的制剂。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。例如，这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来实现。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即，一个或多个(若干个)氨基酸残基取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指将占据一个位置的氨基酸用不同的氨基酸替换；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据某一位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:1的至少20％，例如至少40％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。

命名法

出于本发明的目的，命名法[E/Q]是指在该位置的氨基酸可以是谷氨酸(Glu，E)或谷氨酰胺(Gln，Q)。同样，命名法[V/G/A/I]意指在此位置的氨基酸可以是缬氨酸(Val，V)、甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)或异亮氨酸(Ile，I)，对于如本文所述的其他组合，依次类推。除非进一步另有限制，否则氨基酸X被这样定义，使得它可以是20种天然氨基酸中的任一种。

具体实施方式

包含具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料添加剂

蛋白酶通过将蛋白质降解成更小的片段起作用，这些片段更容易被动物消化和利用。动物饮食中主要包含碳水化合物源(例如，玉蜀黍、小麦、黑麦)和蛋白质源(通常是大豆粉)，然后补充少量脂肪和含有例如维生素和矿物质的预混物。蛋白酶将主要帮助消化蛋白质源，并且测定这种利用的一个方法是测定动物(例如肉鸡)的回肠氮消化率。回肠氮消化率越高，蛋白质的降解越好，这通常会导致动物中体增重和FCR的改善。

为了确定蛋白酶是否实际改善了回肠氮消化率，希望的是同时用阳性和阴性对照进行体内试验。在阴性对照顶部添加该酶，而阳性对照用更容易消化的蛋白质源(如大豆蛋白浓缩物)交换一些大豆粉。与NC相比，PC通常显示改善的回肠氮消化率，尽管如果NC中的蛋白内容物是高度可消化的，那么差异可能很小。然而，目的蛋白酶，例如本发明的那些，与NC和还优选的PC相比将显示出改善的回肠氮消化率。

因此，在第一方面，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料添加剂，其中该多肽是S8蛋白酶且与SEQ ID NO:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:1相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

该动物饲料添加剂优选包含SEQ ID NO:1或其等位基因变体，或由该SEQ ID NO:1或其等位基因变体组成；包含SEQ ID NO:1以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:1以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有蛋白酶活性并且具有SEQ ID NO:1长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在另一个实施例中，该动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:1的氨基酸1至314或由其组成。在另一个实施例中，该动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:1的氨基酸2至314或由其组成。在另一个实施例中，该动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:1的氨基酸4至314或由其组成。在实施例中，该多肽已经被分离。

在第一方面的延续中，本发明涉及包含SEQ ID NO:1的一个或多个变体的动物饲料添加剂，其中该变体是具有蛋白酶活性的S8蛋白酶并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或缺失、和/或插入或其任何组合。在实施例中，包含在SEQ ID NO:1中的取代和/或缺失和/或插入或其任何组合的位置的数目在1和50之间，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在实施例中，包含在SEQ ID NO:1中的取代和/或缺失和/或插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQID NO:1中的取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:1中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

如上所述，本发明的实施例涉及动物饲料或动物饲料添加剂，该动物饲料或动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:9的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合。已经制备了许多SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、和SEQ ID NO:9的单个突变变体和多个突变变体。实例12、14和15说明了SEQ IDNO:1的胃稳定性和它们在体内的性能。对单个突变(数据未显示)和多个突变变体进行测试，发现与SEQ ID NO:1的亲本多肽相比，所述单个突变和多个突变变体具有更好的酸稳定性、胃稳定性和残余活性。因此，本发明的实施例涉及动物饲料添加剂或动物饲料组合物，该动物饲料添加剂或动物饲料组合物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:9、或其变体，其中该变体具有蛋白酶活性且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中，典型地在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个，更典型地在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个位置中，或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个位置中，或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合。

与SEQ ID NO:1相比，具有突变S173P、S175P、T297P组合的变体改善了酸稳定性并且被用作进一步突变的起点。因此，在本发明的一个实施例中该多肽与包含S173P、S175P、T297P突变的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:9的任一个具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。值得注意的是，SEQ ID NO:2的突变形式SEQ ID NO:3包含突变S173P、S175P、T297P。如实例中所示，该动物饲料添加剂合适地包含与多肽具有至少90％的同一性的S8蛋白酶，该多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，更典型地由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成，其中该多肽包含零个、一个或多个选自下组的突变，该组由以下组成：S173P、S175P、T297P；L61P、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；H39D、L61P、S173P、S175P、T297P；L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；L61P、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；H123W、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；N59D、H83T、S173P、S175P、T297P；N59D、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；L61Y、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；N59D、L61P、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、H83T、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61Y、S173P、S175P、T297P；H39D、H83T、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、L61Y、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；H39D、L61Y、H83T、S173P、S175P、T297P；L61Y、H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61Y、H83T、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、S173P、S175P、T297P；H83T、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；L61Y、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、N59D、S173P、S175P、T297P；H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；L61P、H123W、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61P、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；L61P、H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；I43P、H83T、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、L61Y、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、N59D、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；N59D、H83T、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；N59D、L61Y、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；I43P、L61Y、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；I43P、N59D、L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；H39D、I43P、N59D、L61Y、S173P、S175P、T297P和L61Y、H83T、S173P、S175P、T297P。

在本发明的实施例中，动物饲料添加剂通常包含选自下组的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:9、或其变体，其中该变体具有蛋白酶活性且包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合，其中一个或多个取代是包含选自下组的突变的多个突变，该组由以下组成：S173P、S175P、T297P；L61P、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；H39D、L61P、S173P、S175P、T297P；L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；L61P、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；H123W、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；N59D、H83T、S173P、S175P、T297P；N59D、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；L61Y、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；N59D、L61P、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、H83T、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61Y、S173P、S175P、T297P；H39D、H83T、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、L61Y、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；H39D、L61Y、H83T、S173P、S175P、T297P；L61Y、H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61Y、H83T、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、S173P、S175P、T297P；H83T、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；L61Y、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、N59D、S173P、S175P、T297P；H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；L61P、H123W、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61P、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；L61P、H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；I43P、H83T、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、L61Y、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、N59D、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；N59D、H83T、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；N59D、L61Y、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；I43P、L61Y、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；I43P、N59D、L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；H39D、I43P、N59D、L61Y、S173P、S175P、T297P和L61Y、H83T、S173P、S175P、T297P。

此外，制备了许多同源物。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9彼此是同源物。

本发明的实施例涉及本发明的动物饲料添加剂，其中该多肽是选自下组的S8蛋白酶，该组由以下组成：来自芽孢杆菌属物种-13380，与SEQ ID NO:1具有至少75％，例如至少76％、至少77％，例如至少78％的序列同一性的S8蛋白酶；来自病研所芽孢杆菌，与SEQ IDNO:1具有80％的序列同一性的S8蛋白酶；来自芽孢杆菌属物种-62451，与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性的S8蛋白酶；以及来自海泥芽孢杆菌，与SEQ ID NO:1具有至少85％，例如至少86％，例如至少87％的序列同一性的S8蛋白酶。本发明的另外的实施例涉及包含S8蛋白酶的饲料添加剂，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％的同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQID NO:9。

在第一方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)包含一个或多个基序TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG(SEQ ID NO:4)。在第一方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)获得自或可获得自分类目芽孢杆菌目(Bacillales)，优选分类科芽孢杆菌科(Bacillaceae)，或更优选分类属芽孢杆菌属(Bacillus)。

在第一方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)具有SEQ ID NO:1的多肽蛋白酶活性的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在第一方面的任一部分的实施例中，与无蛋白酶(变体)添加至饮食中的阴性对照相比，该多肽(或变体)将回肠氮消化率提高了至少1％，例如至少1.5％、至少2.0％、至少2.5％、至少3.0％、至少3.5％、或至少4.0％。

所述氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。通常不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979，于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。保守取代的其他实例是G至A；A至G、S；V至I、L、A、T、S；I至V、L、M；L至I、M、V；M至L、I、V；P至A、S、N；F至Y、W、H；Y至F、W、H；W至Y、F、H；R至K、E、D；K至R、E、D；H至Q、N、S；D至N、E、K、R、Q；E至Q、D、K、R、N；S至T、A；T至S、V、A；C至S、T、A；N至D、Q、H、S；Q至E、N、H、K、R。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。也可以结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。

肽酶家族S8含有丝氨酸内肽酶，并且就序列数目和特征肽酶两者而言，是丝氨酸肽酶第二大家族。在亚家族S8A中，活性位点残基经常发生在基序Asp-Thr/Ser-Gly、His-Gly-Thr-His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro中。由此，SEQ ID NO:1、2和3的催化残基被鉴定为Asp-35、His-72和Ser-251，并且第四活性位点氨基酸被鉴定为Asn-170。该催化残基的任意氨基酸的突变将导致酶活性的变化或损失。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。

融合多肽可进一步包含两个多肽之间的裂解位点。在融合蛋白分泌之时，所述位点被裂解，从而释放出这两种多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6：240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。

在第二方面，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性多肽的动物饲料添加剂，其中该多肽是S8蛋白酶且与SEQ ID NO:2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:2相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

该动物饲料添加剂优选包含SEQ ID NO:2或其等位基因变体或由其组成；包含SEQID NO:2以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:2以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有蛋白酶活性并且具有SEQID NO:2长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在另一个实施例中，该动物饲料添加剂包含SEQ IDNO:2的氨基酸1至311或由其组成。在实施例中，该多肽已经被分离。

在第二方面的延续中，本发明涉及包含SEQ ID NO:2的一个或多个变体的动物饲料添加剂，其中该变体是具有蛋白酶活性的S8蛋白酶并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或缺失、和/或插入或其任何组合。在一个实施例中，包含在SEQ ID NO:2中的取代和/或缺失和/或插入或其任何组合的位置的数目在1和50之间，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在实施例中，包含在SEQ ID NO:2中的取代和/或缺失和/或插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:2中的取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:2中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本文的第二方面中描述了氨基酸变化、保守取代和融合肽的实例。

在第二方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)包含一个或多个基序TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG(SEQ ID NO:4)。在第二方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)获得自或可获得自分类目芽孢杆菌目(Bacillales)，优选分类科芽孢杆菌科(Bacillaceae)，更优选分类属芽孢杆菌属(Bacillus)。

在第二方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)具有SEQ ID NO:1多肽的蛋白酶活性的至少40％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在第二方面的任一部分的实施例中，与无蛋白酶(变体)添加至饮食中的阴性对照相比，该多肽(或变体)将回肠氮消化率提高了至少1％，例如至少1.5％、至少2.0％、至少2.5％、至少3.0％、至少3.5％、或至少4.0％。

在第三方面，本发明涉及包含一种或多种多肽具有蛋白酶活性的动物饲料添加剂，其中该多肽是S8蛋白酶并且具有与SEQ ID NO:3至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:1相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或3、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

该动物饲料添加剂优选包含SEQ ID NO:3或其等位基因变体或由其组成；包含SEQID NO:3以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:3以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有蛋白酶活性并且具有SEQID NO:3长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在另一个实施例中，该动物饲料添加剂包含SEQ IDNO:3的氨基酸1至311或由其组成。在实施例中，该多肽已经被分离。

在第三方面的延续中，本发明涉及包含SEQ ID NO:3的一个或多个变体的动物饲料添加剂，其中该变体是具有蛋白酶活性的S8蛋白酶并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或缺失、和/或插入或其任何组合。在实施例中，包含在SEQ ID NO:3中的取代和/或缺失和/或插入或其任何组合的位置的数目在1和50之间，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在实施例中，包含在SEQ ID NO:3中的取代和/或缺失和/或插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQID NO:3中的取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:3中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本文的第二方面中描述了氨基酸变化、保守取代和融合肽的实例。

本发明的另一个令人感兴趣的方面涉及包含S8蛋白酶的饲料添加剂，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％的同一性，例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。SEQ-ID-NO:2和SEQ-ID-NO:3的氨基酸序列在13个位置处不同。因此，本发明的实施例涉及包含S8蛋白酶的饲料添加剂，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％的同一性，例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，特别是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，其中该多肽在27、109、111、171、173、174、175、180、182、184、198、199和297中的零个、一个或多个位置处包含突变。本发明的动物饲料添加剂优选包含S8蛋白酶，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％的同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，或其中该S8蛋白酶是在SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的27、109、111、171、173、174、175、180、182、184、198、199和297中的零个、一个或多个位置处包含突变的多肽。本发明的实施例涉及包含S8蛋白酶的饲料添加剂，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％的同一性，例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，典型地SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，其中该多肽包含零个、一个或多个选自下组的突变，该组由以下组成：S27K、N109K、S111E、S171E、S173P、G174K、S175P、F180Y、G182A、L184F、Q198E、N199K和T297P。

本发明的实施例涉及包含S8蛋白酶的饲料添加剂，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％的同一性，例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，典型地SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3，其中该多肽包含选自下组的零个、一个或多个突变，该组由以下组成：S27K+N109K、S27K+S111E、S27K+S171E、S27K+S173P、S27K+G174K、S27K+S175P、S27K+F180Y、S27K+G182A、S27K+L184F、S27K+Q198E、S27K+N199K、N109K+S111E、N109K+S171E、N109K+S173P、N109K+G174K、N109K+S175P、N109K+F180Y、N109K+G182A、N109K+L184F、N109K+Q198E、N109K+N199K、S111E+S171E、S111E+S173P、S111E+G174K、S111E+S175P、S111E+F180Y、S111E+G182A、S111E+L184F、S111E+Q198E、S111E+N199K、S171E+S173P、S171E+G174K、S171E+S175P、S171E+F180Y、S171E+G182A、S171E+L184F、S171E+Q198E、S171E+N199K、S173P+G174K、S173P+S175P、S173P+F180Y、S173P+G182A、S173P+L184F、S173P+Q198E、S173P+N199K、G174K+S175P、G174K+F180Y、G174K+G182A、G174K+L184F、G174K+Q198E、G174K+N199K、S175P+F180Y、S175P+G182A、S175P+L184F、S175P+Q198E、S175P+N199K、F180Y+G182A、F180Y+L184F、F180Y+Q198E、F180Y+N199K、G182A+L184F、G182A+Q198E、G182A+N199K、L184F+Q198E、L184F+N199K、和Q198E+N199K。

本发明的实施例涉及包含S8蛋白酶的饲料添加剂，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％的同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，典型地SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，其中该多肽包含选自下组的零个、一个或多个突变，该组由以下组成：S27K+N109K+S111E、S27K+N109K+S171E、S27K+N109K+S173P、S27K+N109K+G174K、S27K+N109K+S175P、S27K+N109K+F180Y、S27K+N109K+G182A、S27K+N109K+L184F、S27K+N109K+Q198E、S27K+N109K+N199K、S27K+S111E+S171E、S27K+S111E+S173P、S27K+S111E+G174K、S27K+S111E+S175P、S27K+S111E+F180Y、S27K+S111E+G182A、S27K+S111E+L184F、S27K+S111E+Q198E、S27K+S111E+N199K、S27K+S171E+S173P、S27K+S171E+G174K、S27K+S171E+S175P、S27K+S171E+F180Y、S27K+S171E+G182A、S27K+S171E+L184F、S27K+S171E+Q198E、S27K+S171E+N199K、S27K+S173P+G174K、S27K+S173P+S175P、S27K+S173P+F180Y、S27K+S173P+G182A、S27K+S173P+L184F、S27K+S173P+Q198E、S27K+S173P+N199K、S27K+G174K+S175P、S27K+G174K+F180Y、S27K+G174K+G182A、S27K+G174K+L184F、S27K+G174K+Q198E、S27K+G174K+N199K、S27K+S175P+F180Y、S27K+S175P+G182A、S27K+S175P+L184F、S27K+S175P+Q198E、S27K+S175P+N199K、S27K+F180Y+G182A、S27K+F180Y+L184F、S27K+F180Y+Q198E、S27K+F180Y+N199K、S27K+G182A+L184F、S27K+G182A+Q198E、S27K+G182A+N199K、S27K+L184F+Q198E、S27K+L184F+N199K、S27K+Q198E+N199K、N109K+S111E+S171E、N109K+S111E+S173P、N109K+S111E+G174K、N109K+S111E+S175P、N109K+S111E+F180Y、N109K+S111E+G182A、N109K+S111E+L184F、N109K+S111E+Q198E、N109K+S111E+N199K、N109K+S171E+S173P、N109K+S171E+G174K、N109K+S171E+S175P、N109K+S171E+F180Y、N109K+S171E+G182A、N109K+S171E+L184F、N109K+S171E+Q198E、N109K+S171E+N199K、N109K+S173P+G174K、N109K+S173P+S175P、N109K+S173P+F180Y、N109K+S173P+G182A、N109K+S173P+L184F、N109K+S173P+Q198E、N109K+S173P+N199K、N109K+G174K+S175P、N109K+G174K+F180Y、N109K+G174K+G182A、N109K+G174K+L184F、N109K+G174K+Q198E、N109K+G174K+N199K、N109K+S175P+F180Y、N109K+S175P+G182A、N109K+S175P+L184F、N109K+S175P+Q198E、N109K+S175P+N199K、N109K+F180Y+G182A、N109K+F180Y+L184F、N109K+F180Y+Q198E、N109K+F180Y+N199K、N109K+G182A+L184F、N109K+G182A+Q198E、N109K+G182A+N199K、N109K+L184F+Q198E、N109K+L184F+N199K、N109K+Q198E+N199K、S111E+S171E+S173P、S111E+S171E+G174K、S111E+S171E+S175P、S111E+S171E+F180Y、S111E+S171E+G182A、S111E+S171E+L184F、S111E+S171E+Q198E、S111E+S171E+N199K、S111E+S173P+G174K、S111E+S173P+S175P、S111E+S173P+F180Y、S111E+S173P+G182A、S111E+S173P+L184F、S111E+S173P+Q198E、S111E+S173P+N199K、S111E+G174K+S175P、S111E+G174K+F180Y、S111E+G174K+G182A、S111E+G174K+L184F、S111E+G174K+Q198E、S111E+G174K+N199K、S111E+S175P+F180Y、S111E+S175P+G182A、S111E+S175P+L184F、S111E+S175P+Q198E、S111E+S175P+N199K、S111E+F180Y+G182A、S111E+F180Y+L184F、S111E+F180Y+Q198E、S111E+F180Y+N199K、S111E+G182A+L184F、S111E+G182A+Q198E、S111E+G182A+N199K、S111E+L184F+Q198E、S111E+L184F+N199K、S111E+Q198E+N199K、S171E+S173P+G174K、S171E+S173P+S175P、S171E+S173P+F180Y、S171E+S173P+G182A、S171E+S173P+L184F、S171E+S173P+Q198E、S171E+S173P+N199K、S171E+G174K+S175P、S171E+G174K+F180Y、S171E+G174K+G182A、S171E+G174K+L184F、S171E+G174K+Q198E、S171E+G174K+N199K、S171E+S175P+F180Y、S171E+S175P+G182A、S171E+S175P+L184F、S171E+S175P+Q198E、S171E+S175P+N199K、S171E+F180Y+G182A、S171E+F180Y+L184F、S171E+F180Y+Q198E、S171E+F180Y+N199K、S171E+G182A+L184F、S171E+G182A+Q198E、S171E+G182A+N199K、S171E+L184F+Q198E、S171E+L184F+N199K、S171E+Q198E+N199K、S173P+G174K+S175P、S173P+G174K+F180Y、S173P+G174K+G182A、S173P+G174K+L184F、S173P+G174K+Q198E、S173P+G174K+N199K、S173P+S175P+F180Y、S173P+S175P+G182A、S173P+S175P+L184F、S173P+S175P+Q198E、S173P+S175P+N199K、S173P+F180Y+G182A、S173P+F180Y+L184F、S173P+F180Y+Q198E、S173P+F180Y+N199K、S173P+G182A+L184F、S173P+G182A+Q198E、S173P+G182A+N199K、S173P+L184F+Q198E、S173P+L184F+N199K、S173P+Q198E+N199K、G174K+S175P+F180Y、G174K+S175P+G182A、G174K+S175P+L184F、G174K+S175P+Q198E、G174K+S175P+N199K、G174K+F180Y+G182A、G174K+F180Y+L184F、G174K+F180Y+Q198E、G174K+F180Y+N199K、G174K+G182A+L184F、G174K+G182A+Q198E、G174K+G182A+N199K、G174K+L184F+Q198E、G174K+L184F+N199K、G174K+Q198E+N199K、S175P+F180Y+G182A、S175P+F180Y+L184F、S175P+F180Y+Q198E、S175P+F180Y+N199K、S175P+G182A+L184F、S175P+G182A+Q198E、S175P+G182A+N199K、S175P+L184F+Q198E、S175P+L184F+N199K、S175P+Q198E+N199K、F180Y+G182A+L184F、F180Y+G182A+Q198E、F180Y+G182A+N199K、F180Y+L184F+Q198E、F180Y+L184F+N199K、F180Y+Q198E+N199K、G182A+L184F+Q198E、G182A+L184F+N199K、G182A+Q198E+N199K和L184F+Q198E+N199K。

本发明的实施例涉及包含S8蛋白酶的饲料添加剂，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％的同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，典型地SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，其中该多肽包含选自下组的零个、一个或多个突变，该组由以下组成：S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A、

S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+L184F、

S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+Q198E、

S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+N199K、

S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+G182A+L184F、

S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+G182A+Q198E、

S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+G182A+N199K、

S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+L184F+Q198E、

S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+L184F+N199K、

S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+Q198E+N199K、

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本发明的实施例涉及包含S8蛋白酶的饲料添加剂，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％的同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，典型地SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，其中该多肽包含选自下组的零个、一个或多个突变，该组由以下组成：S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F、

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本发明的实施例涉及包含S8蛋白酶的饲料添加剂，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％的同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，典型地SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，其中该多肽包含选自下组的零个、一个或多个突变，该组由以下组成：S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q198E、S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+N199K、

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S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+L184F+Q198E+N199K、

S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+G182A+L184F+Q198E+N199K、

S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+F180Y+G182A+L184F+Q198E+N199K、

S27K+N109K+S111E+S171E+S173P+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q198E+N199K、

S27K+N109K+S111E+S171E+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q198E+N199K、

S27K+N109K+S111E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q198E+N199K、

S27K+N109K+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q198E+N199K、

S27K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q198E+N199K和

N109K+S111E+S171E+S173P+G174K+S175P+F180Y+G182A+L184F+Q198E+N199K。

在第三方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)包含一个或多个基序TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG(SEQ ID NO:4)。在第三方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)获得自或可获得自分类目芽孢杆菌目(Bacillales)，优选分类科芽孢杆菌科(Bacillaceae)，更优选分类属芽孢杆菌属(Bacillus)。

在第三方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)具有SEQ ID NO:1多肽的蛋白酶活性的至少40％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在第三方面的任一部分的实施例中，与无蛋白酶(变体)添加至饮食中的阴性对照相比，该多肽(或变体)将回肠氮消化率提高了至少1％，例如至少1.5％、至少2.0％、至少2.5％、至少3.0％、至少3.5％、或至少4.0％。

第一、二或三的任一方面的动物饲料添加剂可以进一步包含选自以下列表的一种或多种组分，该列表由以下组成：一种或多种配制剂；一种或多种另外的酶；一种或多种微生物；一种或多种维生素；一种或多种矿物质；一种或多种氨基酸；一种或多种益生元；一种或多种植生素；一种或多种有机酸；以及一种或多种其他饲料成分。

第一、二或三任一方面的动物饲料添加剂可以进一步包含一种或多种配制剂，如以下配制品部分中所讨论。优选的配制剂是甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素或其任何组合。

第一、二或三任一方面的动物饲料添加剂可以进一步包含一种或多种另外的酶，如以下酶部分中所讨论。优选的酶是乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。

第一、二或三任一方面的动物饲料添加剂可以进一步包含一种或多种微生物，如以下益生菌部分中所讨论。优选的微生物是来自：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium sp.)、肉食杆菌属物种(Carnobacterium sp.)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、梭菌属物种(Clostridium sp.)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、肠球菌属物种(Enterococcus sp.)、乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳球菌属物种(Lactococcus sp.)、明串珠菌属物种(Leuconostoc sp.)、埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)、巨型球菌属物种(Megasphaera sp.)、乳酸片球菌(Pediococsusacidilactici)、片球菌属物种(Pediococcus sp.)、特氏丙酸杆菌(Propionibacteriumthoenii)、丙酸杆菌属物种(Propionibacterium sp.)、链球菌属物种(Streptococcussp.)或其任何组合。

第一、二或三任一方面的动物饲料添加剂可以进一步包含一种或多种维生素，如以下维生素和矿物质部分中所讨论。第一、二或三任一方面的动物饲料添加剂可以进一步包含一种或多种矿物质，如以下维生素和矿物质部分中所讨论。第一、二或三任一方面的动物饲料添加剂可以进一步包含一种或多种氨基酸，如以下氨基酸部分中所讨论。第一、二或三任一方面的动物饲料添加剂可以进一步包含一种或多种益生元，如以下益生元部分中所讨论。第一、二或三任一方面的动物饲料添加剂可以进一步包含一种或多种植生素，如以下植生素部分中所讨论。第一、二或三任一方面的动物饲料添加剂可以进一步包含一种或多种有机酸，如以下有机酸部分中所讨论。

在一个实施例中，动物饲料添加剂中的S8蛋白酶被配制为颗粒。在一个实施例中，动物饲料添加剂中的S8蛋白酶被配制为颗粒，其中该颗粒包含核心粒子和一种或多种包衣。在一个实施例中，动物饲料添加剂中的S8蛋白酶被配制为颗粒，该颗粒包含核心粒子和一种或多种包衣，其中该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂处于液体配制品的形式。在一个实施例中，该动物饲料添加剂处于液体配制品的形式，其中该S8蛋白酶在0.001％至25％w/w的液体配制品，优选0.01％至25％w/w，更优选0.05％至20％w/w，更优选0.2％至15％w/w，甚至更优选0.5％至15％w/w或最优选1.0％至10％w/w的多肽给药。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂处于液体配制品的形式，其中该液体配制品包含20％至80％w/w的多元醇。在一个实施例中，该动物饲料添加剂处于液体配制品的形式，该液体配制品包含20％至80％w/w的多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)或其任何组合。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂处于液体配制品的形式，其中该液体配制品包含0.01％至2.0％w/w的防腐剂。在一个实施例中，该动物饲料添加剂处于液体配制品的形式，该液体配制品包含0.01％至2.0％w/w的防腐剂，其中该防腐剂选自下组，该组由以下组成：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂处于液体配制品的形式，该液体配制品包含：

(A)本发明的0.001％至25％w/w的S8蛋白酶(如在上文第一、二和三方面所述)；

(B)20％至80％w/w的多元醇；

(C)0.001％至2.0％w/w的防腐剂；和

(D)水。

在以下段落中描述了多元醇和防腐剂的优选的实例。

包含具有蛋白酶活性的多肽的颗粒

在第四方面，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的颗粒，其中该多肽是选自下组的S8蛋白酶，该组由以下组成：

(d)SEQ ID NO:1的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(e)SEQ ID NO:2的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(f)SEQ ID NO:3的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(g)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；

(h)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多肽以及多至10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的N-末端和/或C-末端延伸；和

(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性并且具有成熟多肽的至少90％的长度。

在第四方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)包含一个或多个基序TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG(SEQ ID NO:4)。在第四方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)获得自或可获得自分类目芽孢杆菌目(Bacillales)，优选分类科芽孢杆菌科(Bacillaceae)，更优选分类属芽孢杆菌属(Bacillus)。

在第四方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)具有SEQ ID NO:1多肽的蛋白酶活性的至少40％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在第四方面的任一部分的实施例中，与无蛋白酶(变体)添加至饮食中的阴性对照相比，该多肽(或变体)将回肠氮消化率提高了至少1％，例如至少1.5％、至少2.0％、至少2.5％、至少3.0％、至少3.5％、或至少4.0％。

在第四方面的实施例中，该颗粒包含核心粒子和一种或多种包衣。在实施例中，该颗粒包含核心粒子和一种或多种包衣，其中该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。

第四方面的颗粒可以进一步包含一种或多种选自下组的组分，该组由以下组成：一种或多种配制剂；一种或多种另外的酶；一种或多种微生物；一种或多种维生素；一种或多种矿物质；一种或多种氨基酸；一种或多种益生元；一种或多种植生素；一种或多种有机酸；以及一种或多种其他饲料成分。

第四方面的颗粒可以进一步包含一种或多种配制剂，如以下配制品部分中所讨论。优选的配制剂是甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素或其任何组合。

第四方面的颗粒可以进一步包含一种或多种另外的酶，如以下酶部分中所讨论。优选的酶是乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。

第四方面的颗粒可以进一步包含一种或多种微生物，如以下益生菌部分中所讨论。优选的微生物是来自：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、双歧杆菌属物种、肉食杆菌属物种、丁酸梭菌、梭菌属物种、屎肠球菌、肠球菌属物种、乳杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属物种、明串珠菌属物种、埃氏巨型球菌、巨型球菌属物种、乳酸片球菌、片球菌属物种、特氏丙酸杆菌、丙酸杆菌属物种、链球菌属物种或其任何组合。

第四方面的颗粒可以进一步包含一种或多种维生素，如以下维生素和矿物质部分中所讨论。第四方面的颗粒可以进一步包含一种或多种矿物质，如以下维生素和矿物质部分中所讨论。第四方面的颗粒可以进一步包含一种或多种氨基酸，如以下氨基酸部分中所讨论。第四方面的颗粒可以进一步包含一种或多种益生元，如以下益生元部分中所讨论。第四方面的颗粒可以进一步包含一种或多种植生素，如以下植生素部分中所讨论。第四方面的颗粒可以进一步包含一种或多种有机酸，如以下有机酸部分中所讨论。

包含具有蛋白酶活性的多肽的液体配制品

在第五方面，本发明涉及液体配制品，该液体配制品包含：

(A)一种或多种0.001％至25％w/w的具有蛋白酶活性的多肽，其中该多肽是选自以下列表的S8蛋白酶，该列表由以下组成：

(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％的长度；和

(B)水。

在第五方面的一个实施例中，本发明涉及液体配制品，该液体配制品包含：

(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％的长度；

(B)20％至80％w/w的多元醇；

(C)任选地0.001％至2.0％w/w的防腐剂；和

(D)水。

(B)0.001％至2.0％w/w的防腐剂；

(C)任选地20％至80％w/w的多元醇；和

(D)水。

在第五方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)包含一个或多个基序TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG(SEQ ID NO:4)。在第五方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)获得自或可获得自分类目芽孢杆菌目(Bacillales)，优选分类科芽孢杆菌科(Bacillaceae)，更优选分类属芽孢杆菌属(Bacillus)。

在第五方面的任一部分的实施例中，该多肽(或变体)具有SEQ ID NO:1多肽的蛋白酶活性的至少40％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在第五方面的任一部分的实施例中，与无蛋白酶(变体)添加至饮食中的阴性对照相比，该多肽(或变体)将回肠氮消化率提高了至少1％，例如至少1.5％、至少2.0％、至少2.5％、至少3.0％、至少3.5％、或至少4.0％。

在第五方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含一种或多种多元醇，优选选自下组的多元醇，该组由以下组成：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)，更优选选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)或其任何组合。

在第五方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％的多元醇(即多元醇的总量)，优选25％-75％的多元醇，更优选30％-70％的多元醇，更优选35％-65％的多元醇，或最优选40％-60％的多元醇。在第五方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％的多元醇，优选25％-75％的多元醇，更优选30％-70％的多元醇，更优选35％-65％的多元醇，或最优选40％-60％的多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)。在第五方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％的多元醇(即多元醇的总量)，优选25％-75％的多元醇，更优选30％-70％的多元醇，更优选35％-65％的多元醇，或最优选40％-60％的多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)。

在第五方面的任一部分的一个实施例中，该防腐剂选自下组，该组由以下组成：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。在一个实施例中，该液体配制品包含0.02％至1.5％w/w的防腐剂，更优选0.05％至1.0％w/w的防腐剂，或最优选0.1％至0.5％w/w的防腐剂。在一个实施例中，该液体配制品包含0.001％至2.0％w/w的防腐剂(即防腐剂的总量)，优选0.02％至1.5％w/w的防腐剂，更优选0.05％至1.0％w/w的防腐剂，或最优选0.1％至0.5％w/w的防腐剂，其中该防腐剂选自下组，该组由以下组成：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。

在第五方面的任一部分的一个实施例中，该S8蛋白酶在0.001％至25％w/w的液体配制品，优选0.01％至25％w/w，更优选0.05％至20％w/w，更优选0.2％至15％w/w，甚至更优选0.5％至15％w/w或最优选1.0％至10％w/w的多肽给药。

在第五方面的任一部分的液体配制品，该液体配制品可以进一步包含选自以下列表的一种或多种组分，该列表由以下组成：一种或多种配制剂；一种或多种另外的酶；一种或多种微生物；一种或多种维生素；一种或多种矿物质；一种或多种氨基酸；一种或多种益生元；一种或多种植生素；一种或多种有机酸；以及一种或多种其他饲料成分。

在第五方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含一种或多种配制剂(例如本文描述的那些)，优选地选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、PVA、乙酸盐和磷酸盐，优选地选自以下列表，该列表由以下组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。

在第五方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含一种或多种另外的酶。该一种或多种另外的酶优选选自下组，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。

在第五方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品一种或多种益生菌。该一种或多种益生菌优选选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、双歧杆菌属物种、肉食杆菌属物种、丁酸梭菌、梭菌属物种、屎肠球菌、肠球菌属物种、乳杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属物种、明串珠菌属物种、埃氏巨型球菌、巨型球菌属物种、乳酸片球菌、片球菌属物种、特氏丙酸杆菌、丙酸杆菌属物种和链球菌属物种或其任何组合。

在第五方面的任一部分的液体配制品可以进一步包含一种或多种维生素，如以下维生素和矿物质部分中所讨论。在第五方面的任一部分的液体配制品可以进一步包含一种或多种矿物质，如以下维生素和矿物质部分中所讨论。在第五方面的任一部分的液体配制品可以进一步包含一种或多种氨基酸，如以下氨基酸部分中所讨论。在第五方面的任一部分的液体配制品可以进一步包含一种或多种益生元，如以下益生元部分中所讨论。在第五方面的任一部分的液体配制品可以进一步包含一种或多种植生素，如以下植生素部分中所讨论。在第五方面的任一部分的液体配制品可以进一步包含一种或多种有机酸，如以下有机酸部分中所讨论。

特性

pH-活性

蛋白酶的pH-活性曲线可以如动力学Suc-AAPF-pNA测定中描述的来确定。在较低pH(例如，4-7)下的活性对于在动物中蛋白质的消化可以是有利的。

pH-稳定性

蛋白酶的pH-稳定性曲线可以如动力学Suc-AAPF-pNA测定中描述的来确定。在较低pH(例如，pH 3)下的稳定性可以有利于蛋白酶在动物胃肠道的条件下存活。

热稳定性

可如在实例5中所述的确定热稳定性，即，使用DSC测量来确定经纯化的蛋白酶蛋白的变性温度(T_d)。Td指示了该蛋白质的热稳定性：T_d越高，热稳定性越高。因此，在一个优选的实施例中，本发明的蛋白酶具有一个T_d，该T_d高于参照蛋白酶的T_d，其中T_d是对经纯化的蛋白酶样品(优选地具有至少90％或95％的纯度，如通过SDS-PAGE确定的)确定的。

在优选实施例中，如通过残余活性，变性温度T_d，所提供的这些热特性(例如加热稳定性、温度稳定性、热稳定性、蒸汽稳定性、和/或造粒稳定性)，或本发明的蛋白酶的其他参数高于相应的值(如SEQ ID NO:1的蛋白酶的残余活性或T_d)，更优选地是它的至少101％，或者它的至少102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、或者至少110％。甚至更优选地，本发明的蛋白酶的参数(如残余活性或T_d)的值是SEQ ID NO:1的蛋白酶的值的至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、或至少190％。

在仍另外的具体实施例中，本发明的热稳定的蛋白酶具有至少50℃的熔化温度T_m(或变性温度T_d)，如通过在实例5(即在20mM乙酸钠，pH 4.0)中所述的差示扫描量热法(DSC)所确定的。在仍另外的具体实施例中，该T_m是至少51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或至少100℃。

蒸汽稳定性

蒸汽稳定性可以如在实例6中所述的，通过确定在85℃或90℃下蒸汽处理一个短的时间之后蛋白酶分子的残余活性来确定。

造粒稳定性

造粒稳定性可如在实例7中所述的，通过使用与饲料预混合的酶颗粒来确定。由该混合器用蒸汽将该饲料调节至95℃。在调节之后，将该饲料加压成丸粒并确定残余活性。

具有蛋白酶活性的多肽的来源

可以从任何属的微生物获得根据本发明的具有蛋白酶活性的多肽。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“获得自”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由所述来源或由已经插入了来自所述来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是具有蛋白酶活性的、来自如放线菌门内的一种革兰氏阳性细菌或来自如变形菌门内的一种革兰氏阴性细菌的多肽。

在一方面，该多肽是来自芽孢杆菌目，或来自芽孢杆菌科或来自芽孢杆菌属细菌的蛋白酶。

应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学等同物(equivalent)，例如无性型，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。

这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码所述多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)分离或克隆多核苷酸。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸，如本文中所述。在一个实施例中，编码本发明的多肽的多核苷酸已经被分离。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],AcademicPress[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自芽孢杆菌属的菌株或来自芽孢杆菌目相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的等位基因变体或物种变体。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，其包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，所述一个或多个控制序列指导所述编码序列在适合的宿主细胞中的表达。

可用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

所述控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。所述启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子有效地连接到编码该多肽的多核苷酸的3’-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延伸因子。

用于酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992，同上)描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加所述基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例从以下获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导子有效地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，有效地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。

控制序列也可为编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以含有对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替换天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992，同上)描述。

控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化裂解或自身催化裂解来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列两者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。

还可希望的是添加调节序列，所述调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码所述多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达所述多核苷酸。在产生所述表达载体时，所述编码序列位于所述载体中，这样使得所述编码序列与所述用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞中的选择性标记包括但不限于：adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、以及其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。

选择性标记可以是如WO 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到所述宿主细胞基因组中，所述载体可以依靠编码所述多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到所述基因组中的所述载体的任何其他元件。可替代地，所述载体可含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，所述复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含所述基因的质粒或载体的构建。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽疫亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或轭合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下方式来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下方式来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如,Clewell,1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥])。

真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner、Passmore和Davenport编辑,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所述的那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、带纹金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,AcademicPress,Inc.[学术出版社有限公司],纽约)；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，所述方法包括(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；(b)任选地分离该多肽；以及(c)回收该多肽。在一方面，该细胞是芽孢杆菌属细胞。在另一方面，该细胞是霍耐克芽孢杆菌细胞。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)培养重组芽孢杆菌属宿主细胞，该重组芽孢杆菌属宿主细胞包含编码本发明多肽的外源多核苷酸，其中表达该多核苷酸并产生该多肽；

(b)任选地分离该多肽；和

(c)任选地回收该多肽。

在实施例中，该重组芽孢杆菌属宿主细胞选自以下列表，该列表由以下组成：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、以及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。在一个优选的实施例中，该重组芽孢杆菌属宿主细胞选自以下列表，该列表由以下组成：地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌、和枯草芽孢杆菌。

宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，所述培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。

可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一个方面，回收包含多肽的发酵液。

可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH Publishers[VCH出版公司]，纽约，1989)。

在一个替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。

植物

本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多肽，从而以可回收的量表达和产生多肽或结构域。可以从该植物或植物部分回收该多肽或结构域。可替代地，含有该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)；饲用草，例如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷物，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草、豆科植物(例如羽扇豆、马铃薯、糖甜菜、豌豆、菜豆和大豆)以及十字花科植物(十字花科)(例如花椰菜、油菜籽和紧密相关的模式生物体拟南芥)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎以及包含这些部分的独立组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。

植物细胞和特定的植物细胞区室(例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质)也被认为是植物部分。

同样包含于本发明范围内的是此类植物、植物部分以及植物细胞的子代。

可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。

本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编码该多肽或结构域的多核苷酸；并且(b)回收该多肽或结构域。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。该发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，该发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在一个特定实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。

在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所述的方法来产生。

酶组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含本发明的多肽。术语“富集”表示组合物的蛋白酶活性已增加，例如富集因子为至少1.1，例如至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少2.0、至少3.0、至少4.0、至少5.0、至少10。

配制品

本发明的酶可以配制为液体或固体。针对液体配制品，该配制剂可以包含多元醇(像例如，甘油、乙二醇或丙二醇)、盐(像例如，氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾)或糖或糖衍生物(像例如，糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨醇)。因此，在一个实施例中，该组合物是液体组合物，其包含本发明的多肽和一种或多种选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨醇。该液体配制品可以喷洒在已经丸粒化(pelleted)的饲料上，或可以添加至供给动物的饮用水中。

针对固体配制品，该配制品可以例如作为颗粒、喷雾干粉或聚结物(例如如在WO00/70034中所披露)。配制剂可以包含盐(有机的或无机的锌、钠、钾或钙盐，像例如，如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)。

在一个实施例中，该组合物是一种固体组合物，例如喷雾干燥组合物，该固体组合物包含本发明的蛋白酶和一种或多种选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素。在一个优选的实施例中，该配制剂选自一种或多种以下化合物：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、硫酸镁和碳酸钙。

本发明还涉及包含本发明的蛋白酶的酶颗粒/粒子任选地与一种或多种另外的酶的组合。该颗粒由核心以及任选地包围该核心的一种或多种包衣(外层)构成。

通常，该颗粒的粒度(granule/particle size)(测量为当量球径(基于体积的平均粒度))是20-2000μm，具体是50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。

该核心可以通过粒化成分的共混物来制备，例如通过包括造粒技术的方法，例如结晶、沉淀、锅包衣(pan-coating)、流化床包衣、流化床凝集、旋转雾化、挤压、颗粒化(prilling)、滚圆(spheronization)、粒度减小法、转鼓造粒(drum granulation)和/或高剪切造粒。

用于制备核心的方法可见于Handbook of Powder Technology[粉末技术手册]；C.E.Capes的Particle size enlargement[粒度增大]；第1卷；1980；Elsevier[爱思唯尔]。制备方法包括已知的饲料和颗粒配制技术，例如：

a)喷雾干燥产品，其中在喷雾干燥塔中雾化液体含酶溶液以形成小液滴，在它们在沿干燥塔下降的过程中干燥形成含有酶的颗粒状材料；

b)层状产品，其中酶作为层包衣在预形成的惰性核心粒子周围，其中包括酶的溶液被雾化，通常在流化床装置中，其中预形成的核心粒子被流体化，并且含酶的溶液附着到核心粒子上并干燥，直到使得干的酶层留在核心粒子的表面上。如果可以发现具有期望尺寸的有用核心粒子，则通过这种方式能够获得具有期望尺寸的粒子。这种类型的产品描述于例如WO 97/23606中；

c)吸收的核心粒子，其中不是包衣该酶作为核心周围的层，而是在核心的表面上和/或表面中吸收该酶。这样的方法描述于WO 97/39116中。

d)挤出或丸粒化的(pelletized)产品，其中将含有酶的糊料压成丸粒或在压力下通过小的开口挤出并切割为粒子，随后干燥这些粒子。此类粒子通常具有相当大的尺寸，因为开有挤出开口的材料(通常是具有钻孔的平板)限制了通过挤出开口可允许的压力降。此外，当使用小的开口时，非常高的挤出压力增加了酶糊料中的热发生，这对酶是有害的；

e)颗粒化的产品，其中含酶的粉末悬浮于熔化的蜡中并且例如通过转盘喷雾器将悬浮液喷洒到冷却室中，在此液滴快速地固化(Michael S.Showell(编辑)；Powdereddetergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系]；1998；第71卷；第140-142页；Marcel Dekker[马塞尔德克尔出版社])。所获得产物是酶均匀分布遍及整个惰性材料而不是集中在其表面上的产物。US 4,016,040和US 4,713,245也与此技术有关；

f)混合造粒产品，其中将液体添加至例如常用造粒组分的干燥粉末组合物中，经由液体或粉末或二者引入该酶。将液体和粉末混合，并且因为液体的水分为干燥粉末所吸收，干燥粉末的组分开始附着并附聚，并且粒子将构建，形成包含酶的颗粒。此种方法描述于US 4,106,991和有关的文献EP 170360、EP 304332、EP 304331、WO 90/09440和WO 90/09428中。在其中可以用各种高剪切混合器作为造粒机的此方法的具体产品中，将由酶、填料和粘合剂等组成的颗粒与纤维素纤维混合以强化粒子，而得到所谓的T-颗粒(T-granulate)。经强化的粒子更加坚固，酶粉尘释放更少。

g)粒度减小，其中通过碾磨或压碎含酶的较大的粒子、丸粒、平片体、坯块(briquette)等产生核心。通过将碾磨或压碎的产物过筛获得所需要的核心粒子级分。可以回收尺寸过大和尺寸过小的粒子。粒度减小描述于(Martin Rhodes(编辑)；Principles ofPowder Technology[粉末技术原理]；1990；第10章；John Wiley&Sons[约翰威利父子公司])；

h)流化床造粒，其涉及将颗粒悬浮于空气流中并经喷嘴喷洒液体到流态化粒子上。被喷洒的液滴击中的粒子湿润并发粘。发粘的粒子与其他粒子碰撞并附着于其上并形成颗粒；

i)这些核心可经受干燥，例如在流化床干燥器中。本领域技术人员可以使用其他已知的在饲料或洗涤剂工业中用于干燥颗粒的方法。干燥优选在从25℃至90℃的产物温度下进行。对于一些酶来说，重要的是包含酶的核心在包衣之前含有少量的水。如果在过量水除去之前水敏性酶被包衣，则水分会截留在核心中并可能消极地影响酶的活性。干燥之后，这些核心优选含有0.1-10％w/w的水。

该核心可以包括另外的材料如填料、纤维材料(纤维素或合成纤维)、稳定剂、增溶剂、悬浮剂、黏度调节剂、轻球体、增塑剂、盐、润滑剂和芳香剂。

该核心可以包含粘合剂，例如合成聚合物、蜡、脂肪或碳水化合物。

该核心通常作为均匀的共混物可以包含多价阳离子的盐、还原剂、抗氧剂、过氧化物分解催化剂和/或酸性缓冲液组分。

在一个实施例中，该核心包含选自下组的材料，该组由以下组成：盐(例如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、有机小分子、淀粉、面粉、纤维素和矿物质以及粘土矿物质(也称作水性页硅酸铝)。在一个实施例中，该核心包含粘土矿物质，例如高岭石或高岭土。

该核心可以包含惰性粒子，其中酶被吸附到该惰性粒子之内，或者被施加(例如通过流化床包衣)到该惰性粒子的表面上。

该核心的直径可以是20-2000μm，具体地50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。

该核心可以被至少一种包衣包围，例如以改善储存稳定性、以减少在处理过程中的粉尘形成或用于着色该颗粒。任选的一种或多种包衣可以包括盐和/或蜡和/或面粉包衣或其他合适的包衣材料。

可以将该包衣按核心的重量计以至少0.1％(例如，至少0.5％、1％或5％)的量施加。该量至多可以是100％、70％、50％、40％或30％。

该包衣优选是至少0.1μm厚，具体地至少0.5μm、至少1μm或至少5μm。在一些实施例中，该包衣的厚度低于100μm，例如低于60μm或低于40μm。

该包衣应当通过形成基本上连续的层来密封该核心单元。基本上连续的层应当理解为具有极少或没有孔洞的包衣，使得密封或封闭的核心单元具有极少或没有未包衣的区域。在一个具体实施例中，该层或包衣在厚度上应是均匀的。

包衣可以进一步包含如本领域已知的其他材料，例如填充剂、防粘剂、色素、染料、增塑剂和/或粘合剂，如二氧化钛、高岭土、碳酸钙或滑石。

盐包衣可以包含按重量计至少60％的盐，例如按重量计至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。

该盐可以从盐溶液(其中该盐是完全溶解的)中添加，或者从盐悬浮液(其中该细粒子是少于50μm，例如少于10μm或少于5μm)中添加。

该盐包衣可以包含单一盐或者两种或更多种盐的混合物。该盐可以是水溶性的，具体地具有在20℃在100g水中至少0.1g的溶解度，优选至少0.5g/100g水，例如至少1g/100g水、例如至少5g/100g水。

该盐可以是无机盐，例如硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯盐或碳酸盐或者简单有机酸(少于10个碳原子，例如6个或更少的碳原子)的盐例如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。在这些盐中的阳离子的实例是碱或碱土金属离子、铵离子或第一过渡系的金属离子，例如钠、钾、镁、钙、锌或铝。阴离子的实例包括氯、溴、碘、硫酸根、亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫代硫酸根、磷酸根、磷酸二氢根、二碱式磷酸根、次磷酸根、焦磷酸二氢根、四硼酸根、硼酸根、碳酸根、碳酸氢根、硅酸根、柠檬酸根、苹果酸根、马来酸根、丙二酸根、琥珀酸根、乳酸根、甲酸根、乙酸根、丁酸根、丙酸根、苯甲酸根、酒石酸根、山梨酸根、抗坏血酸根或葡萄糖酸根。具体而言，可以使用硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、膦酸根、硝酸根、氯或碳酸根的碱或碱土金属盐或者简单有机酸的盐如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。

在包衣中的盐可以在20℃下具有超过60％的恒定湿度，具体地超过70％、超过80％或超过85％，或者它可以是此盐的另一种水合物形式(例如，无水物)。该盐包衣可以如WO 97/05245、WO 98/54980、WO 98/55599、WO 00/70034、WO 2006/034710、WO 2008/017661、WO 2008/017659、WO 00/20569、WO 01/004279、WO 97/05245、WO 00/01793、WO2003/059086、WO 2003/059087、WO 2007/031483、WO 2007/031485、WO 2007/044968、WO2013/192043、WO 2014/014647和WO 2015/197719中所述或是如WO 01/00042中所述的聚合物包衣。

适合的盐的具体实例是NaCl(CH20℃＝76％)、Na₂CO₃(CH20℃＝92％)、NaNO₃(CH20℃＝73％)、Na₂HPO₄(CH20℃＝95％)、Na₃PO₄(CH25℃＝92％)、NH₄Cl(CH20℃＝79.5％)、(NH₄)₂HPO₄(CH20℃＝93,0％)、NH₄H₂PO₄(CH20℃＝93.1％)、(NH₄)₂SO₄(CH20℃＝81.1％)、KCl(CH20℃＝85％)、K₂HPO₄(CH20℃＝92％)、KH₂PO₄(CH20℃＝96.5％)、KNO₃(CH20℃＝93.5％)、Na₂SO₄(CH20℃＝93％)、K₂SO₄(CH20℃＝98％)、KHSO₄(CH20℃＝86％)、MgSO₄(CH20℃＝90％)、ZnSO₄(CH20℃＝90％)和柠檬酸钠(CH25℃＝86％)。其他实例包括NaH₂PO₄、(NH₄)H₂PO₄、CuSO₄、Mg(NO₃)₂、乙酸镁、乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌和山梨酸锌。

该盐可以处于无水形式，或者它可以是水合盐，即具有结晶化的一个或多个结合水的结晶盐水合物，例如描述于WO 99/32595中。具体实例包括无水硫酸钠(Na₂SO₄)、无水硫酸镁(MgSO₄)、七水硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)、七水硫酸锌(ZnSO₄.7H₂O)、七水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄.7H₂O)、六水硝酸镁(Mg(NO₃)₂(6H₂O))、二水柠檬酸钠以及四水乙酸镁。

优选地，作为盐溶液使用该盐，例如使用流化床。

蜡包衣可以包含按重量计至少60％的蜡，例如按重量计至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。

蜡的具体实例是聚乙二醇；聚丙烯；巴西棕榈蜡；小烛树蜡；蜂蜡；氢化植物油或动物脂油例如聚乙二醇(PEG)、甲基羟丙基纤维素(MHPC)、聚乙烯醇(PVA)、氢化牛脂、氢化棕榈油、氢化棉籽油和/或氢化豆油；脂肪酸醇；单甘油酯和/或二甘油酯，例如甘油硬脂酸酯，其中硬脂酸酯是硬脂酸和棕榈酸的混合物；微晶蜡；石蜡；以及脂肪酸，如氢化的线性长链脂肪酸和其衍生物。优选的蜡是棕榈油或氢化棕榈油。

该颗粒可以包含核心(其包含本发明的蛋白酶)、一种或多种盐包衣和一种或多种蜡包衣。具有多种包衣的酶颗粒的实例示于WO 93/07263、WO 97/23606和WO 2016/149636中。

可以产生非粉尘颗粒，例如如美国专利号4,106,991和4,661,452中所披露，并且这些颗粒可以任选地通过本领域已知的方法来包衣。这些包衣材料可以是蜡状包衣材料和成膜包衣材料。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中所述醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适合用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。

该颗粒可以进一步包含一种或多种另外的酶。然后，每种酶将存在于更多颗粒中，确保酶的更均匀分布，并且还由于不同的粒度而减少不同酶的物理分离。用于产生多酶共颗粒的方法披露于ip.com公开内容IPCOM000200739D中。

通过使用共颗粒配制酶的另一个实例披露于WO 2013/188331中。

本发明还涉及根据EP 238,216中披露的方法制备的受保护的酶。

因此，在一个另外的方面，本发明提供了颗粒，其包含：

(a)包含根据本发明的蛋白酶的核心，和

(b)由包围该核心的一个或多个层组成的包衣。

在一个实施例中，该包衣包含如本文所述的盐包衣。在一个实施例中，该包衣包含如本文所述的蜡包衣。在一个实施例中，该包衣包含盐包衣，然后是本文所述的蜡包衣。

动物饲料

本发明还涉及包含一种或多种本发明蛋白酶的动物饲料。在一个实施例中，本发明涉及包含第一、二或三方面的动物饲料添加剂以及植物基材料的动物饲料。在一个实施例中，本发明涉及包含第四方面的颗粒和植物基材料的动物饲料。在一个实施例中，本发明涉及包含第五方面的液体配制品和植物基材料的动物饲料。

本发明进一步涉及丸粒化动物饲料。该丸粒化动物饲料可以通过将如以上段落中描述的动物饲料的造粒来制备。因此，在一个实施例中，本发明涉及包含第一、二或三方面的动物饲料添加剂以及植物基材料的丸粒化动物饲料。在一个实施例中，本发明涉及包含第四方面的颗粒和植物基材料的丸粒化动物饲料。在一个实施例中，本发明涉及包含第五方面的液体配制品和植物基材料的丸粒化动物饲料。

在一个实施例中，该植物基材料包含：豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，处于其加工形式(如大豆粉、油菜籽粕)或其任何组合。在一个优选的实施例中，该植物基材料是大豆粉。

动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白质含量。在WO 01/58275的表B的第2-3列中指出了家禽和猪的饮食的特点。鱼饮食可以如表B第4栏所示来表征。此外，此类鱼饮食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。

根据本发明的动物饲料组合物具有的粗蛋白含量为50-800g/kg，此外还包含至少一种本文所要求的蛋白酶。

此外或在(上述粗蛋白含量)的替代方案中，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。

在具体实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量落入WO 01/58275表B中的范围2、3、4或5(R.2-5)中的任何一个内。

粗蛋白以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)x 6.25。通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测定氮含量(A.O.A.C.,1984,Official Methods of Analysis[官方分析方法]第14版,Association of Official Analytical Chemists[官方分析化学家集],华盛顿特区)。

可代谢能量可根据如下进行计算：NRC出版物Nutrient requirements in swine[猪的营养需求],第九次再版1988,subcommittee on swine nutrition,committee onanimal nutrition,board of agriculture,national research council[美国国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会].美国国家科学院出版社[National AcademyPress],华盛顿特区,第2-6页；以及欧洲家禽饲养材料能量值表(European Table ofEnergy Values for Poultry Feed-stuffs),斯克得霍特家禽研究与推广中心[Spelderholt centre for poultry research and extension],7361DA贝克贝亨,荷兰,Grafisch bedrijf Ponsen&looijen公司，瓦赫宁恩(Wageningen)，ISBN 90-71463-12-5。

根据诸如Veevoedertabel 1997,gegevens over chemische samenstelling,verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen,Central Veevoederbureau,Runderweg 6,8219pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7等饲料表计算在动物全饮食中的钙、有效磷和氨基酸的膳食含量。

在一个具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含如上定义的至少一种植物性蛋白质。

本发明的动物饲料组合物还可以含有动物蛋白，例如肉和骨粉、羽毛粉和/或鱼粉，通常量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可以包含具有可溶物的干酒糟(DriedDistillers Grains with Solubles，DDGS)，通常量为0-30％。

在再进一步具体的实施例中，本发明的动物饲料组合物含有0-80％玉蜀黍；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％大豆粉；和/或0-25％鱼粉；和/或0-25％肉和骨粉；和/或0-20％乳清。

该动物饲料可以包含植物性蛋白质。在具体实施例中，这些植物性蛋白质的蛋白质含量是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(w/w)。植物性蛋白质可以衍生自植物性蛋白质源，例如豆类和谷类，例如得自蝶形花科(豆科)、十字花科、藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉饼、羽扇豆粉饼、油菜籽粉饼及其组合。

在实施例中，该植物性蛋白质源是来自豆科的一种或多种植物(例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆)的材料。在另一个实施例中，植物性蛋白质源是来自藜科的一种或多种植物，例如甜菜、糖甜菜、菠菜或奎奴亚藜的材料。植物性蛋白质源的其他实例是油菜和卷心菜。在另一个实施例中，大豆是优选的植物性蛋白质源。植物性蛋白质源的其他实例是谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻和高粱。

可以将动物饮食制成例如粉状饲料(非丸粒状)或丸粒化状饲料。通常，混合研磨的饲料并根据所讨论的种类的说明添加充足量的必需维生素和矿物质。作为固体或液体酶配制品添加酶。例如，对于粉状饲料，在成分混合步骤前或期间可以添加固体或液体酶配制品。对于丸粒化饲料，在饲料成分步骤前或期间还可添加该(固体或液体)蛋白酶/酶制剂。典型地，液体蛋白酶/酶制剂包含本发明的蛋白酶，任选地伴随着多元醇(例如甘油、乙二醇或丙二醇)，并且是在造粒步骤后添加，例如通过将该液体配制品喷涂至丸粒上。也可以将该酶掺入饲料添加剂或预混物中。

可替代地，可以通过冷冻液体酶溶液与膨胀剂(例如研磨的大豆粉)的混合物，并且然后冻干该混合物，来制备蛋白酶。

饮食中的最终酶浓度在0.01-200mg酶蛋白/kg饮食的范围内，优选在0.05-100mg/kg饮食之间，更优选0.1-50mg，甚至更优选0.2-20mg酶蛋白/kg动物饮食。

目前预期按一种或多种以下量(剂量范围)施用所述酶：0.01-200；0.05-100；0.1-50；0.2-20；0.1-1；0.2-2；0.5-5；或1-10；-所有这些范围都是以mg蛋白酶蛋白/kg饲料(ppm)。

为了确定每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数，从饲料组合物中纯化蛋白酶，并且使用相关试验(参见蛋白酶活性)确定经纯化的蛋白酶的比活性。使用相同试验测定该饲料组合物的蛋白酶活性，并且在这两次测定的基础上计算出以每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数计的剂量。

在一个具体实施例中，本发明的动物饲料添加剂意欲以0.01％至10.0％，更特别地0.05％至5.0％或0.2％至1.0％(％意指g添加剂/100g饲料)的水平包含(或规定为必须包含)在动物饮食或饲料中。具体地说，对预混物也是如此。

使用相同的原理测定饲料添加剂中的蛋白酶蛋白mg数。当然，如果可获得制备饲料添加剂或饲料所用蛋白酶的样品，可由该样品测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化蛋白酶)。

另外的酶

在另一个实施例中，本文描述的组合物任选地包含一种或多种酶。可以根据handbook Enzyme Nomenclature[酶命名手册](来自NC-IUBMB,1992)对酶进行分类，还参见因特网上的ENZYME网站：www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是相对于酶命名法的信息储库。它主要基于国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(IUB-MB)，学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，1992的推荐并且描述了所表征的酶的每种类型，为所述酶提供EC(酶委员会)编号(Bairoch.2000,The ENZYME database[酶数据库],Nucleic Acids Res.[核酸研究]28:304-305)。这种IUB-MB酶命名法是基于它们的底物特异性，有时基于它们的分子机制；这种分类不反映这些酶的结构特征。

Henrissat等人在“The carbohydrate-active enzymes database(CAZy)in 2013[2013年的碳水化合物活性酶数据库(CAZy)]”,Nucl.Acids Res.[核酸研究](2014年1月1日)42(D1):D490-D495中描述了某些糖苷水解酶(如内切葡聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、溶菌酶和半乳糖苷酶)的另一种分类；还参见www.cazy.org。

因此，本发明的组合物还可以包含至少一种选自下组的其他酶，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.23)、酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.72)、α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)、半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、β-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、溶菌酶(EC 3.2.1.17)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)(EC 3.2.1.25)、植酸酶(EC 3.1.3.8，EC 3.1.3.26，EC 3.1.3.72)、磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)、磷脂酶D(EC 3.1.4.4)、蛋白酶(EC 3.4)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、果胶酯酶(EC 3.1.1.11)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8，EC 3.2.1.136)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)或其任何组合。

在实施例中，本发明的组合物包含半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)和β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)。

在实施例中，本发明的组合物包含植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)。可商购的植酸酶的实例包括Bio-Feed^TM植酸酶(诺维信公司(Novozymes))、

P、

NP和

HiPhos(帝斯曼营养产品公司(DSM NutritionalProducts))、Natuphos^TM(巴斯夫公司(BASF))、Natuphos^TM E(巴斯夫公司)、

和

Blue(AB酶公司(AB Enzymes))、

(浩卫制药公司(Huvepharma))、

Phytase(Aveve Biochem公司)、

XP(范恩尼姆/杜邦公司(Verenium/DuPont))以及

PHY(杜邦公司(DuPont))。其他优选的植酸酶包括描述于例如WO 98/28408、WO 00/43503、和WO 03/066847中的那些。

在实施例中，本发明的组合物包含木聚糖酶(EC 3.2.1.8)。可商购的木聚糖酶的实例包括

WX(帝斯曼营养产品公司)、

XT和Barley(AB Vista公司)、

(范恩尼姆公司(Verenium))、

X(浩卫制药公司)、

XB(木聚糖酶/β-葡聚糖酶，杜邦公司)和

XAP(木聚糖酶/淀粉酶/蛋白酶，杜邦公司)、

XG 10(木聚糖酶/葡聚糖酶)和

02CS(木聚糖酶/葡聚糖酶/果胶酶，Aveve Biochem公司)以及Naturgrain(巴斯夫公司)。

在实施例中，本发明的组合物包含蛋白酶(EC 3.4)。可商购的蛋白酶的实例包括

ProAct(帝斯曼营养产品公司(DSM Nutritional Products))、Winzyme Pro

(圣泰国际有限公司(Suntaq International Limited))和

DP100(诺伟司国际公司(Novus International))。

在实施例中，本发明的组合物包含α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。可商购的α-淀粉酶的实例包括

A和

RumiStar^TM(帝斯曼营养产品公司)。

在一个实施例中，本发明的组合物包含多组分酶产品，例如

Octazyme(弗拉曼科公司)、

G2、

VP和

MultiGrain(帝斯曼营养产品公司)、

Excel或

Advance(安迪苏公司(Adisseo))、

DC(内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶和内切-1,4-β-木聚糖酶，安德烈斯皮特鲁巴公司(AndresPintaluba SA))或

(内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶和内切-1,4-β-木聚糖酶和α-淀粉酶，安德烈斯皮特鲁巴公司)。

摄生品

摄生品(eubiotic)是意欲在胃肠道中提供微生物菌群的健康平衡的化合物。摄生品包括许多不同的饲料添加剂，例如益生菌、益生元、植生素(精油)和有机酸，其在下面更详细地描述。

益生菌

在一个实施例中，该动物饲料组合物进一步包含一种或多种另外的益生菌。在实施例中，该动物饲料组合物进一步包含来自以下一个或多个属的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉食杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属和巨型球菌或其任何组合。

在实施例中，该动物饲料组合物进一步包含来自以下一个或多个菌株的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、屎肠球菌、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特氏丙酸杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis ssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius ssp.salivarius)、埃氏巨型球菌、丙酸杆菌属物种。

在实施例中，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料进一步包含来自以下一种或多种枯草芽孢杆菌菌株的细菌：3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)、22C-P1(PTA-6508)、2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-50105)、BS 18(NRRL B-50633)、BS 278(NRRL B-50634)、DSM 29870、DSM 29871、DSM 32315、NRRL B-50136、NRRLB-50605、NRRL B-50606、NRRL B-50622以及PTA-7547。

在实施例中，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料进一步包含来自以下一种或多种短小芽孢杆菌菌株的细菌：NRRL B-50016、ATCC 700385、NRRL B-50885或NRRL B-50886。

在实施例中，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料进一步包含来自以下一种或多种地衣芽孢杆菌菌株的细菌：NRRL B-50015、NRRL B-50621或NRRL B-50623。

在实施例中，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料进一步包含来自以下一种或多种解淀粉芽孢杆菌菌株的细菌：DSM 29869、DSM 29869、NRRL B 50607、PTA-7543、PTA-7549、NRRL B-50349、NRRL B-50606、NRRL B-50013、NRRL B-50151、NRRL B-50141、NRRL B-50147或NRRL B-50888。

该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数在1x 10⁴和1x 10¹⁴CFU/kg的干物质之间，优选在1x 10⁶和1x 10¹²CFU/kg的干物质之间，并且更优选在1x 10⁷至1x10¹¹CFU/kg的干物质之间。在实施例中，该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数在1x 10⁸和1x 10¹⁰CFU/kg的干物质之间。

该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数在1x 10⁵和1x 10¹⁵CFU/动物/天之间，优选在1x 10⁷和1x 10¹³CFU/动物/天之间，并且更优选在1x 10⁸和1x 10¹²CFU/动物/天之间。在实施例中，该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数在1x 10⁹和1x10¹¹CFU/动物/天之间。在一个实施例中，益生菌的量按重量计为组合物的0.001％至10％。

在另一个实施例中，该一种或多种细菌菌株以稳定的孢子形式存在。

商业产品的实例是

(帝斯曼营养产品公司)、Alterion(安迪苏公司)、Enviva PRO(杜邦动物营养公司(DuPont Animal Nutrition))、

(混合酶+益生菌，杜邦动物营养公司)、

和

(Norel/Evonik)以及

PY1(赢创公司(Evonik))。

益生元

益生元是诱导微生物(例如，细菌和真菌)生长或活动的物质，其有助于宿主的健康。益生元通常是不可消化的纤维化合物，其未消化地通过胃肠道的上部并刺激通过充当它们的底物而定殖大肠的有利细菌的生长或活动。通常，益生元增加胃肠(GI)道中双歧杆菌和乳酸菌的数量或活动。

酵母衍生物(灭活的整个酵母或酵母细胞壁)也可以被认为是益生元。它们通常包含甘露寡糖、酵母β-葡聚糖或蛋白质内容物，并且通常衍生自酵母(酿酒酵母)的细胞壁。

在一个实施例中，益生元的量按重量计为组合物的0.001％至10％。酵母产品的实例是

和Agrimos(拉曼动物营养公司(Lallemand Animal Nutrition))。

植生素

植生素是一组来自草药、香料或其他植物的用作饲料添加剂的天然生长促进剂或非抗生素生长促进剂。植生素可以是由精油/提取物、精油/提取物、单一植物和植物混合物(草药产品)或精油/提取物/植物的混合物(专门产品)制备的单一物质。

植生素的实例是迷迭香、鼠尾草、牛至、百里香、丁香和柠檬草。精油的实例是百里酚、丁香酚、间甲酚、香草醛、水杨酸酯、间苯二酚、邻甲氧基苯酚(guajacol)、姜酚、薰衣草油、紫罗酮、鸢尾酮、桉叶油素、薄荷醇、薄荷油、α-蒎烯、柠檬烯、茴香脑、芳樟醇、二氢茉莉酸甲酯、香芹酚、丙酸/丙酸酯、乙酸/乙酸酯、丁酸/丁酸酯、迷迭香油、丁香油、香叶醇、萜品醇、香茅醇、水杨酸戊酯和/或水杨酸苄酯、肉桂醛、植物多酚(单宁)、姜黄和姜黄提取物。

在一个实施例中，植生素的量按重量计为组合物的0.001％至10％。商业产品的实例是

(帝斯曼营养产品公司)、Cinergy^TM、Biacid^TM、ProHacidTM Classic和ProHacidTM Advance^TM(all Promivi公司/嘉吉公司(Cargill))以及Envivo EO(杜邦动物营养公司(DuPont Animal Nutrition))。

有机酸

有机酸(C1-C7)在自然界中作为植物或动物组织的正常成分广泛分布。它们也通过主要在大肠中的碳水化合物的微生物发酵形成。它们通常在猪和家禽生产中用作抗生素生长促进剂的替代品，因为它们对鸡的坏死性肠炎和仔猪的大肠杆菌感染等肠道问题具有预防作用。有机酸可以作为单组分或通常2或3种不同有机酸的混合物出售。有机酸的实例为短链脂肪酸(例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸)、中链脂肪酸(例如己酸、辛酸、癸酸、月桂酸)、二/三羧酸(例如反丁烯二酸)、羟基酸(例如乳酸)、芳香酸(例如苯甲酸)、柠檬酸、山梨酸、苹果酸、酒石酸或其盐(通常为钠或钾盐，如二甲酸钾或丁酸钠)。

在一个实施例中，有机酸的量按重量计为组合物的0.001％至10％。商业产品的实例是

(帝斯曼营养产品公司)、

(巴斯夫公司)、正丁酸AF(OXEA)以及Adimix Precision(Nutriad公司)。

预混物

将如上文示例的饲料添加剂的组合物掺入动物饲料(例如家禽饲料)中在实践中是使用浓缩剂或预混物进行的。预混物是指一种或多种微小成分与稀释剂和/或载体的优选均匀的混合物。预混物用于促进微小成分在较大混合物中均匀分散。根据本发明的预混物可以作为固体(例如作为水溶性粉末)或液体添加至饲料成分或饮用水中。

氨基酸

本发明的组合物可以进一步包含一种或多种氨基酸。用于动物饲料的氨基酸的实例是赖氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。在一个实施例中，氨基酸的量按重量计为组合物的0.001％至10％。

维生素和矿物质

在另一个实施例中，该动物饲料可以包含一种或多种维生素，如一种或多种脂溶性维生素和/或一种或多种水溶性维生素。在另一个实施例中，该动物饲料可以任选地包含一种或多种矿物质，如一种或多种痕量矿物质和/或一种或多种常量矿物质。

通常，脂溶性维生素和水溶性维生素、以及痕量矿物质形成了一种所谓的旨在添加至饲料中的预混物的部分，而常量矿物质通常被分开地添加至饲料中。

脂溶性维生素的非限制性实例包括维生素A、维生素D3、维生素E、以及维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的非限制性实例包括维生素C、维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如Ca-D-泛酸盐。

痕量矿物质的非限制性实例包括硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、、碘、硒和锌。

常量矿物质的非限制性实例包括钙、镁、磷、钾和钠。

在一个实施例中，维生素的量按重量计为组合物的0.001％至10％。在一个实施例中，矿物质的量按重量计为组合物的0.001％至10％。

这些组分的营养需求(以家禽和仔猪/猪为例)列于WO 01/58275的表A中。营养需求意指应在饮食中提供指定浓度的这些组分。

在替代方案中，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275的表A中指定的单独组分中的至少一种。至少一种意指一种或两种或三种或四种等直至所有十三种或直至所有十五种单独组分中的任一种、一种或多种。更具体地，此至少一种单独组分以提供在表A的第四栏或第五栏或第六栏说明的范围内的饲料中浓度(in-feed-concentration)的量包含在本发明的添加剂内。

在一个仍另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种以下维生素，优选以提供落入下表1中所限定的范围之内(分别针对仔猪饮食和肉鸡饮食)的饲料中浓度。

表1：典型维生素推荐

维生素	仔猪饮食	肉鸡饮食
			维生素A	10,000-15,000IU/kg饲料	8-12,500IU/kg饲料
维生素D3	1800-2000IU/kg饲料	3000-5000IU/kg饲料
			维生素E	60-100mg/kg饲料	150-240mg/kg饲料
维生素K3	2-4mg/kg饲料	2-4mg/kg饲料
			维生素B1	2-4mg/kg饲料	2-3mg/kg饲料
维生素B2	6-10mg/kg饲料	7-9mg/kg饲料
			维生素B6	4-8mg/kg饲料	3-6mg/kg饲料
维生素B12	0.03-0.05mg/kg饲料	0.015-0.04mg/kg饲料
			烟酸(维生素B3)	30-50mg/kg饲料	50-80mg/kg饲料
泛酸	20-40mg/kg饲料	10-18mg/kg饲料
			叶酸	1-2mg/kg饲料	1-2mg/kg饲料
生物素	0.15-0.4mg/kg饲料	0.15-0.3mg/kg饲料
			氯化胆碱	200-400mg/kg饲料	300-600mg/kg饲料

其他饲料成分

本发明的组合物可以进一步包含着色剂、稳定剂、生长改善添加剂和芳香化合物/调味品、多不饱和脂肪酸(PUFA)；活性氧产生物质、抗氧化剂、抗微生物肽、抗真菌多肽以及霉菌毒素控制化合物。

着色剂的实例是类胡萝卜素，例如β-胡萝卜素、虾青素和叶黄素。

香料化合物/调味品的实例是甲氧甲酚，茴香醚，十、十一和/或十二内酯、紫罗酮、鸢尾酮、姜辣素、哌啶、亚丙基苯酞(propylidene phatalide)、亚丁基苯酞(butylidenephatalide)、辣椒素和鞣质。

抗微生物肽(AMP)的实例是CAP18、林可霉素(Leucocin)A、三色肽(Tritrpticin)、Protegrin-1、死亡素(Thanatin)、防卫素、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽和奥维司匹林(Ovispirin)如诺维司匹林(Novispirin)(Robert Lehrer,2000)、菌丝霉素(Plectasin)和他汀(包括在WO 03/044049和WO 03/048148中披露的化合物和多肽)以及以上的保留抗微生物活性的变体或片段。

抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉和黑曲霉的肽连同其保留抗真菌活性的变体和片段，如在WO 94/01459和WO 02/90384中披露的。

多不饱和脂肪酸的实例为C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚油酸。

活性氧产生物质的实例为例如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐等化学品；以及例如氧化酶、氧合酶或合成酶等酶。

抗氧化剂可以用于限制可产生的活性氧物质的数量，使得活性氧物质的水平与抗氧化剂平衡。

霉菌毒素(例如脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏马菌素)可以在动物饲料中发现，并且可以导致消极的动物性能或疾病。可以将能够例如通过霉菌毒素的失活或通过霉菌毒素的结合控制霉菌毒素水平的化合物添加至饲料中以改善这些负面影响。霉菌毒素控制化合物的实例是

Vitafix Ultra(核科学公司(Nuscience))、

Secure、

BBSH、

MTV(百奥明公司(Biomin))、

以及

Plus(Nutriad公司)。

制备动物饲料的方法

本发明进一步涉及制备动物饲料的方法，该方法包括将第一、二或三方面的动物饲料添加剂与至少一种蛋白质或蛋白质源进行混合。本发明进一步涉及制备动物饲料的方法，该方法包括将第四方面的颗粒与至少一种蛋白质或蛋白质源进行混合。本发明进一步涉及制备动物饲料的方法，该方法包括将第五方面的液体配制品与至少一种蛋白质或蛋白质源进行混合。

在一个实施例中，该蛋白质或蛋白质源包含：豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，处于其加工形式(如大豆粉、油菜籽粕)或其任何组合。在一个优选的实施例中，该蛋白质或蛋白质源是大豆粉。

本发明进一步涉及制备动物饲料的方法，该方法包括将第五方面的液体配制品施加到植物基材料上。在一个实施例中，该液体配制品通过喷雾施加。在另外的实施例中，该植物基材料包含：豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，处于其加工形式(如大豆粉、油菜籽粕)或其任何组合。在一个优选的实施例中，该植物基材料是大豆粉。

改善动物性能的方法

本发明进一步涉及改善动物的一个或多个性能参数的方法，该方法包括向一种或多种动物施用第一、二或三方面的动物饲料添加剂。本发明进一步涉及改善动物的一个或多个性能参数的方法，该方法包括向一种或多种动物施用第四方面的颗粒。本发明进一步涉及改善动物的一个或多个性能参数的方法，该方法包括向一种或多种动物施用第五方面的液体配制品。

在一个实施例中，如本文所述的从动物饲料添加剂、颗粒或液体配制品中制备动物饲料并向动物施用。本发明进一步涉及改善动物的一个或多个性能参数的方法，该方法包括向一种或多种动物施用动物饲料或包含本发明S8蛋白酶的丸粒化动物饲料。

在一个实施例中，“改善动物的性能”意指存在体增重的增加。在另一个实施例中，“改善动物的性能”意指存在改善的饲料转化率。在另外的实施例中，“改善动物的性能”意指存在增加的饲料效率。在另外的实施例中，“改善动物的性能”意指存在体增重的增加和/或改善的饲料转化率和/或增加的饲料效率。

用于改善动物饲料的营养价值的方法

术语改善动物饲料的营养价值意指提高饲料中营养素的可利用性。在本发明中，改善营养价值具体指的是改善饲料的蛋白质部分的可利用性，从而导致蛋白质提取的增加，较高的蛋白质产量，和/或蛋白质利用的改善。当饲料的营养价值增加时，蛋白质和/或氨基酸消化率增加，并且该动物的生长速率和/或体重增加量和/或饲料转化(即相对于体重增加的饲料摄取量)可被改善。

因此，本发明进一步涉及改善动物饲料营养价值的方法，该方法包括将第一、二或三方面的动物饲料添加剂添加至饲料。因此，本发明进一步涉及改善动物饲料营养价值的方法，该方法包括将第四方面的颗粒添加至饲料。因此，本发明进一步涉及改善动物饲料营养价值的方法，该方法包括将第五方面的液体配制品添加至饲料。

在实施例中，该饲料包含：豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，处于其加工形式(如大豆粉、油菜籽粕)或其任何组合。在一个优选的实施例中，饲料包含大豆粉。

用途

本发明还针对用于使用具有蛋白酶活性的多肽或其组合物(用于例如动物饲料)的方法。

在动物饲料中的用途

本发明的蛋白酶还可以在动物饲料中使用。在一个实施例中，本发明提供了一种用于制备动物饲料组合物的方法，该方法包括将本发明的一种或多种蛋白酶添加至一种或多种动物饲料成分中。

根据WO 00/21381和WO 2004/026334，还可以将本发明的一种或多种蛋白酶在动物饲料中用作改善饲料可消化性以增加其利用效率的饲料增强酶。

在另外的实施例中，可以将本发明的蛋白酶用于动物饲料中或用作饲料添加剂，其中它对动物消化道可以提供积极作用并且以此方式根据体重增加、饲料转化率(FCR)、欧洲生产效率因子(EPEF)、欧洲生产效能因子(EFF)改善动物生产性能，或改善动物健康，例如降低的死亡率。将FCR计算为相对于以g/动物计的体重增加的以g/动物计的饲料摄入。

在根据本发明的用途中，可在饮食之前、之后或同时给动物饲喂蛋白酶。优选后者。

在实施例中，明确限定了将蛋白酶添加至饲料中时或将其包括在饲料添加剂中时蛋白酶的形式。明确限定指的是如经大小排阻色谱法(参见WO 01/58275的实例12)测定的，蛋白酶制剂至少为50％纯。在其他实施例中，如经此方法测定的，蛋白酶制剂至少为60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％、或至少为95％纯。

明确限定的蛋白酶制剂是有利的。例如，对于实质上不受其他蛋白酶干扰或污染的蛋白酶而言，更容易确定它在饲料中的正确剂量。术语正确地给料(dose correctly)具体是指得到一致且恒定的结果的目标，和基于所希望的效果优化剂量的能力。

然而，为了在动物饲料中使用，蛋白酶不必是纯的；可以例如包括其他酶，此时可将其称为蛋白酶制剂。

该蛋白酶制剂可以(a)直接添加至饲料，或者(b)它可以用于随后添加至饲料(或者用于处理过程中)的一种或多种中间组合物，如饲料添加剂或者预混物的生产。不论是否根据上述(a)或(b)来使用，上文所述的纯度指的都是原始蛋白酶制剂的纯度。

具体地说，使用重组生产方法即可获得纯度为上述数量级的蛋白酶制剂，然而，当通过传统的发酵方法生产蛋白酶时，要想获得这些蛋白酶制剂却并非易事，而且，批次与批次之间会有较高的差异。

这类蛋白酶制剂当然可以与其他酶混合。

该蛋白质可以是动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉；或者它可为植物性蛋白质。

如本文所使用的术语植物性蛋白质指包括至少一种得自或来源自植物的蛋白质的任何化合物、组合物、制剂或混合物，其中所述蛋白质包括经修饰蛋白或蛋白衍生物。在实施例中，这些植物性蛋白质的蛋白质含量至少为10、20、30、40、50或60％(w/w)。

植物性蛋白质可以衍生自植物性蛋白质源，如豆类和谷类，例如得自蝶形花科(豆科)、十字花科、藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。

在实施例中，该植物性蛋白质源是来自豆科的一种或多种植物(例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆)的材料。

在另一个实施例中，植物性蛋白质源是来自藜科的一种或多种植物，例如甜菜、糖甜菜、菠菜或奎奴亚藜的材料。

植物性蛋白质源的其他实例为油菜籽、向日蔡籽、棉籽和卷心菜。

大豆为优选的植物性蛋白质源。

植物性蛋白质源的其他实例为谷类，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麦和高粱。

在处理过程的实施例中，所讨论的这种或这些种蛋白酶影响这些蛋白质如植物性蛋白质或蛋白质源(或对其发挥作用或施加水解或降解影响)。为了达到此目的，一般将蛋白质或蛋白质源悬浮于溶剂，例如含水溶剂，如水中，并适当关注所讨论的酶的特征，以调节pH和温度值。例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的pH值下进行处理。类似地，例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的温度下进行处理。上述活性百分比指示是相对于最大活性而言的。持续进行酶解反应直至获得所需结果，然后可以通过例如热-处理步骤灭活酶来终止反应，或者也可以不终止反应。

在本发明处理过程的另一个实施例中，蛋白酶作用被维持，这意味着例如将蛋白酶加入这些蛋白质，但其水解影响可以说尚未开启，直到后来当有此需求时，一旦建立了适当的水解条件，或一旦灭活了任何酶抑制剂，或不论使用何种其他方式延迟了酶的作用，才会开启其水解影响。

在一个实施例中，处理是预-处理动物饲料或用于动物饲料的蛋白质，即这些蛋白质是在摄入之前被水解的。

能以任何形式将蛋白酶添加至饲料中，如它是相对纯的蛋白酶，或与欲添加至动物饲料的其他组分的混合物，即以动物饲料添加剂的形式，例如所谓的动物饲料预混物。

本发明的适合的实施例

在下面的一组项目中描述了本发明的优选实施例。

1.一种动物饲料添加剂，其包含一种或多种维生素和一种或多种具有蛋白酶活性的多肽，其中该多肽是选自下组的S8蛋白酶，该组由以下组成：(a)多肽，该多肽与SEQ IDNO:1具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

(s)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、或(i)的多肽以及多至10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的N-末端和/或C-末端延伸；和

2.如项目1所述的动物饲料添加剂，其中该S8蛋白酶获得自或可获得自分类目芽孢杆菌目(Bacillales)，优选分类科芽孢杆菌科(Bacillaceae)，更优选分类属芽孢杆菌属(Bacillus)。

3.如项目1至2中任一项所述的动物饲料添加剂，其中该S8蛋白酶包含基序TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG(SEQ ID NO:4)。

4.如项目1至3中任一项所述的动物饲料添加剂，其中该动物饲料添加剂不包含表面活性剂。

5.如项目1至4中任一项所述的动物饲料添加剂，其中该S8蛋白酶具有SEQ ID NO:1多肽蛋白酶活性的至少40％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。

6.如项目1至4中任一项所述的动物饲料添加剂，其中与阴性对照相比，该S8蛋白酶将回肠氮消化率提高了至少1％，例如至少1.5％、至少2.0％、至少2.5％、至少3.0％、至少3.5％、或至少4.0％。

7.如项目1至6中任一项所述的动物饲料添加剂，其中该多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1至314、SEQ ID NO:2的氨基酸1至311或SEQ ID NO:3的氨基酸1至311，或者由其组成。

8.如项目1至7中任一项所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂进一步包含选自如下列表的一种或多种组分，该列表由以下组成：

一种或多种维生素；

一种或多种矿物质；

一种或多种氨基酸；

一种或多种益生元；

一种或多种植生素；

一种或多种有机酸；和

一种或多种其他饲料成分。

9.如项目1至8中任一项所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂进一步包含一种或多种配制剂。

10.如项目9所述的动物饲料添加剂，其中该一种或多种配制剂选自下组，该组由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素或其任何组合。

11.如项目1至10中任一项所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂进一步包含一种或多种另外的酶。

12.如项目11所述的动物饲料添加剂，其中该一种或多种另外的酶选自下组，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。

13如项目1至12中任一项所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂进一步包含一种或多种微生物。

14.如项目13所述的动物饲料添加剂，其中该一种或多种微生物选自下组，该组由以下组成：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、双歧杆菌属物种、肉食杆菌属物种、丁酸梭菌、梭菌属物种、屎肠球菌、肠球菌属物种、乳杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属物种、明串珠菌属物种、埃氏巨型球菌、巨型球菌属物种、乳酸片球菌、片球菌属物种、特氏丙酸杆菌、丙酸杆菌属物种和链球菌属物种或其任何组合。

15.如项目1至14所述中任一项所述的动物饲料添加剂，其中该S8蛋白酶被配制为颗粒。

16.如项目15所述的动物饲料添加剂，其中该颗粒包含核心粒子和一种或多种包衣。

17.如项目16所述的动物饲料添加剂，其中该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。

18.如项目1至14任一项所述的动物饲料添加剂，其中该添加剂处于液体配制品的形式。

19.如项目18所述的动物饲料添加剂，其中将该S8蛋白酶在0.001％至25％w/w的液体配制品，优选0.01％至25％w/w，更优选0.05％至20％w/w，更优选0.2％至15％w/w，甚至更优选0.5％至15％w/w或最优选1.0％至10％w/w多肽给药。

20.如项目18或19中所述的动物饲料添加剂，其中该配制品进一步包含20％至80％w/w的多元醇。

21.如项目20所述的动物饲料添加剂，其中该多元醇选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)或其任何组合。

22.如项目18至21中任一项所述的动物饲料添加剂，其中该配制品进一步包含0.01％至2.0％w/w的防腐剂。

23.如项目22所述的动物饲料添加剂，其中该防腐剂选自下组，该组由以下组成：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。

24.包含如项目1至14任一项所述的动物饲料添加剂的颗粒。

25.如项目24所述的颗粒，其中该颗粒包含核心粒子和一种或多种包衣。

26.如项目25所述的颗粒，其中该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。

27.包含如项目1至14任一项所述的动物饲料添加剂的液体配制品。

28.如项目27所述的液体配制品，其中将该S8蛋白酶在0.001％至25％w/w的液体配制品，优选0.01％至25％w/w，更优选0.05％至20％w/w，更优选0.2％至15％w/w，甚至更优选0.5％至15％w/w或最优选1.0％至10％w/w多肽给药。

29.如项目27或28所述的液体配制品，其中该配制品进一步包含20％至80％w/w的多元醇。

30.如项目29所述的液体配制品，其中该多元醇选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)或其任何组合。

31.如项目27至30中任一项所述的液体配制品，其中该配制品进一步包含0.01％至2.0％w/w的防腐剂。

32.如项目31所述的液体配制品，其中该防腐剂选自下组，该组由以下组成：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。

33.一种制备动物饲料的方法，该方法包括将如项目27至32中任一项所述的液体配制品施加到植物基材料上。

34.如项目33所述的方法，其中该液体配制品通过喷雾施加。

35.如项目33或34中所述的方法，其中该植物基材料包含处于其加工形式的(如大豆粉、油菜籽粕)豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，或者其任何组合。

36.如项目33至35中任一项所述的方法，其中该植物基材料处于丸粒化形式。

37.一种动物饲料，该动物饲料包含如项目1至23中任一项所述的动物饲料添加剂、如项目24至26中任一项所述的颗粒或如项目27至32中任一项所述的液体配制品和植物基材料。

38.如项目37中所述的动物饲料，其中该植物基材料包含处于其加工形式的(如大豆粉、油菜籽粕)豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，或者其任何组合。

39.使用如项目33至36中任一项所述的方法，或通过将如项目37或38所述的动物饲料造粒，制备丸粒化动物饲料。

40.一种改善动物的一个或多个性能参数的方法，该方法包括向一种或多种动物施用如项目1至23中任一项所述的动物饲料添加剂、如项目24至26中任一项所述的颗粒、如项目27至32中任一项所述的液体配制品、如项目37或38中所述的动物饲料或如项目39所述的丸粒化动物饲料。

41.如项目40所述的方法，其中改善动物的性能意指改善的体增重、改善的欧洲生产效率因子(EPEF)和/或改善的FCR。

42.一种制备动物饲料的方法，该方法包括将如项目1至23中任一项所述的动物饲料添加剂、如项目24至26中任一项所述的颗粒或如项目27至32中任一项所述的液体配制品与至少一种蛋白质或蛋白质源进行混合。

43.一种用于蛋白质的处理方法，该方法包括将如项目1至23中任一项所述的动物饲料添加剂、如项目24至26中任一项所述的颗粒或如项目27至32中任一项所述的液体配制品添加至至少一种蛋白质或蛋白质源中的步骤。

44.一种用于增加蛋白质的消化率和/或溶解度的方法，该方法包括将如项目1至23中任一项所述的动物饲料添加剂、如项目24至26中任一项所述的颗粒或如项目27至32中任一项所述的液体配制品与至少一种蛋白质或蛋白质源进行混合。

45.如项目40至44中任一项所述的方法，其中该蛋白质或蛋白质源包含处于其加工形式的(如大豆粉、油菜籽粕)豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，或者其任何组合。

46.一种用于改善动物饲料营养价值的方法，该方法包括将如项目1至23中任一项所述的动物饲料添加剂、如项目24至26中任一项所述的颗粒或如项目27至32中任一项所述的液体配制品添加至饲料。

47.如项目46所述的方法，其中该动物饲料包含处于其加工形式的(如大豆粉、油菜籽粕)豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，或者其任何组合。

48.如项目1至23中任一项所述的动物饲料添加剂的用途、如项目24至26中任一项所述的颗粒或如项目27至32中任一项所述的液体配制品：

在用于在动物饲料中使用的组合物的制备中；

用于改善动物饲料的营养价值；

用于增加动物饲料中的可消化和/或可溶性蛋白质；

用于增加动物饮食中的蛋白质的水解程度；

用于改善动物中的一个或多个性能参数；和/或

用于处理蛋白质。

49.一种生产多肽的方法，该方法包括以下步骤：

(a)培养重组芽孢杆菌属宿主细胞，该重组芽孢杆菌属宿主细胞包含编码如项目1所定义的多肽的外源多核苷酸，其中表达该多核苷酸并产生该多肽；和，任选地

(b)回收该多肽。

50.如项目49所述的方法，其中外源多核苷酸整合入宿主细胞的染色体中并与启动子可操作地连接。

实例

菌株

如WO 2015/091990中披露的，在1995年或之前从土耳其的环境样品中分离到霍耐克芽孢杆菌。

如WO 92/17577中披露的，从约1989年的南极土壤样品中分离到芽孢杆菌属物种TY145。

蛋白酶测定

1)动力学Suc-AAPF-pNA测定：

pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨公司(Bachem)L-1400)。

温度：室温(25℃)

测定缓冲液：100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl₂、150mM KCl、0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。

将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。测定起始于添加100μl pNA底物(50mg溶解于1.0ml DMSO并且用0.01％Triton X-100进一步稀释45x)。监测OD₄₀₅的增加作为蛋白酶活性的量度。

2)端点Suc-AAPF-pNA测定：

pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨公司(Bachem)L-1400)。

温度：受控的(测定温度)。

测定缓冲液：100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl₂、150mM KCl、0.01％Triton X-100，pH 7.0。

将200μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用测定缓冲液稀释50x)用移液管移至艾本德管(Eppendorf tube)中并置于冰上。添加20μl肽酶样品(稀释在0.01％Triton X-100中)。通过将艾本德管转移至设置为测定温度的艾本德恒温混匀仪(Eppendorf thermomixer)中来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm)下孵育15分钟。通过将管转移到冰浴并添加600μl 500mM琥珀酸(pH3.5)来停止孵育。将200μl上清液转移至微量滴定板中。读取OD₄₀₅作为肽酶活性的量度。在测定中包括空白缓冲液(buffer blind)(代替酶)。

2)普罗塔酶AK测定：

底物：普罗塔酶AK片(交联和染色的酪蛋白；来自麦格酶公司(Megazyme))

温度：受控的(测定温度)。

测定缓冲液：100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl₂、150mM KCl、0.01％Triton X-100，pH 9.0。

通过温和搅拌，将普罗塔酶AK片剂悬浮于2.0ml 0.01％Triton X-100中。将500μl的这种悬浮液和500μl的测定缓冲液分散在艾本德管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％Triton X-100中)。通过将艾本德管转移至设置为测定温度的艾本德恒温混匀仪(Eppendorf thermomixer)中来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm)下孵育15分钟。通过将该管转移返回至冰浴停止孵育。然后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μl上清液转移至微量滴定板。读取OD₆₅₀作为蛋白酶活性的量度。在测定中包括空白缓冲液(buffer blind)(代替酶)。

3)邻苯二甲醛(OPA)测定：

这一测定检测伯胺并且因此可以将肽键由一种蛋白酶的切割测量为蛋白酶处理的样品与对照样品之间的吸光度的差异。基本上根据Nielsen等人(Nielsen等人,2001,(Improved method for determining food protein degree of hydrolysis[用于确定食物蛋白水解程度的改进方法]),(J Food Sci[食品科学杂志]),66:642-646)进行该测定。

将0.5ml样品通过PALL 96孔滤板PN8175(10min，2700rpm，5℃)过滤。将这些样品在去离子水中稀释大约(例如10倍、50倍或100倍)，并将25μl的每份样品装载到96孔微量滴定板中(5个重复)。将200μl OPA试剂(100mM四硼酸二钠十水合物、3.5mM十二烷基硫酸钠(SDS)、5.7mM二硫苏糖醇(DDT)、6mM邻苯二甲醛)分配在所有孔中，振荡该板(60sec，650rpm)并且在340nm下测量吸光度。

实例1：从霍耐克芽孢杆菌中表达和纯化S8蛋白酶

如WO 2015/091990的实例1所述的表达和纯化来自霍耐克芽孢杆菌的S8蛋白酶(SEQ ID NO:1)。使用动力学Suc-AAPF-pNA测定来获得pH-活性曲线和pH-稳定性曲线。使用端点Suc-AAPF-pNA测定以获得在pH 7下的温度-活性曲线。

来自霍耐克芽孢杆菌的S8蛋白酶(SEQ ID NO:1)的特征

通过SDS-PAGE确定的相对分子量是大约Mr＝35kDa。

通过埃德曼降解确定的N-末端序列是：EVTATPS。

通过完整分子量分析确定的主峰(约50％)的分子量是32132.0Da。

主峰的成熟序列(来自埃德曼N-末端测序数据和完整MS数据)：

EVTATPSTQTPWGIKSIYNDQSITKTTGGSGIKVAVLDTGVHTGHIDLAGSSEQCKDFTQSNPLVNGSCTDRQGHGTHVAGTVLAHGGSDGQGVYGVAPQAKLWAYKVLGDNGSGYSDDIAAAIRHVADEASRTGSKVVINMSLGSSGKDSLIASAVDYAYGKGVLIVAAAGNSGSGSNTIGYPAALVNAVAVAALENVQQNGTYRVANFSSRGNPATAGDFRIQERDVEVSAPGASVESTWYNGGYNTISGTSMATPHVAGLAAKIWSSNSSLSHSQLRTELQNRAKVYDIKGGIGAGTGDDYASGFGYPRVK(SEQ ID NO:1)

来自这一成熟序列的计算的分子量是32132.0Da。

完整分子量分析表明，产物的约10％为氨基酸2-314并且产物的约40％为氨基酸4-314。

实例2.1：从芽孢杆菌属物种TY145中表达和纯化S8蛋白酶

如WO 92/17577实例1所述的表达和纯化来自芽孢杆菌属物种TY145的S8蛋白酶(SEQ ID NO:2)。使用动力学Suc-AAPF-pNA测定来获得pH-活性曲线和pH-稳定性曲线。使用普罗塔酶AK测定以获得在pH 9下的温度-活性曲线。

来自芽孢杆菌属物种TY145的S8蛋白酶(SEQ ID NO:2)的特征

通过SDS-PAGE确定的相对分子量是大约Mr＝34kDa。

通过埃德曼降解确定的N-末端序列是：AVPSTQT。

通过完整分子量分析确定的分子量是31784Da。

成熟序列(来自埃德曼N-末端测序数据和完整MS数据)：

AVPSTQTPWGIKSIYNDQSITKTTGGSGIKVAVLDTGVYTSHLDLAGSAEQCKDFTQSNPLVDGSCTDRQGHGTHVAGTVLAHGGSNGQGVYGVAPQAKLWAYKVLGDNGSGYSDDIAAAIRHVADEASRTGSKVVINMSLGSSAKDSLIASAVDYAYGKGVLIVAAAGNSGSGSNTIGFPGGLVNAVAVAALENVQQNGTYRVADFSSRGNPATAGDYIIQERDIEVSAPGASVESTWYTGGYNTISGTSMATPHVAGLAAKIWSANTSLSHSQLRTELQNRAKVYDIKGGIGAGTGDDYASGFGYPRVK(SEQ ID NO:2)

来自这一成熟序列的计算的分子量是31783.7Da。

完整的分子量分析也表明产物的约10％在N-末端包含额外的EVT。

实例2.2来自芽孢杆菌属的五种S8蛋白酶(SEQ ID NO:1的同源物)的表达实例

在枯草芽孢杆菌中表达了五种另外的S8蛋白酶。SEQ ID NO:5的表达：在WO2017064253-A1中描述了来自芽孢杆菌属物种-13380(芽孢杆菌属物种-1，GENESEQP:BDV61032)的S8蛋白酶1。SEQ ID NO:6的表达，该S8蛋白酶来自病研所芽孢杆菌(GENESEQP:BCB40142)。SEQ ID NO:7的表达：该S8蛋白酶2来自芽孢杆菌属物种-13380(芽孢杆菌属物种-1，GENESEQP:BCB40140)；SEQ ID NO:8的表达，在专利WO 2015091989-A1中描述了来自芽孢杆菌属物种-62451(芽孢杆菌属物种-2，GENESEQP:BCB40144)的S8蛋白酶。

按以下方式进行来自海泥芽孢杆菌的S8蛋白酶(SEQ ID NO:9)的表达。编码海泥芽孢杆菌的S8蛋白酶(SEQ ID NO:10)基因通过整合DNA技术(Interleuvenlaan 12A，B-3001鲁汶，比利时)经密码子优化并合成。将该基因表达为一种分泌酶，其中用克劳氏芽孢杆菌分泌信号(具有以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA)代替该基因的天然分泌信号。将该构建体制备为线性整合构建体，其中该合成基因通过在两个枯草芽孢杆菌同源染色体区域之间连同一个强启动子与氯霉素抗性标记进行PCR融合。通过SOE PCR进行融合(Horton,R.M.,Hunt,H.D.,Ho,S.N.,Pullen,J.K.和Pease,L.R.(1989)Engineeringhybrid genes without the use of restriction enzymes,gene splicing by overlapextension Gene[不使用限制酶，通过重叠延伸的基因剪接工程化杂种基因]77:61-68)。SOE PCR方法也描述于专利申请WO 2003095658中。在两种构建体中，该基因三联启动子系统(如WO 99/43835中所述)的控制下表达，该启动子系统由包括稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)启动子和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。将线性PCR构建体转化到枯草芽孢杆菌中。在每ml补充有6μg氯霉素的LB板上选择转化体。将重组枯草芽孢杆菌克隆在液体培养基中进行生长。该重组酶在经自然细胞裂解的上清液中积累。采集含有酶的上清液并如实例1中所描述的将该酶进行纯化。

实例3：S8蛋白酶变体(SEQ ID NO:3)的构建、表达和纯化

如WO 2016/097354的实例1所述构建、表达和纯化TY145蛋白酶的变体(SEQ IDNO:3)。使用动力学Suc-AAPF-pNA测定来获得pH-活性曲线和pH-稳定性曲线。使用普罗塔酶AK测定以获得在pH 9下的温度-活性曲线。

S8蛋白酶变体(SEQ ID NO:3)的特征

通过SDS-PAGE确定的相对分子量是大约Mr＝37kDa。

通过埃德曼降解确定的N-末端序列是：AVPSTQT。

通过完整分子量分析确定的分子量是32089.1Da。

成熟序列(来自埃德曼N-末端测序数据和完整MS数据)：

AVPSTQTPWGIKSIYNDQSITKTTGGKGIKVAVLDTGVYTSHLDLAGSAEQCKDFTQSNPLVDGSCTDRQGHGTHVAGTVLAHGGSNGQGVYGVAPQAKLWAYKVLGDKGEGYSDDIAAAIRHVADEASRTGSKVVINMSLGSSAKDSLIASAVDYAYGKGVLIVAAAGNEGPKPNTIGYPAGFVNAVAVAALENVQEKGTYRVADFSSRGNPATAGDYIIQERDIEVSAPGASVESTWYTGGYNTISGTSMATPHVAGLAAKIWSANTSLSHSQLRTELQNRAKVYDIKGGIGAGPGDDYASGFGYPRVK(SEQ ID NO:3)

来自这一成熟序列的计算的分子量是32089.3Da

完整的分子量分析也表明产物的约10％在N-末端包含额外的EVT或VT。

实例4：SBM-玉蜀黍浆液的pH曲线

根据以下方法确定本发明的S8蛋白酶对大豆-玉米粉浆液的pH活性曲线。

底物：SBM-玉蜀黍(30:70)

温度：40℃

测定缓冲液：100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS缓冲液、12.5mMCaCl₂、150mM KCl、0.01％Triton X-100，用NaOH或HCl调节至所希望的pH(3、4、5、6、7)

向2g SBM-玉蜀黍(30:70)底物中添加20ml用NaOH或HCl调节至所希望的pH的测定缓冲液。将浆液搅拌5min，并将浆液的2ml部分转移到板混匀器上24孔板的每个孔中，伴随组合的加热和磁力混合。将这些样品在40℃下预孵育30min。将该蛋白酶稀释至在100mM乙酸钠缓冲液(9.565g/L NaOAc，1.75g/L乙酸，5mM CaCl₂，0.01％BSA，0.01％吐温20，pH6.0)中的100ul，以达到200mg EP/kg底物的终浓度，并添加至孔中。在40℃磁力搅拌下3小时后，将该板离心(10min，4000rpm，0℃)，并使用OPA(邻苯二甲醛)测定分析上清液。该蛋白酶的活性是游离α-氨基末端的量，通过在340nm处的吸光度减去空白(样品在没有酶时运行)确定，且在下表4中给出。

表4：不同蛋白酶对玉蜀黍-SBM的pH-活性

实例5：热稳定性

将蛋白酶的蛋白质样品的等分部分脱盐或使用预装PD-10柱改变缓冲液为20mM乙酸钠，pH 4.0或在4℃下以2-3小时步骤针对2x 500ml 20mM乙酸钠，pH 4.0进行透析，随后是一个过夜步骤。将该样品进行0.45μm过滤并用缓冲液稀释至大约2A280单位。在差示扫描量热法(DSC)中使用该透析缓冲液作为参照。使用真空吸引器对这些样品进行脱气并搅拌大约10分钟。

以1.5℃/min的恒定扫描速率从20℃-90℃在MicroCal VP-DSC上进行DSC扫描。使用MicroCal原点软件(Origin software)(4.10版本)进行数据处理，并将变性温度T_d(也称为熔解温度T_m)定义为温度自记曲线的峰尖端的温度。

实例6：蒸汽稳定性

可以使用以下测定法评价蒸汽处理后该蛋白酶的残余活性。

在这些试验中，使用修改设置从而该蒸汽是从蒸汽发生器中提供的并被导入到箱中。当温度达到约93℃-94℃时，通过抽屉将放置在板上的这些样品插入到该箱中。插入这些样品后，温度即降低4℃。当温度停留在大约恒定的90℃时，孵育30秒。此后，将盘快速地从盒中移除，将样品放置在冰上，重悬浮，并且使用例如Suc-AAPF-pNA或邻苯二醛(OPA)测定来针对蛋白酶活性进行评估。将各个酶样品与未经蒸汽处理的相似样品比较以计算残余活性。

实例7：造粒稳定性测试

如美国专利号4,106,991，实例1中所述的方式将酶粒化。将获得的颗粒在流化床中干燥至含水量低于1％并过筛以获得具有250μm至850μm粒子范围的产物。最终，将该产物用棕榈油和碳酸钙以如在美国专利号4,106,991，实例22中所述的方式进行包衣。

在小型卧式搅拌器中，大致地将50g酶颗粒与10kg饲料预混合10分钟。在大型卧式搅拌器中将该预混合物与90kg饲料混合10分钟。将该饲料从该搅拌器中以大约300kg/小时的速率导至调节器(带有蒸汽注入的串联搅拌器)。该调节器通过注入蒸汽将该饲料加热至95℃(在排气口进行测量)。在该调节器中的停留时间是30秒。将该饲料从该调节器中导至配备有3.0x 35mm水平冲模的西蒙黑森(Simon Heesen)压力机中并将其压缩成具有15mm左右的长度的丸粒。在压缩后，将这些丸粒放置在冷气机中并冷却15分钟。

使用Suc-AAPF-pNA测定法，在造粒之前测量蛋白酶活性，并在造粒之后测量该饲料丸粒中的蛋白酶活性。通过将丸粒化饲料中的蛋白酶活性相对于非丸粒化饲料中的活性相对比以确定造粒稳定性。

实例8：使用来自霍耐克芽孢杆菌的S8蛋白酶(SEQ ID NO:1)在肉鸡中进行回肠氮消化率试验

动物和饲喂

使用从商业孵化场(Accouvoir multiplicateur Grelier,La Bohardière，法国)获得的一天龄的鸡(Cobb500)。鸡被饲养在缆线底层架式鸡笼(wire-floor battery cage)中(0.75m2/笼，6只鸡/笼)中，可随意获得饲料和水。根据鸡的营养需要，将喂养分为两个阶段，起始喂养和生长喂养(分别为1-7和8-21)。根据第1天的体重将鸡分配到笼子中，以使笼间的体重变化最小。所有的鸡在生命的前16天期间都经受相同的喂养策略，随后从第17-21天进行为期5天的实验。在实验期间，笼子被分配给阴性对照饮食(NC)、阳性对照饮食(PC)或酶处理(从NC构建，喷洒液体蛋白酶溶液)，参见表5。PC被配制为与NC具有相同的代谢能、粗蛋白、赖氨酸和甲硫氨酸浓度，但与NC相比，PC使用更高消化率的蛋白质源。所有饮食均含有TiO₂作为消化率标记。

表5：饮食的组成和化学分析

数据和样品收集

在第16天和第21天之间获得了笼子总重量和饲料消耗量。在第21天，所有鸡均经颈椎脱位处死。将鸡进行解剖并收集回肠末端的内容物。回肠末端定义为近端17厘米至回肠-盲肠交界处前2厘米的点，如Jallier等人(2003,Influence of the methodology ofsampling content from different parts of the ileum on the values of apparentileal digestibility in broiler chickens[来自回肠不同部分内容物的取样方法学对肉鸡中表观回肠消化率值的影响],Br.Poult.Sci.[英国家禽科学]44:807-809)所述。将回肠消化物在笼子里合并，冻干，并研磨用于化学分析。在消化物和饲料样品中确定粗蛋白和TiO₂浓度，用于随后估计表6中给出的表观回肠氮消化率AIDN(％)：

AIDN(％)＝100-[(CMf/CMe)x(CNe/CNf)]x 100

其中

CMf＝饲料中标记的浓度；CMe＝回肠消化物中标记的浓度；

CNf＝饲料中营养素的浓度；CNe＝回肠消化物营养素的浓度

根据Dumas法(Dumas,1831,Procedes de l’Analyse Organique[有机分析方法],Ann.Chim.Phys.[化学与物理年鉴]247:198-213)，通过LECO装置FP-528(

公司)来确定氮含量。使用6.25的因子将氮含量转化为粗蛋白。

根据DIN EN ISO 11885:1997(DIN EN ISO 1998)，在样品的H₂SO₄矿化后，通过电感耦合等离子体(ICP)装置ICP-OES 5100(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))确定饲料和消化物中的二氧化钛浓度。

表6：来自肉鸡体内试验的AIDN结果

与NC和PC两者相比，霍耐克芽孢杆菌蛋白酶显著(与NC相比，P<0.01)增加表观回肠氮消化率。

实例9：使用来自霍耐克芽孢杆菌的S8蛋白酶(SEQ ID NO:1)和来自芽孢杆菌属物种的S8蛋白酶变体进行肉鸡中回肠氮消化率试验。

如实例8中所述进行试验，并且AIDN结果呈现于下表7中。

表7：来自肉鸡体内试验的AIDN结果

与NC和PC两者相比，霍耐克芽孢杆菌蛋白酶和来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶变体两者均增加了表观回肠氮消化率。在该体内试验中，饲料成分的固有蛋白质消化率出人意料地高，意指与NC相比，PC的消化率仅表现出最小的提高。虽然如此，与PC相比，蛋白酶仍然增加了表观回肠氮消化率，表明该蛋白酶甚至可以在高质量的饮食中发挥作用。

实例10：动物饲料和动物饲料添加剂

颗粒

通过用填充剂(如硫酸钠、硫酸镁、碳酸钙和/或纤维素)粒化本发明的蛋白酶来制备颗粒，并然后任选地用蜡涂层(例如氢化棕榈油)或盐包衣(例如硫酸钠和/或硫酸镁)涂覆颗粒。

可替代地，通过将本发明的蛋白酶的液体溶液吸收到惰性核心上，并且然后任选地用蜡包衣(例如氢化棕榈油)或盐包衣(例如硫酸钠和/或硫酸镁)给颗粒包衣来制备颗粒。

液体配制品

本发明的蛋白酶的液体配制品包含0.1％至10w/w酶蛋白、40％-60％甘油、0.1％至0.5％苯甲酸钠和水。将该液体配制品喷洒在如上所述的丸粒化动物饲料上或粉状饲料上。

动物饲料添加剂

将含有0.01g至10g酶蛋白酶/千克的预混物(任选地配制为包衣颗粒)的本发明的蛋白酶的预混物配制品添加至以下预混物中：

动物饲料的实例

这是肉鸡饲料的实例，其包含如上所述的动物饲料添加剂：

62.55％玉蜀黍

33.8％大豆粉(50％粗蛋白)

1.0％大豆油

0.2％DL-甲硫氨酸

0.22％DCP(磷酸二钙)

0.76％CaCO₃(碳酸钙)

0.32％砂

0.15％NaCl(氯化钠)

1％的上述动物饲料添加剂(预混物)。

将这些成分混合，并将饲料在所希望的温度(例如60℃、65℃、75℃、80℃、85℃、90℃或甚至95℃)下丸粒化。

仅通过实例，鸡(例如肉鸡)饲料可以包含下表8.1中给出的实例百分比中列出的一种或多种成分。

表8.1：在起始期和后期中肉鸡饮食的实例

成分	起始期(％)	后期(％)
			玉蜀黍	46.2	46.7
次粉	6.7	10.0
			玉蜀黍DDGS	7.0	7.0
大豆粉48％CP	32.8	26.2
			动物/植物脂肪共混物	3.0	5.8
L-盐酸赖氨酸	0.3	0.3
			DL-甲硫氨酸	0.3	0.3
L-苏氨酸	0.1	0.1
			盐	0.3	0.4
石灰石	1.1	1.1
			磷酸二钙	1.2	1.2
维生素和矿物质预混物	0.3	0.3

仅通过实例，鸡(例如肉鸡)的饮食规格可以如下表8.2中给出的所述。

表8.2：在起始期和后期中鸡饮食规格的实例

仅通过实例，蛋鸡饲料可以包含下表8.3中给出的实例百分比中列出的一种或多种成分。

表8.3：产蛋期蛋鸡饲料的实例

成分	产蛋期(％)
		玉蜀黍	10.0
小麦	53.6
		玉蜀黍DDGS	5.0
大豆粉48％CP	14.9
		次粉	3.0
大豆油	1.8
		L-盐酸赖氨酸	0.2
DL-甲硫氨酸	0.2
		L-苏氨酸	0.1
盐	0.3
		磷酸二钙	1.6
石灰石	8.9
		维生素和矿物质预混物	0.6

仅通过实例，蛋鸡饮食规格可以如下表8.4中给出的所述。

表8.4：产蛋期蛋鸡饮食规格的实例

仅通过实例，火鸡饲料可以包含下表8.5中给出的实例百分比中列出的一种或多种成分。

表8.5：第1至4阶段中火鸡饮食的实例

仅通过实例，火鸡饮食规格可以如下表8.6中给出的所述。

表8.6：第1至4阶段中火鸡饮食规格的实例

仅通过实例，仔猪饲料可以包含下表8.7中给出的实例百分比中列出的一种或多种成分。

表8.7：第1至2阶段中仔猪饮食的实例

成分	阶段1(％)	阶段2(％)
			玉蜀黍	20.0	7.0
小麦	25.9	46.6
			黑麦	4.0	10.0
次粉	4.0	4.0
			玉蜀黍DDGS	6.0	8.0
大豆粉48％CP	25.7	19.9
			干燥乳清	10.0	0.0
大豆油	1.0	0.7
			L-盐酸赖氨酸	0.4	0.5
DL-甲硫氨酸	0.2	0.2
			L-苏氨酸	0.1	0.2
L-色氨酸	0.03	0.04
			石灰石	0.6	0.7
磷酸二钙	1.6	1.6
			维生素和矿物质预混物	0.2	0.2
盐	0.2	0.4

仅通过实例，仔猪饮食规格可以如下表8.8中给出的所述。

表8.8：1至2阶段中仔猪饮食规格的实例

仅通过实例，生长期/后期猪饲料可以包含下表8.9中给出的实例百分比中列出的一种或多种成分。

表8.9：生长期/后期饮食的实例

成分	生长期/后期(％)
		玉蜀黍	27.5
大豆粉48％CP	15.4
		玉蜀黍DDGS	20.0
小麦麸	11.1
		米糠	12.0
卡诺拉籽粕	10.0
		石灰石	1.6
磷酸二钙	0.01
		盐	0.4
维生素和矿物质预混物	0.3
		盐酸赖氨酸	0.2
植物油	0.5

仅通过实例，生长期/后期猪饮食规格，可以如下表8.10中给出的所述。

表8.10：生长期/后期猪饮食规格的实例

饮食规格	生长期/后期
		粗蛋白(％)	22.60
代谢能(kcal/kg)	3030
		钙(％)	0.75
有效磷(％)	0.29
		可消化的赖氨酸(％)	1.01
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％)	0.73
		可消化的苏氨酸(％)	0.66

实例11：与基准(Cibenza)相比，肉鸡中新蛋白酶的表观空肠氮消化率试验

动物和饲喂

使用从商业孵化场(Accouvoir multiplicateur Grelier,La Bohardière，法国)获得的一天龄的鸡(Cobb500)。鸡被饲养在缆线底层架式鸡笼中(0.75m2/笼，6只鸡/笼)。向鸡随意提供表9中提供的饲料和水，直到第7天。第7天将鸡进行称重，并使用体重为标准将鸡分配至6个处理中的一个。以相同的饮食饲喂鸡，直到第16天。然后实验期从鸡生命的第16天至21天进行。在实验期间，向鸡喂养阳性对照饮食(PC)、阴性对照饮食(NC)或NC+测试酶(表9)。实验中使用的测试酶是SEQ ID NO:1(S8，霍耐克芽孢杆菌)和SEQ ID NO:3(S8，芽孢杆菌属物种-11238)

这些酶以液体形式提供，并通过使用与Forberg F60混合器偶联的超低压系统偶联进行喷雾施加到处理上。PC被配制为提供与NC相同的代谢能、粗蛋白、赖氨酸和甲硫氨酸浓度，但与NC相比，PC含有更高消化率的蛋白质源。所有饮食均含有TiO₂作为消化率标记。

表9：饮食的组成和化学分析

数据和样品收集

在第16天和第21天之间，获得每笼和每个处理中的平均体重和饲料消耗。在第21天，所有鸡均经颈椎脱位处死。将鸡进行解剖并收集空肠内容物。空肠被定义为开始于胰腺环状(十二指肠)的末端，并在梅克尔憩室的近端1厘米处远端结束的小肠区段。将空肠消化物合并在笼子里，冻干，并研磨用于化学分析。在消化物和饲料样品中确定粗蛋白和TiO₂浓度，用于随后估计表10中给出的表观空肠氮消化率AJDN(％)：

AJDN(％)＝100-[(CMf/CMe)x(CNe/CNf)]x 100

其中

CMf＝饲料中标记的浓度；CMe＝空肠消化物中标记的浓度；

CNf＝饲料中营养素的浓度；CNe＝空肠消化物营养素的浓度

根据Dumas法(Dumas,1831,Procedes de l’Analyse Organique[有机分析方法],Ann.Chim.Phys.[化学与物理年鉴]247:198-213)，使用LECO装置FP-528(

根据DIN EN ISO 11885:1997(DIN EN ISO 1998)，在样品的H₂SO₄矿化后，使用ICP-OES 5100装置(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))确定饲料和消化物中的二氧化钛浓度。

表10：首次体内试验的结果

结果证明，与NC、PC和基准(Cibenza)相比，蛋白酶增加了表观空肠氮的消化率。

实例12：与基准(Cibenza)相比，肉鸡中新蛋白酶同源物的表观空肠氮消化率试验动物和饲喂

使用从商业孵化场(Accouvoir multiplicateur Grelier,La Bohardière，法国)获得的一天龄的鸡(Cobb500)。鸡被饲养在缆线底层架式鸡笼中(0.75m2/笼，6只鸡/笼)。向鸡随意提供饲料[什么样的饲料？]和水，直到第7天。第7天将鸡进行称重，并以体重为标准分配至8个处理中的一个。以相同的饮食[描述饮食？]饲喂鸡，直到第16天。然后实验期从鸡生命的第16天至21天进行。在实验期间，向鸡喂养阳性对照饮食(PC)、阴性对照饮食(NC)或NC+测试酶(表11)。实验中使用的测试酶是：

表11：饮食的组成和化学分析

数据和样品收集

在第16天和第21天之间，获得每笼和每个处理中的平均体重和饲料消耗。在第21天，所有鸡均经颈椎脱位处死。将鸡进行解剖并收集空肠内容物。空肠被定义为开始于胰腺环状(十二指肠)的末端，并在梅克尔憩室的近端1厘米处远端结束的小肠区段。将空肠消化物合并在一个笼子里，冻干，并研磨用于化学分析。在消化物和饲料样品中确定粗蛋白和TiO₂浓度，用于随后估计表12中给出的表观空肠氮消化率AJDN(％)：

AJDN(％)＝100-[(CMf/CMe)x(CNe/CNf)]x 100

其中

CMf＝饲料中标记的浓度；CMe＝空肠消化物中标记的浓度；

CNf＝饲料中营养素的浓度；CNe＝空肠消化物营养素的浓度

根据Dumas法(Dumas,J.B.A.,Procedes de l’Analyse Organique[有机分析方法],Ann.Chim.Phys.[化学与物理年鉴]247:198-213(1831))，使用LECO装置FP-528(

表12：首次体内试验的结果

结果证明，与NC和基准(Cibenza)两者相比，蛋白酶增加了表观空肠氮的消化率

本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

实例12.SEQ ID:1的10个PE-变体在pH 7时对饲料相关材料(SBM/玉米)的活性

将蛋白酶与SBM-玉米浆在pH 7、40℃搅拌下孵育。孵育后，通过OPA法测定蛋白酶的效果。

制备缓冲储备溶液(100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CAPS、12.5mMCaCl₂*2H₂O、306mM KCl、0.01％Triton X-100)，并用10M NaOH或37％HCl调节至pH 7.36。将1.4g经研磨的SBM(大豆粉)、0.6g经研磨的玉米与20ml缓冲储备溶液混合，给出具有所得pH7的浆液。将该浆液在磁力搅拌器上，在室温下预混合5min。

将24孔板(带交叉磁铁)放置在加热和搅拌组合装置上，在40℃下预热。将pH 7的2ml浆液转移至各孔，并用密封带封闭板，并预孵育30min。将100ul缓冲液(空白)或酶溶液添加至孔中(对应于200mg酶/kg饲料)，用密封带封闭并将板孵育3小时。将板在0℃下，以4000rpm(2500x g)离心10min。将上清液转移到艾本德管中，并使用上述OPA方法进行分析。

与野生型相比，所有测试的PE变体在pH 7时对SBM:玉米具有更高的活性。

实例13.SEQ ID NO:3.饲料相关材料的体外数据

如上述步骤相同的程序。

蛋白酶	pH 7时的活性
		ProAct	3,27
SEQ ID NO:3	4,25

在pH 7时，与

相比，SEQ ID NO:3对SBM:玉米具有更高的活性。

实例14SEQ ID NO 1的PE变体的克隆和表达实例

实例14.1：通过定点诱变构建变体

定点变体是构建自包含根据本发明的具体的取代的霍耐克芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶S8A(SEQ ID NO:1)。使用PCR连同正确地设计的诱变寡核苷酸(其在所得序列中引入所希望的突变并且可以由本领域每位技术人员重复)，通过传统的DNA片段克隆制得这些变体(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第2版，冷泉港，1989)。

对应于所需的一个或多个突变位点侧翼的DNA序列设计诱变的寡核苷酸，其由限定插入/缺失/取代的DNA碱基对分离，并购自寡核苷酸的供应商，如综合DNA技术公司(IDT)。为了测试本发明的蛋白酶变体，通过同源重组将包含本发明变体的突变DNA整合到感受态枯草芽孢杆菌菌株中，使用标准方案发酵(基于酵母提取物的培养基，4天，30℃)，并且通过活性测定筛选。

实例14.2：活性测定的表达

将构建的变体铺在补充有6ug/ml氯霉素的LB琼脂上，并在37℃下生长一天。在生长后，将菌落挑选到标准24深孔板(DWP)中的各个孔中，这些深孔板含有3mL TBgly肉汤，补充有6ug/ml氯霉素和痕量金属(50mM FeCl3、20mM CaCl2、10mM MnCl2、10mM ZnSO4、2mMCuCl2、和2mM NiCl2，(F.William Studier,“Protein production by auto-induction inhigh-density shaking cultures[在高密度振荡培养中通过自动诱导产生蛋白质]”,Protein Expression and Purification[蛋白质表达和纯化],41(2005)207-234)。

还将野生型霍耐克芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶S8A作为参考接种在每个深孔板上的四个孔中。使DWP板在30℃下以220rpm振荡生长4天。生长后，将板以2500rpm离心10分钟，并将上清液在96孔微量滴定板中重新网格化，然后用于筛选残余活性。

实例14.3：用于纯化的发酵

可以通过本领域熟知的或如以下的方法进行发酵。将具有变体的不同枯草芽孢杆菌菌株在LB-琼脂板上划线，并在37℃下生长过夜。将克隆转移至500ml摇瓶中的100ml PS-1培养基：(PS-1：100g/L蔗糖(丹尼斯克目录号109-0429)、40g/L大豆壳(大豆粉)、10g/LNa2HPO4.12H2O(默克(Merck)目录号6579)、0.1ml/L替换-Dowfax63N10(陶氏化学(Dow))。典型地在30℃下，在270rpm的振摇下进行4天的培养。通过在4500rpm下离心20-25分钟从发酵液中去除细胞和其他未溶解的材料。

实例15用于筛选SEQ ID NO 1变体以改善胃稳定性的测定描述

培养基和溶液

一升100mM乙酸盐/MES/HEPES/甘氨酸缓冲液由8.2g乙酸钠、19.5g MES、23.8gHEPES、7.5g甘氨酸组成。将该缓冲液补充1mL CaCl₂(1M)、50mL 20％SDS、1mL 10％Triton-X，并且pH用5N NaOH调节至pH 7。

通过将715ml，0.1M的柠檬酸与285ml，0,2M Na₂HPO₄混合来制备pH 3.4的胃激发缓冲液。

终止试剂由0,2M Na₂HPO₄组成。

在V底Nunc U96PP 0,5ml 96孔板上制备pH 7的普罗塔酶AK测定板。在室温下，通过搅拌10分钟，将100个普罗塔酶AK片(麦格酶公司(Megazyme)T-PRAK-200T)(约10.825g)溶解于200ml乙酸盐/MES/HEPES/甘氨酸/CaCl2/SDS/Triton-X100中。使用8通道移液管和宽口吸头将180μL这一溶液等分到MTP V底部96孔板(Nunc U96PP，0,5ml)中。将板封闭和冷冻直到使用。

将SEQ ID NO:1变体的芽孢杆菌属肉汤等分到两个相同的网格中。每个网格含有重复的样品且所有板的每个网格上也存在两个参考主链。

测定描述

测定在Biomek FXp(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))上进行。测定含有在23C时，对SEQ ID NO:1的不同变体进行pH降至pH3.4(胃内激发)10分钟(初步筛选)和15分钟(在来自初步筛选的组合突变上进行次级筛选)。在孵育期间，不同变体的主链的稳定性受pH下降的影响不同。通过添加终止试剂来中和激发网格中的反应，终止胃内激发测定。为了避免板间差异，将用于该胃内激发测定的测试样品分成96孔板上的两个网格：没有使其受到pH值下降影响的控制网格和受到pH值下降压力的激发网格。

测定的第二部分包括通过胃内挑战测定后在普罗塔酶AK pH7的平板上的孵育来揭示残余活性。在23C下，500rpm的振摇下将普罗塔酶AK测定孵育15分钟。通过离心终止反应，并将上清液转移至读板分光光度计上。通过计算(来自激发网格的平均吸光度变化)/(来自激发网格的平均吸光度变化)*100的比率，来计算每个变体的残余活性(RA)比率。使用这一RA数对针对变体的改善的胃稳定性对变体进行排序。进行两轮筛选：第一轮为了鉴定最有希望的原发性突变，且第二轮为了鉴定从组合的原发性突变中产生的最稳定的变体。在590nm处分析分光光度计板的吸光度。

实例16：对蛋白酶的PE-变体的纯化

活性测定

Suc-AAPF-pNA测定：

pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨公司(Bachem)L-1400)。

温度：室温(25℃)

将20μl蛋白酶(在0.01％Triton X-100中稀释)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。

SEQ ID NO:1PE-变体的纯化

PE-变体在枯草芽孢杆菌中表达。将培养液离心(26000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物倾析分开。将上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余的芽孢杆菌属宿主细胞。将0.2μm滤液以1:1与3.0M(NH₄)₂SO₄混合，并且将该混合物施加到苯基-琼脂糖FF(高取代(high sub))柱(来自GE医疗公司(GE Healthcare))上，该柱以50mMH₃BO₃、10mM MES/NaOH、2mM CaCl₂、1.5M(NH₄)₂SO₄(pH 6.0)平衡。用平衡缓冲液洗涤该柱后，将蛋白酶用50mM H3BO3、10mM MES、2mM CaCl₂(pH 6.0)进行逐步洗脱。收集洗脱峰(含有蛋白酶活性)，并且施加至在50mM H₃BO₃、10mM MES、2mM CaCl₂(pH 6.0)中平衡的杆菌肽琼脂糖柱(来自Upfront色谱公司(Upfront chromatography))上。在用平衡缓冲液充分地洗涤该柱之后，将蛋白酶用具有25％(v/v)2-丙醇的50mM H₃BO₃、10mM MES、2mM CaCl₂、1M NaCl(pH 6.0)洗脱。将洗脱峰(含有蛋白酶活性)转移至在G25葡聚糖凝胶柱(来自GE医疗公司)上的20mM MES、2mM CaCl₂(pH 6.0)。经G25转移的峰是纯化的制剂，并且将其用于进一步实验。

当通过非还原性SDS-PAGE分析纯化的PE-变体蛋白酶制剂并将凝胶用考马斯染色时，在约34-37kDa处看到PE-变体蛋白酶为主要的优势带。

实例17.体内肉鸡试验

材料与方法

进行4个独立的地面围栏试验和1个笼式围栏肉鸡研究，来评价生长性能和表观回肠氮消化率。

动物和圈舍

在到达当天(第1天)，按体重将鸡(Ross 308/708，Cobb 500)每18-25只鸡进行分组。将每组分别放置于一个铺满刨花的地面围栏中，并分配至不同处理中的一个。在笼式围栏试验中，使用每一个重复5只鸡。

每个处理用8-12个组进行重复。将鸡饲养在环境受控的房间内。使室温改适于鸡年龄。鸡可以自由获取饲料和水。

饲料组合物、处理和饲喂时间

饲喂阶段：

·起始期(第0-14天)

·生长期(第14-28天)

·后期(第28-35天)

具有酶补充剂的实验饮食：第0-35天

饲料分配：造粒后饲料或粉状饲料

将酶以液体形式提供，并在造粒后或在粉状饲料上施用。

产品溶液的最终体积：约200kg饮食中300至500ml。

实验饮食(起始饮食和生长饮食)是基于玉蜀黍-大豆粉(参见下表))。将饮食配制成起始期含有215-220g粗蛋白和12.9MJ/kg MEN以及生长期含有190-195g粗蛋白和13.4MJ/kg MEN。根据当地实践，基础饮食含有抗球虫药。

成分(％)	起始饮食(第1-14天)	生长饮食(第14-35天)
			玉蜀黍8.0％	51.30-52.70	58.76-60.20
大豆O/C 44％	38.50-39.70	31.00-32.30
			大豆油	3.70-3.90	4.20-4.50
预混物<sup>1</sup>	1.00	1.00
			其他	2.7-5.5	2.0-5.04
计算的含量
			粗蛋白(g/kg)	215-220	190-195
代谢能(MJ/kg)<sup>2</sup>	12.9	13.4

以每千克饮食提供的¹维生素-矿物质预混物：维生素A：10’000I.U.；维生素E：40I.U.；维生素K3:3.0mg；维生素C：100mg；维生素B1：2.50mg；维生素B2：8.00mg；维生素B6：5.00mg；维生素B12：0.03mg；烟酸：50.0mg；泛酸钙：12.0mg；叶酸：1.50mg；生物素0.15mg；胆碱：450mg；乙氧基喹啉：54mg；Na：1.17g；Mg：0.8g；Mn：80mg；Fe：60mg；Cu：30mg；Zn：54mg；I：1.24mg；Co：0.6mg；Se：0.3mg

饲喂饮食不补充(阴性对照，C)，或者补充有

1.按10mg酶蛋白/kg饲料的SEQ ID NO:1或

2.按10mg酶蛋白/kg饲料的SEQ ID NO:2或

3.阳性对照中的合成氨基酸。

对于丸粒化后的应用，将适当量的蛋白酶液体制剂稀释于水中并喷洒到各自的丸粒化饲料上，以获得对应于不同处理的饲料中的最终浓度。为了使所有处理的程序平衡，还将相同体积的水喷洒到对照饮食的丸粒上。

实验参数和分析

实验中，在第1、24、28和35天对这些鸡进行称重(作为重复组)。测定中间期的饲料消耗量。计算体增重和饲料转化率(饲料/增加)。此外，在试验结束时(第35天)收集回肠内容物，以测定表观回肠氮消化率。

结果和结论

本研究中所获得的结果证明，纳入蛋白酶在改善肉鸡饲喂饮食的饲料转化率方面是有效的。特别是，这些结果表明，酶处理一致地改善了在本发明的所有测试酶中的性能。这种一致性和改善水平是业界所追求的。

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

<120> 包含具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料添加剂及其用途

<130> 14625-WO-PCT

<160> 10

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 314

<212> PRT

<213> 霍耐克芽孢杆菌

<220>

<221> 成熟肽

<222> (1)..(314)

<400> 1

Glu Val Thr Ala Thr Pro Ser Thr Gln Thr Pro Trp Gly Ile Lys Ser

1 5 10 15

Ile Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Lys Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ile

20 25 30

Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Val His Thr Gly His Ile Asp Leu

35 40 45

Ala Gly Ser Ser Glu Gln Cys Lys Asp Phe Thr Gln Ser Asn Pro Leu

50 55 60

Val Asn Gly Ser Cys Thr Asp Arg Gln Gly His Gly Thr His Val Ala

65 70 75 80

Gly Thr Val Leu Ala His Gly Gly Ser Asp Gly Gln Gly Val Tyr Gly

85 90 95

Val Ala Pro Gln Ala Lys Leu Trp Ala Tyr Lys Val Leu Gly Asp Asn

100 105 110

Gly Ser Gly Tyr Ser Asp Asp Ile Ala Ala Ala Ile Arg His Val Ala

115 120 125

Asp Glu Ala Ser Arg Thr Gly Ser Lys Val Val Ile Asn Met Ser Leu

130 135 140

Gly Ser Ser Gly Lys Asp Ser Leu Ile Ala Ser Ala Val Asp Tyr Ala

145 150 155 160

Tyr Gly Lys Gly Val Leu Ile Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser

165 170 175

Gly Ser Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Ala Leu Val Asn Ala Val Ala

180 185 190

Val Ala Ala Leu Glu Asn Val Gln Gln Asn Gly Thr Tyr Arg Val Ala

195 200 205

Asn Phe Ser Ser Arg Gly Asn Pro Ala Thr Ala Gly Asp Phe Arg Ile

210 215 220

Gln Glu Arg Asp Val Glu Val Ser Ala Pro Gly Ala Ser Val Glu Ser

225 230 235 240

Thr Trp Tyr Asn Gly Gly Tyr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala

245 250 255

Thr Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Lys Ile Trp Ser Ser Asn Ser

260 265 270

Ser Leu Ser His Ser Gln Leu Arg Thr Glu Leu Gln Asn Arg Ala Lys

275 280 285

Val Tyr Asp Ile Lys Gly Gly Ile Gly Ala Gly Thr Gly Asp Asp Tyr

290 295 300

Ala Ser Gly Phe Gly Tyr Pro Arg Val Lys

305 310

<210> 2

<211> 311

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属物种

<220>

<221> 成熟肽

<222> (1)..(311)

<400> 2

Ala Val Pro Ser Thr Gln Thr Pro Trp Gly Ile Lys Ser Ile Tyr Asn

1 5 10 15

Asp Gln Ser Ile Thr Lys Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ile Lys Val Ala

20 25 30

Val Leu Asp Thr Gly Val Tyr Thr Ser His Leu Asp Leu Ala Gly Ser

35 40 45

Ala Glu Gln Cys Lys Asp Phe Thr Gln Ser Asn Pro Leu Val Asp Gly

50 55 60

Ser Cys Thr Asp Arg Gln Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val

65 70 75 80

Leu Ala His Gly Gly Ser Asn Gly Gln Gly Val Tyr Gly Val Ala Pro

85 90 95

Gln Ala Lys Leu Trp Ala Tyr Lys Val Leu Gly Asp Asn Gly Ser Gly

100 105 110

Tyr Ser Asp Asp Ile Ala Ala Ala Ile Arg His Val Ala Asp Glu Ala

115 120 125

Ser Arg Thr Gly Ser Lys Val Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Ser Ser

130 135 140

Ala Lys Asp Ser Leu Ile Ala Ser Ala Val Asp Tyr Ala Tyr Gly Lys

145 150 155 160

Gly Val Leu Ile Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Gly Ser Asn

165 170 175

Thr Ile Gly Phe Pro Gly Gly Leu Val Asn Ala Val Ala Val Ala Ala

180 185 190

Leu Glu Asn Val Gln Gln Asn Gly Thr Tyr Arg Val Ala Asp Phe Ser

195 200 205

Ser Arg Gly Asn Pro Ala Thr Ala Gly Asp Tyr Ile Ile Gln Glu Arg

210 215 220

Asp Ile Glu Val Ser Ala Pro Gly Ala Ser Val Glu Ser Thr Trp Tyr

225 230 235 240

Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His

245 250 255

Val Ala Gly Leu Ala Ala Lys Ile Trp Ser Ala Asn Thr Ser Leu Ser

260 265 270

His Ser Gln Leu Arg Thr Glu Leu Gln Asn Arg Ala Lys Val Tyr Asp

275 280 285

Ile Lys Gly Gly Ile Gly Ala Gly Thr Gly Asp Asp Tyr Ala Ser Gly

290 295 300

Phe Gly Tyr Pro Arg Val Lys

305 310

<210> 3

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白质工程化变体

<220>

<221> 成熟肽

<222> (1)..(311)

<400> 3

Ala Val Pro Ser Thr Gln Thr Pro Trp Gly Ile Lys Ser Ile Tyr Asn

1 5 10 15

Asp Gln Ser Ile Thr Lys Thr Thr Gly Gly Lys Gly Ile Lys Val Ala

20 25 30

Val Leu Asp Thr Gly Val Tyr Thr Ser His Leu Asp Leu Ala Gly Ser

35 40 45

Ala Glu Gln Cys Lys Asp Phe Thr Gln Ser Asn Pro Leu Val Asp Gly

50 55 60

Ser Cys Thr Asp Arg Gln Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val

65 70 75 80

Leu Ala His Gly Gly Ser Asn Gly Gln Gly Val Tyr Gly Val Ala Pro

85 90 95

Gln Ala Lys Leu Trp Ala Tyr Lys Val Leu Gly Asp Lys Gly Glu Gly

100 105 110

Tyr Ser Asp Asp Ile Ala Ala Ala Ile Arg His Val Ala Asp Glu Ala

115 120 125

Ser Arg Thr Gly Ser Lys Val Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Ser Ser

130 135 140

Ala Lys Asp Ser Leu Ile Ala Ser Ala Val Asp Tyr Ala Tyr Gly Lys

145 150 155 160

Gly Val Leu Ile Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Lys Pro Asn

165 170 175

Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Gly Phe Val Asn Ala Val Ala Val Ala Ala

180 185 190

Leu Glu Asn Val Gln Glu Lys Gly Thr Tyr Arg Val Ala Asp Phe Ser

195 200 205

Ser Arg Gly Asn Pro Ala Thr Ala Gly Asp Tyr Ile Ile Gln Glu Arg

210 215 220

Asp Ile Glu Val Ser Ala Pro Gly Ala Ser Val Glu Ser Thr Trp Tyr

225 230 235 240

Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His

245 250 255

Val Ala Gly Leu Ala Ala Lys Ile Trp Ser Ala Asn Thr Ser Leu Ser

260 265 270

His Ser Gln Leu Arg Thr Glu Leu Gln Asn Arg Ala Lys Val Tyr Asp

275 280 285

Ile Lys Gly Gly Ile Gly Ala Gly Pro Gly Asp Asp Tyr Ala Ser Gly

290 295 300

Phe Gly Tyr Pro Arg Val Lys

305 310

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 保守基序TGXKV[I/V]XXMSLG.

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> 在位置3中的氨基酸是任何氨基酸.

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> 在位置3中的氨基酸是缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）.

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> 在位置7中的氨基酸是任何氨基酸.

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (8)..(8)

<223> 在位置8中的氨基酸是任何氨基酸.

<400> 4

Thr Gly Xaa Lys Val Xaa Xaa Xaa Met Ser Leu Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 418

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属物种-13380

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(418)

<223> 信号肽：残基1-27

<400> 5

Met Lys Lys Lys Arg Ile Ile Gly Ser Ala Val Leu Ser Val Ala Met

1 5 10 15

Gly Leu Ser Val Phe Ala Ser Gly Ala Phe Gly Gln Gln Val Glu Ser

20 25 30

Asn Glu Thr Tyr Arg Val Val Ile Gln Gly Pro Ser Ala Glu Lys Ala

35 40 45

Lys Ala Lys Ser Asn Tyr Gly Val Arg Trp Asp Phe Gly Gln Lys Gly

50 55 60

Phe Thr Thr Thr Val Asn Ala Lys Gln Tyr Gln Ala Leu Leu Lys Asn

65 70 75 80

Lys Asn Leu Lys Ile Asp Arg Val Asp Glu Val Lys Asn Ala Pro Val

85 90 95

Thr Ala Ala Lys Pro Gly Ser Gly Ala Ala Ser Ala Pro Ala Asp Gly

100 105 110

Thr Pro Trp Gly Ile Glu Ala Ile Tyr Asn Asp Ser Ser Ile Gln Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Asn Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Val

130 135 140

Asn Thr Ala His Ala Asp Leu Ala Gly Gln Ala Glu Gln Cys Lys Asp

145 150 155 160

Phe Thr Gln Arg Lys Thr Pro Leu Ile Asp Gly Ser Cys Gly Asp Lys

165 170 175

Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Leu Ala His Gly Gly

180 185 190

Ala Asn Gly Gln Gly Val Tyr Gly Val Ala Pro Asp Ala Asp Leu Trp

195 200 205

Ala Tyr Lys Val Leu Asn Asp Arg Gly Ser Gly Tyr Ser Asp Asp Ile

210 215 220

Ala Gly Ala Ile Lys His Ala Ala Asp Glu Ala Val Arg Thr Gly Ser

225 230 235 240

Lys Val Val Ile Ser Met Ser Leu Gly Ser Ser Ser Lys Ser Thr Leu

245 250 255

Ile Ala Asp Ala Val Asp Tyr Ala Tyr Ser Lys Gly Val Leu Val Val

260 265 270

Ala Ala Ala Gly Asn Asp Gly Pro Ala Asp Asn Thr Ile Gly Tyr Pro

275 280 285

Gly Ala Leu Val Asn Ala Val Ala Val Ala Ala Leu Glu Asn Val Gln

290 295 300

Gln Asn Gly Ser Tyr Arg Val Ala Asp Phe Ser Ser Arg Gly Asn Pro

305 310 315 320

Ala Thr Asp Gly Asp Phe Val Ile Gln Glu Arg Asp Val Glu Val Ser

325 330 335

Ala Pro Gly Arg Ala Ile Glu Ser Thr Trp Tyr Asp Gly Ser Tyr Ser

340 345 350

Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Leu Ala

355 360 365

Ala Lys Ile Trp Ala Gln Asn Pro Ser Met Ser His Thr Gln Leu Arg

370 375 380

Ala Glu Leu Gln Ser Arg Ala Lys Gln Asn Asp Ile Leu Gly Gly Thr

385 390 395 400

Gly Ala Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Ala Ser Gly Phe Gly Phe Pro Arg

405 410 415

Val Lys

<210> 6

<211> 417

<212> PRT

<213> 病研所芽孢杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(417)

<223> 信号肽：残基1-27

<400> 6

Met Lys Ile Arg Lys Val Leu Gly Val Ala Val Leu Ser Leu Ser Met

1 5 10 15

Ser Leu Ser Met Phe Gly Thr Asn Thr Phe Ala Gln Asp Ala Ala Lys

20 25 30

Thr Asp Val Asn Gln Asp Ser Ile Arg Val Val Ile Lys Gly Thr Asp

35 40 45

Thr Glu Lys Val Lys Met Lys Lys Ser His Lys Val Arg Arg Asp Phe

50 55 60

Gly Lys Asp Gly Phe Thr Thr Thr Val Asn Ala Lys Glu Tyr Glu Ala

65 70 75 80

Leu Ile Lys Asn Asp Lys Ile Lys Val Glu Lys Val Ser Thr Leu Gln

85 90 95

Val Ala Ala Gly Lys Pro Ile Lys Thr Met Ala Leu Pro Ser Thr Arg

100 105 110

Thr Pro Trp Gly Ile Lys Ala Ile Tyr Asn Asn Ser Ser Leu Thr Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Asp Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu Asp Thr Gly Val

130 135 140

Gln Thr Ser His Ile Asp Leu Ser Gln Asn Val Glu Gln Cys Lys Asp

145 150 155 160

Phe Thr Val Gly Ser Ser Tyr Thr Asn Gly Ser Cys Thr Asp Arg Asn

165 170 175

Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ala Leu Ala Asn Gly Gly Ser

180 185 190

Asp Gly Met Gly Ile Tyr Gly Val Ala Pro Gln Ser Glu Leu Trp Ala

195 200 205

Tyr Lys Val Leu Thr Asp Ser Gly Ser Gly Tyr Ser Asp Asp Ile Ala

210 215 220

Ala Ala Ile Arg His Ala Ala Asp Glu Gly Thr Arg Thr Gly Ser Lys

225 230 235 240

Val Ile Ile Ser Met Ser Leu Gly Ser Ser Gly Lys Asp Ser Leu Ile

245 250 255

Ala Ser Ala Val Asp Tyr Ala Tyr Gly Lys Gly Ala Leu Val Ile Ala

260 265 270

Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Gly Asn Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Gly

275 280 285

Ala Leu Val Asn Ala Val Ala Val Ala Ala Leu Glu Asn Val Gln Gln

290 295 300

Asn Gly Thr Tyr Arg Val Ala Asn Phe Ser Ser Arg Gly Asn Ser Ala

305 310 315 320

Thr Asp Gly Asp Phe Ile Ile Gly Glu Arg Asp Val Glu Ile Ser Ala

325 330 335

Pro Gly Ala Ser Ile Glu Ser Thr Trp Ile Asn Ser Gly Tyr Asn Thr

340 345 350

Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Leu Ala Ala

355 360 365

Lys Ile Trp Ser Ser Asn Lys Ser Gln Ser Asn Val Gln Val Arg Ala

370 375 380

Glu Leu Gln Asn Arg Ala Lys Leu Tyr Asp Ile Lys Gly Gly Ile Gly

385 390 395 400

Ala Ala Thr Gly Asp Asp His Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ala Arg Val

405 410 415

Gln

<210> 7

<211> 413

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属物种

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(413)

<223> 信号肽：残基1-27

<400> 7

Leu Leu Ser Met Thr Met Gly Leu Ser Val Phe Thr Ala Gly Ala Phe

1 5 10 15

Ala Lys Glu Pro Glu Thr Gln Asn Glu Thr Tyr Arg Val Leu Ile Gln

20 25 30

Gly Pro Ala Asn Ala Lys Ala Ser Val Asn Ser Gln Val Asp Lys Arg

35 40 45

Trp Asp Phe Gly Ser Asp Gly Met Thr Ala Glu Val Asn Ala Lys Gln

50 55 60

Tyr Gln Ala Leu Leu Lys Asn Lys Asn Leu Lys Ile Glu Lys Val Ser

65 70 75 80

Glu Val Thr Leu Asp Thr Ala Arg Thr Glu Ala Ser Lys Lys Asp Ser

85 90 95

Val Ser Ile Gln Ala Ala Gly Tyr Pro Ser Asp Gln Thr Pro Trp Gly

100 105 110

Ile Ala Ser Ile Tyr Asn Asn Ser Ser Ile Thr Ser Thr Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Ile Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Tyr Thr Gly His

130 135 140

Ile Asp Leu Glu Gly Ser Ala Glu Gln Cys Lys Asp Phe Thr Gln Ser

145 150 155 160

Thr Pro Leu Val Asn Gly Ser Cys Thr Asp Arg Gln Gly His Gly Thr

165 170 175

His Val Ala Gly Thr Val Leu Ala His Gly Gly Tyr Asp Gly Gln Gly

180 185 190

Ile Tyr Gly Val Ala Pro Gln Ala Lys Leu Trp Ala Tyr Lys Val Leu

195 200 205

Gly Asp Asn Gly Ser Gly Tyr Ser Asp Asp Ile Ala Gly Ala Ile Arg

210 215 220

His Val Ala Asp Glu Ala Ser Arg Thr Gly Ser Lys Val Val Ile Asn

225 230 235 240

Met Ser Leu Gly Ser Ser Gly Lys Asp Ser Leu Ile Ser Ser Ala Val

245 250 255

Asp Tyr Ala Tyr Ser Lys Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ala Gly Asn

260 265 270

Ser Gly Tyr Ser Ala Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Gly Ala Leu Lys Asn

275 280 285

Ala Ile Ala Val Ala Ala Leu Glu Asn Val Gln Gln Asn Gly Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Ala Asn Phe Ser Ser Arg Gly Asn Pro Asn Thr Asp Gly Asp

305 310 315 320

Tyr Ile Ile Gln Glu Lys Asp Val Glu Val Ser Ala Pro Gly Ala Ser

325 330 335

Ile Glu Ser Thr Trp Tyr Asn Gly Gly Tyr Asn Thr Ile Ser Gly Thr

340 345 350

Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Lys Ile Trp Ser

355 360 365

Ser Ser Pro Ser Met Ser His Thr Gln Leu Arg Thr Glu Leu Gln Asn

370 375 380

Arg Ala Lys Gln Tyr Asp Ile Lys Gly Gly Tyr Gly Ala Ala Thr Gly

385 390 395 400

Asp Asp Tyr Ala Ser Gly Phe Gly Tyr Pro Arg Val Lys

405 410

<210> 8

<211> 420

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属物种

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(420)

<223> 信号肽：残基1-29

<400> 8

Met Thr Lys Lys Lys Thr Val Ala Ala Ala Leu Leu Ser Leu Thr Leu

1 5 10 15

Gly Met Ser Val Phe Thr Ser Gly Ile Ser Ala Gln Val Ser Asp Glu

20 25 30

Ala Lys Gly Ser Glu Thr Tyr Arg Val Leu Ile Gln Ala Pro Ser Asn

35 40 45

Ser Val Asn Ala Leu Glu Thr Lys Tyr Glu Lys Arg Trp Asp Phe Gly

50 55 60

Lys Glu Gly Phe Thr Ala Asp Val Asn Ala Lys Glu Leu Gln Thr Leu

65 70 75 80

Gln Ala Thr Lys Asn Val Glu Val Gln Lys Val Asn Glu Met Ser Ile

85 90 95

Ala Thr Val Thr Gly Glu Val Ser Lys Ala Glu Val Thr Ala Val Pro

100 105 110

Ser Ser Gln Thr Pro Trp Gly Ile Lys Ser Ile Tyr Asn Asn Gln Ser

115 120 125

Leu Thr Ala Thr Ser Gly Gly Asn Gly Ile Lys Val Ala Val Leu Asp

130 135 140

Thr Gly Val Tyr Thr Asn His Ile Asp Leu Ala Gly Ser Ala Glu Gln

145 150 155 160

Cys Lys Asp Phe Thr Gln Ser Ser Pro Leu Val Asn Gly Ser Cys Thr

165 170 175

Asp Arg Gln Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Leu Ala His

180 185 190

Gly Gly Ser Asp Gly Gln Gly Val Tyr Gly Val Ala Pro Asp Ala Lys

195 200 205

Leu Trp Ala Tyr Lys Val Leu Gly Asp Asn Gly Ser Gly Tyr Ser Asp

210 215 220

Asp Ile Ala Ala Ala Ile Arg His Val Ala Asp Gln Ala Thr Ser Thr

225 230 235 240

Gly Ser Lys Val Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Ser Ser Gly Lys Asp

245 250 255

Ser Leu Ile Ser Ser Ala Val Asp Tyr Ala Tyr Asn Lys Gly Val Leu

260 265 270

Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Ile Gly

275 280 285

Tyr Pro Gly Ala Leu Val Asn Ala Val Ala Val Ala Ala Leu Glu Asn

290 295 300

Val Gln Gln Asn Gly Thr Tyr Arg Val Ala Asn Phe Ser Ser Arg Gly

305 310 315 320

Asn Pro Ser Thr Asp Gly Asp Tyr Val Ile Gln Glu Arg Asp Ile Glu

325 330 335

Val Ser Ala Pro Gly Ala Ala Val Glu Ser Thr Trp Tyr Asn Gly Gly

340 345 350

Tyr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly

355 360 365

Leu Ala Ala Lys Ile Trp Ala Ser Asn Pro Ser Trp Ser Lys Ser Thr

370 375 380

Leu Arg Thr Glu Leu Gln Asn Arg Ala Lys Val Tyr Asp Ile Lys Gly

385 390 395 400

Gly Val Gly Ala Thr Thr Gly Asp Asp Tyr Ala Ser Gly Phe Gly Tyr

405 410 415

Pro Arg Val Lys

420

<210> 9

<211> 425

<212> PRT

<213> 海泥芽孢杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(425)

<223> 信号肽：残基1-25

<400> 9

Met Lys Lys Lys Arg Val Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ser Met Thr Met

1 5 10 15

Gly Leu Ser Val Phe Thr Ala Gly Ala Phe Ala Lys Gly Pro Glu Ala

20 25 30

Asn Glu Ser Tyr Arg Val Leu Ile Gln Gly Pro Ala Ala Glu Arg Ala

35 40 45

Asn Val Lys Ala Gln Ile Glu Glu Arg Trp Asp Phe Gly Lys Asp Gly

50 55 60

Leu Thr Ala Glu Val Asn Ser Lys Gln Tyr Gln Ala Leu Leu Lys Asn

65 70 75 80

Lys Asn Ile Thr Ile Glu Lys Val Ser Glu Val Thr Leu Asp Thr Ala

85 90 95

Arg Thr Glu Ala Ser Ser Ser Lys Asn Asp Ser Ile Ser Leu Glu Ala

100 105 110

Ala Gly Tyr Pro Ser Asp Gln Thr Pro Trp Gly Ile Glu Ser Ile Tyr

115 120 125

Asn Asn Ser Tyr Ile Ser Ser Thr Ser Gly Gly Ser Gly Ile Lys Val

130 135 140

Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Tyr Thr Asn His Ile Asp Leu Glu Gly

145 150 155 160

Ser Ala Glu Gln Cys Lys Asp Phe Thr Gln Ser Tyr Ser Ser Met Val

165 170 175

Asn Gly Thr Cys Thr Asp Arg Gln Gly His Gly Thr His Val Ala Gly

180 185 190

Thr Val Leu Ala His Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Gly Val Tyr Gly Val

195 200 205

Ala Pro Gln Ala Lys Leu Trp Ala Tyr Lys Val Leu Gly Asp Asn Gly

210 215 220

Ser Gly Tyr Ser Asp Asp Ile Ala Gly Ala Ile Arg His Val Ala Asp

225 230 235 240

Glu Ala Val Arg Thr Gly Ser Lys Val Val Ile Asn Met Ser Leu Gly

245 250 255

Ser Ser Gly Lys Asp Ser Leu Ile Ala Ser Ala Val Asp Tyr Ala Tyr

260 265 270

Ser Lys Gly Val Leu Ile Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Tyr Ser

275 280 285

Ala Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Gly Ala Leu Thr Asn Ala Ile Ala Val

290 295 300

Ala Ala Leu Glu Asn Val Gln Gln Asn Gly Thr Tyr Arg Val Ala Asn

305 310 315 320

Phe Ser Ser Arg Gly Asn Pro Asn Thr Asp Gly Asp Tyr Tyr Ile Gln

325 330 335

Glu Arg Asp Val Glu Val Ser Ala Pro Gly Ala Ser Ile Glu Ser Thr

340 345 350

Trp Tyr Asn Gly Gly Tyr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr

355 360 365

Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Lys Ile Trp Ser Ser Asn Pro Tyr

370 375 380

Met Ser His Thr Gln Leu Arg Thr Glu Leu Arg Asn Arg Ala Lys Gln

385 390 395 400

Tyr Asp Ile Lys Gly Gly Tyr Gly Ala Ala Thr Gly Asp Asp Tyr Ala

405 410 415

Ser Gly Phe Gly Tyr Pro Arg Val Arg

420 425

<210> 10

<211> 1278

<212> DNA

<213> 海泥芽孢杆菌

<400> 10

atgaagaaga agcgcgtact tggcgcagct cttctttcaa tgacaatggg cctttcagta 60

ttcacagctg gcgcatttgc taaaggtcct gaggctaacg agtcttaccg cgtacttatc 120

caaggacctg cggctgaacg cgctaacgtt aaagcccaaa tcgaggagcg ctgggacttt 180

ggtaaagacg gtcttacggc tgaggttaac tctaaacagt accaggctct tcttaagaac 240

aaaaacatca ctatcgagaa agtttcagag gttacgttag acacagctcg cactgaggct 300

tcatcaagca aaaacgactc aatctcactt gaggcagctg gctatccttc agaccaaact 360

ccttggggca tcgagtcaat ctacaacaac tcttacatct catcaacatc aggaggctca 420

ggtatcaaag ttgcagtttt agacactggc gtttacacaa accacatcga ccttgagggc 480

tctgcagagc agtgcaaaga ctttactcag tcttactcat caatggttaa cggtacgtgc 540

acagaccgcc agggccatgg cacacacgta gcaggcacag ttcttgcgca cggtggctac 600

gacggccttg gtgtatatgg cgttgcacct caagccaaac tttgggctta caaagttctt 660

ggcgacaacg gatcaggcta ttcagacgac atcgcaggcg ctatccgcca cgtagctgac 720

gaggctgttc gcacaggatc aaaagtagta atcaacatgt cacttggaag ctcaggtaaa 780

gactcactta tcgcgtcagc tgttgactat gcttattcaa aaggcgttct tatcgttgct 840

gcggctggta actcaggtta ttcagcaaac acaatcggct accctggtgc gcttacgaac 900

gcaatcgctg ttgccgctct tgagaacgta caacagaacg gcacttatcg cgttgcgaac 960

ttttcatcac gcggaaaccc taacacagac ggcgactact atatccagga gcgcgacgtt 1020

gaggtttcag ctcctggtgc ttcaatcgag tcaacgtggt acaatggtgg ctacaacact 1080

atctcaggca cgtcaatggc tacgcctcac gttgctggcc ttgctgcgaa aatctggtct 1140

tcaaaccctt acatgtcaca cactcaactt cgcactgagc ttcgcaatcg cgctaaacaa 1200

tacgacatca aaggtggata tggagctgct actggtgacg actacgcatc aggttttggt 1260

tatcctcgcg ttcgctaa 1278

Claims

1.一种动物饲料添加剂，其包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽，其中该多肽是选自下组的S8蛋白酶，该组由以下组成：

2.如权利要求1所述的动物饲料添加剂，其中该S8蛋白酶包含基序TGXK[V/T][I/V]X[N/S]MSLG(SEQ ID NO:4)。

3.如权利要求1或2所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂进一步包含一种或多种维生素。

4.如权利要求1至3所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽，其中该多肽是选自下组的S8蛋白酶，该组由以下组成：

(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:1具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；

(b)多肽，该多肽与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；

(c)多肽，该多肽与SEQ ID NO:3具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；

(d)多肽，该多肽与SEQ ID NO:4具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；

(e)多肽，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；

(f)多肽，该多肽与SEQ ID NO:6具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；

(g)多肽，该多肽与SEQ ID NO:7具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；

(h)多肽，该多肽与SEQ ID NO:8具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；

(i)多肽，该多肽与SEQ ID NO:9具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；

(j)SEQ ID NO:1的变体，其中该变体具有蛋白酶活性，并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个位置中的一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(k)SEQ ID NO:2的变体，其中该变体具有蛋白酶活性，并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个位置中的一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(l)SEQ ID NO:3的变体，其中该变体具有蛋白酶活性，并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个位置中的一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(m)SEQ ID NO:5的变体，其中该变体具有蛋白酶活性，并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个位置中的一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(n)SEQ ID NO:6的变体，其中该变体具有蛋白酶活性，并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个位置中的一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(o)SEQ ID NO:7的变体，其中该变体具有蛋白酶活性，并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个位置中的一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(p)SEQ ID NO:8的变体，其中该变体具有蛋白酶活性，并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或30个位置中的一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；

(q)SEQ ID NO:9的变体，其中该变体具有蛋白酶活性，并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个位置中的一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合。

5.如权利要求1至4所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、或SEQ IDNO:9、或其变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中，典型地在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个，更典型地在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个位置中，或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个位置中，或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合。

6.如权利要求1至4所述的动物饲料添加剂，其中该取代是多个突变，该多个突变包含选自下组的突变，该组由以下组成：

S173P、S175P、T297P；L61P、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；H39D、L61P、S173P、S175P、T297P；L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；L61P、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；H123W、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；N59D、H83T、S173P、S175P、T297P；N59D、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；L61Y、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；N59D、L61P、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、H83T、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61Y、S173P、S175P、T297P；H39D、H83T、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、L61Y、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；H39D、L61Y、H83T、S173P、S175P、T297P；L61Y、H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61Y、H83T、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、S173P、S175P、T297P；H83T、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；L61Y、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、N59D、S173P、S175P、T297P；H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；L61P、H123W、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61P、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；L61P、H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；I43P、H83T、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、L61Y、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、N59D、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；N59D、H83T、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；N59D、L61Y、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；I43P、L61Y、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；I43P、N59D、L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；H39D、I43P、N59D、L61Y、S173P、S175P、T297P；和L61Y、H83T、S173P、S175P、T297P。

7.如权利要求1至4所述的动物饲料添加剂，其中该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％的同一性，例如至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，其中该多肽包含零个、一个或多个选自下组的突变，该组由以下组成：S27K、N109K、S111E、S171E、S173P、G174K、S175P、F180Y、G182A、L184F、Q198E、N199K和T297P。

8.如权利要求1至4所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含S8蛋白酶，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％的同一性，例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，其中该多肽包含零个、一个或多个选自下组的突变，该组由以下组成：

S173P、S175P、T297P；L61P、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；H39D、L61P、S173P、S175P、T297P；L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；L61P、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；H123W、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；N59D、H83T、S173P、S175P、T297P；N59D、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；L61Y、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；N59D、L61P、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、H83T、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61Y、S173P、S175P、T297P；H39D、H83T、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、L61Y、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；H39D、L61Y、H83T、S173P、S175P、T297P；L61Y、H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61Y、H83T、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、S173P、S175P、T297P；H83T、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；L61Y、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、N59D、S173P、S175P、T297P；H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；L61P、H123W、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61P、S173P、S175P、T297P；I43P、L61P、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；L61P、H83T、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；I43P、H83T、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、L61Y、V124A、R130D、S173P、S175P、T297P；I43P、N59D、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；N59D、H83T、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；N59D、L61Y、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、E127N、S129M、S173P、S175P、T297P；I43P、L61Y、H123W、V124A、S173P、S175P、T297P；H39D、N59D、L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；I43P、N59D、L61P、H83T、S173P、S175P、T297P；H39D、I43P、N59D、L61Y、S173P、S175P、T297P和L61Y、H83T、S173P、S175P、T297P。

9.如权利要求1至4所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含S8蛋白酶，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％，例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，其中该多肽在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的27、109、111、171、173、174、175、180、182、184、198、199和297中的零个、一个或多个位置处包含突变。

10.如权利要求9所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含S8蛋白酶，该S8蛋白酶与选自下组的多肽具有至少90％，例如至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，或其中该S8蛋白酶是在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的27、109、111、171、173、174、175、180、182、184、198、199和297中的零个、一个或多个位置处包含突变的多肽。

11.如权利要求1至4中任一项所述的动物饲料添加剂，其中该多肽是选自下组的S8蛋白酶，该组由以下组成：来自芽孢杆菌属物种-13380，与SEQ ID NO:1具有至少75％，例如至少76％、至少77％、例如至少78％的序列同一性的S8蛋白酶；来自病研所芽孢杆菌，与SEQID NO:1具有80％序列同一性的S8蛋白酶；来自芽孢杆菌属物种-62451，与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的S8蛋白酶；以及来自海泥芽孢杆菌，与SEQ ID NO:1具有至少85％，例如至少86％，例如至少87％的S8蛋白酶。

12.如权利要求1至11所述的动物饲料添加剂，其中该动物饲料添加剂不包含表面活性剂。

13.如权利要求1至12中任一项所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂进一步包含选自以下列表的一种或多种组分，该列表由以下组成：

一种或多种配制剂；

一种或多种另外的酶；

一种或多种微生物；

一种或多种维生素；

一种或多种矿物质；

一种或多种氨基酸；

一种或多种益生元；

一种或多种植生素；

一种或多种有机酸；和

一种或多种其他饲料成分。

14.如权利要求1至13中任一项所述的动物饲料添加剂，其中该S8蛋白酶被配制为颗粒。

15.一种液体配制品，该液体配制品包含如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料添加剂以及20％至80％w/w的多元醇。

16.一种动物饲料，该动物饲料包含如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料添加剂、或如权利要求15所述的液体配制品，以及植物基材料。

17.一种改善动物的一种或多种性能参数的方法，该方法包括向一种或多种动物施用如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料添加剂、如权利要求15所述的液体配制品、或如权利要求16所述的动物饲料。

18.一种制备动物饲料的方法，该方法包括将如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料添加剂或如权利要求15所述的液体配制品与至少一种蛋白质或蛋白质源进行混合。

19.一种用于处理蛋白质的方法，该方法包括将如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料添加剂或如权利要求15所述的液体配制品添加至至少一种蛋白质或蛋白质源。

20.一种用于增加蛋白质的消化率和/或溶解度的方法，该方法包括将如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料添加剂或如权利要求15所述的液体配制品与至少一种蛋白质或蛋白质源进行混合。

21.一种用于改善动物饲料的营养价值的方法，该方法包括将如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料添加剂或如权利要求15所述的液体配制品添加至该饲料中。

22.如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料添加剂或如权利要求15所述的液体配制品在以下方面的用途：

在用于在动物饲料中使用的组合物的制备中；

用于改善动物饲料的营养价值；

用于增加动物饲料中的可消化和/或可溶性蛋白质；

用于增加动物饮食中的蛋白质的水解程度；

用于改善动物中的一个或多个性能参数；和/或

用于处理蛋白质。

23.一种生产多肽的方法，该方法包括以下步骤：

(a)培养重组芽孢杆菌属宿主细胞，该重组芽孢杆菌属宿主细胞包含编码如在权利要求1至11中的任一项中所定义的多肽的外源多核苷酸，其中表达该多核苷酸和生产该多肽；和，任选地

(b)回收该多肽。