JP2002541799A - Ｐｃｒによるクローニング方法 - Google Patents

Ｐｃｒによるクローニング方法

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グリマルディ，ジェイ．，クリストファー
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イー，ソジィー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、標的遺伝子をクローニングするためのＰＣＲによる方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、組換えＤＮＡライブラリーから標的遺伝子を濃縮し単離する方法に
関する。
【０００２】 （発明の背景） (ｃＤＮＡ及びゲノムを含む)組換えＤＮＡライブラリーは、それぞれが異なる
外来ＤＮＡセグメントを含んでいる多数の組換えＤＮＡクローンからなる。組換
えｃＤＮＡライブラリーが細胞中の各ｍＲＮＡの少なくとも１つの複製を確実に
含むようにするためには、一般に約５０００００から１００００００の独立した
ｃＤＮＡクローンを含ませる必要がある。Current Protocols in Molecular Bio
logy, Ausubel等編, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience,
New York, 1991, Vol.1, Unit 5.8.1.。同様に、約７０００００のクローンをベ
ースとするゲノムライブラリーが哺乳動物ＤＮＡの完全なライブラリーを得るた
めに必要である。Ausubel等, 上掲, Unit5.7.1.。任意の特定のライブラリーに
おける異なる遺伝子の頻度は変化するが、殆どの遺伝子は約１０３から１０６分
の１の頻度で存在する。特に希少なｍＲＮＡは１０６のクローンの内の単一のク
ローンにより表されるが、大部分の遺伝子は１０４から１０５分の１のクローン
頻度で存在するであろう。 このような膨大な数の全クローンから任意の所望の組換えＤＮＡクローンを同
定し、単離することは、容易な仕事ではない。過去２５年にわたって、いくつか
のクローニング法が開発されている。殆どの場合、所望のクローンは、核酸プロ
ーブ、リガンド又は抗体を用いてＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること
により同定される。通常、ライブラリーは宿主細胞に導入され、蒔かれ、ニトロ
セルロースフィルターにコロニーを移し、３２Ｐ標識プローブにハイブリダイズ
されるか、抗体に結合させられる。このようなフィルターハイブリダイゼーショ
ン法(Sambrook等, 1989,下記を参照)は濃縮工程を含まない。特定の遺伝子をク
ローニングするためには、しばしば百万ものクローンをスクリーニングしなけれ
ばならない。また、サブトラクティブハイブリダイゼーション技術は標的ＤＮＡ
を単離するためにも使用される。この技術では、双方の集団に存在する核酸分子
を表す第２の集団に存在する核酸分子に相補的であるｃＤＮＡ分子を「サブトラ
クションする」ために、第１の細胞集団からつくられたｃＤＮＡ分子を第２の細
胞集団のｃＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、よって対象の集団に独特の
分子のみを残す。
【０００３】 逆ポリメラーゼ連鎖反応(ＩＰＣＲ)が記載されておいる。Ochman等, Genetic
applications of an inverse PCR reaction, Genetics 120：621(1988)を参照さ
れたい。ＩＰＣＲでは、プライマーが一般的なＰＣＲにおける通常の方向とは逆
の方向に向けられる。すなわち２つのプライマーは互いに離れる方向に伸長して
いる。逆ＰＣＲは、転移因子に直接隣接する特徴付けられていない配列を増幅さ
せるために元々は使用されていた。逆ＰＣＲは、標的遺伝子を単離するために使
用されていた；しかしながら、従来の逆ＰＣＲプロトコールでは標的遺伝子の選
択と濃縮はなく、高バックグラウンドのコロニーが得られていた。 Li等は米国特許第5,500,356号及び同第5,789,166号において、核酸ライブラリ
ーから所望の標的核酸を単離する方法を記載しており、それは、ビオチン標識プ
ローブの使用と、ライブラリーの親鋳型核酸を除去するための酵素的修復切断を
含む。この方法には、一本鎖核酸ライブラリー(Ｍ１３ファージミドライブラリ
ー)が必要である。ライブラリーが二重鎖プラスミドからなる場合は、一本鎖を
最初に調製しておかなければならない。ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブ
は一本鎖分子内で標的配列にハイブリダイズされる。次にこのハイブリダイズさ
れた複合体をアビジン被覆ビーズに捕獲し、ハイブリダイズ分子を変性させてビ
ーズからライブラリーを回収する。この選択により所望されない一本鎖ファージ
ミドＤＮＡが除去される。このクローニング法は選択工程の前の標的遺伝子の増
幅を含まない。回収した一本鎖ＤＮＡをｄＮＴＰ(ｄＵＴＰは不含)の存在下でｄ
ｓＤＮＡに転換し、次いでｄＵＴＰを含む残りのｓｓＤＮＡを消化する酵素Ｈｈ
ａＩで混合物を消化する。所望の分子の形質転換と単離が続く。
【０００４】 点突然変異のような所望の突然変異、欠失又は挿入をつくりだすために、ＰＣ
Ｒによる部位特異的変異誘発法が使用される。Bauer等, 米国特許第5,789,166号
の部位特異的変異誘発法では、ＰＣＲ増幅のための出発ＤＮＡ鋳型は、典型的に
は、変異させる対象の一挿入物を全てが含むプラスミドの同種集団である。この
ようなＰＣＲ反応のための双方のオリゴヌクレオチドプライマーは所望の突然変
異を含まなければならない変異原性プライマーであり；点突然変異に対しては、
これらのプライマーは、プライマーの伸長時に標的遺伝子が所望の変異を生じる
鋳型に対して少なくとも１つの不適性塩基を含むように構築される。点突然変異
に対しては、プライマーは重複している。すなわち、プラスミドの反対鎖におい
て同じ配列をアニールする必要がある。欠失突然変異誘発に対しては、プライマ
ーはプライマー対の５'末端間に間隙が生じるように構築される。よって、プラ
イマー伸長の産物は欠失される配列に対応する標的遺伝子の配列に間隙を有する
。所望の突然変異を含む変異プラスミドが選択され、コンピテント細菌に形質転
換される。 上述の検討から、用途が広く、実施が簡単で、労力が少なく、高スループット
をもたらすことができ、経済的であるクローニング法が必要とされていることは
明らかである。本発明は従来のクローニング法の限界を克服し、以下の詳細な記
載から明らかになるさらなる利点をもたらすものである。
【０００５】 （発明の概要） 本発明は： (ｉ)鋳型分子として、メチル化された環状核酸分子の異種集団を有する組換え
核酸ライブラリーを用意し； (ｉｉ)環状核酸分子の相補鎖に対し、第１及び第２プライマーをアニールして
アニール混合物を作製し、ここで、 ２つのプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応中、互いに反対方向、５'ないし
３'方向に伸長し； ２つのプライマーの５'末端は互いに隣接しており；さらに ここで各プライマーは、対象の核酸分子の対応する配列に対して同一であり； (ｉｉｉ)アニール混合物にポリメラーゼ連鎖反応を施し、これにより直線状単
位複製配列を含有する増幅した混合物を作製し； (ｉｖ)メチル化ＤＮＡを選択的に切断する酵素を用いて増幅された混合物を消
化し、これにより鋳型分子を除去して対象の核酸分子を濃縮し；さらに (ｖ)対象の核酸分子を単離する； ことを含む、遺伝子核酸分子の混合物から対象の核酸分子を増幅し単離するため
の方法を提供する。 一実施態様では、第１及び第２プライマーは５'末端がホスホリル化されて提
供されている。この実施態様では、本方法は、ＰＣＲ工程の後であるが切断工程
前に連結工程を含んでおり、直線状単位複製配列を連結して環状レプリコンを作
製する。あるいは、切断工程の後に、核酸ライブラリーのクローニングベクター
のサイズよりも大きな単位複製配列を例えばゲル精製により単離し、単離した単
位複製配列を連結する。
【０００６】 好ましい実施態様では、増幅した混合物の消化に使用される酵素は、制限エン
ドヌクレアーゼである。特定の実施態様では、制限エンドヌクレアーゼはＤｐｎ
Ｉである。 複数の組換え核酸ライブラリーを、ポリメラーゼ連鎖反応のために混合して単
一反応混合物とすることができる。加えて、複数の対象の核酸分子を、混合ライ
ブラリー溶液の一定分量を９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルにアプ
ライし、マイクロタイタープレートにおいてポリメラーゼ連鎖反応を行わせるこ
とにより、同時にクローニングすることができる。 一実施態様では、核酸ライブラリーはＤＮＡがメチル化されている二重鎖ＤＮ
Ａライブラリーである。好ましいＤＮＡライブラリーはヒトｃＤＮＡ又はヒトゲ
ノムＤＮＡライブラリーである。好ましくは、対象の核酸分子は５ｘ１０５を越
える頻度、より好ましくは１ｘ１０６以上の頻度でライブラリーに現れる。 上述した実施態様の方法は、切断工程後に適切な宿主細胞で環状レプリコンを
形質転換し、クローンを作製する工程をさらに含む。一実施態様では、宿主細胞
はコンピテントな細菌性宿主細胞である。次にクローンをスクリーニングし、対
象の核酸分子を含有するクローンを同定する。別の実施態様では、スクリーニン
グ工程が省略され、クローンは直接シークエンス決定される。シークエンス決定
はクローンから単離された核酸においてなされる。複数のクローンからの核酸を
シークエンス決定工程のためにプールすることができる。 本発明は： (ｉ)鋳型分子として、メチル化された環状核酸分子の異種集団を有する組換え
核酸ライブラリーを用意し； (ｉｉ)環状核酸分子の相補鎖に第１及び第２プライマーをアニールしてアニー
ル混合物を作製し、ここで、 ２つのプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応中、互いに反対方向に伸長し； ２つのプライマーの５'末端はホスホリル化して互いに隣接しており；また ここで各プライマーは、対象の核酸分子の対応する配列と配列が同一であり； (ｉｉｉ)アニール混合物にポリメラーゼ連鎖反応を施し、これにより単位複製
配列を有する増幅された混合物を作製し； (ｉｖ)連結混合物において単位複製配列を連結して環状レプリコンを作製し； (ｖ)連結後、連結混合物を、メチル化核酸を選択的に切断する酵素を用いて切
断し、これにより鋳型分子を除去して対象の核酸分子を濃縮し； (ｖｉ)適切な宿主細胞でレプリコンを形質転換して、形質転換したクローンを
作製し；さらに (ｖｉｉ)対象の核酸分子を単離する； ことを含んでなる、組換え核酸ライブラリーから対象の核酸を増幅し単離する方
法を提供する。 上述した方法の一実施態様では、スクリーニング工程が、形質転換したクロー
ンをスクリーニングして、対象の核酸分子を含むクローンを同定するために提供
される。上述した実施態様のいずれにおいても、５０を越えるｃＤＮＡライブラ
リーがポリメラーゼ連鎖反応のために単一混合物として提供され得る。
【０００７】 （発明の詳細な記載） Ａ．定義 「単位複製配列」は反応に使用されるプライマー対の２つのプライマーから伸
長されるポリメラーゼ連鎖反応産物である。 「レプリコン」は適切な宿主細胞で複製可能な核酸分子である。一般に、レプ
リコンは適合性のある宿主細胞での複製のための複製開始点を有している。 対象の核酸分子はクローン分子のライブラリー又は混合物から単離される。ク
ローンは一本鎖又は二重鎖のいずれかであってよいＤＮＡ又はＲＮＡ又は混合ポ
リマー分子を含む。典型的には、クローンライブラリーは、組換えＤＮＡ法を使
用して調製されるプラスミド又は他のベクター(例えばウイルス性ベクター)を含
んでおり、すなわち組換え核酸ライブラリーは、株化細胞の細胞、又は一次細胞
又は組織等の核酸源から誘導されるＤＮＡ又はＲＮＡの断片を含む。細胞は原核
生物又は真核生物細胞(動物、ヒト、酵母及び高等植物を含む)であってよい。核
酸ライブラリーは同種のクローン集団を含む。好ましい実施態様では、対象の核
酸分子はオープンリーディングフレームを含む遺伝子であり、５'及び／又は３'
非翻訳領域(UT)をさらに含み得る。実施例において「標的遺伝子」又は「対象の
遺伝子」なる用語が使用される場合、それは「対象の核酸分子」も包含すると理
解される。 特に示さない限りは、「ＤＮＡ」なる用語は、細菌、植物細胞、及び哺乳動物
細胞、好ましくは高等霊長類の細胞、例えばサル又はヒト、最も好ましくはヒト
の細胞を含む任意の供給源から調製されるゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを集合的に
指すために使用される。 「組換えＤＮＡライブラリー」なる語句はゲノム及びｃＤＮＡライブラリーを
集合的に指すために使用される。好ましくは、「組換えＤＮＡライブラリー」は
、特定の細胞又は組織源からの全てのゲノム又はｃＤＮＡ配列を実質的に完全に
表わすものを含む。 ゲノムＤＮＡライブラリーに対して、任意に与えられた遺伝子の「頻度」は、
ゲノムに存在する塩基対(ｂｐ)の全数に対する、与えられた長さの特定の遺伝子
断片の比である。例えば、ゲノムが３ｘ１０９の塩基対からなる場合、特定の対
象の３０００ｂｐの遺伝子は１０６分の１の頻度で存在する。ｃＤＮＡライブラ
リーにおける特定のｃＤＮＡの「頻度」は、ＲＮＡを含む全ポリ(Ａ)に対するそ
のｍＲＮＡの比により表される。この比は、通常、ｃＤＮＡｇへのｍＲＮＡの複
製プロセスによる影響を受けない。
【０００８】 ここで用いられる場合の「ポリメラーゼ連鎖反応」、すなわち「ＰＣＲ」の方
法は、一般に核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの特定片の微小量を、1987年7月28
日に発行された米国特許第4,683,195号に記載したように増幅する手順を意味す
るものである。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを構築できるような、対
象の領域又はこれを越えた領域からのいくつかの配列情報が利用できることが必
要であり；これらのプライマーは増幅される鋳型における反対のストランドと配
列が同一か類似している。一般に、ＰＣＲ法は、増幅されるヌクレオチド配列を
含む鋳型核酸に優先的にハイブリダイズ可能な２つのプライマーを使用する、プ
ライマー伸長合成の反復サイクルを含む。鋳型核酸がＤＮＡである場合、増幅さ
れるＤＮＡは試料を加熱することにより変性される。ＤＮＡポリメラーゼ及び過
度のデオキシヌクレオチドトリホスフェートの存在下で、標的配列に特異的にア
ニールするオリゴヌクレオチドが新規のＤＮＡ合成を開始させる。ＰＣＲにより
、個々の単位複製配列がプライマー伸長のサイクル数に対して指数的に量が増加
する「増幅された混合物」が産生される。ＰＣＲは特定のＲＮＡ配列、全ゲノム
ＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列、及び全細胞ＲＮＡ、バクテリオファージ又はプ
ラスミド配列から転写されたｃＤＮＡ等を増幅するのに使用できる。一般には、
Mullis等, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51：263(1987)；Erlich編
, PCR Technology,(Stockton Press, NY, 1989)；Wang & Mark, in PCR Protoco
ls, pp.70-75(Academic Press, 1990)；Scharf, in PCR Protocols, pp.84-98；
Kawasaki & Wang, in PCR Technology, pp.89-97(Stockton Press, 1989)を参照
されたい。 ここで用いられる「プライマー」は、ポリメラーゼにより触媒される鋳型依存
性重合反応中にヌクレオチドモノマーの共有付加により伸長可能な一本鎖オリゴ
ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に少なくとも１５
ヌクレオチド長、好ましくは約２５から約４５塩基、より好ましくは約２５から
３５ヌクレオチド、さらに好ましくは２０−２４ヌクレオチドである。 一対のオリゴヌクレオチドプライマーが逆ＰＣＲ工程で使用される。対となっ
た２つのプライマーは、それらが重複しないか、その間に任意の間隙を有すると
いう意味で互いに「隣接」している。「隣接」するプライマーは図３(左側及び
右側プライマーを参照されたい)に例示している。ここで用いられる場合、プラ
イマーを記述するのに使用される場合の正方向及び逆方向とは、標的配列に対し
てプライマーの３'末端が指している方向を意味する。ここで用いられる場合、
「正方向」プライマーは遺伝子の３'末端に向けて下流方向へ伸長する。逆方向
プライマーはプライマー伸長中に正方向プライマーとは反対の方向に伸長する。
例示として、任意に番号が付された塩基１−３２の核酸分子断片がプライマー対
の構築のための鋳型となり、５'から３'への左側プライマーが１６から１までの
上方ストランドのヌクレオチドと同一であると仮定すると、右側プライマーは下
方ストランドのヌクレオチド１７−３２と同一である。このようにして、プライ
マーは、鋳型配列の伸展に対して重複せず、間隙も持たない。 ２つの配列は、それらが互いにハイブリダイズ可能で、安定した逆平行の二重
鎖核酸構造を形成するならば、互いに「相補的」である。 「連結」反応においては、リガーゼ酵素が、２つの核酸断片の並列した５'ホ
スフェート及び３'ヒドロキシル末端間のホスホジエステル結合の形成を触媒す
る。核酸断片を互いに連結させるためには、それらの末端は適合性でなければな
らない。ある場合には、末端はエンドヌクレアーゼによる消化後に直接適合性に
なる。しかし、エンドヌクレアーゼ消化後に一般的に生じるねじれ型末端を平滑
末端にまず転換してそれらを連結に適合するものとする必要がある。末端の平滑
化には、ＤＮＡを、４つのデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートの存在下
でＤＮＡポリメラーゼＩ又はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を用いて
適切なバッファー中で処理する。次にＤＮＡを、例えばフェノール-クロロホル
ム抽出及びエタノール沈降により精製する。互いに連結されるＤＮＡ断片をほぼ
等モル量の溶液に混合する。溶液は、リガーゼバッファー、及びリガーゼ、例え
ばＴ４ ＤＮＡリガーゼをＤＮＡ０．５μｇ当たり約１０単位含む。ＤＮＡがベ
クターに連結される場合、ベクターはまず適切な制限エンドヌクレアーゼ(類)を
用いて消化することにより直線化される。次に直線化された断片を細菌性アルカ
リホスファターゼ又は子ウシ腸ホスファターゼで処理し、連結工程中の自己連結
を防止する。
【０００９】 「濃縮する」又は「濃縮」という用語は、濃縮工程を適用前の同一の組換え核
酸ライブラリーにおける特定の核酸分子の頻度よりも、本発明の濃縮工程(ここ
では選択とも称される)の適用後の組換え核酸ライブラリーにおける特定の核酸
分子の発生頻度、例えば組換えｃＤＮＡライブラリーにおける特定のｃＤＮＡの
発生頻度が増加していることを示すために使用される。従って、濃縮度合い(濃
縮倍数)は、濃縮方法の適用前のライブラリーにおける特定のｃＤＮＡ又は対応
するゲノムＤＮＡの頻度に対する、本発明の濃縮方法の適用後の組換えＤＮＡラ
イブラリーにおける特定のｃＤＮＡの発生頻度の比として表される。 「形質転換」とは、染色体構成要素または染色体外エレメントとしてＤＮＡを
複製可能とするように宿主細胞中にＤＮＡを導入することを意味する。形質転換
は、通常、エレクトロポレーション(Miller等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85
, 856-860(1988))、ＣａＣｌ２トランスフェクション(Mandel及びHiga, J. Mol.
Biol. 53, 159-162(1970)、Shigekawa及びDower, BioTechnique 6, 742-751(19
88))、ＤＥＡＥ-デキストラン法(真核生物細胞, Lopata等, Nucleic Acids Res.
12, 5707(1984))、及びリボソーム媒介性トランスフェクション(Felgner等, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417(1987))により行われる。他に規定し
ないならば、ここで大腸菌の形質転換のために使用される方法はエレクトロポレ
ーションである。 「形質転換体」、「形質転換した宿主細胞」及び「形質転換された」という用
語は、細胞内へのＤＮＡの導入を意味する。その細胞は「宿主細胞」と呼ばれ、
原核生物又は真核生物細胞でありうる。典型的な原核生物宿主細胞には、種々の
株の大腸菌（E. coli.）が含まれる。典型的な真核生物宿主細胞は哺乳動物、例
えばチャイニーズハムスターの卵巣細胞、又はヒト胚腎臓２９３細胞である。導
入されるＤＮＡ配列は宿主細胞と同じ種、あるいは宿主細胞とは異なる種からの
ものであってよく、もしくは外来性及びいくつかの相同的ＤＮＡを含むハイブリ
ッドＤＮＡ配列であってもよい。 「プレート」なる用語は、分離した細菌コロニー又はプラークを成長させるた
めに使用される、固形培地で満たされたペトリ皿又は９６-ウェルマイクロタイ
ター皿を指すために使用される。「プレーティング」又は「プレーティングアウ
ト」なる用語は、コロニー又はプラークが形成されるようにプレートに細菌又は
ファージを置くことを意味する。 本発明において、「細胞」、「株化細胞」及び「細胞培養物」なる表現は相互
に交換可能に用いられ、その全ての標記は子孫を含む。また、全ての子孫は、意
図的なあるいは意図しない突然変異の影響で、正確には同一のＤＮＡ内容を有す
るわけではないことも理解される。最初に形質転換された細胞についてスクリー
ニングしたものと同じ機能又は生物学的性質を有する変異体子孫が含まれる。
【００１０】 Ｂ．好適な実施態様 本発明は全長逆ＰＣＲ(「ＦＬＩＰ」)と称し、またこの方法が長い遺伝子を単
離することができることから、ここでは逆ロングＰＣＲとも称するクローニング
及び選択方法を提供する。ＦＬＩＰは、核酸ライブラリーをメチル化する宿主細
胞中で増殖した任意の核酸ライブラリーから、特定の核酸分子の全クローン、ベ
クター及び挿入物を単離するための高速で高スループットの方法である。ＦＬＩ
Ｐクローニング法は標的遺伝子又はヌクレオチド配列を増幅し、高度に精製され
た標的遺伝子の集団を産生する。 従来のクローニング法に対してＦＬＩＰ法にはいくつかの利点がある。ＦＬＩ
Ｐ法は、標準的な分子生物学的技術、ＰＣＲ、連結、消化、及びＤＮＡハイブリ
ダイゼーション手順を使用して実施が容易で、最終的に単一遺伝子を表すクロー
ン集団を産出する。ＦＬＩＰ法は用途が広く、高スループットであり、経済的で
ある。ＦＬＩＰにより新規ならびに既知の遺伝子のクローニングが可能であり；
これは、クローニングのためには全長遺伝子が知られていることを必要とする標
準的なＰＣＲクローニング法及びＴ／Ａクローニング法と対照的である。ライブ
ラリーアレイクローニング技術、例えばＨＵＣＬ(ヒト普遍的ｃＤＮＡライブラ
リー；Stratagene、カタログ#937811 & 937820、ＨＵＣＬアライＩ膜)クローニ
ングシステムは、ＦＬＩＰに比べて高価であり、及び／又は労力がかかり、高ス
ループットの利用にはならない。ＦＬＩＰ法を使用すると、９６又はそれ以上の
多くの別の標的遺伝子を、単一のＦＬＩＰ手順で数日のうちに同時に増幅しクロ
ーニングすることができる。ＦＬＩＰに独特の利点は、いくつかのｃＤＮＡライ
ブラリーを一緒に混合し、一回のＦＬＩＰ-ＩＰＣＲ反応で効果的にスクリーニ
ングすることができることである。現在まで、我々は５６の別個のｃＤＮＡライ
ブラリーを一つの混合物に混合し、このライブラリー混合物を常套的にスクリー
ニングして特定の遺伝子を単離することに成功した。この５６のライブラリーの
混合物により、数億の異なるｃＤＮＡクローンのクローン複雑性を有するライブ
ラリーが作製される。他の利点は、ＦＬＩＰ手順が一本鎖ｃＤＮＡライブラリー
を必要とする他の方法の代わりに、二重鎖ｃＤＮＡライブラリーを使用すること
ができることである。一本鎖ライブラリーは典型的にあまり複雑ではなく、二重
鎖対応物よりも挿入サイズが短く、つくるのがより困難である。今までのところ
、ＦＬＩＰ法を使用してクローニングすることができる核酸分子の長さは、ライ
ブラリー自体のＤＮＡ分子のサイズによってのみ制約される。ＦＬＩＰは希少な
遺伝子の増幅も可能とする。ある特定のライブラリーにおける異なる遺伝子の頻
度は変化するが、殆どの遺伝子は約１０３から１０６分の１の頻度で存在するで
あろう。特に希少なｍＲＮＡは約５ｘ１０５又はそれ以上のクローンの単一のＤ
ＮＡにより表される一方、遺伝子の大部分は１０４から１０５分の１のクローン
頻度で存在するであろう。好ましい実施態様では、ＦＬＩＰは逆ＰＣＲ工程にお
いて非ホスホリル化プライマーの代わりに５'ホスホリル化プライマーが使用さ
れ、単位複製配列を自己連結させ、環状分子を産生することが可能になる。５'
ホスホリル化プライマーの使用のためと、標的遺伝子がベクター配列と共に増幅
されるという事実から、直線状単位複製配列の末端における単一連結事象は、宿
主細胞において増殖され、さらに増幅されうるレプリコンの再生に十分である。
より有利には、選択工程により、ＦＬＩＰは、典型的には、多大な背景（バック
グラウンド）クローン中に陽性クローンを産生する代わりに、標的遺伝子を高い
純度まで増幅される。ＦＬＩＰ法のこれら及び他の利点は、以下の手順の説明に
より明らかになるであろう。
【００１１】 一実施態様では、ＦＬＩＰ法は次の工程： (ｉ)核酸ライブラリー又はライブラリーの混合物からの対象の核酸及びベクター
配列を含む全プラスミドを増幅するための逆ＰＣＲ； (ｉｉ)単位複製配列を環化するための連結； (ｉｉｉ)ライブラリーの親鋳型プラスミドを除去するための酵素消化； (ｉｖ)結果として得られた増幅プラスミドを増幅するための宿主細胞中での形質
転換； (ｖ)標的遺伝子を有するクローンを単離するための形質転換体のスクリーニング
；及び (ｖｉ)標的遺伝子を同定するためのシークエンス決定； を含む。 ある工程は異なる順序で行ってもよく、またある工程は任意であると理解され
る。例えば、ＦＬＩＰの本実施態様においては酵素による切断の前の連結の上記
の順序は好ましいが、単位複製配列を連結工程の前でＤｐｎＩで処理することも
できる。他の実施態様では、形質転換後のスクリーニング工程は省略することも
できる。ＦＬＩＰは高度に精製された標的遺伝子集団を産生可能であるため、制
限消化選択後に残存するプラスミドを形質転換し、形質転換した細菌の全集団か
らプラスミドＤＮＡを調製し、遺伝子特異的プライマーを使用してプラスミドＤ
ＮＡを直接シークエンス決定することにより、直接ＦＬＩＰ反応産物のシークエ
ンス決定をすることができる。ＦＬＩＰ反応産物を直接シークエンス決定するた
めには、ＦＬＩＰ反応生成物中の標的遺伝子の濃度は、好ましくは、ＦＬＩＰ反
応産物混合物中の全遺伝子の少なくとも２０％である。ＦＬＩＰ反応産物中の標
的遺伝子の濃度が全遺伝子の２０％以下であるならば、混合物は、遺伝子特異的
プライマーとベクタープライマーを使用して標的遺伝子をまずＰＣＲ増幅し、つ
いで単位複製配列をシークエンス決定することにより、なおシークエンス決定す
ることができる。ＦＬＩＰ反応の複合混合物のシークエンス決定により、いくつ
かの精製クローンを単離する必要なく、新規の遺伝子を迅速に決定することが可
能になる。
【００１２】 別の実施態様では、逆ＰＣＲ工程の次に、ＰＣＲ混合物を、酵素、典型的には
制限酵素で処理して鋳型プラスミドを消化排除し、次にライブラリークローニン
グベクターのサイズよりも大きいＰＣＲ増幅産物をゲル精製する。ついで、ゲル
精製された断片を自己連結させ、コンピテントな細菌細胞中で形質転換させる。
次にコロニーを標的遺伝子についてスクリーニングし、陽性クローンから調製さ
れるプラスミドをシークエンス決定する。 ＦＬＩＰ法の工程を以下にさらに詳細に説明する。 (ｉ)逆ＰＣＲ工程 逆ＰＣＲ増幅のための出発材料はメチル化された環状核酸であり、その供給源
は一又は複数の核酸ライブラリーとすることができる。ライブラリーはインビボ
又はインビトロでメチル化することができる。ＤＮＡライブラリーはｃＤＮＡ又
はゲノムＤＮＡライブラリーであってよい。プラスミド、コスミド、及びファー
ジミドｃＤＮＡライブラリー、又はゲノムライブラリーの構築は記載されており
、例えばSambrook, J.等, In：Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)
が参照される。通常、標的遺伝子又は対象配列はｃＤＮＡライブラリーから増幅
される。ライブラリーのＤＮＡ断片が挿入されるベクターは、典型的には、適切
な宿主細胞中での複製を可能にする複製開始点と、さらには少なくとも１つの選
択可能マーカーを含む。例えば、大腸菌中での複製用のベクターはＣｏｌ Ｅ１
複製開始点と、選択可能マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子を含みうる。ま
た、β-ガラクトシダーゼ遺伝子を、付加的な選択可能マーカーとして含んでも
よい。 標的遺伝子をどのライブラリーが含むかを予め決定するために、最初に個々の
ライブラリーをスクリーニングし、ついで、ＦＬＩＰでの増幅用にそのライブラ
リーを選択する工程を排除するために、ｃＤＮＡライブラリーの混合物に対して
逆ＰＣＲを行うことができる。これにより時間と労力が節約される。ＦＬＩＰ法
を使用して、一つの混合物とされた、８、１０、１５及び５６の別個のｃＤＮＡ
ライブラリーから標的遺伝子を増幅し単離することに成功した。一回の反応でス
クリーニングすることができるライブラリーの数に明らかな制限はない。例えば
、９６の異なる遺伝子をマイクロタイタープレート上での単一のＰＣＲ反応によ
りスクリーニングすることができ、ここで、９６ウェルマイクロタイタープレー
トの各ウェルが１５のライブラリー混合物を含む。対象の核酸分子を、４０を越
える、好ましくは５０を越える、より好ましくは６０を越えるライブラリーを含
む単一の混合物から増幅することができる。単一の混合物に混合される異なる組
織及び株化細胞から調製される５６ｃＤＮＡライブラリーにより、数億の異なる
ｃＤＮＡクローンのクローン複雑性を有するライブラリーが作製される。いくつ
かの特異的遺伝子は５６ライブラリー混合物から単離され、そのうちのいくつか
は、常套的な方法では単離に成功しなかったものである。ＦＬＩＰでは、標的遺
伝子及びベクター配列を含む全プラスミドが逆ＰＣＲにより増幅される。 それぞれの対象の標的遺伝子又は核酸に対して、一対の合成オリゴヌクレオチ
ドプライマーがＩＰＣＲ工程において必要となる。プライマーは、単離される標
的遺伝子の既知の配列の伸展の反対のストランドに対してそれぞれ相補的である
。既知の配列は対象の潜在的核酸分子のインジケーターである任意の配列であり
得；既知の遺伝子の高度に保存された領域又はドメインに対して相同性を示して
もよい。ゲノムＤＮＡに対しては、エクソンを探し、断片を同定して、プライマ
ーを作製するかもしれない。既知の配列は、通常、約３００−６００塩基である
ＥＳＴ(発現配列タグ)であってもよい。ＦＬＩＰの目的に対しては、既知の配列
の短い領域、例えば約３０ｂｐが、十分である。ＦＬＩＰ逆ＰＣＲ用のプライマ
ーは標的遺伝子の配列の対応の伸展と配列が同一であり；プライマー配列は、部
位特異的変異誘発プロトコールにおいて不適正ヌクレオチドを故意に組み込む変
異誘発性オリゴヌクレオチドと異なり、鋳型にミスマッチではない。逆ＰＣＲ用
のオリゴヌクレオチドプライマーの対は、プライマーが互いに隣接し、各プライ
マーの５'から３'方向が互いに反対方向に伸長するように構築される。プライマ
ーは重複せず、同じ長さを有する必要はない。
【００１３】 ＩＰＣＲ反応混合物に加えられるプライマーは、必ずではないが、好ましくは
５’末端がホスホリル化されていて、レプリコンを産出するために直線状単位複
製配列の自己連結を可能にする。プライマーが当初からホスホリル化されていな
い場合、単位複製配列ストランドの５'末端は連結前にインビトロでキナーゼを
用いてホスホリル化されうる。オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に少なく
とも１５ヌクレオチド長、好ましくは約２５から約４５塩基、より好ましくは約
２５から３５ヌクレオチド、さらに好ましくは２０−２４ヌクレオチドである。
使用されるＰＣＲプライマーの量は、多くは１０倍と、大きく変動しうる。通常
は、プライマーは約１μＭの最終濃度で使用される(例えば、Molecular Cloning
：A Laboratory Manual, J. Sambrook等, Cold Spring Harbor Laboratory, Col
d Spring Harber, N.Y., 1989, section14.15を参照されたい)。融解温度(ｔｍ)
は変わりうる。一実施態様では、プライマーは標的配列への特異的なハイブリダ
イゼーションを至適化するために６８−７１℃のｔｍを持つ。好適な実施態様で
は、各プライマー対のプライマーは互いの１℃以内のｔｍを有する。ＰＣＲプラ
イマーの設計において考慮される他のパラメータ、例えばＧＣ量等は当該分野に
おいて教唆される通りである。オリゴヌクレオチドプライマーは既知の方法で合
成することもできるし、商業的供給源から特注して入手することもできる。 オリゴヌクレオチドプライマーを鋳型ストランドにアニールし、閉じた環状鋳
型ＤＮＡの２つのＤＮＡストランドに対応する第１及び第２のＤＮＡストランド
を指数関数的なサイクリック増幅反応において合成する。オリゴヌクレオチドプ
ライマーを適切なポリメラーゼ、好ましくは熱安定性又は好熱性ポリメラーゼを
使用して温度循環中に伸長させる。熱安定性ポリメラーゼは約５０℃から約１０
０℃の温度でヌクレオチド付加を触媒可能である。熱安定性ポリメラーゼの例は
、出典明示によりここに取り込まれる欧州特許第0258017号に記載されている。
ＦＬＩＰに有用な好熱性ＤＮＡポリメラーゼには、Ｐｆｕ(StratageneからのPfu
Turbo, La Jolla CA)、Vent(登録商標)ＤＮＡポリメラーゼ(New England BioLa
bs, Beverly, MA)、及びプラチナPfx(Life Technologies, Rockville, MD)が含
まれる。高度な複製性を有し(校正（プルーフリーディング）特性を有し)、エラ
ーの発生率が低い熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。Pfu及びVentポリメ
ラーゼは、双方とも、ポリメラーゼがヌクレオチドの誤取込みエラーを矯正可能
な複合的３'ないし５'エキソヌクレアーゼ校正活性を有する。 鋳型ストランドに対するプライマーのアニーリングのためのアニール温度は変
わりうる。好ましくは、アニール温度は６５℃−７１℃、好ましくは標的遺伝子
に対して高度な特異性を提供する６５℃である。アニール温度を６５℃より低く
すると、特異性が低減しうる。 ＰＣＲサイクルの数は変わりうる；ここでは、５、１０、１５、２０及び２３
サイクルが成功裡に使用された。２０のＰＣＲサイクルでは百万倍に増幅される
。ｃＤＮＡライブラリーによく表される一般的な遺伝子に対しては、５−１０サ
イクルが適当である。ＰＣＲ誘発性変異発生率を低く維持しつつ、おそらくは希
少な標的遺伝子を単離するのに至適なＰＣＲサイクルの数が好ましく、常套的な
方法で決定することができる。
【００１４】 ＦＬＩＰは既知の全長遺伝子の単離に有利に使用することができる。このため
には、ＩＰＣＲ工程用のプライマーは５'ＡＴＧ開始コドンの近傍に設計される
。スクリーニング工程に対しては、プローブは所望の３'末端、例えば終止コド
ンに設計することができる。これは、ＡＴＧ開始及び所望の３'末端との間の全
長配列を含む任意のクローンの単離に有利である。また、ＦＬＩＰは、使用され
るＤＮＡポリメラーゼ(例えばPfu、Pfx)が長い断片を重合することができるため
、長い遺伝子の増幅に有用である。Pfuポリメラーゼは１０ｋｂまでのプライマ
ー伸長を重合することができる一方、Pfxは１２ｋｂまでゲノム鋳型を、また１
２ｋｂまでプラスミド鋳型を明らかに増幅することができる。４．２ｋｂ長のTo
ll６遺伝子(オープンリーディングフレームプラス５'及び３'UT)及び約５．１ｋ
ｂのｐＲＫ５Ｄベクターを約９．３ｋｂの全長単位複製配列に加えたものの単離
により、ＦＬＩＰクローニング法の能力が例証される。 (ｉｉ)連結 ＰＣＲ反応により、標的遺伝子及びベクター配列を含む、直線状で二重鎖のＤ
ＮＡ単位複製配列が産生される。次に、連結反応では、この直線状の単位複製配
列を、プライマーの５'-ホスホリル化末端を使用して自己連結させ、適切な宿主
細胞中で複製可能なレプリコンを再生する。 (ｉｉｉ)酵素消化 次に、ＰＣＲ増幅産物をライブラリーの親鋳型に対して選択し、濃縮するため
に、鋳型プラスミドが感受性の選択酵素で環化単位複製配列を切断する。この選
択工程により、スクリーニングのためのクローンの背景（バックグラウンド）が
低減する。典型的には、ｃＤＮＡライブラリーはメチル化陽性細菌において増殖
される。ほとんど全ての大腸菌株から単離されるＤＮＡはdamメチル化され、よ
ってメチル化認識配列に特異的な制限エンドヌクレアーゼによる消化に感受性で
ある。また、鋳型ＤＮＡはインビトロでメチル化することもできる。よって、メ
チル化されているものを消化するが、メチル化されていないものは消化しない少
なくとも１つの制限酵素を使用して、親鋳型プラスミドを除去することができる
。好ましくは、メチル化ＤＮＡを切断する制限酵素は頻繁に使用するカッターで
あり、すなわち、６塩基認識部位より短く、好ましくは４塩基対認識部位を有す
る。一実施態様では、メチル化ＤＮＡに特異的な制限酵素はＤｐｎ Ｉである。
Ｄｐｎ Ｉは認識配列５'ＧｍＡＴＣ３'を有する４塩基カッターであり；メチル
化及びヘミメチル化ＤＮＡに特異的である。ベクターｐＲＫ５Ｄは２３Ｄｐｎ
Ｉ部位を有する。よって、Ｄｐｎ Ｉ消化が５％しか有効でなくても、酵素は全
てのメチル化鋳型ベクターを少なくとも一度は切断し、消化されたベクターによ
り細菌の形質転換ができないようにし、よって全ての形質転換した細菌が非メチ
ル化の環化された単位複製配列を提示する。他のメチル化要求性エンドヌクレア
ーゼにはＭｃｒＢＣ(NEB, Beverly, MA)が含まれる。 (ｉｖ)形質転換。制限酵素での処理後に得られるプラスミドのレプリコンを増幅
し、適切な宿主細胞、典型的にはコンピテントな細菌細胞中で増殖させることが
できる。コンピテントな細菌の形質転換は、当該分野においてよく知られている
任意の方法で行うことができ、例えば上掲のSambrook等に記載されている。形質
転換法にはリポフェクション、熱衝撃、エレクトロポレーション、リン酸カルシ
ウム共沈降、、塩化ルビジウム又はポリカチオン(例えばＤＥＡＥ-デキストラン
)媒介性トランスフェクションが含まれる。形質転換にコンピテントな細菌は商
業的に入手可能であり、これらの細胞の形質転換は製造者の使用説明書に従って
実施することができる。最適な形質転換頻度をもたらす形質転換法が好ましい。
好ましい実施態様では、形質転換はエレクトロポレーションにより行われる。形
質転換は９６ウェルフォーマットで効果的に実施することができる。
【００１５】 (ｖ)スクリーニング 典型的には、ＦＬＩＰ法は、最終的なＦＬＩＰ反応生成物中に多くの種が存在
するように標的遺伝子を増幅する。次に、形質転換体は、それが細菌である場合
、典型的にはベクター上の特異的な選択可能マーカーに応じての適切な薬物の選
択下で、寒天プレート上に蒔く。次に得られた細菌コロニーを、常套的な方法に
より標的遺伝子の存在についてスクリーニングする。コロニーは、例えばＰＣＲ
又はコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる。
(ｖｉ)スクリーニングから、陽性クローンを同定し、ＤＮＡをシークエンス決定
のためにクローンから調製する。シークエンス決定は以前に記載されている常套
的な方法、例えば上掲のSambrook等, 1989を使用して行われる。シークエンス決
定は個々の陽性クローン又はクローンのプールのＤＮＡ調製物について実施する
ことができる。
【００１６】 本発明は、本発明を例証することを意図するがその範囲を制限するものではな
い次の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。全ての文
献及び特許引用例は出典明示により明示的に取り込まれる。 Ｃ．実施例 実施例１ Toll６遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンの単離 Toll６遺伝子(Genbank受託番号AB020807)はそのオープンリディングフレーム(
ＯＲＦ)に対応する２７６０ｂｐの既知の配列を有する。本実験でＦＬＩＰ法を
使用し、ＯＲＦに加え５'及び３'UTを含むToll６遺伝子を含むｃＤＮＡクローン
を単離した。単離したToll６遺伝子の全長は４．２ｋｂであり；使用したベクタ
ーｐＲＫ５Ｄは５．１ｋｂで、よって加えて全長が９．３ｋｂのＤＮＡ分子をＩ
ＰＣＲにより増幅し、単離した。 Toll６遺伝子を次のようにしてＦＬＩＰを使用してクローニングした。２つの
隣接する５'ホスホリル化プライマー、128185.snr1と128185.snf1を、それぞれ
６９．３℃及び６９．８℃の融解温度を有する反対のストランドに設計した。こ
れらのプライマーを逆ＰＣＲ反応で使用した。ＰＣＲプライマー配列は次の通り
であった： 128185.snr1(配列番号：１)＞pGCTATCCTAAAGGGTTGTTCTTCTTCAGAGCAT及び128185.
snf1(配列番号：２)＞pCACTGCAACATCATGACCAAAGACAAAGA ５０ｕｌの反応物に次の試薬を添加した：メチル化陽性細菌中で増殖させたベク
ターｐＲＫ５Ｄ中の骨髄ｃＤＮＡライブラリーを５０ｎｇ：各ＰＣＲプライマー
を５０ピコモル；各デオキシヌクレオチドトリホスフェートを１０ｎモル、Pfu
10xバッファー(Stratagene, La Jolla CA)を５ｕｌ、及びPfu Turbo(Stratagene
, La Jolla CA)を１ｕｌ。プラスミドベクターｐＲＫ５(4661bp)は記載されてお
り(1989年3月15日に公開された欧州特許第307,247号)；ｐＲＫ５Ｄ(5117bp)はｐ
ＲＫ５の誘導体である。 ＰＣＲサイクル条件は９４℃３分間で１サイクル、次に９４℃３０秒、６５℃
３０秒、７２℃１３分で２０サイクルであった。ＰＣＲ反応によりToll６ｃＤＮ
Ａ挿入物及びｐＲＫ５Ｄベクターを含む直線状５'ホスホリル化単位複製配列を
産生した。 次に、１０ｕｌの完了したＰＣＲ反応物を、次の他の試薬：１０ｕｌの10xT4
ＤＮＡリガーゼバッファー(New England BioLads, Beverly, MA)、４ｕｌのT4Ｄ
ＮＡリガーゼ(New England BioLads, Beverly, MA)、７６ｕｌのＨ２Ｏを含む１
００ｕｌの反応物中で連結した。連結物を、ベンチトップにて周囲温度で１時間
、インキュベートした。 連結１時間後、２ｕｌの制限酵素Ｄｐｎ Ｉ(New England BioLads, Beverly,
MA)を連結反応物に添加し、３７℃で１時間、消化し続けた。Ｄｐｎ Ｉは特にメ
チル化ＤＮＡを消化し、メチル化していないＤＮＡは消化せず；よって鋳型とし
て使用した元の骨髄ｃＤＮＡライブラリーは消化され、Toll６／ベクター単位複
製配列のみを無傷のまま残した。消化の完了後、QIAクイックＰＣＲ精製キット(
Qiagen, Valencia, CA)を使用して試料を洗浄し、３０ｕｌの溶出用バッファー
又はＨ２Ｏで溶出し、次にエタノール沈降を行った。ペレットを２ｕｌのＨ２Ｏ
に再懸濁し、ついで全試料を細菌の形質転換に使用した。
【００１７】 形質転換をＤＨ１０Ｂエレクトロマックスコンピテント細菌(Life Technologi
es, Rockville, MD)におけるエレクトロポレーションにより行った。形質転換し
た細菌をルリアブイヨン寒天プレートに蒔き、３７℃で一晩コロニーを成長させ
た。 次の日、コロニーをナイロン膜に移し、変性させ、復元し、３２Ｐ-ＡＴＰキ
ナーゼ標識Toll６特異性プローブでプローブした。Toll６特異性プローブの配列
は以下の通りである。 128185.p1(配列番号：３)＞GTTAGCCTGCCAGTTAGAGACAGCCCA 陽性クローンをシークエンス決定し、配列がＰＣＲ反応により導入された点突然
変異を含まないことを確認した。 異なる長さと塩基組成の他の既知の遺伝子を、この実施例に記載したような手
順に従ってクローニングした。これらの遺伝子を表１に示したGenbank受託番号
により同定した。 表２には、単一のＩＰＣＲ混合物における８つの異なるライブラリーの混合物
又は単一のライブラリーからの２２の新規な(知られていない)標的遺伝子を単離
するためにＦＬＩＰを使用した結果を示している。新規の遺伝子はＤＮＡ番号に
より同定している。表２では、標的配列のプロービングで陽性の全培養クローン
のパーセントと、探索している遺伝子の単離の全成功率を比較している。ＣＦＵ
は蒔いたときの細菌性コロニー形成単位である。ＦＬＩＰ(混合)は８つの混合ラ
イブラリーで行われたＦＬＩＰを意味する。
【００１８】
【００１９】 実施例２ ヒトＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンの単離 図３に示すIncyteクローン509 1511H(配列番号：４)のＤＮＡ配列(Incyte Pha
rmaceuticals LIFESEQＴＭdatabase)に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、
ＰＣＲにより、対象の配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定した。これらのオ
リゴヌクレオチドは次の通りであった： 正方向プライマー： 5'GAGGGGGCTGGGTGAGATGTG3' (509-1)(配列番号：５) 逆方向プライマー： 5'TGCTTTTGTACCTGCCAGGAGG3' (509-4AS)(配列番号：６)
【００２０】 ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの全長コード化配列を単離するために、ＦＬＩ
Ｐ手順(逆ロングＰＣＲとも称する)を実施した(図２を参照)。ＰＣＲプライマー
は一般に２０から３０ヌクレオチドの範囲であった。逆ロングＰＣＲに対して、
プライマー対を、各プライマーの５'から３'方向が互いに離れる方向に向くよう
に設計した。 ＤＮＡ９８８５３をクローニングするために一対の逆ロングＰＣＲプライマー
を合成した： プライマー１(左側プライマー)： 5'pCATGGTGGGAAGGCCGGTAACG3' (509-P5)(配列番号：７) プライマー２(右側プライマー)： 5'pGATTGCCAAGAAAATGAGTACTGGGACC3' (509-P6)(配列番号：８) 逆ロングＰＣＲ反応では、鋳型はプラスミドｃＤＮＡライブラリーである。そ
の結果、ＰＣＲ産物は、その中央部に、両端に対象の挿入配列を有する全ベクタ
ー配列を含む。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ混合物を、鋳型プラスミドのみを消化する
Ｄｐｎ Ｉで処理し、続いて、ライブラリークローニングベクターのサイズより
も大きなＰＣＲ生成物をアガロースゲルにより精製した。また、逆ロングＰＣＲ
に使用したプライマーは５'ホスホリル化されているので、次に、精製された生
成物を自己連結させ、大腸菌コンピテント細胞で形質転換させた。５'ベクター
プライマー及び適切な遺伝子特異性プライマーを使用するＰＣＲによりコロニー
をスクリーニングし、より大きな５'配列を有するクローンを同定した。陽性ク
ローンから調製したプラスミドをシークエンス決定した。必要ならば、先の段階
で得られた新規な配列に基づき、より多くの５'配列を得るために、この方法を
繰り返すこともできる。 この実験における逆ロングＰＣＲの目的は標的遺伝子の完全な配列を得ること
である。全長コード化領域を含むクローンは、従来のＰＣＲによっても得た。 ＤＮＡ９８８５３の全長コード領域をクローニングするために使用するプライ
マー対を合成した： 正方向プライマー： 5'ggaggatcgatACCATGGATTGCCAAGAAAATGAG3'(Cla-MD-509)(配列番号：９) 逆方向プライマー： 5'ggaggagcggccgcttaAGGGCTGGGAACTTCAAAGGGCAC(509.TAA.not)(配列番号：１
０) クローニングの目的で、Ｃｌａ Ｉ部位とＮｏｔ Ｉ部位を、それぞれ正方向プ
ライマー及び逆方向プライマーに含有せしめた。 ＰＣＲ産物の精度を確保するために、独立してＰＣＲ反応を行わせ、いくつか
のクローン産物をシークエンス決定した。 上述したようにして単離したクローンのＤＮＡシークエンス決定により、ＤＮ
Ａ９８８５３ポリペプチドの全長ＤＮＡ配列(ここではＤＮＡ９８８５３-１７３
９と命名)(配列番号：１１)及びＤＮＡ９８８５３ポリペプチドの誘導タンパク
質配列(配列番号：１２)が得られた。
【００２１】 図１にはＤＮＡ９８８５３のＯＲＦのヌクレオチド配列を示している。全ｃＤ
ＮＡ配列はさらに長く、５'及び３'UT(非翻訳領域)を含む。クローンＤＮＡ９８
８５３-１７３９は、ブタペスト条約に従って１９９９年４月６日にＡＴＣＣ寄
託番号ＡＴＣＣ２０３９０６としてＡＴＣＣに寄託された。アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)は、ヴァージニア州 20110-2209、マナッサ
ス、ユニバーシティ・ブルバード 10801 にある。クローンＤＮＡ９８８５３は
単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４−６に見かけ
の翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置９０１−９０３の停止コドンで終端す
る(図４)。予測されるポリペプチド前駆体は２９９アミノ酸長である(図５；配
列番号：１２)。図５に示す全長ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドタンパク質は約
３．３キロダルトンの推定分子量と約４．７２のｐＩを有する。潜在的Ｎ-グル
コシル化部位は図５に示すアミノ酸配列のアミノ酸７４と７７の間に存在する。
潜在的Ｎ-ミリストイル化部位は図５に示すアミノ酸配列のアミノ酸２４と２９
の間に存在する。潜在的カゼインキナーゼＩＩホスホリル化部位は、図５に示す
アミノ酸配列のアミノ酸１２３−１２６、１８５−１８８、２００−２０３、２
５２−２５５、２５７−２６０、２７１−２７４及び２８３−２８６の間に存在
する。潜在的膜貫通ドメインは図５に示す配列のアミノ酸１３７と１５８の間に
存在する。現在のことろ、該ポリペプチドはシグナル配列を含まないと考えられ
る。 全長ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、その一部が
腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーと相同性を有していることが示唆
され、よってＤＮＡ９８８５３ポリペプチドは腫瘍壊死因子レセプターファミリ
ーの新規なメンバーであることが示された。ＴＮＦＲファミリーに特徴的な３つ
の見かけの細胞外システインリッチドメインが存在しており[Naismith及びSpran
g, Trends Biochem. Sci., 23：74-79(1998)を参照]、その最初の２つのＣＲＤ
は６つのシステインを有し、第３のＣＲＤは４つのシステインを有する。
【００２２】 結論 これらの実験の結果から、本ＦＬＩＰ法は広範囲の遺伝子を効率的にクローニ
ングするのに高い成功率を有していることが証明された。 参考文献 本発明の実施においては、特に示さない限りは、当業者の技量の範囲内にある
ＰＣＲ、分子生物学等の一般的な技術を使用する。このような技術は文献に十分
に説明されている。例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(J. Sam
brook等, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)
；Current Protocols in Molecular Biology(F. Ausubel等編, 1987及び更新)；
Essential Molecular Biology(T. Brown 編, IRL Press 1991)；Gene Expressi
on Technology(Goeddel 編, Academic Press 1991)；Methods for Cloning and
Analysis of Eukaryotic Genes(A. Bothwell等編, Bartlett Publ. 1990)；Gene
Transfer and Expression(M. Kriegler, Stockton Press 1990)；RecombinantD
NA Methodology II(R. Wu 編, Academic Press 1995)；PCR：A Practical Appro
ach(M. McPherson等, IRL Press at Oxford University Press 1991)；Oligonuc
leotide Synthesis(M. Gait 編, 1984)；Cell Culture for Biochemists(R. Ada
ms 編, Elsevier Science Publishers 1990)；Gene Transfer Vectors for Mamm
alian Cells(J. Miller & M. Calos 編, 1987)を参照のこと。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１に詳細に記載したような、制限消化(この場合はＤｐｎ
Ｉを使用)選択工程までの、ＦＬＩＰクローニング方法を例証するフローチャー
トである。ベクター配列に隣接する陰をつけたボックスは標的遺伝子配列を表す
。
【図２】 実施例２で行ったような、上述のＦＬＩＰ法に対する別の一実施
態様を示すフローチャートである。
【図３】 実施例４で使用したIncyteクローン509 1511H(配列番号：４)の
ヌクレオチド配列を示す図である。
【図４】 天然配列ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドｃＤＮＡ(ヌクレオチド
１-９０３)のヌクレオチド配列(配列番号：１１)を示す図である。下線を付した
ヌクレオチド１０−１２６、１３３−２５２及び２５９−３５７によりコードさ
れる３つのシステインリッチ反復の位置が存在する。タンパク質の推定膜貫通ド
メインは、この図のヌクレオチド４０９−４７４によりコードされる。実施例２
を参照。
【図５】 図４に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド４−９００から誘導
されたアミノ酸配列(配列番号：１２)を示す図である。潜在的膜貫通ドメインは
、該図のアミノ酸１３７から１５８の間（双方を含む）に存在する。実施例２を
参照。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 チュイ，クラリッサ，ジェイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94131， サンフランシスコ，アメシスト ウェイ 48 (72)発明者 グリマルディ，ジェイ．，クリストファー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94122， サンフランシスコ，サーティーシックスス アヴェニュー 1434 (72)発明者 ミルトン，シーン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94107， サンフランシスコ，ミシシッピ ストリー ト 230，アパートメント ２ (72)発明者 ヤン，ミンホン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， バーリンゲーム，ガーデン ドライブ 1910 114号室 (72)発明者 イー，ソジィー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94577， サンリアンドロ，バンクロフト アヴェニ ュー 532 309号室 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA01 CA04 CA09 DA05 EA04 HA12

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (ｉ)鋳型分子としてメチル化された環状核酸分子の異種集団
    を有する組換え核酸ライブラリーを用意し； (ｉｉ)環状核酸分子の相補鎖に対して第１及び第２プライマーをアニールして
    アニール混合物を作製し、ここで、 ２つのプライマーはポリメラーゼ連鎖反応中に互いに反対方向に伸長し； ２つのプライマーの５'末端は互いに隣接し；さらに ここで、各プライマーは、対象の核酸分子の対応する配列に対して配列が同一
    であり； (ｉｉｉ)アニール混合物にポリメラーゼ連鎖反応を施し、これにより直線状単
    位複製配列を含む増幅した混合物を作製し； (ｉｖ)メチル化ＤＮＡを選択的に切断する酵素を用いて増幅された混合物を切
    断し、これにより鋳型分子を除去して対象の核酸分子を濃縮し； (ｖ)対象の核酸分子を単離する； ことを含んでなる、核酸分子の混合物から対象の核酸分子を増幅し単離する方法
    。
  2. 【請求項２】 ２つのプライマーは５'末端がホスホリル化している請求項
    １に記載の方法。
  3. 【請求項３】 切断工程前に直線状単位複製配列を連結して環状レプリコン
    を作製することをさらに含む請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 切断工程後、核酸ライブラリーのクローニングベクターのサ
    イズよりも大きな単位複製配列を単離し、単離したより大きな単位複製配列を連
    結することをさらに含んでなる請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 より大きな単位複製配列をゲル精製により単離する請求項４
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】 酵素が制限エンドヌクレアーゼである請求項１に記載の方法
    。
  7. 【請求項７】 制限エンドヌクレアーゼがＤｐｎＩである請求項６に記載の
    方法。
  8. 【請求項８】 複数の組換え核酸ライブラリーがポリメラーゼ連鎖反応のた
    めの単一混合物として提供される請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 核酸ライブラリーが、ＤＮＡはメチル化されている二重鎖Ｄ
    ＮＡライブラリーである請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 核酸ライブラリーがヒトｃＤＮＡライブラリーである請求
    項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 組換えＤＮＡライブラリーがヒトゲノムＤＮＡライブラリ
    ーである請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 対象の核酸分子が５ｘ１０５を越える頻度でライブラリー
    に現れる請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 対象の核酸分子が１ｘ１０６以上の頻度でライブラリーに
    現れる請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 切断工程後に適切な宿主細胞で環状レプリコンを形質転換
    し、クローンを産生することをさらに含む請求項３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 宿主細胞はコンピテント細菌性宿主細胞である請求項１４
    に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 クローンをスクリーニングし、対象の核酸分子を含むクロ
    ーンを同定することをさらに含む請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 クローンから単離された核酸のシークエンス決定をさらに
    含む請求項１４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 単一混合物の溶液を９６ウェルマイクロタイタープレート
    のウェルに適用し、マイクロタイタープレート中でポリメラーゼ連鎖反応を行わ
    せ、複数の対象の核酸分子を同時に単離する請求項８に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 (ｉ)鋳型分子としてメチル化された環状核酸分子の異種集
    団を有する組換え核酸ライブラリーを用意し； (ｉｉ)環状核酸分子の相補鎖に対して第１及び第２プライマーをアニールして
    アニール混合物を作製し、ここで、 ２つのプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応中に互いに反対方向に伸長し； ２つのプライマーの５'末端は互いに隣接し；さらに ここで、各プライマーは、対象の核酸分子の対応する配列に対して同一であり
    ； (ｉｉｉ)アニール混合物にポリメラーゼ連鎖反応を施し、これにより単位複製
    配列を有する増幅された混合物を作製し； (ｉｖ)連結混合物において単位複製配列を連結して環状レプリコンを作製し； (ｖ)連結混合物をメチル化核酸を選択的に切断する酵素を用いて切断し、これ
    により鋳型分子を除去して対象の核酸分子を濃縮し； (ｖｉ)適切な宿主細胞でレプリコンを形質転換し、形質転換したクローンを産
    生し； (ｖｉｉ)対象の核酸分子を単離する； ことを含んでなる、組換え核酸ライブラリーから対象の核酸を増幅し単離する方
    法。
  20. 【請求項２０】 形質転換したクローンをスクリーニングし、対象の核酸分
    子を含有するクローンを同定することをさらに含む請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 ５０を越えるｃＤＮＡライブラリーがポリメラーゼ連鎖反
    応のための単一混合物として提供される請求項１９に記載の方法。
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