JPH03236789A - 大腸菌における異種蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、大腸菌を宿主とする組換えＤＮＡ手法を用い
た異種蛋白質の製造法に関するものである。

〈従来の技術〉 大腸菌において異種蛋白質を組換えＤＮＡ手法を用いて
製造する場合、異種蛋白質によっては大腸菌のプロテア
ーゼに対して高い感受性を示し、通常の発現系では、そ
の生産性が極めて低くなるものがある。また、大腸菌プ
ロテアーゼに高い感受性を示さないまでも、ある程度プ
ロテアーゼの作用を受け、その収量が低下する場合が数
多く存在している。

Ｔ４ファージは、大腸菌を宿主とするピルレントファー
ジの一つであり、宿主プロテアーゼに対するインヒビタ
ーを生産する（Ｓｉｍｏｎら、　Ｎａｔｕｒｅ。

２７５．４２４　（１９７８））などの優れた物質生産
能を有している。このため、Ｔ４ファージの諸機能、特
に宿主プロテアーゼに対するインヒビター生産能を大腸
菌を宿主とする組換えＤＮＡ手法による有用物質の製造
に応用することは産業上非常に有益である。

従来、Ｔ４ファージのｍ能を直接利用する目的で、Ｔ４
ファージゲノムに異種蛋白質の遺伝情報をコードするＤ
ＮＡ断片をクローン化し、Ｔ４ファージ自身を発現ベク
ター化する研究がなされてきた（Ｃａｓｎａら、Ｇｅｎ
ｅ、１８，２９７　（１９８２）。

Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅ、４４，１３３　　（１９
８６）。

Ｍａｔｔｓｏｎら特表昭６Ｏ−５０２１８７）、これら
はいずれもＴ４ファージのＤＮＡ組換え活性を利用し、
プラスミドにクローン化したＴ４ファージＤＮＡ部分と
宿主に感染したＴ４ファージゲノムとのＤ　Ｎ−Ａ相同
性を介したｉｎ　ｖｉｖｏで置換型組換えを起こさせて
異種蛋白質の遺伝情報をコードするＤＮＡ断片をファー
ジゲノムに導入するというものである。この方法により
適当なＴ４ファージプロモーターと発現を目的とする異
種蛋白質の遺伝子を連結したものをファージゲノムに導
入することができ、Ｔ４ファージ自身を発現ベクター化
することは一応の成功を収めた（Ｃａｓｎａら、　Ｇｅ
ｎｅ。

３７．３１　（１９８５）、好日ら、特開昭６２−２３
２３８４）。

〈本発明が解決しようとする課題〉 Ｔ４ファージは、そのＤＮＡ鎖中に通常のデオキシシチ
ジン（ｄＣ）の代わりに異常塩基であるヒドロキシメチ
ルデオキシシチジン（ＨＭｄＣ）を含んでいる。しかし
遺伝子４２．５６、ｄｅｎ　Ｂおよびａｌｅに変異が導
入されるとそのＨＭｄＣが通常のｄＣに完全に置換され
る（Ｓｎｙｄｅｒら、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）＊　７３．２
０９８　（１９７６））。このような多重変異株を通常
Ｔ４ｄＣファージと呼ぶ、Ｔ４ｄＣファージは、ｄｅｎ
　Ｂ　−（６１ｄＯｒ１１１ｃｌｅａｓｅ　ＩＶ欠損）
であるため、野生型に比ベプラスミドとのＤＮＡ組換え
頻度は極めて高い。

このため、前述した従来法においてはＴ４ｄＣファージ
を感染させてプラスミドとＤＮＡ組換えを起こさせて組
換え体Ｔ４ｄＣファージを造成している。しかし、Ｔ４
ｄＣファージは、多重変異株であるため野生型ファージ
に比べ増殖力弱く、物質生産能も低下しており、目的と
する異種蛋白質を大量に発現させるためには先に得られ
た組換え体Ｔ４ｄＣファージをさらに野生型ファージと
掛は合わせてＨＭｄＣ型組換え体ファージを造成する必
要があった。

上述したように、Ｔ４ファージ自身の発現ベクター化は
、雑菌プラスミドの作製を含め非常に煩雑であり、また
目的とする異種蛋白質の発現量も十分満足し得るもので
はなかった（好日ら、特開昭６２−２３２３８４　、　
Ｃａ５ｎａら、Ｇｅｎｅ、　　３７　。

３１　（１９８６））。

〈課題を解決するための手段〉 本発明者らは、Ｔ４ファージ自身を発現ベクター化する
従来法とは異なり、より簡便な方法を開発すべく研究を
重ねた結果、適当なＴ４ファージ由来の転写開始シグナ
ルおよび翻訳開始シグナルの下流に生産を目的とする異
種蛋白質の遺伝情報をコードするＤＮＡ断片を連結した
融合ＤＮＡを含有するプラスミドにより形質転換された
大腸菌にＴ４ファージｄｅｎ　Ｂ変異株を低い多重感染
度（ｍ　、　ｏ　、　ｉ　、　＝＝ｍｕｌｔｉｐｌｉｃ
ｉｔｙ　ｏｆ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）で感染させること
により、目的とする異種蛋白質を従来法と比較して極め
て収率よく生産できることを見い出し１本発明を完成さ
せた。

以下、本発明方法を説明する。

本明細書において、以下の用語は下記の定義のとおりで
ある。

「転写開始シグナルおよび翻訳開始シグナル」とは、ｔ
ａ型ＤＮＡから伝令ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）　への転写と
ｍ　ＲＮ　Ａの情報を蛋白質へ翻訳させるために必要と
される特定の塩基配列を含有するＤＮＡ断片を相称する
。Ｔ４ファージとその宿主である大腸菌における転写開
始シグナルおよび翻訳開始シグナルに対応するＤＮＡの
塩基配列は多少相違しており　（Ｍａｔｈｅｖｓら、　
ＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ　４　。

＾ｍｅｒｉｅａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ。

Ｖａｓｈｉｎｓｔｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，（１９８３）　）
　、Ｔ４ファージ感染後の宿主遺伝子の発現は完全に抑
制され。

ファージ遺伝子のみが発現される。このため１本発明方
法に用いる転写開始シグナルおよび翻訳開始シグナルは
Ｔ４ファージ由来のもの、またはＴ４ファージ由来のも
のと同一の機能を有する合成りＮＡ断片を使用する０本
発明において使用可能なＴ４ファージ由来の転写開始シ
グナルおよび翻訳開始シグナルを含有する遺伝子を具体
的に例示すれば、ｕｖｓ　Ｙ遺伝子、ｇ２２遺伝子、ｇ
１８遺伝子などが挙げられる。

「生産を目的とする異種蛋白質の遺伝情報をコードする
ＤＮＡ断片」とは、製造を目的とする蛋白質またはペプ
チドをコードするＤＮＡ断片のことを示す６本発明方法
に使用する異種蛋白′質の遺伝情報をコードするＤＮＡ
断片は、種類、起源、由来などに制限されず１例えば動
物、植物、微生物などの天然物から得られるＤＮＡ断片
、前記の天然物から得られるｍ　ＲＮ　Ａに逆転写酵素
等を作用させて得られるＤＮＡ断片、または化学的に合
成されたＤＮＡ断片などのいずれであってもよい。

「プラスミド」とは、特定の制限酵素切断部位を有し、
大腸菌内でｍｍ可能なプラスミドを示す。

本発明方法においては、上記条件を満足するものであれ
ばいずれのものも使用可能であり、より好ましくは目的
とする蛋白質あるいはペプチドの生産量を多くするため
に、菌体中のコピー数の高いプラスミドを使用するのが
望ましい、具体的にはＣｏ　Ｉ　Ｅ　１の系統、ｐＭＢ
９の系統、ｐＢＲ３２２の系統、ｐｓｃｌｏｌの系統、
Ｒ６にの系統などのプラスミドを、より具体的に、たと
えばｐＢＲ３２２（ＢｏＬｉｖｅｒら＋　Ｇｅｎｅ、　
　２　ｅ　９５　（１９７５））、ｐＵｃ１８．ｐＵｃ
１９　　（Ｍｅｓｓｉｎｇら。

Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１０１
＋　２０　（１９８３））などを例示することができる
。

ｒｍ、ｏ、　ｉ、Ｊとは菌体１個あたりの感染させるフ
ァージ数を表わす。

本発明方法は以下のＡ−Ｅ工程を主要構成工程とするも
のである。

（Ａ）Ｔ４ファージ由来の転写開始シグナル及び翻訳開
始シグナルの下流に生産を目的とする異種蛋白質の遺伝
情報をコードするＤＮＡ断片を発現可能な形で連結し、
これを大腸菌内で複製可能なプラスミドに挿入する工程
、（Ｂ）Ａ工程で得られた雑稀プラスミドを用いて大腸
菌を形質転換する工程、 （Ｃ）Ｂ工程で得られた形質転換体を当該微生物が増殖
可能な培地中で増殖させ、Ｔ４ファージｄｅｎ　Ｂ変異
株を低い多重感染度（＋ａ、　ｏ、　ｉ、　）で感染さ
せる工程、 （Ｄ）Ｃ工程で得られたファージ感染菌を培養する工程
、 （Ｅ）Ｄ工程で培養した菌体を回収し、目的とする異種
蛋白質を取得する工程。

１、Ａ工程 Ａ工程におけるＴ４ファージ由来の転写開始シグナルお
よび翻訳開始シグナルを含むＤＮＡ断片と異種蛋白質の
遺伝情報をコードするＤＮＡ断片との連結並びにその融
合ＤＮＡをプラスミドに挿入する方法は一般の技術者、
特に生化学、分子生物学、遺伝子工学の分野に属する技
術者にとっては周知の技術であり、具体的には、例えば
「Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｕｇＪ　　（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら編、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂ
ｏｒ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）　）に記載の方法に従
って行うことができる。

１１．８工程 １３工程において使用される大腸菌は、安全性が高く扱
いやすいものであれば特にその菌株の種類に限定されな
い。ただしＴ４ファージｄｅｎ　Ｂ変異株としてＴ４ｄ
Ｃファージを感染させる場合は、使用する大腸菌として
は制限系欠損株であることが望ましい。より具体的には
組換えＤＮＡ実験に繁用されているＣＣ６００ｒ菌、Ｊ
Ｍ１０５菌、３Ｍ１０９菌、ＭＣ１０６１菌などが使用
可能である。

大腸菌を形質転換する方法は１例えば大腸菌を低温下、
塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを移入する
方法（Ｍａｎｄｅｌら、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、。

１主、１５９　（１９７０））などの常法によればよい
。

ｍ、ｃ工程 形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの大腸菌の増
殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って
行えばよい０例えば２ｘＹＴ培地（Ｍｅｓｓｉｎｇら、
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　　
１００　＊２０　（１９８３））、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ
培地（Ｍａｎｉａｔｉｓら編、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）などの大腸菌の培養に使用され
ている培地を用い、プラスミドの脱落を防ぐため適当な
抗生物質（アンピシリン、テトラサイクリン等）等の薬
剤を適当量加えて２０〜４０℃で必要により通気・Ｍｌ
ｊ’Ｐシながら培養する。

培養中期に生産を目的とする異種蛋白質の発現を誘導す
るため、Ｔ４ファージｄｅｎ　Ｂ変異株を低いｍ、ｏ、
ｉ、、好ましくはｍ、ｏ、ｉ、＝０．０１〜１．０の範
囲で感染させる。感染させるＴ４ファージｄｅｎ　Ｂ変
異株としては溶菌活性の弱まった変異株であればよい、
具体的にはＴ４ｄＣファージなどが例示される。また生
産性を上げるため、リシスインヒビション現象（「バク
テリオファージの実験法」富沢純−著、１９７０年５月
３０日。

音波書店発行）を利用することも有効であり、この場合
にはｒｌｌ＋ｌｌ−ジを使用するのが望ましい。

ｍＶ、Ｄ工程 ファージ感染後も形質転換体の培養を数時間行う。具体
的には、前記培養温度で２〜１０時間程度ファージ感染
菌を培養すればよい。またこの際。

通気、撹拌を十分に行うことが望ましい。

Ｖ、Ｃ工程 培養後、菌体からの目的蛋白質の取得は、常法を適宜応
用して行うことができる０例えば回収した菌体を適当な
り新液に懸濁して超音波処理等の常法によって菌体を砕
して目的蛋白質を抽出し、遠心分離により菌体残渣を除
去後、イオン交換クロマトグラフィー法およびゲル濾過
法などを用いて目的とする蛋白質の精製を行えばよい。

〈発明の効果〉 本発明方法は、従来法のようにＴ４ファージ自身を発現
ベクター化せずに、Ｔ４ファージ由来の転写開始シグナ
ルおよび翻訳開始シグナルの下流に生産を目的とする異
Ｎ１蛋白質の近体情報をコードするＤＮＡ断片を発現可
能な形で連結し、これを大腸菌で複製可能なプラスミド
に挿入したｍ種プラスミドを造威しくＡ工程）、これを
用いて大腸菌を形質転換後（Ｂ工程）、Ｔ４ファージｄ
ｅｎＢ変質株を低いｍ、ｏ、ｉ、で感染させ（Ｃ工程）
。

目的とする異種蛋白質を発現、回収するものである（Ｄ
およびＣ工程）、このような極めて簡便な方法により特
に大腸菌プロテアーゼに感受性を示し、従来は大腸菌に
おいて生産性の低い異種蛋白質をＴ４ファージのプロテ
アーゼインヒビター生産能を利用して大腸菌で大量に生
産することが可能となった。さらに本発明方法に使用す
る発現系は、その構築は極めて容易であり、またＴ４フ
ァージｄｅｎ　Ｂ変異株の低ｍ、ｏ、ｉ、感染により生
産性を向上させることもできた。

すなわち本発明は、Ｔ４ファージの物質生産能を利用し
、大腸菌を宿主とする組換えＤＮＡ手法を用いた有用物
質（特に大腸菌菌体内で不安定な蛋白質またはペプチド
）の実用的な製造法を初めて提Ｏ（するものである。

〈実施例〉 大腸菌プロテアーゼに対して非常に感受性の高い蛋白質
であるヒト心室筋ミオシンＬ鎖の製造を実施例として以
下に示す。

また、本実施例におけるＤＮＡの精製、制限酵素による
切断、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡの連結、並びに大腸菌
の形質転換法は全て「Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇＪ　　（Ｍａｎｉａｔｉｓら編、　ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　　１口ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ　（１９８２）　）に従って行った。また各
種制限酵素、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ、並びにクローニングベクターｐＵｃ１８．
ｐＢＲ３２２は全て宝酒造■より入手した。

■　ヒト心室筋ミオシンＬｆｆｉオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）ＤＮＡの調製 ヒト心室ミオシンＬ　ｐｉ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含むプラ
スミドｐＤＲ−ＶＬＣ４（特開平１−２４０１９７参照
）ＤＮＡを制限酵素ｌ吐ＨＩで切断し、６４０ｂｐのヒ
ト心室前ミオシンＬｆｉ○ＲＦをコードするＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動法により分離・精製した。こ
のＤＮＡを制限酵素Ｆｏｋ　Ｉにより切断し、生じた２
０１ｂｐおよび３８９ｂＰのＤＮＡ断片を１０％ポリア
クリルアミドゲルによるゲル電気泳動法により分離・精
製した。

ヒト心室前ミオシンＬｆｆｉＯＲＦの５′−側領域は、
Ｔ４ファージｕｖｓ　Ｙプロモーターと連結するため、
以下の２本のＤＮＡをＤＮＡ合成機（ファルマシア社製
、　Ｇｅｎｅ　Ａｓ５ｅ＋ｍｂｌｅｒ　ｐｌｕｓ）を用
いて合成した。

（５’　−ＶＬＣ） ５　’　　Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＣＡ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　ＣＣ
Ａ　Ｇ　Ａ　Ｇ　ＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＣ
ＡＡＧＧ−３’（５’　−ＶＬＣ−Ｒ） ５’　−ＧＣＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＣ
ＴＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＧ　　３’合成した２
本のＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５
′−末端をリン酸化し、アニーリングさせた後、先の２
０１ｂｐおよび３８９ｂｐのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結させた。連結反応後、ＤＮＡをエタ
ノール沈殿により回収し、制限酵素ＢａｍＨＩで切断し
た。この６２７ｂｐのｔニド心室筋ミオシンＬ　１１０
　ＲＦ　Ｄ　Ｎ　ＡをクローニングベクターＰＵＣ１８
のＢａｎ＋ＨＩ切断部位にＭｅｓｓｉｎｇらの方法（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ１ミｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１０１
　、２０　（１９８３）　）を用いチクローン化した（
ｐＵＣ−ＶＬＣ２８）。

■　ヒト心室前ミオシンＬ＃！ｌ０ＲＦとＴ４ｕｖｓＹ
逍伝子プロモーターとの連結 ｐＨＴＬ８　（高橋ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１２０　
、１２２　（１９８２）、ｐＨＴＬ８を挿入したＣ６０
０菌は、大腸菌に１２株ＴＮＣ１０１菌として工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されている（微工研菌寄
第８０３８号））ＤＮＡを制限酵素ｔｌｉｎｄｍで切断
し、アガロースゲル電気泳動法によりＴ４ｕｖｓＹｍ伝
子を含む１．４ＫｂのＤＮＡ断片を分離、精製した。制
限酵素Ｈｉｎｄ　ｍにより切断したｐＢＲ３２２のＤＮ
Ａとこの１．４ＫｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結し、大腸菌Ｃ６００（微工研菌寄第８０３
７号）をこのＤＮＡを用いて形質転換した。

得られたアンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性形
質転換体より、１．４ｋｂのＤＮＡ断片がＨｉｎｄｎｌ
切断部位に挿入されたｐＨ８５を選出した。

ｐＨＢ５は、Ｔ４［伝子２５およびｕｖｓＹｌ伝子を含
み、ｕｖｓ　Ｙプロモーターの直下に制限酵素り匹■切
断部位を１カ所有している。

次に、ｐＵＣ−ＶＬＣ：２８　　ＤＮＡを制限酵素Ｂａ
ｍＨ１で切断し、アガロースゲル電気泳動により６２７
ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。この６２７ｂｐのＤ
ＮＡ断片とＵ■で切断したｐＨ８５を７４ＤＮＡリガー
ゼにより連結し、この反応液を用いて大腸菌Ｍ　Ｃ１０
６１（Ｃａｓａｄａｂａｎら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ
、　７６．４５３０（１９７９））を形質転換した。得
られたアンピシリン耐性形質転換体より、ｐＨＢ−ＶＬ
Ｃ２８を選出した。

ｐＨＢ−ＶＬＣ２８は、Ｔ　４　ｕｖｓ　Ｙプロモータ
ーの下流にヒト心室前ミオシンＬ　ｆｉ　ＯＲＦが転写
方向に一致して挿入されたものであるが、そのアミノ酸
配列は、生来のものと若干異なっている。

詳しくは、Ｎ末端から２番めのアラニンが４アミノ酸（
グルタミン酸−ロイシン−グルタミン酸−アスパラギン
酸）に置換された形となっている。

■　Ｔ４ｄＣファージ感染によるヒト心室前ミオシンＬ
ｆｉの発現誘導 ｐＨＢ−ＶＬＣ２８を含む大腸菌ＭＣ１０６１（微工研
菌寄第１１１９８号）を３０　ｐＨ／　ｍＱのアンピシ
リンを含むＭ９ＣＡ培地（０，１８％ＮａＨ，ＰＯ，”
１２Ｈ２０，０、３％ＮａＣ１，０、０５％Ｎ）１４Ｃ
１゜Ｑ、５％グルコース、０．５％カザミノＭ［Ｄｉｆ
ｃｏ社］、　　１ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ１（ｐＨ７，２）　）
　　１００＋ａＱを用い、３７℃で培養し、２　Ｘ　１
０＠菌／−に達した時点でＴ４ｄｃファージＧ　Ｔ　７
　（Ｉｌｉｌｓｏｎら。

Ｎａｔｕｒｅ、　２８０．８０　（１９７９）　）をｍ
、０゜ｉ＝０．１となるように感染させた。感染後さら
に３７℃で３時間培養を続け、培養液をｓｏｏ。

×ｇ、１０分間の遠心分離により菌体を調製した。

得うレタ菌体１；ｌ　１０ｍＱノ１ｍ衝液［５０ｍＭ　
　ト’Ｊスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）、２０ｍＭ　　
ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメタンスルホニル・フロライ
ド（ＰＭＳ　Ｆ）および５０μＭ　２−メルカプトエタ
ノール含有コに懸濁し、超音波処理により菌体を破壊し
た。

次に１１００００Ｘ、１０分間の遠心分離を行い、菌体
残渣を除去し、上清画分を試料として矢崎らの方法（特
開昭６１−２８６７５２号公報）に従ってヒト心筋ミオ
シンＬｆ１を定量した。また同試料の蛋白質濃度をプロ
ティンアッセイキット（バイオ−ラッド社製）を用いて
測定した。対照実験としてｔａｃプロモーター（＋３ｏ
ｅｒら、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、ａｃａｄ、ＵＳＡ、、８０．２１　　（１９
８３））を用いた発現系（特開平１−２４０１９７）で
ヒト心室前ミオシンＬｌ’ｌの生産を行った。

その結果を第１表に示す。

第１表 １）特開平１−２４０１９７ ２）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドｔ
ａｃプロモーターの発現誘導のため１ｍＭ添加３）犀／
■蛋白質 第１表に示す通り、ヒト心室前ミオシンＬＩ！１は、大
腸菌体内で非常に不安定であり、従来法においてはその
生ｇｔｍは、０．２８ｔＩｇ／■蛋白質と低かった。一
方、本発明による発現系では、ファージ感染により、ヒ
ト心室前ミオシンＩＪｆｉは約１２μｇ／■蛋白質の生
産性が得られた。

なお、Ｔ４ｄＣファージＧＴ７の代わりにｄｅｎＢ＋株
である野生型Ｔ４ファージを感染させたところ、上述の
ような発現誘導は全く認められなかつた・ 次に、Ｍ９ＣＡ培地を用いて、Ｔ４ｄＣファージＧＴ７
を種々のｍ、ｏ、ｉ、で感染させ、ヒト心室前ミオシン
ＬＩ！Ａの生産性を解析した。ファージ感染後３時間に
おける培地当たりの生産量を第２表に示す。

第２表 第２表に示すとおり、高ｍ、ｏ、ｉ、感染（たとえばｍ
、ｏ、ｉ、＝５．００）においては、感染後速やかな溶
菌が起こり、生産量は低ｍ、ｏ。

ｉ、に比べて極めて低かった。

さらに使用する培地と生産性に関して解析したところ２
ｘＴＹ培地（前述）において、１４７４／ｍＱ培地の生
産性が得られた。

以上示したように５本発明は、Ｔ４ファージの持つ物質
生産能（特に宿主プロテアーゼインヒビター生産能）を
利用した。大ｆ３閑における異神蛋白質の大量製造を可
能たらしめるものである。

（微生物の寄託） ｐＨＢ−ＶＬＣ２８を含む大腸菌ＭＣ１０６１は平成２
年１月１９日に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されて、微工研菌寄第１１１９８号の受託番号を得てい
る。また、Ｔ４ｄＣファージＧＴ７は今だに微生物工業
技術研究所の寄託対象徴生物になっておらず、寄託する
ことができないがＴ４ファージ（ＴＡＣＣ１１３０３−
Ｂ４）から公知の方法（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　、±４，２
０７　（１９７４））により調製することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＨＢ−ＶＬＣ２８（ｉＦ）構築を示す。 手続補正書 箸１　図 ５ｙｒＩ＝”＋＊ｓＬＺ＠ｄ　ＤＮＡ 平成３年　ユ月　１ら日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）下記の（Ａ）〜（Ｅ）工程からなる大腸菌における
   異種蛋白質の製造法。 （Ａ）Ｔ４ファージ由来の転写開始シグナル及び翻訳開
   始シグナルの下流に生産を目的とする異種蛋白質の遺伝
   情報をコードするＤＮＡ断片を発現可能な形で連結し、
   これを大腸菌内で複製可能なプラスミドに挿入する工程
   。 （Ｂ）Ａ工程で得られた雑種プラスミドを用いて大腸菌
   を形質転換する工程。 （Ｃ）Ｂ工程で得られた形質転換体を当該微生物が増殖
   可能な培地中で増殖させ、Ｔ４ファージｄｅｎＢ変異株
   を低い多重感染度（ｍ．ｏ．ｉ．）で感染させる工程、 （Ｄ）Ｃ工程で得られたファージ感染菌を培養する工程
   、 （Ｅ）Ｄ工程で培養した菌体を回収し、目的とする異種
   蛋白質を取得する工程。