JPS63254985A - 組換ｄｎａ、発現ベクター及びプラスミド、これらの製法及び誘発可能で抑制可能な外来遺伝子の発現法 - Google Patents
組換ｄｎａ、発現ベクター及びプラスミド、これらの製法及び誘発可能で抑制可能な外来遺伝子の発現法Info
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- JPS63254985A JPS63254985A JP63073505A JP7350588A JPS63254985A JP S63254985 A JPS63254985 A JP S63254985A JP 63073505 A JP63073505 A JP 63073505A JP 7350588 A JP7350588 A JP 7350588A JP S63254985 A JPS63254985 A JP S63254985A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は組換ＤＮＡ及び表現ベクター、これらの組換Ｄ
ＮＡ及び表現ベクターの製法並びに外来遺伝子のｉＷＪ
！Ａ可能で、抑制可能な表現のためのこれらの使用に関
する。
ＮＡ及び表現ベクターの製法並びに外来遺伝子のｉＷＪ
！Ａ可能で、抑制可能な表現のためのこれらの使用に関
する。
従来の技術
通用された遺伝子操作の及要な目的は組換ＤＮＡからの
蛋白質生産である。このためには、特別な部類のベクタ
ー、いわゆる表現ベクターが必要である。このベクター
は組換ＤＮＡのクロだ 一ン化、転移及び増殖のための構造的条件２けでなく、
蛋白質における表現のための構造的条件を有していなく
てはならない。このためにはこの組換えＤＮＡ−分子は
特別な調節配列、いわゆるプロモーターを必要とし、こ
れはりボゾームによる翻訳を完厄した蛋白質にする、Ｒ
ＮＡ中のＤＮＡ配クリの転写に作用する。
蛋白質生産である。このためには、特別な部類のベクタ
ー、いわゆる表現ベクターが必要である。このベクター
は組換ＤＮＡのクロだ 一ン化、転移及び増殖のための構造的条件２けでなく、
蛋白質における表現のための構造的条件を有していなく
てはならない。このためにはこの組換えＤＮＡ−分子は
特別な調節配列、いわゆるプロモーターを必要とし、こ
れはりボゾームによる翻訳を完厄した蛋白質にする、Ｒ
ＮＡ中のＤＮＡ配クリの転写に作用する。
１種以上の遺伝子の転写のためのバクテリア由来ＲＮＡ
−ポリメラーゼに結合しなけれはならないＤＮＡ−城ｔ
−プロモーターと呼ぶ。このような多くのプロモーター
は構造的な共通点を有し、その意味は特に一定の蛋白質
との相互作用にあると思われる。細胞蛋白質又は他の分
子とのそのような相互作用によジブロモ−ターの活性の
抑制並ひに誘発が生じる。例えは、このための例ハラム
ダプロモーターＰ】とラムダリプレッサ１工との相互作
用である。
−ポリメラーゼに結合しなけれはならないＤＮＡ−城ｔ
−プロモーターと呼ぶ。このような多くのプロモーター
は構造的な共通点を有し、その意味は特に一定の蛋白質
との相互作用にあると思われる。細胞蛋白質又は他の分
子とのそのような相互作用によジブロモ−ターの活性の
抑制並ひに誘発が生じる。例えは、このための例ハラム
ダプロモーターＰ】とラムダリプレッサ１工との相互作
用である。
遺伝子操作による蛋白質の生産において、リプレッサー
又は誘発物質の存在又は添加により表現ベクター中に存
在するプロモーターを制御することができる場合、それ
は特に有利である。
又は誘発物質の存在又は添加により表現ベクター中に存
在するプロモーターを制御することができる場合、それ
は特に有利である。
しかしながら従来は、誘発物質の姫加により、又は温度
に敏感な微生物の使用及び正確に保持されｍ温度変化に
よってのみそのような抑制又は誘発を生せしめることが
可能であった。使用した誘発物質は多くの場合非常に高
く、誘発又は抑制のために通用した方法は複雑であり、
蛋白質の表現の制御のためには条件付きで好適である。
に敏感な微生物の使用及び正確に保持されｍ温度変化に
よってのみそのような抑制又は誘発を生せしめることが
可能であった。使用した誘発物質は多くの場合非常に高
く、誘発又は抑制のために通用した方法は複雑であり、
蛋白質の表現の制御のためには条件付きで好適である。
発明が解決しようとする課題
従って、本発明の課題はできるだけ容易な方法で所望の
遺伝子生成物の表現の制御差ひに高めた遺伝子生成物の
表現速度をできるだけ簡単な方法で可能とする組換ＤＮ
Ａ及び表現ベクターを製迫することである。
遺伝子生成物の表現の制御差ひに高めた遺伝子生成物の
表現速度をできるだけ簡単な方法で可能とする組換ＤＮ
Ａ及び表現ベクターを製迫することである。
課題を解決するための手段
］ンセンサス配列：
Ｔ ＴＴＴＣＴ ＡＡ Ｔ及び
ＤＮＡ−配列ＧＧＮ１ｏＧＣを有するプロモーター全含
有することを特徴とする組換ＤＮＡによりこの課題は解
決する。
ＤＮＡ−配列ＧＧＮ１ｏＧＣを有するプロモーター全含
有することを特徴とする組換ＤＮＡによりこの課題は解
決する。
ＤＮＡ−コンセンサス配列の存在により、その後方にる
り、かつＤＮＡ−配列ＧＧＮ１ｏＧＣ金有するプロモー
ターが酸素により抑制され、これに対し嫌気性条件下に
ホルミエートによりｄ発さｔしるということが生じる。
り、かつＤＮＡ−配列ＧＧＮ１ｏＧＣ金有するプロモー
ターが酸素により抑制され、これに対し嫌気性条件下に
ホルミエートによりｄ発さｔしるということが生じる。
有利にＤＮＡ−コンセンサス配列１５〜１５０塩基対が
プロモーターの制御下に表現される遺伝子の転写開始位
の上方に（すなわち５′−側に）存在し、この際プロモ
ーターはコンセンサス配列と転写開始位との間にある。
プロモーターの制御下に表現される遺伝子の転写開始位
の上方に（すなわち５′−側に）存在し、この際プロモ
ーターはコンセンサス配列と転写開始位との間にある。
特に有利ＶＣはコンセンサス配列８０〜１６０塩基対は
転写開始位の前方にある。
転写開始位の前方にある。
プロモーターとして好適であるのはｆｄｈＦ −プロモ
ーター、ヒドロｒテーゼ表現に必須の転写重量のプロモ
ーター又はｎｔｒＡ−依存プロモーターの必須ｍｇ酸成
分おるが、これらは前記のＤＮＡ−配列を有している。
ーター、ヒドロｒテーゼ表現に必須の転写重量のプロモ
ーター又はｎｔｒＡ−依存プロモーターの必須ｍｇ酸成
分おるが、これらは前記のＤＮＡ−配列を有している。
ｆｄｈＦ−プロモーターを便用てるのが有利である。
本発明のもう１つの課題は本発明による組換ＤＮＡを好
適なベクター中に組込んで貧有する表現ベクターでおる
。ベクターとしてはこの際通冨使用されるベクター、例
えばｐＢＲ５２２又はｐＵＣ−ベクターを便用てること
ができる。更に、本発明による表現ベクターはプロモー
ターの後方にポリリンカーを有しており、このポリリン
カーは多くの制限切断位の存在により任意の外来遺伝子
の組込みを容易にする。
適なベクター中に組込んで貧有する表現ベクターでおる
。ベクターとしてはこの際通冨使用されるベクター、例
えばｐＢＲ５２２又はｐＵＣ−ベクターを便用てること
ができる。更に、本発明による表現ベクターはプロモー
ターの後方にポリリンカーを有しており、このポリリン
カーは多くの制限切断位の存在により任意の外来遺伝子
の組込みを容易にする。
本発明のもう１つの課題はシラスミドｐＢＮ８０、ＤＳ
Ｍ ４０７３であジ、これはｆｄｈＦ−遺伝子の上方域
＊−２４０塩基から翻訳開始置割で含有することに％徴
とする。このｆｄｈＦ−遺伝子の上方域に前記のＤＮＡ
−コンセンサス配列、並びにＤＮＡ配列（）ＯＮＩＯＧ
ＣＱ有するｆｄｈＦ−プロモーターを有する。このプラ
スミドはＯ２により抑制可能であり、嫌気性条件下にホ
ルミエートによシ誘発可能なテトラサイタリン抵抗性を
示す。
Ｍ ４０７３であジ、これはｆｄｈＦ−遺伝子の上方域
＊−２４０塩基から翻訳開始置割で含有することに％徴
とする。このｆｄｈＦ−遺伝子の上方域に前記のＤＮＡ
−コンセンサス配列、並びにＤＮＡ配列（）ＯＮＩＯＧ
ＣＱ有するｆｄｈＦ−プロモーターを有する。このプラ
スミドはＯ２により抑制可能であり、嫌気性条件下にホ
ルミエートによシ誘発可能なテトラサイタリン抵抗性を
示す。
しかしながら、好適な制限ヌクレアーゼで切断し、かつ
他の外来遺伝子をこのシラスミド中に挿入し、かつこの
人埃を前記の方法で制御することも可能である。
他の外来遺伝子をこのシラスミド中に挿入し、かつこの
人埃を前記の方法で制御することも可能である。
本発明のもう１つの課題は本発明による組換ＤＮＡの製
法であり、この方法は０２により抑制可能であシ、嫌気
性条件下にホルミエートによυ誘発可能である遺伝子を
含有する、微生物の遺伝子バンクからコンセンサス配列
を有するＤＮＡ配列を公知法で同定し、単離し、かつ好
適なプロモーターと結合することを特徴とする◎このＤ
ＮＡ−配列の同定のために、例えば指示遺伝子とのハイ
ブリッジ化又はカップリング及び好気性及び嫌気性条件
下での表現検査を実施することができる。
法であり、この方法は０２により抑制可能であシ、嫌気
性条件下にホルミエートによυ誘発可能である遺伝子を
含有する、微生物の遺伝子バンクからコンセンサス配列
を有するＤＮＡ配列を公知法で同定し、単離し、かつ好
適なプロモーターと結合することを特徴とする◎このＤ
ＮＡ−配列の同定のために、例えば指示遺伝子とのハイ
ブリッジ化又はカップリング及び好気性及び嫌気性条件
下での表現検査を実施することができる。
Ｅ、コリ、ＤＳＭ２０９３、ＤＳＭ ２１０２又はサル
七ネラ・テフイムリウム（Ｓａ１ｍｏｎθｌｌａｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｊｕｍ ）、ＤＳＭ ５ 、＃ ４からＤＮ
Ａ−配列を単離てるのが有利である。組換ＤＮＡの製法
と同様にして、コンセンサス配列のみを含有するＤＮＡ
−７ラグメントのかわりに、コンセンサス配列並ひにＤ
ＮＡ−配列ＧＧＮ１ｏＧＣ’ ｋ有するプロモーター全
含有する、ホルミエートにより誘発可能で０２により抑
制可能な遺伝子の全上方域を単離することもできる。こ
のことは、ｆｄｈＦ−遺伝子の上方域又はヒドロｒテー
ゼ表現に必須の転写単位の上方域を単離することによっ
ても有利に災施さｎる。
七ネラ・テフイムリウム（Ｓａ１ｍｏｎθｌｌａｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｊｕｍ ）、ＤＳＭ ５ 、＃ ４からＤＮ
Ａ−配列を単離てるのが有利である。組換ＤＮＡの製法
と同様にして、コンセンサス配列のみを含有するＤＮＡ
−７ラグメントのかわりに、コンセンサス配列並ひにＤ
ＮＡ−配列ＧＧＮ１ｏＧＣ’ ｋ有するプロモーター全
含有する、ホルミエートにより誘発可能で０２により抑
制可能な遺伝子の全上方域を単離することもできる。こ
のことは、ｆｄｈＦ−遺伝子の上方域又はヒドロｒテー
ゼ表現に必須の転写単位の上方域を単離することによっ
ても有利に災施さｎる。
本発明のもう１つの昧顕に本発明による組換ＤＮＡ ｋ
含有する、本発明による表現ベクターの製法でメジ、こ
の際前記のように単離した、コンセンサス配列全好適な
プロモータと結合して含有する、組換ＤＮＡ−配夕ＩＪ
’（ｒ又はコンセンサス配列並ひにプロモーターを含
有する、ホルミエートにより誘発可能で、０２により抑
制可能な遺伝子の上方域全場合により付加的にポリリン
カーと共に好ｌＩＭなベクター中に押入する。この際ベ
クターとしては前記のベクター並ひに外米遺伝子の表現
に常用の好適なベクターを挙げることができる。
含有する、本発明による表現ベクターの製法でメジ、こ
の際前記のように単離した、コンセンサス配列全好適な
プロモータと結合して含有する、組換ＤＮＡ−配夕ＩＪ
’（ｒ又はコンセンサス配列並ひにプロモーターを含
有する、ホルミエートにより誘発可能で、０２により抑
制可能な遺伝子の上方域全場合により付加的にポリリン
カーと共に好ｌＩＭなベクター中に押入する。この際ベ
クターとしては前記のベクター並ひに外米遺伝子の表現
に常用の好適なベクターを挙げることができる。
プラスミドｐＢＮ ８０、ＤＡＭ ４０７３ ｐの本発
明による製法は、ｆｄｈＦ−遺伝子の上方域−２４０ｂ
ｐから翻訳開始置割２ｐｓｔｌ及びＥｇｌ ［１で切断
したベクターｐＧＡ ４３、ＤＳＭ ４０６８ Ｐ中に
挿入することを特徴とする。
明による製法は、ｆｄｈＦ−遺伝子の上方域−２４０ｂ
ｐから翻訳開始置割２ｐｓｔｌ及びＥｇｌ ［１で切断
したベクターｐＧＡ ４３、ＤＳＭ ４０６８ Ｐ中に
挿入することを特徴とする。
誘発可能で抑制可能な、遺伝子の表現のために前記のよ
うな組換ＤＮＡ又は表現ベクターを本発明により使用す
る際に、誘発が味気性条件下にホルミエートにより、抑
制が０２により行なわｔしることを％徴とする。
うな組換ＤＮＡ又は表現ベクターを本発明により使用す
る際に、誘発が味気性条件下にホルミエートにより、抑
制が０２により行なわｔしることを％徴とする。
この際この表現は、このためにエンテロバクテリアツエ
ー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ）の好適
な微生物中で、有利にＥ、コリ又はサルモネラ・テフイ
ムリウム中で実施することができる。
ー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ）の好適
な微生物中で、有利にＥ、コリ又はサルモネラ・テフイ
ムリウム中で実施することができる。
表現をｎｔｒＡ ７’ラスである宿主菌株中で実施する
のが有利である。
のが有利である。
ｎｔｒＡ−遺伝子生成物は微生物の嫌気的代謝で崖要な
役割上はた丁。丁なわち、ｎｔｒＡ−遺伝子生成物は、
ＲＮＡ−ポリメラーゼ酵素のプロモーター選択ｆｆ：を
、本発明の組換ＤＮＡ及び表現ベクター中に含有さ几る
コンセンサス配列及びプロモーター配列をより良好に知
ることができるように俊χるシグマファクターである。
役割上はた丁。丁なわち、ｎｔｒＡ−遺伝子生成物は、
ＲＮＡ−ポリメラーゼ酵素のプロモーター選択ｆｆ：を
、本発明の組換ＤＮＡ及び表現ベクター中に含有さ几る
コンセンサス配列及びプロモーター配列をより良好に知
ることができるように俊χるシグマファクターである。
本発明の組換ＤＮＡ又は表現ベクターの使用はｎｔｒＡ
−遺伝子の存在なしでも１Ｊ能であるか、ｎｔｒＡ遺伝
子生成物に外来遺伝子の表現勿者しく強化する。
−遺伝子の存在なしでも１Ｊ能であるか、ｎｔｒＡ遺伝
子生成物に外来遺伝子の表現勿者しく強化する。
ｎｔｒＡ″″である宿王凶株を使用てる時、それにもか
かわらず該細胞がｎｔｒＡ−遺伝子生成物を供給するた
めの２つの可酢性がある。可能性の１つはｎｔｒＡ−遺
伝子音、所望の外来遺伝子をも有する組換ＤＮＡ又は表
現ベクター中に組込み、こうして外来遺伝子のＬ’ｅｔ
ｊＡとｎｔｒＡ遺伝子生成物の表現とｔ同時に達＆する
か、又は宿主細胞中の付加的なベクター上にｎｔｒＡ−
遺伝子全組込むことでるる。ｎｔｒＡ−遺伝子の生成は
、ｎ ｔ、ｒ Ａ−遺伝千生＊Ｗにより２″ラスの影響
ヲ受ける外米遺伝子の生地から独立している。
かわらず該細胞がｎｔｒＡ−遺伝子生成物を供給するた
めの２つの可酢性がある。可能性の１つはｎｔｒＡ−遺
伝子音、所望の外来遺伝子をも有する組換ＤＮＡ又は表
現ベクター中に組込み、こうして外来遺伝子のＬ’ｅｔ
ｊＡとｎｔｒＡ遺伝子生成物の表現とｔ同時に達＆する
か、又は宿主細胞中の付加的なベクター上にｎｔｒＡ−
遺伝子全組込むことでるる。ｎｔｒＡ−遺伝子の生成は
、ｎ ｔ、ｒ Ａ−遺伝千生＊Ｗにより２″ラスの影響
ヲ受ける外米遺伝子の生地から独立している。
宿主細胞中に挿入するために、宿主細胞のそれに相応す
るｎｔｒＡ−遺伝子を組換ＤＮＡ又は表現ベクターを介
して、又は付加的なベクター上で使用するのが有利であ
る。こうして異種のｎｔｒＡ−遺伝子生成物する除より
も明らかに艮好な結果が得られる（第１表、最終行）。
るｎｔｒＡ−遺伝子を組換ＤＮＡ又は表現ベクターを介
して、又は付加的なベクター上で使用するのが有利であ
る。こうして異種のｎｔｒＡ−遺伝子生成物する除より
も明らかに艮好な結果が得られる（第１表、最終行）。
本発明による組換ＤＮＡ及び衣説ベクターにより外来遺
伝子の表現？Ｉｌ−制＠することが容易な方法で可能で
める。こうして、例えは、使用した倣生物の好気性早期
成長期において、場合による外来遺伝子の表現の妨害を
抑さえる。後期対数的嫌気性成長期への移行において、
表現は微生物により生じたホルミエートにより誘発され
、倣生物の瓜長媒体中へのホルミエートの癌加により表
現の強化が達せられる。ｄ発物負の炸加は異なる成長期
において細胞を外来遺伝子の表現のために刺激し、この
ことが更なるｈＸ、長を場合により阻害し、かつ＃Ｉ肥
自体にマイナスに影響することもめるのだが、前記のよ
うにしてこれらのことを回避することができる。嫌気性
故期対数的成艮勘において、和ｊ胞は十分に處長し、最
適な密度を連取した。この際自動的に酸素限界が生じ、
発酵技術的Ｖこさらに強化又は制御されうる。微生物の
鍋い細胞密度により最適ｌ外米遺伝子の懺現が達せらｎ
る。
伝子の表現？Ｉｌ−制＠することが容易な方法で可能で
める。こうして、例えは、使用した倣生物の好気性早期
成長期において、場合による外来遺伝子の表現の妨害を
抑さえる。後期対数的嫌気性成長期への移行において、
表現は微生物により生じたホルミエートにより誘発され
、倣生物の瓜長媒体中へのホルミエートの癌加により表
現の強化が達せられる。ｄ発物負の炸加は異なる成長期
において細胞を外来遺伝子の表現のために刺激し、この
ことが更なるｈＸ、長を場合により阻害し、かつ＃Ｉ肥
自体にマイナスに影響することもめるのだが、前記のよ
うにしてこれらのことを回避することができる。嫌気性
故期対数的成艮勘において、和ｊ胞は十分に處長し、最
適な密度を連取した。この際自動的に酸素限界が生じ、
発酵技術的Ｖこさらに強化又は制御されうる。微生物の
鍋い細胞密度により最適ｌ外米遺伝子の懺現が達せらｎ
る。
非常に関心のめる蛋白質の生産のために本発明による表
現ベクター全使用すると、高価で複雑な幼発（誘発物置
の亦加、温度変換等）をもはや必晋としなくなるので、
安１曲で簡単な制御可能ａか得られる。
現ベクター全使用すると、高価で複雑な幼発（誘発物置
の亦加、温度変換等）をもはや必晋としなくなるので、
安１曲で簡単な制御可能ａか得られる。
実施例
次に図面と関連させて実施例につき本発明を詳細に祝明
する。
する。
例 １
ｆｄｈＦ −１ａｃ −Ｚ −１１８１合プラスミドの
構造プラスミドｐＢＮ ２、ＤＳＭ ４０７２ ＰのＡ
ａｔ Ｉｔ−７ラグメント（約１．５ ｋｌ） ）、ｆ
ｄｈＦ −１ｅ、ｃ −Ｚ−Ｘ合７′２スミｈ’ （Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
構造プラスミドｐＢＮ ２、ＤＳＭ ４０７２ ＰのＡ
ａｔ Ｉｔ−７ラグメント（約１．５ ｋｌ） ）、ｆ
ｄｈＦ −１ｅ、ｃ −Ｚ−Ｘ合７′２スミｈ’ （Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ 、第８６巻（１９８６年）、第４６５０〜４６
５４貴を肖製用アガロース・グル電気原動によシ単離し
、異なる長さで、２０℃でＤＮＡＢａ １３１エキンヌ
クレアーゼ０．２０ ／ ｐｇと恒温保持する。ＤＮＡ
−ポリメラーゼ（フレノウフラグメントンで突出する５
′−末端全光たした後、該フラグメントｆ ＥｃｏＲＩ
−リンカ−（ａｏＧＡＡＴＴｃｃ ）と結合し、引き続
き制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで
消化する。調製用アガロース−グル電気原動によりフラ
グメントｍ合物７分離し、三つの大きなフラクション（
長さマーカーとして公知の大きさの制限フラグメントと
比較ンをｒルから＃５離する。このフラグメントをプラ
スミドｐＭＣ１４０３、ＤＳＭ４０６７ｐのマルチリン
カ−位でクローン化操作した。この際レシピエンドとし
てニＥ、コリＦＭ５Ｍ１、ＤＳＭ ４０６６ Ｐ （Ｍ
Ｃ４１００、ｆｄｈＦ 、 ｒｅｃ Ａ ５６．１ａ
ｃ−） ’（使用する。上方域の５′−側から短かくし
たクローンがここから生じた。第２の工程においてに、
最も短かいクローン、ｐＢＮ ２０８、ＤＳＭ ４０６
９が単離され、ＥｃｏＲＩでの消化により線状となり、
ＤＮＡ Ｂａ１３１０．１Ｕ／μ９と共に２０°Ｃで恒
温保持した。突出した５′−才端の充填の後、ＥｃｏＲ
ｒ −ＩＪンカー金再たひ結合させ、次にＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩ及びＣ１ａ！で切断した。一連のフラグメントが
生じ、これはＥｃｏＲＩ ／ Ｃ１ａ ｌ−消化ベクタ
ーｐＭＣ１４０３、ＤＳＭ ４０６７ ｐ中にバックク
ローン化した。得られたプラスミＶを新たにＥ、コリ菌
株ＦＭ９１１中で形質転換した。両方のクローン、ｐＢ
Ｎ２１０、ＤＳＭ４０７０Ｆ、及びｐＢＮ ２１１、Ｄ
ＳＭ４０７１Ｐを＊離した。
５４貴を肖製用アガロース・グル電気原動によシ単離し
、異なる長さで、２０℃でＤＮＡＢａ １３１エキンヌ
クレアーゼ０．２０ ／ ｐｇと恒温保持する。ＤＮＡ
−ポリメラーゼ（フレノウフラグメントンで突出する５
′−末端全光たした後、該フラグメントｆ ＥｃｏＲＩ
−リンカ−（ａｏＧＡＡＴＴｃｃ ）と結合し、引き続
き制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで
消化する。調製用アガロース−グル電気原動によりフラ
グメントｍ合物７分離し、三つの大きなフラクション（
長さマーカーとして公知の大きさの制限フラグメントと
比較ンをｒルから＃５離する。このフラグメントをプラ
スミドｐＭＣ１４０３、ＤＳＭ４０６７ｐのマルチリン
カ−位でクローン化操作した。この際レシピエンドとし
てニＥ、コリＦＭ５Ｍ１、ＤＳＭ ４０６６ Ｐ （Ｍ
Ｃ４１００、ｆｄｈＦ 、 ｒｅｃ Ａ ５６．１ａ
ｃ−） ’（使用する。上方域の５′−側から短かくし
たクローンがここから生じた。第２の工程においてに、
最も短かいクローン、ｐＢＮ ２０８、ＤＳＭ ４０６
９が単離され、ＥｃｏＲＩでの消化により線状となり、
ＤＮＡ Ｂａ１３１０．１Ｕ／μ９と共に２０°Ｃで恒
温保持した。突出した５′−才端の充填の後、ＥｃｏＲ
ｒ −ＩＪンカー金再たひ結合させ、次にＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩ及びＣ１ａ！で切断した。一連のフラグメントが
生じ、これはＥｃｏＲＩ ／ Ｃ１ａ ｌ−消化ベクタ
ーｐＭＣ１４０３、ＤＳＭ ４０６７ ｐ中にバックク
ローン化した。得られたプラスミＶを新たにＥ、コリ菌
株ＦＭ９１１中で形質転換した。両方のクローン、ｐＢ
Ｎ２１０、ＤＳＭ４０７０Ｆ、及びｐＢＮ ２１１、Ｄ
ＳＭ４０７１Ｐを＊離した。
菌株２Ｍ９１１中でプラスミドｐＢＮ ２、ｐＢＮ２０
８、ｐＢＮ ２１０、ｐＢＮ ２１１、ｐＭｃ１４０３
の形質転換を主にコーヘン（Ｃｏｈｅｎ ）等により記
載さｎた方法（Ｃｏｈｅｎ 等者、１９７７年、ＰＮＡ
Ｓ第６９巻：第２１１０〜２１１４貞ンにより実施した
： 早期対数期細胞全ｏ ’ｃに冷却しｆｃｖｋに集め、引
き続き氷冷ＣａＣｔ２ （５０ｍＭ）での処理を行なっ
た。ＤＮＳの添加ｋＯ℃で行ない、がっＯｏＣで４５分
間恒温保持した後、熱衝撃（４分間、４３ ’Ｏ） ｋ
実施する。室温に冷却した後、この細胞を表現型発埃の
ために６７℃で１時間完全場地中で恒温保持する。デラ
スミ）−” ｐＢＮ ２、ｐＢＮ ２０８、ｐＢＮ ２
１０、ｐＢＮ ２１１、ｐＭＣ１４０６におけるアンピ
シリン抵抗による選択はアンピシリン１００μＭ／ＩＩ
Ｌｔでプレート上で行なう。
８、ｐＢＮ ２１０、ｐＢＮ ２１１、ｐＭｃ１４０３
の形質転換を主にコーヘン（Ｃｏｈｅｎ ）等により記
載さｎた方法（Ｃｏｈｅｎ 等者、１９７７年、ＰＮＡ
Ｓ第６９巻：第２１１０〜２１１４貞ンにより実施した
： 早期対数期細胞全ｏ ’ｃに冷却しｆｃｖｋに集め、引
き続き氷冷ＣａＣｔ２ （５０ｍＭ）での処理を行なっ
た。ＤＮＳの添加ｋＯ℃で行ない、がっＯｏＣで４５分
間恒温保持した後、熱衝撃（４分間、４３ ’Ｏ） ｋ
実施する。室温に冷却した後、この細胞を表現型発埃の
ために６７℃で１時間完全場地中で恒温保持する。デラ
スミ）−” ｐＢＮ ２、ｐＢＮ ２０８、ｐＢＮ ２
１０、ｐＢＮ ２１１、ｐＭＣ１４０６におけるアンピ
シリン抵抗による選択はアンピシリン１００μＭ／ＩＩ
Ｌｔでプレート上で行なう。
ベクターとｆｄｈＦ −ＤＮＡ−フラグメントとの正確
な結合位置、すなわちＥｃｏＲＩ −’）ンカーの位置
はマキサム（Ｍａｘａｍ ）及びイルバート（Ｇ１１ｂ
ｅｒｔ ）の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ。
な結合位置、すなわちＥｃｏＲＩ −’）ンカーの位置
はマキサム（Ｍａｘａｍ ）及びイルバート（Ｇ１１ｂ
ｅｒｔ ）の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ。
第６５巻、第４９９〜５６０員、１９８０年）に従って
、ＤＮＡ−配列決定により実施された。
、ＤＮＡ−配列決定により実施された。
第１ａ図及び第１ｂ図中には５′上方域を含むｆｄｈＦ
−遺伝子のヌクレオチド配列が示さノしている（第１ｂ
図には第１ａ図にｈ０載され７’Ｃ配列の続きの配列が
示されている）。ＡＴＧは翻訳の開始位を示す。図面か
らプラスミドｐＢＮ ２０８、ｐＢＮ ２１０及びｐＢ
Ｎ ２１１に関する残ったｆｄｈＦ−域を知ることがで
きる。
−遺伝子のヌクレオチド配列が示さノしている（第１ｂ
図には第１ａ図にｈ０載され７’Ｃ配列の続きの配列が
示されている）。ＡＴＧは翻訳の開始位を示す。図面か
らプラスミドｐＢＮ ２０８、ｐＢＮ ２１０及びｐＢ
Ｎ ２１１に関する残ったｆｄｈＦ−域を知ることがで
きる。
例 ２
−ｌグラミ）＝ｐＢＮ ２０８、ｐＢＮ ２１０及びｐ
ＢＮ２１１のβ−ガラクトシダーゼ−表現の比較例１に
員己叔したようにして得られたｆａｈＦ −１ａｃ Ｚ
−融合プラスミドを嫌気性及び好気性成長条件下にβ−
ガラクトシダーゼ活性の表現に関して央峡した。β−ガ
ラクトシダーゼ活性はＪ 、Ｈ，ミ ラ − （Ｍｉｎ
ｅｒ ； Ｅｘｐｅｒｊｍｅｎｔｓ ｊｎ ｍ
ｏｌｅ−ｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｊｃｓ 、Ｃｏｌ Ｓ
ｐｒｊｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ 、
Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ ＋ Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９７２年ン）によジ測定し、比活性ｋｉｔ
算した。結果は第２図に示す。第２図のＡ部分中には嫌
気性条件下での表現の結果を、８８１５分中には好気注
戟長条件下での表現の結果全示す。
ＢＮ２１１のβ−ガラクトシダーゼ−表現の比較例１に
員己叔したようにして得られたｆａｈＦ −１ａｃ Ｚ
−融合プラスミドを嫌気性及び好気性成長条件下にβ−
ガラクトシダーゼ活性の表現に関して央峡した。β−ガ
ラクトシダーゼ活性はＪ 、Ｈ，ミ ラ − （Ｍｉｎ
ｅｒ ； Ｅｘｐｅｒｊｍｅｎｔｓ ｊｎ ｍ
ｏｌｅ−ｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｊｃｓ 、Ｃｏｌ Ｓ
ｐｒｊｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ 、
Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ ＋ Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９７２年ン）によジ測定し、比活性ｋｉｔ
算した。結果は第２図に示す。第２図のＡ部分中には嫌
気性条件下での表現の結果を、８８１５分中には好気注
戟長条件下での表現の結果全示す。
横座標には欠失の位置を示すが、これは翻訳開始ｆｉｌ
（位置＋１）創のエコ・リンカ−の位置を衣わ丁。−
２４０におけるエコ・リンカ−はグラ。
（位置＋１）創のエコ・リンカ−の位置を衣わ丁。−
２４０におけるエコ・リンカ−はグラ。
スミドｐＢＮ ２０８であり、−２１０はプラスミドｐ
ＢＮ ２１０及び−１４３はプラスミドｐＢＮ２１１で
ある。ニトレートｔ” １０ ｍｍｏｔの墓で、ホルミ
エートｋ ３ Ｄ ｍｍｏｔの最終濃度でざト加する。
ＢＮ ２１０及び−１４３はプラスミドｐＢＮ２１１で
ある。ニトレートｔ” １０ ｍｍｏｔの墓で、ホルミ
エートｋ ３ Ｄ ｍｍｏｔの最終濃度でざト加する。
例 ６
プラスミドｐＢＮ ８０ 、 ＤＳＭ ４０７３ Ｐ
の製造プラスミドｐＢＮ ２０８の１．１１１ｃｂＢａ
ｍＨＩ ／ＰｓｔＩフラグメンｌｔ−調製用ｒｋ電気激
動で単離し、引き続き制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉ及びＢｇｌｕで切断されたベクターｐＧＡ ４６゜Ｄ
ＳＭ ４０６８ Ｐ中にクローン化操作する。組換プラ
スミド中でこれによジβ−ラクタマーゼ遺伝子が再徊成
される。結合したプラスミドｐＢＮ８０、ＤＳＭ４０７
３ ｐｋｓ プラスミドｐＢＮ ２、ｐＢＮ ２０８、
ｐＢＮ ２１０、ｐＢＮ ２１１及びｐＭＣ１４０６に
関して例１でｉ已載したように、Ｅ。
の製造プラスミドｐＢＮ ２０８の１．１１１ｃｂＢａ
ｍＨＩ ／ＰｓｔＩフラグメンｌｔ−調製用ｒｋ電気激
動で単離し、引き続き制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉ及びＢｇｌｕで切断されたベクターｐＧＡ ４６゜Ｄ
ＳＭ ４０６８ Ｐ中にクローン化操作する。組換プラ
スミド中でこれによジβ−ラクタマーゼ遺伝子が再徊成
される。結合したプラスミドｐＢＮ８０、ＤＳＭ４０７
３ ｐｋｓ プラスミドｐＢＮ ２、ｐＢＮ ２０８、
ｐＢＮ ２１０、ｐＢＮ ２１１及びｐＭＣ１４０６に
関して例１でｉ已載したように、Ｅ。
コ！Ｊ ＦＭ ９１１中で形質転換した。従って、組換
グラスミＶでの形質転換による選択はクロラムフェニコ
ールａ抗（３０μｇ／酊＞及びｙンビシリン抵抗（１０
０μ＆／！ｎｔ）により行なわれた。得られたクローン
は好気性及び嫌気性条件下にそのテトラサイクリン抵抗
に関して調べた。燐酸塩緩衝（ｐｉ−１７）完全培地（
０，８％グルコース含有）含有するグレート上で、該ク
ローンは好気性条件下にテトラサイタリン感作性である
。嫌気性条件下にはテトラサイクリン抵抗性で表現し、
ホルミエート（３０ｍＭ）で酵発される。これに対して
、ニトレート５０ｍＭの存在下で嫌気性条件下で、クロ
ーンはテトラサイタリン感作性である。
グラスミＶでの形質転換による選択はクロラムフェニコ
ールａ抗（３０μｇ／酊＞及びｙンビシリン抵抗（１０
０μ＆／！ｎｔ）により行なわれた。得られたクローン
は好気性及び嫌気性条件下にそのテトラサイクリン抵抗
に関して調べた。燐酸塩緩衝（ｐｉ−１７）完全培地（
０，８％グルコース含有）含有するグレート上で、該ク
ローンは好気性条件下にテトラサイタリン感作性である
。嫌気性条件下にはテトラサイクリン抵抗性で表現し、
ホルミエート（３０ｍＭ）で酵発される。これに対して
、ニトレート５０ｍＭの存在下で嫌気性条件下で、クロ
ーンはテトラサイタリン感作性である。
例 ４
ｆｄｈＦ −１ａｃＺ−融合遺伝子の表現に関するｎｔ
ｒＡ−突然装具の効果 ｎｔｒＡ−遺伝子中での突然変異の影響を調べるために
、ｆｄｈＦ −１ａｃＺ−融合遺伝子を含有するプラス
ミドｐＢＮ ２０８、ＤＡＭ ４０６９で形質転換され
た、２釉の異なるＥ、コリ菌株中でβ−ガラクトシダー
ゼ活性１−［気性及び好気性条件下に調べた。このため
にはｎｔｒＡ ｆラスであるＥ、コリ凶株ＦＭ ９０９
、ＤＳＭ ４２７９並ひにｎｔｒＡマイナスでめるＥ、
コリ菌株ＢＮ ９５０、ＤＳＭ ４２７８を使用する。
ｒＡ−突然装具の効果 ｎｔｒＡ−遺伝子中での突然変異の影響を調べるために
、ｆｄｈＦ −１ａｃＺ−融合遺伝子を含有するプラス
ミドｐＢＮ ２０８、ＤＡＭ ４０６９で形質転換され
た、２釉の異なるＥ、コリ菌株中でβ−ガラクトシダー
ゼ活性１−［気性及び好気性条件下に調べた。このため
にはｎｔｒＡ ｆラスであるＥ、コリ凶株ＦＭ ９０９
、ＤＳＭ ４２７９並ひにｎｔｒＡマイナスでめるＥ、
コリ菌株ＢＮ ９５０、ＤＳＭ ４２７８を使用する。
Ｅ、コリ菌株を、グルタミン０．２％（Ｗ／Ｖ）及び提
示量のホルミエート又はニトレートを言上するＴＧＹＥ
Ｐ培地、ｐ）１６．５ （Ｂｅｇｇ 等、１９７７年、
ＦＥＭＳ Ｍｊ ｋｒｏ−ｂｊｏｌ、 Ｌｅｔ、 ２
： ４７〜５７ 頁）中で培養した。
示量のホルミエート又はニトレートを言上するＴＧＹＥ
Ｐ培地、ｐ）１６．５ （Ｂｅｇｇ 等、１９７７年、
ＦＥＭＳ Ｍｊ ｋｒｏ−ｂｊｏｌ、 Ｌｅｔ、 ２
： ４７〜５７ 頁）中で培養した。
史に、菌株ＢＮ ９５０ 、 ＤＳＭ ４２７８奮６つ
の七の他のプラスミド、すなわちｐＢＮ １７ 、ＤＳ
Ｍ４２８０ Ｐ ％ ］）ＢＮ １８ （例６参照〕、
及びｐＢＮ６１、ＤＳＭ ４２８１ ｐで形質転換した
。両方のプラスミドｐＢＮ １７及びｐＢＮ １８はタ
レブシエラ・デノイモニアｘ （Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ
ｐｎｅｕｍＯｒ＞ｊａ６ ）からのｎｔｒＡ−遺伝子を
異なる方向づけでベクター中に組込んで含有する。グラ
スミＰ ｐＢＮ６１はＥ、コリからのｎｔｒＡ−遺伝子
全ベクター中に挿入して含有する。これハＥ、コＩＪ
−ＤＮＡからの２．７ ｋ′ｂの大きさの７ラグメント
をベクターｐＡＣＹＣ１８４（、Ｔ、 Ｂａｃｔｅｒｊ
ｏｌ、 １３４ （１９７８）、第１１４１〜１１５６
頁）のＢａｍＨＩ−切断位に挿入することによシ製輩さ
れる。この形質転換した菌株に関しても、Ｅ、コリ菌株
の提示した培養培地中でβ−ガラクトシダーゼの表現に
関して試験し、結果を第１衣に示した。
の七の他のプラスミド、すなわちｐＢＮ １７ 、ＤＳ
Ｍ４２８０ Ｐ ％ ］）ＢＮ １８ （例６参照〕、
及びｐＢＮ６１、ＤＳＭ ４２８１ ｐで形質転換した
。両方のプラスミドｐＢＮ １７及びｐＢＮ １８はタ
レブシエラ・デノイモニアｘ （Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ
ｐｎｅｕｍＯｒ＞ｊａ６ ）からのｎｔｒＡ−遺伝子を
異なる方向づけでベクター中に組込んで含有する。グラ
スミＰ ｐＢＮ６１はＥ、コリからのｎｔｒＡ−遺伝子
全ベクター中に挿入して含有する。これハＥ、コＩＪ
−ＤＮＡからの２．７ ｋ′ｂの大きさの７ラグメント
をベクターｐＡＣＹＣ１８４（、Ｔ、 Ｂａｃｔｅｒｊ
ｏｌ、 １３４ （１９７８）、第１１４１〜１１５６
頁）のＢａｍＨＩ−切断位に挿入することによシ製輩さ
れる。この形質転換した菌株に関しても、Ｅ、コリ菌株
の提示した培養培地中でβ−ガラクトシダーゼの表現に
関して試験し、結果を第１衣に示した。
例 ５
ｐＢＮ １７の製造
プラスミドｐＭＭ １７の０１ａＩ−フラグメント１．
９６ｋｂ（配列： Ｎｕｃｌ、 Ａｃｊｄｓ Ｒｅｓ、
第１６巻（１９８５）、第７６０７〜７６２０頁）ｔＣ
ｌａＩ−切防位中のベクターｐへ〇Ｙｃ １８４ （Ｊ
−Ｂａｃｔｅｒｊｏｌ、第１６４巻、１９７８年、第１
１４１〜１１５６貞）中にクローン化操作する。このｗ
ｎｔｒＡ−遺伝子を含有し、かつＥｃｏＲＶでの処理
に２いて長さ１．３５ｋｌ）／７５０ｍ）及び６．８３
ｋｂの７ラグメントに切断されるベクターｐＢＮ１７
（ＤＳＭ ４２８０ ｐ ）が得られる。
９６ｋｂ（配列： Ｎｕｃｌ、 Ａｃｊｄｓ Ｒｅｓ、
第１６巻（１９８５）、第７６０７〜７６２０頁）ｔＣ
ｌａＩ−切防位中のベクターｐへ〇Ｙｃ １８４ （Ｊ
−Ｂａｃｔｅｒｊｏｌ、第１６４巻、１９７８年、第１
１４１〜１１５６貞）中にクローン化操作する。このｗ
ｎｔｒＡ−遺伝子を含有し、かつＥｃｏＲＶでの処理
に２いて長さ１．３５ｋｌ）／７５０ｍ）及び６．８３
ｋｂの７ラグメントに切断されるベクターｐＢＮ１７
（ＤＳＭ ４２８０ ｐ ）が得られる。
例 ６
ｐＢＮ １８の製造
ｐＢＮ １８はｐＢＮ １７と同様に逆の方向つけでｎ
ｔ ｒ Ａ−遺伝子を有しており、かつＣ１ａＩでの
ｐＢＮ １７の切断及び引きＭ ＜ Ｔ、 −＋）ガー
ゼでの結合により製造される。
ｔ ｒ Ａ−遺伝子を有しており、かつＣ１ａＩでの
ｐＢＮ １７の切断及び引きＭ ＜ Ｔ、 −＋）ガー
ゼでの結合により製造される。
プラスミドｐＢＮ １８にＥｃｏＲＶでの処理によシ長
さ１．３５ｋｌ）／１５０１）及び４．４３ ｋｂのフ
ラグメントが得られる。
さ１．３５ｋｌ）／１５０１）及び４．４３ ｋｂのフ
ラグメントが得られる。
第１ａ図及び第１ｂ図は５′−上方域を言むｆｄｈＦ−
遺伝子のヌクレオチド配列を示す図であり；第２１￥１
は嫌気性培養条件（Ａ）下及び好気性培養条件ＣＢ）下
にプラスミドｐＢＮ ２０８、ｐＢＮ ２１０及びｐＢ
Ｎ ２１１の表埃によるβ−ガラクトシダーゼ活性を示
すグラフ図でおる。
遺伝子のヌクレオチド配列を示す図であり；第２１￥１
は嫌気性培養条件（Ａ）下及び好気性培養条件ＣＢ）下
にプラスミドｐＢＮ ２０８、ｐＢＮ ２１０及びｐＢ
Ｎ ２１１の表埃によるβ−ガラクトシダーゼ活性を示
すグラフ図でおる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、コンセンサス配列： ▲数式、化学式、表等があります▼ 及びＤＮＡ−配列ＧＧＮ＿１＿０ＧＣを有するプロモー
ターを含有することを特徴とする組換ＤＮＡ。 ２、コンセンサス−配列１５〜１５０塩基対がプロモー
ターの制御下に表現される遺伝子の転写開始位から上方
に、かつプロモーターがコンセンサス配列と転写開始位
との間に存在する請求項１記載の組換ＤＮＡ。 ３、コンセンサス配列８０〜１３０ｂｐが転写開始位の
前に存在する請求項２記載の組換 ４、ヒドロゲナーゼ表現に必須な転写単位のプロモータ
ー又はｆｄｈＦ−プロモーターを含有する請求項１から
３までのいずれか１項記載の組換ＤＮＡ。 ５、ｎｔｒＡ−依存プロモーターの必須構成成分を含有
する請求項１から３までのいずれか１項記載の組換ＤＮ
Ａ。 ６、請求項１から５による組換ＤＮＡを好適なベクター
中に組み込んで含有することを特徴とする表現ベクター
。 ７、外来遺伝子の組込みのためにポリリンカーを付加的
に含有する請求項６記載の表現ベクター。 ８、ｆｄｈＦ−プロモーターを含めてｆｄｈＦ−の上方
域−２４０ｂｐから翻訳開始位までを含有することを特
徴とするプラスミドｐＢＮ８０、ＤＳＭ４０７３Ｐ ９、Ｏ＿２により抑制可能であり、嫌気性条件下にホル
ミエートにより誘発可能である遺伝子を含有する微生物
の遺伝子バンクからコンセンサス配列を有するＤＮＡ−
配列を公知法により同定し、単離し、かつ好適なプロモ
ーターと結合することを特徴とする請求項１から５まで
のいずれか１項記載の組換ＤＮＡの製法。 １０、エンテロ・バクテリアツエーの群からの微生物の
遺伝子バンクからＤＮＡ−配列を単離する請求項９記載
の方法。 １１、Ｅ．コリ、ＤＳＭ２０９３又は２１０２、又はサ
ルモネラ・チフイムリウム、ＤＳＭ５５４からＤＮＡ−
配列を単離する請求項１０記載の方法。 １２、コンセンサス配列及びプロモーターを含有する、
ホルミエートにより誘発可能で、Ｏ＿２により抑制可能
な遺伝子の全上方域を単離する請求項９から１１までの
いずれか１項記載の方法。 １３、ｆｄｈＦ−遺伝子の上方域を単離する請求項１２
記載の方法。 １４、ヒドロゲナーゼ表現に関して必須の転写単位のプ
ロモーターの上方域を単離する請求項１２記載の方法。 １５、コンセンサス配列及びプロモーターを含有する単
離組換ＤＮＡ−配列を場合によりポリリンカーと共に好
適なベクター中に挿入することを特徴とする請求項６又
は７による表現ベクターを製造するための請求項９から
１４までのいずれか１項記載の方法。 １６、−２４０ｂｐから翻訳開始位までのｆｄｈＦ−遺
伝子の上方域Ｐｓｔ I 及びＢｇｌIIで切断したベクタ
ーｐＧＡ４６、ＤＳＭ４０６８Ｐ中に組込むことを特徴
とする請求項８によるプラスミドｐＢＮ８０、ＤＳＭ４
０７３Ｐを製造するための請求項１３記載の方法。 １７、請求項１から５又は８のいずれか１項による組換
ＤＮＡ又は請求項６又は７による表現ベクターを使用し
、誘発が嫌気性条件下にホルミエートにより、抑制がＯ
＿２により生じることを特徴とする誘発可能で、抑制可
能な外来遺伝子の表現法。 １８、Ｅ．コリ又はサルモネラ・チフイリウム中で表現
を実施する請求項１７記載の表現法。 １９、ｎｔｒ＿Ａプラスである宿主菌株中で実施する請
求項１７又は１８記載の表現法。 ２０、表現をｎｔｒ＿Ａ＾−である宿主菌株中で実施し
、かつｎｔｒ＿Ａ−遺伝子を組換ＤＮＡ又は表現ベクタ
ー中に組込む請求項１７又は１８記載の表現法。 ２１、ｎｔｒ＿Ａ＾−である宿主菌株を使用し、付加的
なベクター上のｎｔｒ＿Ａ−遺伝子を宿主細胞中に挿入
する請求項１７又は１８記載の表現法。 ２２、宿主細胞のそれに相応するｎｔｒ＿Ａ−遺伝子を
使用する請求項２０又は２１記載の表現法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873710633 DE3710633A1 (de) | 1987-03-31 | 1987-03-31 | Rekombinante dna zur reprimierbaren und induzierbaren expression von fremdgenen |
| DE3710633.3 | 1987-03-31 | ||
| DE19873735381 DE3735381A1 (de) | 1987-03-31 | 1987-10-19 | Rekombinante dna zur reprimierbaren und induzierbaren expression von fremdgenen |
| DE3735381.0 | 1987-10-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63254985A true JPS63254985A (ja) | 1988-10-21 |
| JPH0829099B2 JPH0829099B2 (ja) | 1996-03-27 |
Family
ID=25854113
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63073505A Expired - Lifetime JPH0829099B2 (ja) | 1987-03-31 | 1988-03-29 | 組換ｄｎａ、発現ベクター及びプラスミド、これらの製法及び誘発可能で抑制可能な外来遺伝子の発現法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4963482A (ja) |
| EP (1) | EP0285152B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0829099B2 (ja) |
| DE (2) | DE3735381A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006028063A1 (ja) * | 2004-09-09 | 2006-03-16 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | プロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5310654A (en) * | 1985-07-31 | 1994-05-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method for determining virulence of Yersinia |
| DE3926076A1 (de) * | 1989-04-21 | 1990-10-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinante dna und expressionsvektor |
| US5830720A (en) * | 1989-04-21 | 1998-11-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Recombinant DNA and expression vector for the repressible and inducible expression of foreign genes |
| JP3415145B2 (ja) * | 1991-03-05 | 2003-06-09 | ザ ウエルカム ファウンデーション リミテッド | 弱毒化細菌における組換えタンパク質の発現 |
| US6080849A (en) | 1997-09-10 | 2000-06-27 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence |
| AU749695B2 (en) | 1997-09-10 | 2002-07-04 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence |
| US6962696B1 (en) | 1999-10-04 | 2005-11-08 | Vion Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
-
1987
- 1987-10-19 DE DE19873735381 patent/DE3735381A1/de not_active Ceased
-
1988
- 1988-03-29 JP JP63073505A patent/JPH0829099B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-30 DE DE8888105219T patent/DE3877233D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-30 EP EP88105219A patent/EP0285152B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-31 US US07/175,780 patent/US4963482A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PROC.NATI.ACAD.SCI.USA=1986´Æ83´±4650-4654 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006028063A1 (ja) * | 2004-09-09 | 2006-03-16 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | プロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
| JPWO2006028063A1 (ja) * | 2004-09-09 | 2008-05-08 | 財団法人地球環境産業技術研究機構 | プロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
| JP4712716B2 (ja) * | 2004-09-09 | 2011-06-29 | 財団法人地球環境産業技術研究機構 | プロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
| US8604180B2 (en) | 2004-09-09 | 2013-12-10 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | DNA fragment having promoter function |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3877233D1 (de) | 1993-02-18 |
| EP0285152A2 (de) | 1988-10-05 |
| JPH0829099B2 (ja) | 1996-03-27 |
| US4963482A (en) | 1990-10-16 |
| EP0285152B1 (de) | 1993-01-07 |
| DE3735381A1 (de) | 1989-05-03 |
| EP0285152A3 (en) | 1989-11-15 |
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