WO2010082619A1 - 高発現プロモーターおよびこれを用いた遺伝子産物製造法 - Google Patents

高発現プロモーターおよびこれを用いた遺伝子産物製造法 Download PDF

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WO2010082619A1
WO2010082619A1 PCT/JP2010/050387 JP2010050387W WO2010082619A1 WO 2010082619 A1 WO2010082619 A1 WO 2010082619A1 JP 2010050387 W JP2010050387 W JP 2010050387W WO 2010082619 A1 WO2010082619 A1 WO 2010082619A1
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nucleic acid
gene
acid molecule
toxin
vector
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PCT/JP2010/050387
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純 櫻井
政博 永浜
真隆 小田
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大塚化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a high-expression promoter and a method for producing a gene product using the same, specifically, a nucleic acid molecule comprising a promoter region derived from a toxin gene of the genus Clostridium, and a heterologous operably linked to the nucleic acid molecule
  • the present invention relates to a nucleic acid construct containing a gene, a vector containing these, a host cell transformed with the vector, a method for producing a gene product and a production kit using the same.
  • Bacillus subtilis a Gram-positive bacterium, that has attracted attention as a bacterial species that does not have such drawbacks.
  • Bacillus subtilis does not have a pyrogen as described above, is not pathogenic, and often secretes gene products outside the cell. Therefore, it is useful for production of gene products to be applied to living bodies such as pharmaceuticals and foods.
  • Bacillus subtilis has the disadvantage that it produces less gene product than E. coli, which hinders industrial utilization of the same species.
  • One reason for the low production of Bacillus subtilis gene products is the absence of a promoter with excellent operability and expression efficiency, such as the lac promoter of Escherichia coli. Under such circumstances, attempts have been made to search for a promoter that works effectively in Bacillus subtilis.
  • Patent Document 1 discloses a promoter including a specific sequence
  • Patent Document 2 includes a hybrid promoter including an Bacillus amyloliquefaciens ⁇ -amylase gene promoter and an enhancer receptor derived from an alkaline protease gene of Bacillus subtilis.
  • Patent Document 3 discloses a DNA fragment capable of increasing the expression of a structural gene linked to a downstream region, including the upstream region of alkaline cellulase K-64
  • Patent Document 4 discloses an ⁇ -amylase gene promoter of Bacillus licheniformis.
  • a promoter derived from a mutant is a promoter including a modified AmyQ promoter sequence, a cryIIIA mRNA stabilizing sequence and a sequence in which these are arranged in tandem in Patent Document 5, and Patent Document 6 discloses an ⁇ -amylase gene of Bacillus amyloliquefaciens. Introducing a special sequence near the 3 'end of the promoter Patent Document 7 discloses a promoter derived from the upstream region of several genes expressed specifically in the stationary phase of Bacillus subtilis, and Non-Patent Document 1 discloses a promoter derived from the Bacillus brevis MWP gene. Are described respectively. However, satisfactory results have not been obtained with any of the above promoters, and further development of promoters has been demanded.
  • An object of the present invention is to provide a promoter capable of expressing a gene product in a large amount in Bacillus subtilis and a method for producing a gene product using the promoter.
  • the present inventors have linked the upstream sequence of the Clostridium toxin gene, particularly the Clostridium perfringens ⁇ toxin gene to a heterologous gene and expressed it in Bacillus subtilis.
  • the present inventors have found that the expression of gene products is dramatically increased and completed the present invention. That is, the present invention relates to the following.
  • a nucleic acid molecule comprising a promoter region derived from a Clostridial toxin gene, wherein the nucleic acid molecule enhances the expression of a heterologous gene operably linked thereto.
  • nucleic acid molecule according to (2) above wherein the toxin gene is selected from the group consisting of Clostridium perfringens alpha toxin, epsilon toxin and iota toxin, botulinum toxin, and tetanus toxin.
  • a nucleic acid construct comprising the nucleic acid molecule of (1) or (2) above and a heterologous gene operably linked thereto.
  • a vector comprising the nucleic acid molecule of (1) or (2) or the nucleic acid construct of (3).
  • a method for producing a gene product comprising the step of culturing the host cell of (5) above.
  • a gene product production kit comprising the nucleic acid molecule of (1) or (2), the nucleic acid construct of (3), the vector of (4), and / or the host cell of (5).
  • the expression of various gene products can be remarkably increased in Bacillus subtilis, which has heretofore been difficult to express in large quantities, gene products safe from living organisms that do not contain pyrogens can be easily obtained. A large amount can be obtained by the refining operation, and a great contribution can be expected especially in the fields of medicine and food. Further, since the gene product production kit of the present invention can produce various gene products easily and in large quantities, it can be advantageously used in research institutions that require the expression of gene products in various small lots. .
  • Enzymatic reactions and purification techniques shall be performed as commonly done in the art or as described herein, according to the manufacturer's specifications.
  • the terms used in connection with the analytical chemistry and synthetic organic chemistry described herein, as well as their experimental procedures and techniques, are well known and commonly used in the art.
  • standard techniques in this technical field are used for genetic manipulation, cell culture, chemical synthesis, chemical analysis, and the like.
  • One aspect of the present invention relates to a nucleic acid molecule comprising a promoter region derived from a Clostridium toxin gene and enhancing the expression of a heterologous gene operably linked thereto.
  • the Clostridium bacterium in the present invention is not particularly limited as long as it has a toxin gene.
  • Clostridium bacterium C. perfringens
  • Clostridium botulinum C. botulinum
  • tetanus C. tetani
  • C. novyi. C. septicum
  • C. histolycum C. difficile and the like.
  • the toxin gene of the genus Clostridium in the present invention is not particularly limited as long as it contains a sequence having promoter activity in the upstream region.
  • the C. perfringens alpha toxin gene for example, Titball et al., Infect Immun. 1989Feb; 57 (2): 367-76
  • epsilon toxin genes eg Hunter et al.,. Infect Immun. 1992 Jan; 60 (1): 102-10) and ⁇ toxin genes (eg Perelle et al ., Infect Immun. 1993 Dec; 61 (12): 5147-56)
  • botulinum toxin genes eg, Whelan et al., Eur J Biochem.
  • the gene sequences of Clostridium perfringens ⁇ toxin, ⁇ toxin and ⁇ toxin are Genbank accession numbers X13608, M80837 and X73562, and the botulinum toxin gene sequences of types A to F are X52066, X78229, S74768, S49407, X62683, In X71086, the tetanus toxin gene sequence is registered in X04436, and can be freely obtained.
  • the promoter region means a gene region that exists upstream of the coding region (structural gene) of the gene, for example, in the 5 'non-coding region, and initiates transcription of the structural gene by its presence.
  • the promoter region is typically located about 10 bases upstream ( ⁇ 10) from the transcription start point (+1), and has a motif such as 5′-TATAAT-3 ′ or a similar sequence thereof, the ⁇ 10 region (Priven box) And / or about 35 bases upstream ( ⁇ 35) and includes a ⁇ 35 region having a motif such as 5′-TTGACA-3 ′ or a similar sequence thereof.
  • the promoter region is a 5 ′ non-gene of a gene selected from the group consisting of a C. perfringens alpha toxin gene, an epsilon toxin gene and an iota toxin gene, a botulinum A and E type toxin gene and a tetanus toxin gene. It includes a coding region, more typically a sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 6 or a partial sequence thereof.
  • Preferred partial sequences are the ⁇ 35 region and / or the ⁇ 10 region, ie, positions 681 to 709 of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 7), positions 97 to 125 of SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 8), 85 of SEQ ID NO: 3. -114 (SEQ ID NO: 9), 19-46 (SEQ ID NO: 10) of SEQ ID NO: 4, 103-108 (SEQ ID NO: 11) of SEQ ID NO: 5, and 193-200 (SEQ ID NO: 12) of SEQ ID NO: 6. Or include this.
  • Examples of the sequence including the ⁇ 35 region and / or the ⁇ 10 region include, but are not limited to, a portion from the ⁇ 35 region or the ⁇ 10 region to the start codon.
  • SEQ ID NOs: 13-18 are the sequences represented by SEQ ID NOs: 13-18. Which part is selected as the partial sequence can be appropriately determined in consideration of various conditions such as high promoter activity and the presence of an appropriate restriction enzyme site. The height of promoter activity can be evaluated by, for example, comparing the degree of expression of a gene operably linked to a target partial sequence as described below.
  • restriction enzyme sites on nucleic acid sequences include Webcutter (http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html) and NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) It can be easily determined using genetic analysis tools available on the Internet. If the desired restriction enzyme site does not exist, a restriction enzyme site can be added to the partial sequence by site-directed mutagenesis as described later.
  • the promoter of the present invention also includes a nucleic acid molecule that does not have a typical motif as described above, but exists upstream of the structural gene of the Clostridium toxin gene and can initiate transcription of the gene.
  • the promoter region can be identified based on the presence of the typical motif as described above, and for convenience, all or part of the 5 ′ non-coding region of the gene can be used as the promoter region. . Since it is believed that RNA polymerase involved in mRNA synthesis binds to the promoter region, it is also possible to identify the promoter region based on the sequence recognized by RNA polymerase.
  • Which part of the gene actually functions as a promoter can be identified by, for example, mutating the upstream part of the coding region (for example, partially deleting or replacing it) and evaluating the change in the expression of the gene. it can.
  • the mutated portion is the promoter region, contained in it, contained, or partially overlapped therewith.
  • the nucleic acid molecule of the present invention also includes a nucleic acid molecule having a nucleic acid sequence similar to that of a natural Clostridial toxin gene promoter region and having an activity equivalent to that region, for example, a transcription promoting activity (promoter activity). But you can.
  • the “similar nucleic acid sequence” includes, for example, a nucleic acid sequence of a natural promoter region (for example, the nucleic acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 6), 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, A nucleic acid sequence having a homology of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more, or a natural promoter region (for example, nucleic acids described in SEQ ID NOs: 1 to 6) The nucleic acid sequence of the nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions to the nucleic acid molecule encoded by the sequence).
  • a natural promoter region for example, the nucleic acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 6
  • a nucleic acid sequence having a homology of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more, or a natural promoter region
  • the homology is a term well known in the technical field, and refers to, for example, the ratio of bases that match between nucleic acid sequences when a plurality of nucleic acid sequences are appropriately aligned.
  • Nucleic acid sequence homology can be determined using publicly available Internet tools such as BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) and various commercially available software. Can be determined.
  • stringent conditions as used herein is a well-known parameter in the art, and is a collection of standard protocols such as Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring. Harbor Press (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) and the like.
  • the stringent conditions in the present invention are, for example, 3.5 ⁇ SSC (0.15 M sodium chloride / 0.15 M sodium citrate, pH 7) at 65 ° C., Ficoll 0.02%, polyvinylpyrrolidone 0.02% Hybridization with a hybridization buffer consisting of 0.02% bovine serum albumin, 25 mM NaH 2 PO 4 (pH 7), 0.05% SDS, 2 mM EDTA. After hybridization, the membrane to which the DNA has been transferred is washed with 2 ⁇ SSC at room temperature and then with 0.1 to 0.5 ⁇ SSC / 0.1 ⁇ SDS at a temperature up to 68 ° C.
  • stringent hybridization may be performed using a commercially available hybridization buffer such as ExpressHyb TM Hybridization Solution (Clontech) under the hybridization and washing conditions described by the manufacturer.
  • a commercially available hybridization buffer such as ExpressHyb TM Hybridization Solution (Clontech) under the hybridization and washing conditions described by the manufacturer.
  • There are other conditions, reagents, etc. that can be used that result in the same degree of stringency but those skilled in the art will be familiar with such conditions and are not specifically described herein. Absent. However, conditions can be appropriately adjusted so that a sequence similar to the Clostridium toxin gene promoter region can be clearly identified.
  • the promoter region in the present invention may be contained in a natural Clostridium toxin gene or may be a mutant obtained by mutating the natural promoter region.
  • mutations include deletion, substitution, and addition of an arbitrary base sequence, such as modifications other than the ⁇ 10 region and / or the ⁇ 35 region, modifications of the ⁇ 10 region to the ⁇ 35 region (including the portion between both regions), ⁇ Modification of motifs in the 10 region and / or -35 region, increase / decrease in the number of bases between these regions and / or substitution of bases, increase / decrease in the number of bases between these regions and the transcription start point and / or substitution of bases Etc.
  • a preferred variant of the nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule comprising one or more mutations in the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7, A nucleic acid molecule comprising one or more mutations in the nucleic acid sequence and comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 8, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 comprising one or more mutations, and SEQ ID NO: 9 A nucleic acid molecule comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4, a nucleic acid molecule comprising one or more mutations and comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 10, one in the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 or A nucleic acid molecule comprising two or more mutations and comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, a nucleic acid sequence comprising one or more mutations and comprising the nucleic acid sequence of
  • the number of bases to be mutated is not particularly limited, but may be in the range of 1 to several, 1 to 10, 1 to 20, 1 to 30, 1 to 50, or 1 to 100. Good.
  • a mutation that increases promoter activity that is, a mutation that increases expression of a target gene is preferable.
  • a desired restriction enzyme site may be added to the promoter region in the present invention.
  • the method for introducing a restriction enzyme site into the promoter region is not particularly limited. For example, various site-specific mutagenesis methods such as an inverse PCR method, an overlap extension PCR method, a megaprimer PCR method, and a restriction enzyme site are added.
  • the nucleic acid molecules of the present invention are typically DNA, but in some cases may be RNA or artificial nucleic acids such as PNA, LNA and various modified nucleic acids (such as phosphorothioate modified nucleic acids).
  • the heterologous gene in the present invention means a gene different from the gene from which the promoter region contained in the nucleic acid molecule of the present invention is derived.
  • the species may be the same or different.
  • the heterologous gene is any gene other than the Clostridium perfringens ⁇ toxin gene, such as, but not limited to, the C. perfringens ⁇ toxin gene, the ⁇ toxin gene. Botulinum toxin gene, tetanus toxin gene.
  • Preferred heterologous genes in the present invention include, but are not limited to, for example, genes derived from bacteria, preferably Gram-positive bacteria (eg, Clostridium perfringens alpha toxin, epsilon toxin and iota toxin, botulinum toxin, tetanus toxin, etc.), low Molecular protein genes (for example, those having a molecular weight of 100 kDa or less, particularly those having a molecular weight of 50 kDa or less), drug genes (for example, enzymes, hormones, antibodies, cytokines, etc. derived from humans or non-human animals to be treated) ).
  • Gram-positive bacteria eg, Clostridium perfringens alpha toxin, epsilon toxin and iota toxin, botulinum toxin, tetanus toxin, etc.
  • low Molecular protein genes for example, those having a molecular weight
  • the heterologous gene of the present invention typically encodes a protein, but may encode a nucleic acid molecule such as an antisense nucleic acid or siRNA.
  • the heterologous gene may include only the coding region or may include a non-coding region.
  • the non-coding region may contain various functional sequences such as a promoter, enhancer, terminator, and ribosome binding sequence.
  • the heterologous gene may also include various modifications that favor the expression, secretion and / or purification of the gene product.
  • modifications include, but are not limited to, addition of a secretory signal sequence, addition of a tag sequence for purification (for example, His tag, GST tag, S tag, T7 tag, etc.).
  • Examples of the secretion signal include, but are not limited to, for example, acetolactate decarboxylase of bacteria belonging to the genus Bacillus, alkaline cellulase, alkaline phosphatase, alkaline protease, amylase (such as ⁇ -amylase), batyropeptidase, chitinase, cyclodextrin glucanotransferase, Derived from ⁇ -glucanase, ⁇ -lactamase, levanase, levansucrase, ⁇ -mannanase, metalloprotease, MWP (middle wall protein), neutral protease, OWP (outer wall protein), RNase, sphingomyelinase, subtilisin, xylanase, etc. (See, for example, Microbiol Rev. 1993 Mar; 57 (1): 109-37 for specific sequences).
  • the heterologous gene and the nucleic acid molecule of the present invention are chemically linked so that the heterologous gene is expressed in a normal state in the host cell.
  • the normal state refers to a state in which treatment for enhancing or reducing the expression of the heterologous gene is not performed in a host cell, or a state in which the host cell is not affected by such a pathogen.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be linked upstream or downstream of the heterologous gene, but is typically located upstream of the heterologous gene.
  • upstream and downstream of the heterologous gene mean the 5 'side and the 3' side of the heterologous gene, respectively.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be directly linked to a heterologous gene or may be linked via an intervening base sequence (spacer).
  • the positional relationship between the nucleic acid molecule of the present invention and a heterologous gene is the same as or close to the positional relationship between the promoter region contained in the nucleic acid molecule of the present invention and the coding region of the gene from which the promoter region is derived. However, it is not limited to this as long as the above conditions are satisfied.
  • the phrase “linked” between the nucleic acid molecule of the present invention and a heterologous gene means that the nucleic acid molecule of the present invention and the heterologous gene are chemically bonded directly or via a spacer.
  • a chemical bond typically includes a phosphodiester bond when the nucleic acid molecule is DNA or RNA, but may be other bonds such as a phosphorothioate bond as long as it is operable.
  • the nucleic acid molecule of the present invention “enhances the expression” of a heterologous gene means that the expression in an appropriate host cell is operably linked to the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the increase in expression can be evaluated as an increase in the expression level per unit time and / or a reduction in the period for obtaining a certain amount of expression product.
  • the expression level is greater than when the nucleic acid molecules of the present invention are not linked, preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, still more preferably 2.5 times or more, and even more preferably 3 times. As described above, it is particularly preferably 4 times or more.
  • the heterogeneous gene expression enhancing effect of the nucleic acid molecule of the present invention may vary depending on the type of heterologous gene to be linked.
  • the amount of the expression product is determined by culturing a host cell into which the nucleic acid construct of the present invention has been introduced for a predetermined period, and the amount of the expression product in the culture supernatant or the lysate after lysing the host cell by a known method. It can be evaluated by measuring.
  • Examples of such methods include, but are not limited to, methods using antibodies such as EIA, ELISA, IRA, IRMA, Western blotting, ultraviolet absorption method, Bradford method (Coomassie blue method), Raleigh method (phenol reagent method) ), Colorimetric methods such as the BCA method (bicinchoninic acid method), and general protein measurement methods such as quantitative methods by comparison of electrophoresis patterns, as well as various methods depending on the nature of the heterologous gene expression product, such as expression If the product is an enzyme, quantify the reaction with the substrate, if the expression product is a substrate for the enzyme, quantify the reaction with the enzyme, and if the expression product is a bioactive substance, Examples include quantification of physiological responses.
  • reporter genes that are easy to detect, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), DsRed (Discosoma sp. Red Fluorescent Protein), green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), lacZ
  • CAT chloramphenicol acetyltransferase
  • DsRed Discosoma sp. Red Fluorescent Protein
  • GFP green fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • the nucleic acid molecule of the present invention can contain two or more promoter regions.
  • at least one of the promoter regions is derived from a Clostridium toxin gene. Therefore, the nucleic acid molecule of the present invention may comprise at least one promoter region derived from a Clostridium toxin gene and at least one promoter region not derived from a Clostridium toxin gene. Two or more promoter regions may be directly connected to each other or may be connected via an intervening sequence.
  • the nucleic acid molecules of the invention may also contain a ribosome binding site such as a Shine-Dalgarno (SD) sequence involved in translation.
  • SD Shine-Dalgarno
  • the SD sequence is a 3 to 9 base long sequence rich in purine bases having a motif such as 5′-AGGAGG-3 ′ or a similar sequence, and 16S rRNA is supposed to bind to it.
  • a ribosome binding site is preferably included downstream of the transcription start site.
  • Examples of the nucleic acid molecule of the present invention containing an SD sequence include those containing the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 or a partial sequence thereof and the sequences of SEQ ID NOs: 19 to 24.
  • the present invention also relates to a nucleic acid construct comprising the nucleic acid molecule of the present invention and a heterologous gene operably linked thereto.
  • the nucleic acid construct of the present invention may have a terminator (also referred to as a transcription termination signal) that terminates transcription in addition to the nucleic acid molecule of the present invention and a heterologous gene.
  • the terminator may be a part of a heterologous gene, one derived therefrom, or one not derived therefrom. Examples of general terminators are well known to those skilled in the art, and any of these can be used.
  • nucleic acid construct of the present invention may include other gene sequences that allow for efficient replication and expression of the construct within the desired cell.
  • the nucleic acid construct of the present invention can be prepared by various nucleic acid introduction methods such as calcium phosphate method, lipofection method, ultrasonic introduction method, electroporation method, particle gun method, microinjection method, liposome method (for example, those using cationic liposomes),
  • a heterologous gene that is introduced into a host cell and carried can be expressed by a competent cell method, a protoplast method, or the like. It is also possible to express the carried heterologous gene by incorporating the nucleic acid construct of the present invention into various expression vectors and transfecting the host cell therewith.
  • the present invention also relates to a vector comprising the nucleic acid molecule or nucleic acid construct of the present invention.
  • a vector is any nucleic acid that can incorporate and maintain the nucleic acid molecule or nucleic acid construct of the present invention, introduce it into a host cell gene, amplify it, and / or express a heterologous gene. Means a molecule.
  • the vector is typically composed of DNA, but a vector composed of RNA can also be used.
  • Vectors include, but are not limited to, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses, YACs, BACs and the like.
  • Vectors can be classified according to their use into cloning vectors used for gene cloning, expression vectors used for gene expression, and the like.
  • the vectors of the present invention include vectors for these various uses.
  • the vector has various functional base sequences useful for incorporation of the nucleic acid molecule or nucleic acid construct, introduction into a host cell, replication, expression of a heterologous gene, etc., in addition to the nucleic acid molecule or nucleic acid construct of the present invention, depending on its use. Can be included. Examples of such base sequences include, but are not limited to, restriction enzyme sites (such as multicloning sites), replication origin sequences, selectable marker gene sequences, reporter gene sequences, promoter sequences, terminator sequences, and the like. Such functional base sequences are well known to those skilled in the art, and any known base sequence can be used in an appropriate position and orientation.
  • the vector of the present invention contains at least the nucleic acid molecule of the present invention. Therefore, one embodiment of the vector of the present invention does not contain the target heterologous gene.
  • the target heterologous gene does not include a functional gene that imparts a secondary function to the vector, such as a selection marker gene or a reporter gene. Therefore, the above-described embodiment of the vector of the present invention does not include the target heterologous gene, but may include such a functional gene.
  • the vector preferably has a restriction enzyme site capable of operably linking the nucleic acid molecule of the present invention and the target heterologous gene, more preferably a multicloning site, and any desired heterologous gene. Can be incorporated.
  • the preferred vector of this embodiment can be used for expression of any heterologous gene.
  • Particularly preferred examples of this embodiment include, but are not limited to, a vector having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 33.
  • a vector of the invention comprises a nucleic acid molecule of the invention and a heterologous gene operably linked thereto, ie, a nucleic acid construct of the invention.
  • Particularly preferred examples of this embodiment include, but are not limited to, vectors having the nucleic acid sequences of SEQ ID NOS: 30, 58 to 62.
  • the vector may be prepared by combining desired functional base sequences, but can also be constructed based on various commercially available vectors.
  • Vectors for various uses corresponding to various host cells are available. Examples of vectors for Bacillus subtilis include pA-spac, pAM1, pAX01, pBS72, pC194, pDG1661, pDG1662, pDG1663, pDG1664, pDG1728, pDG1729, pDG1731, pDG271, pDL, pDK, 19PDH, 19 pGlt-Cm, pGlt-Kan, pHCM02, pHCM04, pHCM05, pHY500, pHY700, pHY4831, pHT110R2L5, pHT210, pHV1431, pHV1432, pIP404, pIP501, pLS20, pLS32, pMLK83, pMTLBS33, NHL33, pD pNU200, pNU211, pNU
  • Restriction enzymes include any known to those skilled in the art, such as AatII, AccI, ApaI, AorI, BamHI, BglII, BsaAI, BsmI, BssHII, BstXI, Cfr9I, ClaI, DdcI, DpnI, DraI, EcoR, EcoV , EcoT22I, FokI, FspI, HaeIII, HapI, HapII, HincII, HinfI, HindIII, KpnI, MaeIII, MboI, MluI, MseI, MvaI, NaeI, NcoI, NdeI, NheI, NotP, , SacII, SalI, Sau3AI, Sau96I, ScaI, SfiI, SmaI, SpeI, SphI
  • the present invention also relates to a host cell transformed with the nucleic acid molecule, nucleic acid construct or vector of the present invention.
  • the host cell in the present invention is one in which the nucleic acid molecule of the present invention can function, that is, can express a heterologous gene linked to the nucleic acid molecule of the present invention, and / or the vector of the present invention is maintained therein or
  • the cells are not particularly limited as long as they can be replicated, and include various cells including prokaryotic cells and eukaryotic cells.
  • the host cell is a prokaryotic cell, typically a bacterial cell.
  • Preferred bacterial species in the present invention include, but are not limited to, Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis, Bacillus brevis, Bacillus cil licheniformis, Bacillus cil megaterium, Bacillus stearothermophilus, and Escherichia coli.
  • Bacillus bacteria are preferable, and Bacillus subtilis is particularly preferable because the expression product can be easily purified and a production process-derived substance harmful to the living body is less likely to be mixed.
  • various strains such as BD170 strain, 168 strain, ISW1214 strain, MI114 strain and the like can be used.
  • strains eg, 106HL strain, DY-16 strain, etc. in which production of protease secreted outside the cells is suppressed can also be used.
  • Transforming a host cell typically refers to the introduction of a foreign nucleic acid molecule into the host cell to change its genetic properties.
  • the nucleic acid molecule, nucleic acid construct or vector of the present invention can be transformed. It is performed by introducing it into a host cell.
  • the introduced host cell may be particularly referred to as a transformant.
  • various nucleic acid introduction methods such as calcium phosphate method, lipofection method, ultrasonic introduction method, electroporation method, particle gun method, microinjection method, liposome method (for example, using cationic liposome), competent cell Method, protoplast method and the like can be used.
  • nucleic acid molecules and nucleic acid constructs in addition to the above, introduction methods using various vectors, for example, viral vectors such as adenovirus vectors and retrovirus vectors can also be used.
  • the introduced nucleic acid molecule, nucleic acid construct or vector is integrated into the genome of the host cell and can express the desired heterologous gene constitutively or inducibly.
  • the heterologous gene may be expressed in the host cell without being integrated into the host cell genome.
  • Host cells can also be used to maintain or amplify the vectors of the present invention.
  • the vector does not integrate into the host cell genome within the host cell, or is integrated into the host cell genome, or replicates autonomously.
  • the expression of the heterologous gene may or may not be performed.
  • the vector is maintained in a non-replicating manner in the same host cell, but is replicated as the host cell divides. The vector thus maintained or amplified can then be introduced into a host cell for expression.
  • the present invention also relates to a method for producing a gene product, which includes the step of culturing the host cell (ie, transformant) of the present invention.
  • the transformant of the present invention can be cultured by a known method suitable for each.
  • the culture is typically performed in a medium.
  • the medium includes various forms such as a solid, a semi-solid, and a liquid, and a liquid medium that can be easily processed and can be cultured in large quantities is preferable.
  • the medium may be a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the transformant and can be cultured efficiently.
  • Any carbon source may be used as long as the transformant can assimilate, and glucose, fructose, sucrose, maltose, cellobiose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, acetic acid, propionic acid, etc. Alcohols such as organic acids, ethanol, and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic or organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, fish extract, yeast extract, corn steeper Liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof, and the like can be used.
  • inorganic salts that can be used include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • Culture of transformants using prokaryotes such as Bacillus subtilis and Escherichia coli or eukaryotes such as yeast as hosts is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is typically 15 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C., and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium when the lac promoter is included, and indoleacrylic acid or the like may be added when the trp promoter is included.
  • the transformant in culture can express the desired heterologous gene without induction or by induction, and can be produced and accumulated in the culture. Expression products of heterologous genes can be accumulated in the host cell, secreted outside the host cell, or accumulated on the host cell outer membrane, changing the host cell used and the structure of the expression product Can change the production mode. In the present invention, since the expression product is easily generated, a mode in which the expression product is secreted outside the host cell is preferable.
  • the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then French press.
  • Cell-free extract by disrupting cells using methods such as mechanical disruption with homogenizer, dynomill, freeze-thaw method, lysozyme addition method, sonication method, surfactant addition method alone or in combination
  • the usual protein isolation and purification method ie, solvent extraction method, dialysis method, ultrafiltration method, gel filtration method, salting-out method by ammonium sulfate, etc.
  • the expression product If the expression product accumulates as an insoluble substance in the cell, collect the cell, crush it, and centrifuge it to collect the polypeptide insoluble matter as a precipitate fraction.
  • the expression product can be purified by subjecting it to solubilization and diluting or dialyzing the resulting solubilized solution to return the expression product to a normal three-dimensional structure, followed by the same isolation and purification method as described above.
  • a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation, and this is subjected to the same isolation and purification method as described above. Can be purified.
  • a tag peptide having a binding property with a specific substance can be incorporated in a polypeptide to be expressed in advance.
  • tag peptides include, but are not limited to, His tags, GST tags, S tags, T7 tags, and the like. Therefore, the target heterologous gene may contain a nucleic acid sequence encoding such a tag peptide.
  • the method of the present invention can be applied to various scales of manufacturing, from small-scale manufacturing at the laboratory level to large-scale manufacturing at the factory level.
  • the above-described method of the present invention may be modified as appropriate to suit the scale. Modifications suitable for each manufacturing scale are well known to those skilled in the art.
  • the invention also relates to a gene product production kit comprising a nucleic acid molecule, a nucleic acid construct, a vector, and / or a host cell of the invention.
  • the nucleic acid molecule, nucleic acid construct, vector and / or host cell of the present invention contained in the kit of the present invention can take any form as long as they exist in a container in a storable state. Is stored in a container in a state of being suspended in a storage solution or lyophilized. When suspended in a preservation solution, refrigeration or cryopreservation may be required.
  • the container is preferably sealed. Freeze-drying can be performed by any technique known to those skilled in the art.
  • the suspension is poured into a sealable container (such as an ampoule), and this is put into a freeze dryer. Mount and freeze-dry. After completion of lyophilization, seal the container.
  • a sealable container such as an ampoule
  • Various operations such as production of an object, injection into a container, and lyophilization are preferably performed under aseptic conditions.
  • Various preservation solutions are known that correspond to applications and objects to be preserved, and these can be used as appropriate.
  • the components contained in the preservation solution are not limited, and for example, propylene glycol, glycerol, polyethylene glycol, ethylene glycol, butanediol, formamide, propanediol, sorbitol, mannitol, DMSO, EDTA, Tris-HCl, TE (Tris -A mixture of HCl and EDTA).
  • the kit of the present invention may contain a nucleic acid construct operatively linked to the nucleic acid molecule of the present invention or a vector containing the same, or a heterologous gene of the present invention. It may be contained in a nucleic acid construct or vector separate from the nucleic acid molecule. Therefore, the kit of the present invention contains the nucleic acid molecule of the present invention but does not contain the target heterologous gene, but only the nucleic acid construct or vector which does not contain the target heterologous gene, the heterologous gene operably linked thereto.
  • nucleic acid constructs or vectors may be included.
  • a nucleic acid construct or vector containing the desired heterologous gene but not the nucleic acid molecule of the present invention may be provided separately as an option of the kit of the present invention.
  • nucleic acid molecule of the present invention and the target heterologous gene are contained in separate nucleic acid constructs or vectors
  • the nucleic acid molecule of the present invention and the nucleic acid molecule of the present invention are activated by treating these nucleic acid constructs or vectors with a restriction enzyme or the like. It is preferred to design each nucleic acid construct or vector such that a nucleic acid construct or vector containing the ligated heterologous genes is generated.
  • the kit of the present invention may contain elements other than those described above that are useful for the production of gene products.
  • elements include, but are not limited to, a nucleic acid molecule, a nucleic acid construct, a vector and / or a regenerant that regenerates a host cell from a preserved state, a restriction enzyme used for incorporation of the nucleic acid molecule, and a culture of the host cell.
  • Culture medium for selection selection medium for selection of transformed host cells, standard substance for known amount of gene product to be used as a reference for evaluating expression level of gene product, nucleic acid molecule, nucleic acid construct, vector of the present invention And / or instructions regarding a method for regenerating a host cell, a method for producing a gene product, and an electronic recording medium such as a CD or DVD.
  • Example 1 Cloning of Clostridium perfringens ⁇ toxin a component (Ia) gene (1) Extraction of Clostridium perfringens plasmid DNA C. perfringens type E (NCIB10748) was cultured at 37 ° C. for 6 hours in 500 ml of brain heart infusion medium. Bacteria were collected by centrifugation at 000 rpm. The precipitated cells were suspended in TNE buffer (100 mM NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8)) and washed by centrifugation.
  • TNE buffer 100 mM NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8)
  • sucrose-containing TNE buffer 25% sucrose-containing TNE buffer and lysozyme (10 mg / ml) were added to the precipitated cells and shaken at 37 ° C. for 15 minutes. Then, a final concentration of 100 mM EDTA was added and incubated at 37 ° C. for 20 minutes. To this was added N-lauroyl sarcosine sodium (LSS) having a final concentration of 1%, and after gently stirring, the lysate was left at 4 ° C. overnight. After centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes, the supernatant was collected, dissolved in 8 ml of cesium chloride with TNE buffer, 8 g of cesium chloride was dissolved using a vertical rotor at 4 ° C.
  • LSS N-lauroyl sarcosine sodium
  • plasmid DNA was recovered.
  • the containing fraction was isolated while confirming with an ultraviolet lamp.
  • plasmid DNA was purified by ethanol precipitation, dissolved in TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)) to obtain plasmid DNA, Used as starting material for cloning.
  • Example 2 Construction of Vector Containing Ia Gene Promoter Region From pT-Ia a region containing Ia structural gene and its upstream and downstream regions (SEQ ID NO: 27) was excised with restriction enzymes EcoRI and XbaI, and Escherichia coli-B.
  • Subtilis shuttle vector pHY300PLK. (Takara Bio Inc.)
  • a multicloning sequence (SEQ ID NO: 1) is located downstream of the promoter region of the Ia gene contained in the obtained Ia gene insertion vector pHY300PLK-CpIa, that is, between positions 1476 and 1477 of the Ia gene sequence complementary strand represented by SEQ ID NO: 28. 29) was inserted.
  • an NdeI site (CATATG) was inserted into the above site to prepare the vector pHY300PLK-CpIa-NdeI, and then the above-described multicloning site was cloned using a Ligation kit (Takara Bio Inc.).
  • the resulting vector pHY300PLK-CpIa-MCS performs sequence analysis with ABI PRISM (R) 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.) to confirm that the desired sequence (SEQ ID NO: 30) was obtained.
  • the promoter region of the Ia gene (SEQ ID NO: 31) was cut out from NyI and EcoRI from the pHY300PLK-CpIa-NdeI obtained above, and a multiple cloning site (SEQ ID NO: 32) with an NdeI site added to the 3 ′ end.
  • the vector pCIP containing the Ia gene promoter region was constructed by ligation to a modified pHY300PLK having The resulting pCIP is, ABI PRISM (R) 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems , Inc.) The sequence analysis with, it was confirmed that the desired sequence was obtained as shown in SEQ ID NO: 33 (see FIGS. 1 and 2) .
  • Cloning of Heterologous Genes (1) Cloning of Clostridium perfringens ⁇ -toxin gene 1) Extraction of chromosomal DNA of Clostridium perfringens Type A Clostridium perfringens (NCTC8237) was cultured at 37 ° C. in 500 ml of brain heart infusion medium for 8 hours The cells were collected by centrifugation at 1,000 rpm. The cells were suspended in TNE buffer and washed by centrifugation. The cells are suspended in TNE buffer and shaken at 37 ° C. for 60 minutes. After adding SDS with a final concentration of 1% and stirring gently, add an equal amount of saturated phenol-chloroform and mix well.
  • Clostridium perfringens ⁇ 2 toxin gene 1 Extraction of Clostridium perfringens plasmid DNA Type A Clostridium perfringens (Strain 13) was cultured in 500 ml of brain heart infusion medium at 37 ° C. for 6 hours and centrifuged at 8,000 rpm. Bacteria were collected. The precipitated cells were suspended in TNE buffer (100 mM NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8)) and washed by centrifugation. 25% sucrose-containing TNE buffer and lysozyme (10 mg / ml) were added to the precipitated cells and shaken at 37 ° C. for 15 minutes.
  • TNE buffer 100 mM NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8)
  • plasmid DNA was purified by ethanol precipitation, dissolved in TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)) to obtain plasmid DNA, Used as starting material for cloning.
  • Bacillus cereus sphingomyelinase (BcSMase) gene 1) Extraction of plasmid DNA of Bacillus cereus Bacillus cereus (IAM1029) was cultured at 37 ° C. in 500 ml of brain heart infusion medium for 6 hours and centrifuged at 8,000 rpm. Bacteria were collected. The precipitated cells were suspended in TNE buffer (100 mM NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8)) and washed by centrifugation. 25% sucrose-containing TNE buffer and lysozyme (10 mg / ml) were added to the precipitated cells and shaken at 37 ° C. for 15 minutes.
  • TNE buffer 100 mM NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8)
  • plasmid DNA was purified by ethanol precipitation, dissolved in TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)) to obtain plasmid DNA, Used as starting material for cloning.
  • Example 4 Insertion of heterologous gene into pCIP vector
  • the heterologous genes obtained in Example 3 C. perfringens alpha toxin gene, C. perfringens beta 2 toxin gene, S. cerevisiae sphingomyelinase
  • CbPLC phospholipase C
  • the obtained approximately 0.8 kbp gene (SEQ ID NO: 48) was cleaved with NdeI and XbaI and ligated with pCIP cleaved with the same enzymes to obtain pCIP-Cp ⁇ 2.
  • the obtained gene of about 1.0 kb (SEQ ID NO: 51) was cleaved with NdeI and XbaI, and ligated with pCIP cleaved with the same enzyme to obtain pCIP-BcSMase.
  • Clostridium botulinum phospholipase C (CbPLC) gene into pCIP CbPLC enzyme structure using Clostridium botulinum phospholipase C gene (pUC18-BPLC, distributed by Prof. Ojiyama Prof. Okuma) as a template
  • pUC18-BPLC Clostridium botulinum phospholipase C gene
  • Prof. Ojiyama Prof. Okuma Clostridium botulinum phospholipase C gene
  • a forward primer having an NdeI cleavage site at the beginning, starting from the start codon: 5′-CATATGATGAATAAGAAAAAAATATTAAAA-3 ′ (SEQ ID NO: 52), and a reverse primer having an XbaI site downstream of the stop codon: 5′-TCTAGATTATTTATTATTTATATAGAATGT-3 '(SEQ ID NO: 53) was used.
  • the obtained approximately 1.2 kb gene (SEQ ID NO: 54) was cleaved with NdeI and XbaI and ligated with pCIP cleaved with the same enzymes to obtain pCIP-CbPLC.
  • a forward primer having an NdeI cleavage site at the beginning, starting from the start codon: 5′-GGCATATGAAAGGTTTAAGAAAATCA-3 ′ (SEQ ID NO: 55), and a reverse primer having an XbaI site downstream of the stop codon: 5′-CCTCTAGATTATTTAGGATTGATAGCTGT-3 '(SEQ ID NO: 56) was used.
  • the obtained approximately 0.8 kb gene (SEQ ID NO: 57) was cleaved with NdeI and XbaI and ligated with pCIP cleaved with the same enzyme to obtain pCIP-CbC3.
  • the resulting sequence of each vector was performed in ABI PRISM (R) 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.) to confirm that the desired sequence was obtained as shown in SEQ ID NO: 58-62.
  • Example 5 Expression of heterologous genes
  • Bacillus subtilis ISW1214 strain was pre-cultured overnight at 37 ° C in 2 ml of LB (Luria-Broth) medium. 2 ml of the preculture was added to 32 ml of the main culture solution (2.9 g of sterilized LB medium containing 2.9 g of sorbitol and sterilized by autoclave), and the main culture was performed at 37 ° C. (about 3 hours). When the absorbance (A 620 ) reached 0.85 to 0.95, the main culture was terminated. The culture was left on ice for 10 minutes, and then centrifuged at 5,000 ⁇ g (9500 rpm) for 5 minutes.
  • ice-cooled Solution A (0.5 M sorbitol + 0.5 M mannitol + 10% glycerol: 45.5 g sorbitol, 45.5 g mannitol and 50 ml glycerol were mixed, sterilized after making up to 500 ml with distilled water.
  • the bacterial cells were washed four times with a liquid, and then suspended in 0.8 ml (1/40 volume of the culture solution) of Solution A. 60 ⁇ l of the obtained bacterial solution was dispensed into a sterilized tube and stored at ⁇ 80 ° C.
  • This mixed solution was transferred to an ice-cooled 0.1 cm cuvette and allowed to stand for 1 to 1.5 minutes, and then pulsed (2 kV, 200 ⁇ , 25 mF) with a gene transfer apparatus (BTX, ECM-630). Then, this was transferred to a 15 ml centrifuge tube, 1 ml of Solution B (LB medium + 0.5 M sorbitol + 0.38 M mannitol) was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. for 3 hours.
  • Solution B LB medium + 0.5 M sorbitol + 0.38 M mannitol
  • the culture was centrifuged (3500 rpm, 5 minutes), 900 ⁇ l of the supernatant was removed, and the sediment was suspended and applied to an LB agar medium containing tetracycline (30 mg / ml) and cultured at 37 ° C. overnight.
  • the formed resistant colonies of the transformant were picked up and subjected to the following culture.
  • Transformants introduced with various vectors were cultured in 37 liters for 14 hours while stirring in 1 liter of LB medium, and then 20 minutes at 4 ° C and 8,000 rpm. Centrifugation for 5 minutes, while stirring the culture supernatant under ice-cooling, a small amount of ammonium sulfate (ammonium sulfate, Nacalai Tesque Co., Ltd., 0619-86) is periodically added to a final concentration of 70% saturated ammonium sulfate (472 g / l). And left overnight.
  • ammonium sulfate ammonium sulfate, Nacalai Tesque Co., Ltd., 0619-86
  • the mixture was centrifuged at 9,500 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the resulting precipitate was dissolved in 0.02 M TB buffer (0.02 M Tris / HCl, pH 7.5), and the same buffer was used at 4 ° C. overnight. Dialyzed. After dialysis, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was used as a crude product (ammonium sulfate product) sample.
  • This crude product preparation was diluted with 1M NaCl-TB (pH 7.5) to a final concentration of 0.5M NaCl, and then a copper chelate affinity column (Chelating Sepharose Fast Flow, GE healthcare), an anion exchange column. (UNO TM Q-1 R Column, BIO-RAD, 720-0011) and / or cation exchange column (SP-TOYOPEARL 650 M, Tosoh Corporation) was used for purification. The amount of protein in each product obtained was measured by the BCA method and confirmed to be free of impurities by SDS-PAGE. A comparison between the final purified amount obtained from 1 liter culture and the maximum final purified amount obtained from 1 liter culture by a similar procedure using conventional pHY300PLK is shown below.
  • the expression of the heterologous gene is remarkably enhanced by the vector of the present invention containing the promoter region of the C. perfringens ⁇ toxin gene.
  • the Clostridium perfringens ⁇ and ⁇ 2 toxin genes were expressed in a large amount in Bacillus subtilis cells even with conventional vectors, it was suggested that the promoter of the same gene can also enhance the expression of heterologous genes.

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Abstract

【課題】枯草菌において遺伝子産物を大量に発現させることができるプロモーター、および該プロモーターを利用した遺伝子産物の製造方法の提供。 【解決手段】クロストリジウム属菌の毒素遺伝子に由来するプロモーター領域を含み、作動可能に連結された異種遺伝子の発現を増強する核酸分子、この核酸分子と異種遺伝子とを含む核酸構築物、これらを含むベクター、このベクターによって形質転換された宿主細胞、これらを用いた異種遺伝子発現産物の製造方法および製造キット。

Description

高発現プロモーターおよびこれを用いた遺伝子産物製造法
　本発明は、高発現プロモーターおよびこれを用いた遺伝子産物製造法、具体的にはクロストリジウム属菌の毒素遺伝子に由来するプロモーター領域を含む核酸分子、同核酸分子とこれに作動可能に連結された異種遺伝子とを含む核酸構築物、これらを含むベクター、同ベクターにより形質転換された宿主細胞、これを用いた遺伝子産物製造法および製造キットに関する。
　遺伝子工学の進歩により、細菌や酵母などの微生物や、哺乳類などの高等動物の培養細胞に所望の遺伝子を導入して発現させ、タンパク質をはじめとする種々の遺伝子産物を製造することが広く行われるようになっている。かかる製造方法においては、培養操作が容易で、増殖力が強く、遺伝子発現量の多い大腸菌を用いる手法が主流となっており、工業的に幅広く用いられている。しかしながら、グラム陰性菌である大腸菌で発現させた遺伝子産物は、内膜と外膜との間のペリプラズムに蓄積されるため、遺伝子産物を抽出するにはまず菌体を破壊してから目的の産物を分離精製しなければならず、また、大腸菌の外膜に存在するＬＰＳ（リポ多糖類）はヒトなどの生体においてパイロジェンとして作用するため、大腸菌を用いて製造した遺伝子産物を生体に適用する際には、こうしたパイロジェンを除去する必要があるなど、遺伝子産物の精製に多大な手間とコストを要する。
　こうした欠点を有しない菌種として注目されているのが、グラム陽性菌の枯草菌である。枯草菌は、上記のようなパイロジェンを有さず、病原性もなく、また遺伝子産物を菌体外に分泌する場合が多い。したがって、医薬や食品など生体に適用する遺伝子産物の製造には有用である。しかしながら、枯草菌は大腸菌と比べて遺伝子産物の産生量が少ないという欠点を有しており、このことが同菌種の工業的利用を妨げている。枯草菌の遺伝子産物産生量が少ない原因の１つとして、大腸菌のｌａｃプロモーターのような操作性や発現効率に優れたプロモーターが存在しないことが挙げられる。このような状況を受けて、枯草菌で有効に作動するプロモーターを探索する試みがなされている。
　例えば、特許文献１には、特定の配列を含むプロモーターが、特許文献２には、Bacillus amyloliquefaciensのα－アミラーゼ遺伝子プロモーターと、枯草菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子等に由来するエンハンサー受容体とを含むハイブリッドプロモーターが、特許文献３には、アルカリセルラーゼＫ－６４の上流領域を含む、下流領域に結合した構造遺伝子の発現を増大させ得るＤＮＡ断片が、特許文献４にはBacillus licheniformisのα－アミラーゼ遺伝子プロモーターの変異体由来のプロモーターが、特許文献５には、改変AmyQプロモーター配列、ｃｒｙＩＩＩＡ mRNA安定化配列およびこれらがタンデムに配置された配列を含むプロモーターが、特許文献６には、Bacillus amyloliquefaciensのα－アミラーゼ遺伝子プロモーターの３’末端近傍に特殊な配列を導入した改変プロモーターが、特許文献７には、枯草菌の定常期特異的に発現する数種の遺伝子の上流領域に由来するプロモーターが、非特許文献１には、Bacillus brevisのＭＷＰ遺伝子に由来するプロモーターがそれぞれ記載されている。
　しかしながら、上記プロモーターのいずれにおいても満足できる結果が得られず、さらなるプロモーターの開発が求められていた。
特開昭６０－１３７２９１ 特表平６－５００６８９ 特開平６－２１７７８１ 特表平７－５０４０８５ 特表２００２－５０４３７９ 特開２００２－２７２４６６ ＷＯ　２００２／０７２８１９
Yamagata et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 May;86（10）:3589-93
　本発明は、枯草菌において遺伝子産物を大量に発現させることができるプロモーター、および該プロモーターを利用した遺伝子産物の製造方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究を続けた結果、クロストリジウム属菌の毒素遺伝子、特にウェルシュ菌のι毒素遺伝子の上流配列を異種遺伝子に連結して枯草菌で発現させたところ、遺伝子産物の発現が飛躍的に増大することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下に関する。
（１）クロストリジウム属菌の毒素遺伝子に由来するプロモーター領域を含む核酸分子であって、これに作動可能に連結された異種遺伝子の発現を増強する、前記核酸分子。
（２）毒素遺伝子がウェルシュ菌α毒素、ε毒素およびι毒素、ボツリヌス毒素、および破傷風毒素からなる群から選択される、上記（２）の核酸分子。
（３）上記（１）または（２）の核酸分子と、これに作動可能に連結された異種遺伝子とを含む核酸構築物。
（４）上記（１）または（２）の核酸分子または上記（３）の核酸構築物を含むベクター。
（５）上記（４）のベクターで形質転換された宿主細胞。
（６）上記（５）の宿主細胞を培養する工程を含む、遺伝子産物の製造方法。
（７）上記（１）もしくは（２）の核酸分子、上記（３）の核酸構築物、上記（４）のベクター、および／または上記（５）の宿主細胞を含む、遺伝子産物製造キット。
　本発明により、これまで遺伝子産物の大量発現が困難とされてきた枯草菌において、種々の遺伝子産物の発現を顕著に高めることができるため、パイロジェンを含まない生体に安全な遺伝子産物を、簡易な精製操作で大量に得ることが可能となり、特に医薬・食品分野において多大な貢献が期待できる。
　また、本発明の遺伝子産物製造キットは、多種の遺伝子産物を簡易かつ大量に製造することができるため、多種小ロットの遺伝子産物発現を要する研究機関などにおいても有利に利用することが可能である。
ｐＣＩＰにおけるウェルシュ菌ι毒素プロモーター（黒矢印）の位置を示した模式図である。 ｐＣＩＰのウェルシュ菌ι毒素プロモーター領域挿入部位の配列を示した図である。図中、網掛太字部分は挿入したプロモーター領域を、下線部分は制限酵素部位をそれぞれ示す。
　本明細書中に別記のない限り、本発明に関して用いられる科学的および技術的用語は、当業者に通常理解されている意味を有するものとする。一般的に、本明細書中に記載された細胞および組織培養、分子生物学、微生物学、遺伝子およびタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して用いられる用語、およびその技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものとする。特段の記載がない限り、本発明の方法および技術は、当該技術分野においてよく知られた慣用の方法に従って、本明細書中に記載された種々の参考文献に記載されたとおりに実行される。かかる文献としては、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）および Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press（2001）、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates（1992, および2000の補遺）、Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology - 4th Ed., Wiley & Sons（1999）、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1990）、および Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1999）などが挙げられる。
　酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従い、当該技術分野において通常なされているとおりに、または本明細書に記載のとおりに行うものとする。本明細書中に記載された分析化学および合成有機化学に関して用いられる用語、ならびにその実験手順および技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものである。また、当該技術分野において標準的な技術を、遺伝子操作、細胞培養、化学合成および化学分析などに用いるものとする。
　本発明の一側面は、クロストリジウム属菌の毒素遺伝子に由来するプロモーター領域を含む核酸分子であって、これに作動可能に連結された異種遺伝子の発現を増強する核酸分子に関する。
　本発明におけるクロストリジウム属菌は、毒素遺伝子を有するものであれば特に限定されず、例えば、ウェルシュ菌（C. perfringens）、ボツリヌス菌（C. botulinum）、破傷風菌（C. tetani）、C. novyi、C. septicum、C. histolycum、C. difficile等を含む。
　本発明におけるクロストリジウム属菌の毒素遺伝子は、上流領域にプロモーター活性を有する配列を含むものであれば特に限定されず、例えば、ウェルシュ菌α毒素遺伝子（例えば、Titball et al., Infect Immun. 1989Feb;57（2）:367-76を参照）、ε毒素遺伝子（例えば、Hunter et al., Infect Immun. 1992 Jan;60（1）:102-10を参照）およびι毒素遺伝子（例えば、Perelle et al., Infect Immun. 1993 Dec;61（12）:5147-56を参照）、ボツリヌス毒素遺伝子（例えば、Whelan et al., Eur J Biochem. 1992 Mar 1;204（2）:657-67、Thompson et al., Eur J Biochem. 1990 Apr 20;189（1）:73-81を参照）、破傷風毒素遺伝子（例えば、Eisel et al., EMBO J. 1986 Oct;5（10）:2495-502を参照）などを含む。これらの遺伝子の核酸配列は知られており、上記文献やＮＣＢＩ等の遺伝子データベースから入手することができる。例えば、ウェルシュ菌α毒素、ε毒素およびι毒素の遺伝子配列はGenBankにアクセッション番号X13608、M80837およびX73562で、Ａ～Ｆ型の各ボツリヌス毒素遺伝子配列は、X52066、X78229、S74768、S49407、X62683、X71086で、破傷風毒素遺伝子配列は、X04436でそれぞれ登録されており、自由に入手することができる。
　本発明において、プロモーター領域とは、遺伝子のコード領域（構造遺伝子）の上流、例えば、５’非コード領域に存在し、その存在によって構造遺伝子の転写を開始させる遺伝子領域を意味する。プロモーター領域は典型的には、転写開始点（＋１）から約１０塩基上流（－１０）に位置し、５’－ＴＡＴＡＡＴ－３’等のモチーフまたはその類似配列を有する－１０領域（プリブノーボックスとも呼ばれる）および／または約３５塩基上流（－３５）に位置し、５’－ＴＴＧＡＣＡ－３’等のモチーフまたはその類似配列を有する－３５領域を含む。したがって、本発明の一態様において、プロモーター領域は、ウェルシュ菌α毒素遺伝子、ε毒素遺伝子およびι毒素遺伝子、ボツリヌスＡおよびＥ型毒素遺伝子および破傷風毒素遺伝子からなる群から選択される遺伝子の５’非コード領域、より典型的には、配列番号１～６で表される配列またはその部分配列を含む。
　好ましい部分配列は、－３５領域および／または－１０領域、すなわち、配列番号１の６８１～７０９位（配列番号７）、配列番号２の９７～１２５位（配列番号８）、配列番号３の８５～１１４位（配列番号９）、配列番号４の１９～４６位（配列番号１０）、配列番号５の１０３～１０８位（配列番号１１）および配列番号６の１９３～２００位（配列番号１２）であるか、またはこれを含む。－３５領域および／または－１０領域を含む配列としては、限定することなく、例えば、－３５領域または－１０領域から開始コドンまでの部分があげられ、上記各毒素遺伝子については、具体的には配列番号１３～１８で表される配列である。部分配列としてどの部分を選択するかは、プロモーター活性の高さ、適切な制限酵素部位の存在などの種々の条件を考慮して適宜決定することができる。プロモーター活性の高さは、例えば、下記のように、対象となる部分配列に作動可能に連結した遺伝子の発現の程度を比較することにより評価することができる。また、核酸配列上の制限酵素部位は、Webcutter（http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html）やNEBcutter（http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php）などのインターネット上で利用できる遺伝子分析ツールを用いて容易に決定することができる。なお、所望の制限酵素部位が存在しない場合には、後述のとおり、部位特異的変異導入法などにより、部分配列に制限酵素部位を付加することもできる。
　一方、上記のような典型的なモチーフを有しないが、クロストリジウム属菌毒素遺伝子の構造遺伝子の上流に存在し、遺伝子の転写を開始させることができる核酸分子も本発明のプロモーターに含まれる。プロモーター領域は、上記のような典型的なモチーフの存在に基づいて同定することもできるし、また、便宜的に遺伝子の５’非コード領域のすべてもしくはその一部をプロモーター領域とすることもできる。プロモーター領域には、ｍＲＮＡの合成に関わるＲＮＡポリメラーゼが結合すると考えられていることから、ＲＮＡポリメラーゼが認識する配列をもとにプロモーター領域を同定することも可能である。実際に遺伝子どの部分がプロモーターとして機能するかは、例えば、コード領域の上流部分を変異させ（例えば、部分的に欠失もしくは置換させ）、遺伝子の発現の変化を評価することにより同定することができる。変異により遺伝子の発現が低下する場合には、変異させた部分がプロモーター領域であるか、これに含まれるか、これを含むか、または、これと一部重複している。
　本発明の核酸分子はまた、天然のクロストリジウム属菌の毒素遺伝子プロモーター領域と類似した核酸配列を有し、かつ、同領域と同等の活性、例えば転写促進活性（プロモーター活性）を有する核酸分子を含んでもよい。前記「類似した核酸配列」には、例えば、天然のプロモーター領域の核酸配列（例えば、配列番号１～６に記載の核酸配列）と６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有する核酸配列、または、天然のプロモーター領域（例えば、配列番号１～６に記載の核酸配列によりコードされる核酸分子）とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子の核酸配列が含まれる。
　ここで、相同性とは、当該技術分野でよく知られた用語であり、例えば、複数の核酸配列を適切にアラインメントした場合に、核酸配列同士で一致する塩基の割合をいう。核酸配列の相同性は、公衆が利用可能なインターネット上のツール、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）や、種々の市販のソフトウェアを利用して決定することができる。
　本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」という用語は、当該技術分野において周知のパラメータであり、標準的なプロトコル集、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press（2001）や、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates（1992）等に記載されている。
　本発明におけるストリンジェントな条件は、例えば、６５℃での、３．５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、フィコール０．０２％、ポリビニルピロリドン０．０２％、ウシ血清アルブミン０．０２％、ＮａＨ２ＰＯ４２５ｍＭ（ｐＨ７）、ＳＤＳ０．０５％、ＥＤＴＡ２ｍＭからなるハイブリダイゼーションバッファーによるハイブリダイゼーションを指す。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが移された膜は、２×ＳＳＣにて室温において、次いで０．１～０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳにて６８℃までの温度において洗浄する。あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ExpressHybTM Hybridization Solution（Clontech社）等の市販のハイブリダイゼーションバッファーを用いて、製造者によって記載されたハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で行ってもよい。
　同程度のストリンジェンシーを生じる結果となる使用可能な他の条件、試薬等が存在するが、当業者はかかる条件に通じていると思われるため、これらについて本明細書中に特段記載はしていない。しかしながら、クロストリジウム属菌毒素遺伝子プロモーター領域に類似する配列の明確な同定ができるよう、条件を適宜調節することが可能である。
　本発明におけるプロモーター領域は、天然のクロストリジウム属菌の毒素遺伝子に含まれるものであっても、天然のプロモーター領域を変異させた変異体であってもよい。変異としては、任意の塩基配列の欠失、置換、付加、例えば、－１０領域および／もしくは－３５領域以外の改変、－１０領域～－３５領域（両領域間部分を含む）の改変、－１０領域および／または－３５領域のモチーフの改変、これらの領域間の塩基数の増減および／または塩基の置換、これらの領域と転写開始点との間の塩基数の増減および／または塩基の置換などを含む。
　本発明の一態様において、好ましい核酸分子の変異体は、配列番号１の核酸配列において、１個または２個以上の変異を含み、かつ配列番号７の核酸配列を含む核酸分子、配列番号２の核酸配列において、１個または２個以上の変異を含み、かつ配列番号８の核酸配列を含む核酸分子、配列番号３の核酸配列において、１個または２個以上の変異を含み、かつ配列番号９の核酸配列を含む核酸分子、配列番号４の核酸配列において、１個または２個以上の変異を含み、かつ配列番号１０の核酸配列を含む核酸分子、配列番号５の核酸配列において、１個または２個以上の変異を含み、かつ配列番号１１の核酸配列を含む核酸分子、配列番号６の核酸配列において、１個または２個以上の変異を含み、かつ配列番号１２の核酸配列を含む核酸分子である。
　変異される塩基の数は特に限定されないが、１個～数個、１～１０個、１～２０個、１～３０個、１～５０個、または、１～１００個の範囲であってもよい。
　上記変異体のうち、プロモーター活性を高める変異、すなわち、目的とする遺伝子の発現を高める変異が好ましい。また、クローニングの便宜のため、本発明におけるプロモーター領域には、所望の制限酵素部位が付加されていてもよい。プロモーター領域への制限酵素部位の導入方法は特に限定されず、例えば、インバースＰＣＲ法、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法、メガプライマーＰＣＲ法などの種々の部位特異的変異導入法や、制限酵素部位を付加したプライマーを用いてＰＣＲ法などで増幅する方法などの既知の任意の手法を用いて行うことができる。
　本発明の核酸分子は、典型的にはＤＮＡであるが、場合によっては、ＲＮＡ、または、人工核酸、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび種々の修飾核酸（ホスホロチオエート修飾核酸など）であってもよい。
　本発明における異種遺伝子は、本発明の核酸分子に含まれるプロモーター領域が由来する遺伝子とは異なる遺伝子を意味する。生物種は同一であっても異なってもよい。例えば、本発明の核酸分子がウェルシュ菌のι毒素遺伝子に由来する場合、異種遺伝子はウェルシュ菌のι毒素遺伝子以外の任意の遺伝子、例えば、限定することなく、ウェルシュ菌α毒素遺伝子、ε毒素遺伝子、ボツリヌス毒素遺伝子、破傷風毒素遺伝子であることができる。
　本発明における好ましい異種遺伝子としては、限定することなく、例えば、細菌、好ましくはグラム陽性細菌に由来する遺伝子（例えば、ウェルシュ菌α毒素、ε毒素およびι毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素など）、低分子タンパク質遺伝子（例えば、分子量１００ｋＤａ以下、特に分子量５０ｋＤａ以下のもの）、薬効を有するタンパク質の遺伝子（例えば、治療の対象となるヒトや、非ヒト動物などに由来する酵素、ホルモン、抗体、サイトカインなど）が挙げられる。本発明の異種遺伝子は、典型的にはタンパク質をコードするが、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡなどの核酸分子をコードするものであってもよい。
　異種遺伝子は、コード領域のみを含んでもよいし、非コード領域を含んでもよい。また、非コード領域には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合配列などの種々の機能的な配列が含まれていてもよい。
　また、異種遺伝子は、遺伝子産物の発現、分泌および／または精製に有利な種々の改変を含んでもよい。かかる改変としては、限定されずに、例えば、分泌シグナル配列の付加、精製のためのタグ配列（例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、Ｓタグ、Ｔ７タグなど）の付加などが挙げられる。
　分泌シグナルとしては、限定することなく、例えば、バチルス属細菌のアセト乳酸デカルボキシラーゼ、アルカリセルラーゼ、アルカリホスファターゼ、アルカリプロテアーゼ、アミラーゼ（α－アミラーゼなど）、バチロペプチダーゼ、キチナーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、β－グルカナーゼ、β－ラクタマーゼ、レバナーゼ、レバンスクラーゼ、β－マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、ＭＷＰ（middle wall protein）、中性プロテアーゼ、ＯＷＰ（outer wall protein）、ＲＮａｓｅ、スフィンゴミエリナーゼ、サブチリシン、キシラナーゼなどに由来するものが挙げられる（具体的な配列は、例えば、Microbiol Rev. 1993 Mar;57（1）:109-37を参照）。
　本発明において、異種遺伝子が本発明の核酸分子に「作動可能に連結される」とは、本発明の核酸分子とこれに連結された異種遺伝子とを含む本発明の核酸構築物が適切な宿主細胞に導入された場合に、その宿主細胞内で通常の状態において前記異種遺伝子が発現されるように、異種遺伝子と本発明の核酸分子とが化学的に結合していることをいう。通常の状態とは、宿主細胞において、前記異種遺伝子の発現を増強または低減するような処置が施されていない状態、または、そのような病原体に冒されていない状態をいう。上記条件を満たす限り、本発明の核酸分子は、異種遺伝子の上流または下流に連結していてもよいが、典型的には異種遺伝子の上流に位置する。ここで、異種遺伝子の上流および下流とは、異種遺伝子の５’側および３’側をそれぞれ意味する。本発明の核酸分子は、異種遺伝子と直接連結されていても、介在塩基配列（スペーサー）を介して連結されていてもよい。本発明の核酸分子と異種遺伝子との位置関係は、本発明の核酸分子に含まれるプロモーター領域と、そのプロモーター領域が由来する遺伝子のコード領域との位置関係と同一であるかまたはこれに近いことが好ましいが、上記条件を満たす限りこれに限定されない。
　本発明において、本発明の核酸分子と異種遺伝子とが「連結される」とは、本発明の核酸分子と異種遺伝子とが、直接、または、スペーサーを介して化学結合していることをいう。本発明において、かかる化学結合は、核酸分子がＤＮＡやＲＮＡの場合には、典型的にはホスホジエステル結合を含むが、作動可能であるかぎり、ホスホロチオエート結合などの他の結合であってもよい。
　本発明において、本発明の核酸分子が異種遺伝子の「発現を増強する」とは、異種遺伝子を本発明の核酸分子に作動可能に連結することにより、適切な宿主細胞における発現が、本発明の核酸分子を連結しない場合に比べて高まることを意味する。発現の高まりは、単位時間あたりの発現量の増加、および／または、一定量の発現産物を得るための期間の短縮として評価することができる。本発明において、発現量は、本発明の核酸分子を連結しない場合より多く、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、より一層好ましくは３倍以上、特に好ましくは４倍以上多い。なお、本発明の核酸分子の異種遺伝子発現増強効果は、連結される異種遺伝子の種類によって異なり得る。
　発現産物の量は、本発明の核酸構築物を導入した宿主細胞を所定期間培養し、その培養上清中、または、宿主細胞を溶解した後の溶解液中の発現産物の量を既知の手法で測定することによって評価することができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法などの抗体を用いる方法、紫外吸収法、ブラッドフォード法（クーマシーブルー法）、ローリー法（フェノール試薬法）、ＢＣＡ法（ビシンコニン酸法）などの比色法、電気泳動パターンの比較による定量法などの一般的なタンパク質測定方法のほか、異種遺伝子発現産物の性質に応じた種々の手法、例えば、発現産物が酵素である場合には、その基質との反応の定量、発現産物が酵素の基質である場合には、その酵素との反応の定量、発現産物が生理活性物質である場合には、その生理学的反応の定量などが挙げられる。
　また、異種遺伝子として、検出が容易なレポーター遺伝子、例えば、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ＤｓＲｅｄ（Discosoma sp. Red Fluorescent Protein）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼなどを用いることにより、発現量を容易に比較することができる。
　本発明の核酸分子は、プロモーター領域を２つ以上含むことができる。この場合、プロモーター領域の少なくとも１つは、クロストリジウム属菌の毒素遺伝子に由来するものである。したがって、本発明の核酸分子は、クロストリジウム属菌の毒素遺伝子に由来するプロモーター領域を少なくとも１つ、および、クロストリジウム属菌の毒素遺伝子に由来しないプロモーター領域を少なくとも１つ含んでもよい。２つ以上のプロモーター領域は、互いに直接連結されていても、介在配列を介して連結されていてもよい。
　本発明の核酸分子はまた、翻訳に関与するシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列などのリボソーム結合部位を含んでもよい。ＳＤ配列は、５’－ＡＧＧＡＧＧ－３’等のモチーフまたはその類似配列を有するプリン塩基に富んだ３～９塩基長の配列であり、１６ＳｒＲＮＡが結合するとされている。リボソーム結合部位は、好ましくは転写開始点の下流に含まれる。ＳＤ配列を含む本発明の核酸分子としては、例えば、配列番号１～６の配列、またはその部分配列である、配列番号１９～２４に記載の配列を含むものが挙げられる。
　本発明はまた、本発明の核酸分子と、これに作動可能に連結された異種遺伝子とを含む核酸構築物に関する。本発明の核酸構築物は、本発明の核酸分子および異種遺伝子のほか、転写を終結させるターミネーター（転写終結シグナルとも呼ぶ）を有してもよい。ターミネーターは、異種遺伝子の一部であっても、これに由来するものでも、または、これに由来しないものであってもよい。一般的なターミネーターの例は当業者によく知られており、これらのうち任意のものを用いることができる。具体的には、限定されずに、例えば、転写されたｍＲＮＡが強固なヘアピン構造をとるようにする回文構造を有する配列（例えば、ＧＣリッチな配列）が挙げられる。本発明の核酸構築物は、上記のほか、所望の細胞内部でのその構築物の効率的な複製および発現を可能にするその他の遺伝子配列を含み得る。
　本発明の核酸構築物は、種々の核酸導入法、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、電気穿孔法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、リポソーム法（例えば、カチオン性リポソームによるもの）、コンピテントセル法、プロトプラスト法などにより、宿主細胞に導入し、担持する異種遺伝子を発現させることができる。また、本発明の核酸構築物を種々の発現ベクターに組み込み、これで宿主細胞をトランスフェクトすることによって、担持する異種遺伝子を発現させることもできる。
　本発明はまた、本発明の核酸分子または核酸構築物を含むベクターに関する。本発明において、ベクターは、本発明の核酸分子または核酸構築物を自身に組み込み、これを維持し、宿主細胞遺伝子に導入し、増幅させ、および／または、異種遺伝子を発現させることができる任意の核酸分子を意味する。ベクターは典型的にはＤＮＡから構成されるが、ＲＮＡから構成されるベクターを用いることもできる。ベクターは、限定されずに、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ等を含む。ベクターは、その用途によって、遺伝子のクローニングに用いるクローニングベクターや、遺伝子の発現に用いる発現ベクターなどに分類することができるが、本発明のベクターはこれらの様々な用途のベクターを包含する。ベクターは、その用途に応じて、本発明の核酸分子または核酸構築物のほか、核酸分子または核酸構築物の組み込み、宿主細胞への導入、複製、異種遺伝子の発現などに有用な種々の機能的塩基配列を含むことができる。かかる塩基配列としては、限定されずに、例えば、制限酵素部位（マルチクローニングサイトなど）、複製起点配列、選択マーカー遺伝子配列、レポーター遺伝子配列、プロモーター配列、ターミネーター配列などが挙げられる。かかる機能的塩基配列は当業者によく知られており、既知の任意のものを、適切な位置および方向で用いることができる。
　本発明のベクターは、本発明の核酸分子を少なくとも含む。したがって、本発明のベクターの一態様は、目的とする異種遺伝子を含まない。ここで、目的とする異種遺伝子は、ベクターに副次的な機能を付与する機能的遺伝子、例えば、選択マーカー遺伝子やレポーター遺伝子を含まないものとする。したがって、本発明のベクターの上記態様は、目的とする異種遺伝子を含まないが、かかる機能的遺伝子を含んでもよい。本態様において、ベクターは好ましくは、本発明の核酸分子と目的とする異種遺伝子とを作動可能に連結し得る制限酵素部位、より好ましくはマルチクローニングサイトを有しており、所望の任意の異種遺伝子を組み込むことができるようになっている。したがって、本態様の好ましいベクターは、任意の異種遺伝子の発現に用いることができる。本態様の特に好ましい例としては、限定されずに、配列番号３３の核酸配列を有するベクターが挙げられる。
　別の態様において、本発明のベクターは、本発明の核酸分子と、これに作動可能に連結された異種遺伝子、すなわち、本発明の核酸構築物を含む。本態様の特に好ましい例としては、限定されずに、配列番号３０、５８～６２の核酸配列を有するベクターが挙げられる。
　ベクターは、所望の機能的塩基配列を組み合わせて作製してもよいが、市販の種々のベクターをベースに構築することも可能である。種々の宿主細胞に対応した、種々の用途のベクターが利用可能となっている。枯草菌用のベクターとしては、例えば、ｐＡ－ｓｐａｃ、ｐＡＭ１、ｐＡＸ０１、ｐＢＳ７２、ｐＣ１９４、ｐＤＧ１６６１、ｐＤＧ１６６２、ｐＤＧ１６６３、ｐＤＧ１６６４、ｐＤＧ１７２８、ｐＤＧ１７２９、ｐＤＧ１７３１、ｐＤＧ２７１、ｐＤＬ、ｐＤＫ、ｐＤＨ３２、ｐＥ１９４、ｐＥ１９４－ｃｏｐ６、ｐＧｌｔ－Ｃｍ、ｐＧｌｔ－Ｋａｎ、ｐＨＣＭ０２、ｐＨＣＭ０４、ｐＨＣＭ０５、ｐＨＹ５００、ｐＨＹ７００、ｐＨＹ４８３１、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５、ｐＨＴ２１０、ｐＨＶ１４３１、ｐＨＶ１４３２、ｐＩＰ４０４、ｐＩＰ５０１、ｐＬＳ２０、ｐＬＳ３２、ｐＭＬＫ８３、ｐＭＴＬＢＳ７２、ｐＮＤＨ３３、ｐＮＨ２００、ｐＮＨ３００、ｐＮＨ４００、ｐＮＵ１００、ｐＮＵ２００、ｐＮＵ２１１、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５、ｐＰｙｒ－Ｃｍ、ｐＰｙｒ－Ｋａｎ、ｐＳａｃ－Ｃｍ、ｐＳａｃ－Ｋａｎ、ｐＳＭ１９０３５、ｐＴ１２７、ｐＴ１８１、ｐＴＡ１０１５、ｐＴＡ１０６０、ｐＴＢ１９、ｐＴＲＫＨ２、ｐＵＢ１１０、φ１０５、ＳＰβなどが、大腸菌用のベクターとしては、例えば、ｐＡＣＹ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｒｉｐｔ、ｐＥＴ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、λｇｔ１０、λｇｔ１１などが、枯草菌および大腸菌の双方に利用可能なベクター（シャトルベクター等）としては、例えば、ｐＢＥ２０、ｐＢＥ６０、ｐＥ１８、ｐＥＢ１０、ｐＨＢ２０１、ｐＨＰ１３、ｐＨＰＳ９、ｐＨＶ１４、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＬＢ５、ｐＲＢ３７３、ｐＵＢ１８、ｐＵＢ１９、ｐＷＢ９８０などが知られている（例えば、Schumann, Adv Appl Microbiol. 2007;62:137-89を参照）。したがって、本発明の一態様は、かかるベクターまたはその改変体に本発明の核酸分子または核酸構築物を組み込んだベクターである。
　ベクターへの本発明の核酸分子または核酸構築物の組み込みは、典型的には制限酵素によって行う。制限酵素としては、当業者に知られた任意のもの、例えば、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩ、ＡｐａＩ、ＡｏｒＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＸＩ、Ｃｆｒ９Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｄｃＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＦｏｋＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨａｐＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＭａｅＩＩＩ、ＭｂｏＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｅＩ、ＭｖａＩ、ＮａｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰｍａＣＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｌＩ、ＳｓｐＩ、ＴａｑＩ、ＸｂａＩ、ＸｍｎＩ、ＸｈｏＩなどを用いることができる。
　本発明はまた、本発明の核酸分子、核酸構築物またはベクターで形質転換された宿主細胞に関する。本発明における宿主細胞は、本発明の核酸分子が機能し得る、すなわち、本発明の核酸分子に連結された異種遺伝子を発現し得るもの、および／または、本発明のベクターがその内部で維持もしくは複製され得るものであれば特に限定されず、原核生物細胞および真核生物細胞を含む種々の細胞を包含する。本発明の一態様において、宿主細胞は原核生物細胞、典型的には細菌細胞である。本発明において好ましい細菌種としては、限定されずに、例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）、Bacillus brevis、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus stearothermophilusなどのバチルス属細菌、大腸菌などが挙げられる。これらのうち、発現産物の精製が容易であり、生体に有害な製造工程由来物質が混入するおそれの低いバチルス属細菌が好ましく、枯草菌が特に好ましい。枯草菌については種々の菌株、例えば、ＢＤ１７０株、１６８株、ＩＳＷ１２１４株、ＭＩ１１４株などが利用可能である。また、細胞外に分泌されるプロテアーゼの産生が抑えられた菌株（例えば、１０６ＨＬ株、ＤＹ－１６株など）を用いることもできる。
　宿主細胞を形質転換するとは、典型的には宿主細胞に外来の核酸分子を導入してその遺伝的性質を変化させることをいい、具体的には、本発明の核酸分子、核酸構築物またはベクターを宿主細胞内へ導入することにより行う。本明細書中では、導入された宿主細胞を特に形質転換体と呼ぶ場合がある。導入には、種々の核酸導入法、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、電気穿孔法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、リポソーム法（例えば、カチオン性リポソームによるもの）、コンピテントセル法、プロトプラスト法などを用いることができる。核酸分子や核酸構築物の場合は、上記のほか、種々のベクター、例えば、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを利用した導入法を用いることもできる。導入された核酸分子、核酸構築物またはベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、構成的に、または、誘導的に目的とする異種遺伝子を発現させることができる。核酸分子を導入する場合、これが目的とする異種遺伝子と作動可能に連結されるように、宿主細胞のゲノムに組み込まれる必要がある。また、ベクターを導入する場合、異種遺伝子は、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、宿主細胞内で発現してもよい。
　宿主細胞はまた、本発明のベクターを維持または増幅するために用いることができる。かかる用途の場合、ベクターは、宿主細胞内で宿主細胞のゲノムに組み込まれずに、もしくは宿主細胞のゲノムに組み込まれて維持されるか、または自律的に複製する。この場合、異種遺伝子の発現は行われても行われなくてもよい。また別の態様では、ベクターは同一宿主細胞内では複製されずに維持されるが、宿主細胞の分裂に伴って複製される。こうして維持または増幅されたベクターは、次いで、発現のための宿主細胞に導入することができる。
　本発明はまた、本発明の宿主細胞（すなわち、形質転換体）を培養する工程を含む、遺伝子産物の製造方法に関する。本発明の形質転換体は、それぞれに適した既知の手法により培養することができる。培養は、典型的には培地中で行う。培地は固形、半固形、液体など種々の形態のものを含むが、処理が容易で、大量培養が可能な液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、セロビオース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
　枯草菌や大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主とする形質転換体の培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は、典型的には１５～５０℃、好ましくは２０～４０℃であり、培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中のｐＨは３．０～９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。本発明の形質転換体が誘導性のプロモーターを含む場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを含む場合はイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを含む場合はインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　培養している形質転換体は、誘導することなく、または誘導により目的とする異種遺伝子を発現し、培養物中に生成蓄積することができる。異種遺伝子の発現産物は、宿主細胞内に蓄積されるか、宿主細胞外に分泌されるか、または、宿主細胞外膜上に蓄積され得、使用する宿主細胞や、発現産物の構造を変えることにより、産生様式を変更することができる。本発明においては、発現産物の生成が容易であることから、発現産物が宿主細胞外に分泌される様式が好ましい。
　本発明の形質転換体により製造された発現産物は、例えば、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、フレンチプレス、ホモジナイザー、ダイノミル等による機械的破砕法、凍結融解法、リゾチーム添加法、超音波処理法、界面活性剤添加法などの手法を単独でまたは組み合わせて用いて細胞を破砕することにより無細胞抽出液を得、次いでこれを遠心分離することにより得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、すなわち、溶媒抽出法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、陰イオン交換クロマトグラフィー法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法（例えば、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー法）、クロマトフォーカシング法、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、アガロースゲル電気泳動法、等電点電気泳動法など）、電気溶出法、などの手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製することができる。
　発現産物が細胞内に不溶体として蓄積する場合は、細胞を回収後、これを破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収し、これをタンパク質変性剤で可溶化し、得られた可溶化液を希釈または透析して発現産物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法に供することにより、発現産物を精製することができる。
　発現産物が細胞外に分泌される場合には、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、これを上記と同様の単離精製法に供することにより、発現産物を精製することができる。
　発現産物の回収を容易にするために、特定の物質との結合性を有するタグペプチドを予め発現させるポリペプチドに組み込んでおくこともできる。かかるタグペプチドとしては、限定することなく、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、Ｓタグ、Ｔ７タグなどを挙げることができる。したがって、目的とする異種遺伝子は、かかるタグペプチドをコードする核酸配列を含んでいてもよい。
　本発明の方法は、研究室レベルの小規模な製造から、工場レベルの大規模な製造を含む、種々の規模の製造に適用することができる。その場合、本発明の上記方法は、その規模に適合するように適宜改変してもよい。各製造規模に適した改変は当業者によく知られている。
　本発明はまた、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクター、および／また宿主細胞を含む、遺伝子産物製造キットに関する。
　本発明のキットに含まれる、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクターおよび／また宿主細胞は、保存可能な状態で容器内に存在していれば任意の形態をとることができるが、典型的には、保存液に懸濁された状態または凍結乾燥された状態で容器中に保存される。保存液に懸濁された状態の場合は、冷蔵保存または凍結保存が必要となることがある。容器は好ましくは密封される。凍結乾燥は、当業者に知られた任意の手法により行うことができる。具体的には、限定されずに、例えば、対象物を分散媒等を含む保存液に懸濁した後、懸濁液を密封可能な容器（アンプルなど）に注入し、これを凍結乾燥機に装着して凍結乾燥を行う。凍結乾燥終了後、容器を密封する。対象物の製造、容器への注入、凍結乾燥などの種々の操作は、好ましくは無菌条件下で行う。保存液は、用途や保存する対象物に対応した種々のものが知られており、これらを適宜利用することができる。保存液に含まれる成分としては、限定されずに、例えば、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ブタンジオール、ホルムアミド、プロパンジオール、ソルビトール、マンニトール、ＤＭＳＯ、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌとＥＤＴＡとの混合物）などが挙げられる。
　本発明のキットは、目的とする１種または２種以上の異種遺伝子を本発明の核酸分子に作動可能に連結した核酸構築物またはこれを含むベクターとして含んでもよく、あるいは、異種遺伝子を本発明の核酸分子とは別の核酸構築物またはベクターに含んでもよい。したがって、本発明のキットは、本発明の核酸分子は含むが、目的とする異種遺伝子を含まない核酸構築物またはベクターのみを含んでも、本発明の核酸分子とこれに作動可能に連結した異種遺伝子を含む核酸構築物またはベクターのみを含んでも、本発明の核酸分子は含むが、目的とする異種遺伝子を含まない核酸構築物またはベクターと、目的とする異種遺伝子を含むが、本発明の核酸分子は含まない核酸構築物またはベクターとを含んでもよい。また、目的とする異種遺伝子を含むが、本発明の核酸分子は含まない核酸構築物またはベクターは、本発明のキットのオプションとして別個に提供されてもよい。本発明の核酸分子と、目的とする異種遺伝子とが別々の核酸構築物またはベクターに含まれる場合、これらの核酸構築物またはベクターを制限酵素などで処理することにより、本発明の核酸分子とこれに作動可能に連結した異種遺伝子を含む核酸構築物またはベクターが生成されるよう、それぞれの核酸構築物またはベクターを設計することが好ましい。
　本発明のキットは、遺伝子産物の製造に有用な上記以外の要素を含んでいてもよい。かかる要素としては、限定されずに、例えば、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクターおよび／また宿主細胞を保存状態から再生する再生剤、核酸分子の組み込みに用いる制限酵素、宿主細胞を培養するための培養培地、形質転換された宿主細胞を選択するための選択培地、遺伝子産物の発現量などを評価する基準となる既知量の遺伝子産物の標準物質、本発明の核酸分子、核酸構築物、ベクターおよび／また宿主細胞等の再生方法、遺伝子産物の製造方法などに関する説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等が含まれる。
　以下に、本発明を具体例に基づいてさらに説明するが、かかる具体例は、本発明の例示であり、本発明を限定するものではない。
実施例１　ウェルシュ菌ι毒素ａ成分（Ｉａ）遺伝子のクローニング
（１）ウェルシュ菌プラスミドＤＮＡの抽出
　Ｅ型ウェルシュ菌（NCIB10748）を５００ｍｌのブレインハートインフュージョン培地中３７℃で６時間培養し、８，０００ｒｐｍの遠心分離により集菌した。沈殿した菌体をＴＮＥ緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８））に懸濁し、遠心分離により洗浄した。沈殿した菌体に２５％スクロース含有ＴＮＥ緩衝液とリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）とを添加し、３７℃で１５分間振盪した。次いで、終濃度１００ｍＭのＥＤＴＡを添加し、３７℃で２０分間インキュベーションした。これに、終濃度１％のＮ－ラウロイルサルコシンナトリウム（ＬＳＳ）を添加して穏やかに攪拌後、ライセートを４℃で一晩放置した。１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離後、その上清を採取し、ＴＮＥ緩衝液で８ｍｌとして塩化セシウム８ｇを溶解し、バーティカルローターを用い４℃、４５，０００ｒｐｍで１２時間遠心分離し、プラスミドＤＮＡを含む画分を紫外線ランプで確認しながら単離した。得られた画分を３ｌのＴＥ緩衝液で透析後、エタノール沈殿法によりプラスミドＤＮＡを精製し、ＴＥ緩衝液（１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に溶解してプラスミドＤＮＡとし、クローニングの出発材料とした。
（２）Ｉａ遺伝子のクローニング
　上記で得たＤＮＡを鋳型にして、Ｉａ遺伝子の既知の塩基配列（Infect. Immun. 61, 5147-5156（1993））を参考にしてプライマーを作製し、ＰＣＲ法でＩａ構造遺伝子およびその上流と下流を含む領域を増幅した。なお、プライマーの配列は以下のとおりである。
　フォワードプライマー：5’-GAATTCAGAAAATACAATCT -3’（配列番号２５）
　リバースプライマー：5’-TATGATAACGTTTGACTTAT-3’（配列番号２６）
　得られた1721bpのＰＣＲ産物（配列番号２７）をＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼによりpT7BlueT-Vector（Novagen社）に挿入して、Ｉａ遺伝子を有するベクターｐＴ－Ｉａを得た。
（３）Ｉａ遺伝子の塩基配列の決定
　得られたＩａの構造遺伝子を含む遺伝子は、アガロースゲル電気泳動で確認したところ、約１．３ｋｂｐであった。ｐＴ－Ｉａの全シークエンスは、Big dye試薬（Applied Biosystems社）と、上記文献に記載のＩａ遺伝子配列を基に作製したプライマーとでシークエンス反応を行い、ABI PRISM(R) 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）で解析した。Ｉａの遺伝子配列は、上記文献に記載のものと一致した。
実施例２　Ｉａ遺伝子プロモーター領域を含むベクターの構築
　ｐＴ－Ｉａから、Ｉａの構造遺伝子とその上流と下流を含む領域（配列番号２７）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切り出し、大腸菌－枯草菌シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ株式会社）に挿入した。得られたＩａ遺伝子挿入ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ－ＣｐＩａに含まれるＩａ遺伝子のプロモーター領域下流、すなわち、配列番号２８で表されるＩａ遺伝子配列相補鎖の１４７６位と１４７７位との間にマルチクローニング配列（配列番号２９）を挿入した。具体的には、上記部位にＮｄｅＩサイト（CATATG）を挿入してベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ－ＣｐＩａ－ＮｄｅＩを作製後、上述のマルチクローニングサイトをLigation kit（タカラバイオ株式会社）を用いてクローニングした。得られたベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ－ＣｐＩａ－ＭＣＳは、ABI PRISM(R) 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）でシークエンス解析を行い、所望の配列（配列番号３０）が得られたことを確認した。
　別な実験では、上記で得たｐＨＹ３００ＰＬＫ－ＣｐＩａ－ＮｄｅＩから、Ｉａ遺伝子のプロモーター領域（配列番号３１）をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで切り出し、３’末端にＮｄｅＩサイトを付加したマルチクローニングサイト（配列番号３２）を有する改変ｐＨＹ３００ＰＬＫにライゲーションし、Ｉａ遺伝子プロモーター領域を含むベクターｐＣＩＰを構築した。得られたｐＣＩＰは、ABI PRISM(R) 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）でシークエンス解析を行い、配列番号３３で表される所望の配列が得られたことを確認した（図１および２参照）。
実施例３　異種遺伝子のクローニング
（１）ウェルシュ菌α毒素遺伝子のクローニング
　１）ウェルシュ菌染色体ＤＮＡの抽出
　Ａ型ウェルシュ菌（NCTC8237）を５００ｍｌのブレインハートインフュージョン培地中３７℃で６時間培養し、８，０００ｒｐｍの遠心分離により集菌した。菌体をＴＮＥ緩衝液に懸濁し、遠心分離により洗浄した。菌体をＴＮＥ緩衝液に懸濁して３７℃で６０分間振盪し、これに、終濃度１％のＳＤＳを添加して緩やかに攪拌後、等量の飽和フェノール－クロロホルムを加えてよく混和して、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、その上清を回収した。上清に等量の飽和クロロホルム－イソアミルアルコールを加えてよく混和し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清を採取して２倍量の９９％エタノールと混和し、－３０℃で２時間冷却してＤＮＡを析出させた。その後、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清を捨て、その沈殿を２０分間減圧乾燥させた。この沈殿をＴＥ緩衝液で溶解し、ＲＮａｓｅ（Sigma社）溶液を１２５ｍｇ／ｍｌとなるように添加して、３７℃で１０分間処理した。これに、終濃度０．１ＭになるようにＮａＣｌを添加し、さらに、等量の飽和クロロホルム－イソアミルアルコールを添加してよく攪拌し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、その上清に２．５倍量の９９％エタノールを加え、－８０℃で３０分間冷却した。析出したＤＮＡを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、沈殿を減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液に溶解して染色体ＤＮＡとし、クローニングの出発材料とした。
　２）ウェルシュ菌α毒素遺伝子のクローニング
　上記の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、３～４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し脱リン酸化したｐＵＣ１９ベクターとライゲーションを行った。このライゲーション液を大腸菌ＪＭ１０９にトランスフォームして、卵黄寒天培地に接種し、一晩培養した。α毒素遺伝子の発現により周囲に白濁が生じたコロニーをピックアップし、ＬＢ培地に接種して培養を行い、α毒素遺伝子を含むプラスミド（ｐＵＡ－３．１）を単離した。
　３）ウェルシュ菌α毒素遺伝子の塩基配列の決定
　得られたα毒素の構造遺伝子を含む遺伝子は、アガロースゲル電気泳動で確認したところ、約３．１ｋｂｐであった。ｐＵＡ－３．１の全シークエンスは、Big dye試薬（Applied Biosystems社）と、既に報告されているα毒素の遺伝子配列（Infect. Immun. 57, 367-376（1989））を基に作製したプライマーとでシークエンス反応を行い、ABI PRISM(R) 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）で解析した。得られたα毒素の遺伝子配列は、上記文献に記載のものと一致した。
　４）ウェルシュ菌α毒素遺伝子の発現ベクターへのクローニング
　ｐＵＡ－３．１を鋳型として、α毒素の構造遺伝子とその上流と下流を含む１．３ｋｂｐの領域をＰＣＲで増幅した。なお、プライマーの配列は以下のとおりである。
　フォワードプライマー：5’-TTTAAAAAATATTCAAAAAAT-3’（配列番号３４）
　リバースプライマー：5’-GGAAGCTTTTATTTTGTAAATAC-3’（配列番号３５）
　得られた１．３ｋｂｐのＰＣＲ産物（配列番号３６）を平滑化したものを、ＳｍａＩで切断したｐＨＹ３００ＰＬＫに挿入し、ウェルシュ菌α毒素遺伝子発現ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ－Ｃｐαを得た。
（２）ウェルシュ菌β２毒素遺伝子のクローニング
　１）ウェルシュ菌プラスミドＤＮＡの抽出
　Ａ型ウェルシュ菌（Strain 13）を５００ｍｌのブレインハートインフュージョン培地中３７℃で６時間培養し、８，０００ｒｐｍの遠心分離により集菌した。沈殿した菌体をＴＮＥ緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８））に懸濁し、遠心分離により洗浄した。沈殿した菌体に２５％スクロース含有ＴＮＥ緩衝液とリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）とを添加し、３７℃で１５分間振盪した。次いで、終濃度１００ｍＭのＥＤＴＡを添加し、３７℃で２０分間インキュベーションした。これに、終濃度１％のＮ－ラウロイルサルコシンナトリウム（ＬＳＳ）を添加して穏やかに攪拌後、ライセートを４℃で一晩放置した。１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離後、その上清を採取し、ＴＮＥ緩衝液で８ｍｌとして塩化セシウム８ｇを溶解し、バーティカルローターを用い４℃、４５，０００ｒｐｍで１２時間遠心分離し、プラスミドＤＮＡを含む画分を紫外線ランプで確認しながら単離した。得られた画分を３ｌのＴＥ緩衝液で透析後、エタノール沈殿法によりプラスミドＤＮＡを精製し、ＴＥ緩衝液（１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に溶解してプラスミドＤＮＡとし、クローニングの出発材料とした。
　２）ウェルシュ菌β２毒素遺伝子のクローニング
　上記で得たＤＮＡを鋳型にして、β２毒素遺伝子の既知の塩基配列（Gene 203, 65-73（1997））を参考にしてプライマーを作製し（フォワードプライマー：5’-TTAGATAAAAGTGTAAAAGA-3’（配列番号３７）、リバースプライマー：5’-TTAGGTTTTTATATAATAA-3’（配列番号３８））、ＰＣＲ法でβ２毒素構造遺伝子およびその上流と下流を含む領域を増幅した。９６０ｂｐのＰＣＲ産物（配列番号３９）をｐＴ７Ｂｌｕｅベクターに挿入して、β２毒素遺伝子を有するベクターｐＴ－β２を得た。
（５）セレウス菌スフィンゴミエリナーゼ（ＢｃＳＭａｓｅ）遺伝子のクローニング
　１）セレウス菌プラスミドＤＮＡの抽出
　セレウス菌（IAM1029）を５００ｍｌのブレインハートインフュージョン培地中３７℃で６時間培養し、８，０００ｒｐｍの遠心分離により集菌した。沈殿した菌体をＴＮＥ緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８））に懸濁し、遠心分離により洗浄した。沈殿した菌体に２５％スクロース含有ＴＮＥ緩衝液とリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）とを添加し、３７℃で１５分間振盪した。次いで、終濃度１００ｍＭのＥＤＴＡを添加し、３７℃で２０分間インキュベーションした。これに、終濃度１％のＮ－ラウロイルサルコシンナトリウム（ＬＳＳ）を添加して穏やかに攪拌後、ライセートを４℃で一晩放置した。１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離後、その上清を採取し、ＴＮＥ緩衝液で８ｍｌとして塩化セシウム８ｇを溶解し、バーティカルローターを用い４℃、４５，０００ｒｐｍで１２時間遠心分離し、プラスミドＤＮＡを含む画分を紫外線ランプで確認しながら単離した。得られた画分を３ｌのＴＥ緩衝液で透析後、エタノール沈殿法によりプラスミドＤＮＡを精製し、ＴＥ緩衝液（１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に溶解してプラスミドＤＮＡとし、クローニングの出発材料とした。
　２）セレウス菌スフィンゴミエリナーゼ遺伝子のクローニング
　上記で得たＤＮＡを鋳型にして、フォワードプライマー：5’-ATGGAGGTATGGAACGTG-3’（配列番号４０）およびリバースプライマー：5’-CTACTTCATAGAAATAGT-3’（配列番号４１）を用いたＰＣＲ法でセレウス菌スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物（配列番号４２）をｐＴ７Ｂｌｕｅベクターに挿入して、セレウス菌スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を有するベクターｐＴ－ＢｃＳＭａｓｅを得た。
実施例４　ｐＣＩＰベクターへの異種遺伝子の挿入
　実施例２で作製したｐＣＩＰのマルチクローニングサイトに、実施例３で得た異種遺伝子（ウェルシュ菌α毒素遺伝子、ウェルシュ菌β２毒素遺伝子、セレウス菌スフィンゴミエリナーゼ遺伝子）、ボツリヌス菌α毒素（ホスホリパーゼＣ（ＣｂＰＬＣ））遺伝子またはボツリヌス菌Ｃ３酵素遺伝子を挿入した。
（１）ウェルシュ菌α毒素遺伝子のｐＣＩＰへの挿入
　ｐＵＡ－３．１を鋳型として、α毒素の構造遺伝子とその上流と下流を含む１．３ｋｂｐの領域をＰＣＲで増幅した。なお、プライマーの配列は以下のとおりである。
　フォワードプライマー：5’-GGGCATATGATGAAAAGAAAGATTTGTAAG-3’（配列番号４３）
　リバースプライマー：5’-CCCTCTAGATTATTTTATATTATAAGTTGA-3’（配列番号４４）
　得られた約１．２ｋｂｐの遺伝子（配列番号４５）をＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断し、同じ酵素で切断したｐＣＩＰとライゲーションして、ウェルシュ菌α毒素遺伝子発現ベクターｐＣＩＰ－Ｃｐαを得た。
（２）ウェルシュ菌β２毒素遺伝子のｐＣＩＰへの挿入
　ｐＴ－β２を鋳型として、β２毒素の構造遺伝子とその上流と下流を含む約０．８ｋｂｐの領域をＰＣＲで増幅した。プライマーとして、先頭のＮｄｅＩ切断部位の後に開始コドン以下の配列を有するフォワードプライマー：5’-AGGCATATGAAAAAAATTATTTCAAAGTTT-3’（配列番号４６）、および停止コドンに終わる下流２９ｂｐを含む、最後にＸｂａＩ部位を持つリバースプライマー：5’-CCTCTAGACTATGCACAATATCCTTC-3’（配列番号４７）を用いた。得られた約０．８ｋｂｐの遺伝子（配列番号４８）をＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断し、同じ酵素で切断したｐＣＩＰとライゲーションしてｐＣＩＰ－Ｃｐβ２を得た。
（３）セレウス菌スフィンゴミエリナーゼ遺伝子のｐＣＩＰへの挿入
　ｐＴ－ＢｃＳＭａｓｅを鋳型として、先頭にＮｄｅＩ切断部位を持つフォワードプライマー：5’-CATATGATGGAGGTATGGAACGTG -3’（配列番号４９）、および最後にＸｂａＩ部位を持つリバースプライマー：5’-TCTAGACTACTTCATAGAAATAGT -3’（配列番号５０）を用いてＰＣＲ法でスフィンゴミエリナーゼ遺伝子を増幅した。得られた約１．０ｋｂの遺伝子（配列番号５１）をＮｄｅＩとＸｂａＩで切断し、同じ酵素で切断したｐＣＩＰとライゲーションしてｐＣＩＰ－ＢｃＳＭａｓｅを得た。
（４）ボツリヌス菌ホスホリパーゼＣ（ＣｂＰＬＣ）遺伝子のｐＣＩＰへの挿入
　ｐＵＣ１８ベクターに挿入されたボツリヌス菌ホスホリパーゼＣ遺伝子（ｐＵＣ１８－ＢＰＬＣ、岡山大大学院　小熊恵二教授より分与）を鋳型として、ＣｂＰＬＣ酵素の構造遺伝子とその上流と下流を含む約１．２ｋｂｐの領域をＰＣＲで増幅した。プライマーとして、開始コドンから始まる、先頭にＮｄｅＩ切断部位を持つフォワードプライマー：5’-CATATGATGAATAAGAAAAAAATATTAAAA-3’（配列番号５２）、および停止コドンの下流にＸｂａＩ部位を持つリバースプライマー：5’-TCTAGATTATTTATTATTTATATAGAATGT-3’（配列番号５３）を用いた。得られた約１．２ｋｂの遺伝子（配列番号５４）をＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断し、同じ酵素で切断したｐＣＩＰとライゲーションしてｐＣＩＰ－ＣｂＰＬＣを得た。
（５）ボツリヌス菌Ｃ３酵素遺伝子のｐＣＩＰへの挿入
　ｐＵＣ１８ベクターに挿入されたＣ３酵素遺伝子（ｐＵＣ１８－Ｃ３、岡山大大学院　小熊恵二教授より分与）を鋳型として、Ｃ３酵素の構造遺伝子とその上流と下流を含む約０．８ｋｂｐの領域をＰＣＲで増幅した。プライマーとして、開始コドンから始まる、先頭にＮｄｅＩ切断部位を持つフォワードプライマー：5’-GGCATATGAAAGGTTTAAGAAAATCA-3’（配列番号５５）、および停止コドンの下流にＸｂａＩ部位を持つリバースプライマー：5’-CCTCTAGATTATTTAGGATTGATAGCTGT-3’（配列番号５６）を用いた。得られた約０．８ｋｂの遺伝子（配列番号５７）をＮｄｅＩとＸｂａＩで切断し、同じ酵素で切断したｐＣＩＰとライゲーションし、ｐＣＩＰ－ＣｂＣ３を得た。
　得られた各ベクターのシークエンスは、ABI PRISM(R) 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）で行い、配列番号５８～６２で表される所望の配列が得られたことを確認した。
実施例５　異種遺伝子の発現
（１）宿主枯草菌細胞の培養
　枯草菌ＩＳＷ１２１４株をＬＢ（Luria-Broth）培地２ｍｌ中３７℃で一晩前培養した。前培養物２ｍｌを本培養液（滅菌ＬＢ培地３２ｍｌに２．９ｇのソルビトールを入れオートクレーブで滅菌したもの）３２ｍｌに加え、３７℃で本培養を行った（約３時間）。吸光度（Ａ６２０）が０．８５～０．９５に達したところで本培養を終了し、培養物を氷中に１０分間放置した後、５，０００×ｇ（９５００ｒｐｍ）で５分間遠心分離した。次いで、氷冷したSolution A（０．５Ｍソルビトール＋０．５Ｍマンニトール＋１０％グリセロール：４５．５ｇのソルビトール、４５．５ｇのマンニトールおよび５０ｍｌのグリセロールを混和し、蒸留水で５００ｍｌにメスアップ後、滅菌したもの）で菌体を４回洗浄した後、０．８ｍｌ（培養液の１／４０量）のSolution Aに懸濁した。得られた菌液を滅菌チューブに６０μｌずつ分注し、－８０℃で保存した。
（２）ベクターの導入
　実施例２～４で作製した各種ベクター（ｐＨＹ３００ＰＬＫ－ＣｐＩａ、ｐＨＹ３００ＰＬＫ－Ｃｐα、ｐＣＩＰ－Ｃｐα、ｐＣＩＰ－Ｃｐβ２、ｐＣＩＰ－ＣｂＰＬＣ、ｐＣＩＰ－ＣｂＣ３またはｐＣＩＰ－ＢｃＳＭａｓｅ）を、エレクトロポレーション法により、宿主枯草菌細胞に導入した。エレクトロポレーションは以下のとおりに行った。まず、上記（１）で調製したエレクトロポレーション用菌液６０μｌを氷中で解凍し、これに１μｌのベクター溶液（１００ｎｇ／μｌ）を加えた。この混合液を、氷冷した０．１ｃｍのキュベットに移して１～１．５分間放置した後、遺伝子導入装置（BTX社、ECM-630）でパルス（２ｋＶ、２００Ω、２５ｍＦ）をかけた。次いで、これを１５ｍｌ遠沈管に移し、Solution B（ＬＢ培地＋０．５Ｍソルビトール＋０．３８Ｍマンニトール）を１ｍｌ加え、３７℃で３時間培養した。培養物を遠心分離し（３５００ｒｐｍ、５分）、上清を９００μｌ除き、沈渣を懸濁したものを、テトラサイクリン（３０ｍｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。形成された形質転換体の耐性コロニーをピックアップし、下記の培養に供した。
（３）形質転換体の培養および遺伝子産物の回収・精製
　各種ベクターが導入された形質転換体を１ｌのＬＢ培地中で攪拌しながら３７℃、１４時間培養後、４℃、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、培養上清を氷冷下で攪拌しながら、硫酸アンモニウム（硫安、ナカライテスク株式会社、０２６１９－８６）を定期的に少量添加して終濃度７０％の飽和硫安（４７２ｇ／ｌ）とし、一晩放置した。その後、４℃、９，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、生じた沈渣を０．０２Ｍ　ＴＢ緩衝液（０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５）に溶解し、同緩衝液で４℃、一晩透析した。透析後、４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を粗生成物（硫安生成物）標品とした。この粗生成物標品を、１Ｍ　ＮａＣｌ－ＴＢ（ｐＨ７．５）で終濃度０．５Ｍ　ＮａＣｌとなるように希釈後、銅キレートアフィニティーカラム（Chelating Sepharose Fast Flow、GE healthcare社）、陰イオン交換カラム（UNOTM Q-1 R Column、BIO-RAD社、720-0011）および／または陽イオン交換カラム（SP-TOYOPEARL 650 M、東ソー株式会社）を用い精製した。得られた各生成物は、ＢＣＡ法でタンパク質量を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで不純物がないことを確認した。１ｌの培養物から得られた最終精製量と、従来のｐＨＹ３００ＰＬＫを用いた同様の手法による１ｌの培養物から得られた最大最終精製量との比較を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　上記結果より、ウェルシュ菌ι毒素遺伝子のプロモーター領域を含む本発明のベクターにより、異種遺伝子の発現が顕著に高まることが示された。また、ウェルシュ菌αおよびβ２毒素遺伝子が従来のベクターでも枯草菌細胞で大量に発現したことから、同遺伝子のプロモーターもまた、異種遺伝子の発現を高め得ることが示唆された。

Claims (7)

  1. 　クロストリジウム属菌の毒素遺伝子に由来するプロモーター領域を含む核酸分子であって、これに作動可能に連結された異種遺伝子の発現を増強する、前記核酸分子。
  2. 　毒素遺伝子がウェルシュ菌α毒素、ε毒素およびι毒素、ボツリヌス毒素、および破傷風毒素からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 　請求項１または２に記載の核酸分子と、これに作動可能に連結された異種遺伝子とを含む核酸構築物。
  4. 　請求項１または２に記載の核酸分子または請求項３に記載の核酸構築物を含むベクター。
  5. 　請求項４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  6. 　請求項５に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、遺伝子産物の製造方法。
  7. 　請求項１もしくは２に記載の核酸分子、請求項３に記載の核酸構築物、請求項４に記載のベクター、および／または請求項５に記載の宿主細胞を含む、遺伝子産物製造キット。
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