JP2002504379A

JP2002504379A - バチルス細胞内でのポリペプチドの製法

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Publication number: JP2002504379A
Application number: JP2000533574A
Authority: JP
Inventors: ウィドナー，ウィリアム; スロマ，アラン; ディー．トーマス，マイケル
Original assignee: ノボザイムスバイオテック，インコーポレイティド
Priority date: 1998-02-26
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2002-02-12
Anticipated expiration: 2019-02-26
Also published as: ATE462794T1; CN1510145A; DK1056873T3; CN1174101C; EP1056873B1; US6255076B1; CN100510095C; DE69942199D1; US20030170876A1; WO1999043835A2; JP2009279014A; JP2009131277A; EP1056873A2; US5955310A; JP5270498B2; JP4571304B2; WO1999043835A3; AU2975699A; US7179634B2; JP4629783B2

Abstract

(57)【要約】本願発明は、（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地中でバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、そのタンデム・プロモーターの各プロモーター配列が上記ポリペプチドをコードする核酸配列と操作可能に連結しているところのタンデム・プロモーターを、そして場合により、（ｉｉ）上記タンデム・プロモーターの下流に、そして上記ポリペプチドをコードする核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列をも含む核酸構築物を含む前記バチルス細胞を培養し；そして、（ｂ）上記培養培地から上記ポリペプチドを単離する、ことを含む、前記ポリペプチドの製法に関する。本願発明は、（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地中でバチルス宿主細胞であって、（ｉ）前記ポリペプチドをコードする核酸配列の単一コピーに操作可能に連結した、「‐３５」領域について配列ＴＴＧＡＣＡを、そして「‐１０」領域について配列ＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーターと、（ｉｉ）上記コンセンサス・プロモーターの下流に、かつ、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列とを含む核酸構築物を含む前記バチルス細胞を、培養し；そして（ｂ）上記培養培地から上記ポリペプチドを単離する、を含む、ポリペプチドの製法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）発明の分野：本発明は、桿菌細胞中でポリペプチドを産生する方法に関する。

【０００２】関連技術の説明：バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ；桿菌）は、天然および組換え
タンパク質を産生するための宿主細胞体系として十分に確立されている。しかし
ながら、タンパク質の発現を増加させる望ましい形質を備えた桿菌宿主細胞は、
業務用には必ずしも最も望ましい特性を有していない可能性がある。通常、桿菌細胞に含有される遺伝子の最高の発現は、今問題にしている遺伝子
と、増幅可能で選択可能の標識遺伝子、例えば抗生物質耐性標識とを操作可能に
連結した単一型プロモーターを含有する発現カセットを、染色体中で増幅するこ
とにより達成される。増幅は、染色体中で発現カセットおよび選択可能な標識の
多重コピーを産生させることになる。

【０００３】しかしながら、この方法には付随する不利点がある。例えば単一型プロモータ
ーにより推進された遺伝子を増幅することによりｍＲＮＡの飽和レベルが達成で
きない可能性がある。また、細胞の染色体中における発現カセットおよび選択可
能の標識遺伝子の多重コピーの生成が不安定である可能性がある。さらに、その
上発現カセットを喪失することなしには選択可能の標識遺伝子の除去が技術的に
実現できない可能性がある。

【０００４】Ｉｃｈｉｋａｗａ等（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＬｅｔｔ
ｅｒｓ，１１１：２１９〜２２４，１９９３）は、成熟したコレラ毒素Ｂを符号
化する遺伝子の発現を仲介する多重型プロモーターを備えた発現／分泌ベクター
を含有するＢａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ中におけるコレラ毒素Ｂの細胞外産
生について記述している。

【０００５】ＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，１３：９７〜１０７，１９９４）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのｃｒｙＩＩＩＡ毒素遺伝子の完全な発現に携わったプロ
モーター領域の構造および機能の分析について記述している。国際特許公開第９
４／２５６１２号は、プロモーターの下流、かつ遺伝子の発現を増加させるｃｒ
ｙＩＩＩＡ遺伝子の解読配列の上流のｍＲＮＡスタビライザー領域について開示
している。

【０００６】Ｈｕｅ等（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７７：３４
６５〜３４７１，１９９５）は、５′末端に存在した場合に幾つかの非相同ＲＮ
Ａ配列を安定化させ、またＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ中において下流
の解読配列の発現を数倍に増加させる５′ｍＲＮＡスタビライザー配列について
記述している。

【０００７】本発明の目的は、桿菌株中でポリペプチドを産生するための改良された方法を
提供することである。（発明の概要）本発明は、（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地中で桿菌宿主細胞を培養
することであって、その桿菌細胞が、（ｉ）タンデム（縦列）プロモーターの各
プロモーター配列がポリペプチドを符号化する核酸配列と操作可能に連結してい
る縦列プロモーター、また別法として（ｉｉ）縦列プロモーターの下流、かつポ
リペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロセシング／安定
化配列を備える核酸構築物を含む、培養することと、（ｂ）培養培地からポリペ
プチドを単離することを含む、ポリペプチドの生成方法に関する。

【０００８】また本発明は、（ｉ）縦列プロモーターの各プロモーター配列がポリペプチド
を符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している縦列プロモーター
、また別法として（ｉｉ）縦列プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化
する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸
構築物を含む桿菌細胞に関する。

【０００９】また本発明は、（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地中で桿菌宿主細胞を
培養することであって、その桿菌細胞が、（ｉ）ポリペプチドを符号化する核酸
配列の単一コピーと操作可能に連結している「‐３５」領域に対してＴＴＧＡＣ
Ａ、「‐１０」領域に対してＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモータ
ー、および（ｉｉ）「コンセンサス」プロモーターの下流、かつポリペプチドを
符号化する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備え
る核酸構築物を含む、培養することと、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離
することを含む、ポリペプチドの生成方法に関する。

【００１０】また本発明は、（ｉ）ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作
可能に連結している「‐３５」領域に対してＴＴＧＡＣＡ、「‐１０」領域に対
してＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーター、および（ｉｉ）「コ
ンセンサス」プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上
流に位置したｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む桿菌
細胞に関する。

【００１１】また本発明は、（ａ）ポリペプチドの生成の助けとなる培地中で桿菌宿主細胞
を培養することであって、その桿菌細胞が、「コンセンサス」ａｍｙＱプロモー
ターと操作可能に連結しているポリペプチドを符号化する核酸配列を含む、培養
することと、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含む、ポリペプ
チドの生成方法に関する。

【００１２】また本発明は、（ｉ）縦列プロモーターの各プロモーター配列がポリペプチド
を符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している「コンセンサス」
ａｍｙＱプロモーター、および（ｉｉ）「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター
の下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロ
セシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む桿菌細胞に関する。

【００１３】また本発明は、桿菌細胞の選択可能な標識のない変異体の生成方法に関する。（発明の詳細な説明）最初の実施形態において本発明は、（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地
中で桿菌宿主細胞を培養することであって、その桿菌細胞が、（ｉ）縦列プロモ
ーターの各プロモーター配列がポリペプチドを符号化する核酸配列と操作可能に
連結している縦列プロモーター、また別法として（ｉｉ）縦列プロモーターの下
流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロセシ
ング／安定化配列を備える核酸構築物を含む、培養することと、（ｂ）培養培地
からポリペプチドを単離することを含む、ポリペプチドの生成方法に関する。

【００１４】二番目の実施形態において本発明は、（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培
地中で桿菌宿主細胞を培養することであって、その桿菌細胞が、（ｉ）ポリペプ
チドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している「コンセンサ
ス」プロモーター、および（ｉｉ）「コンセンサス」プロモーターの下流、かつ
ポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロセシング／安
定化配列を備える核酸構築物を含む、培養することと、（ｂ）培養培地からポリ
ペプチドを単離することを含む、ポリペプチドの生成方法に関する。

【００１５】三番目の実施形態において本発明は、（ａ）ポリペプチドの生成の助けとなる
培地中で桿菌細胞を培養することであって、その桿菌細胞が「コンセンサス」ａ
ｍｙＱプロモーターと操作可能に連結しているポリペプチドを符号化する核酸配
列を含む、培養することと、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを
含む、ポリペプチドの生成方法に関する。

【００１６】本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写を開始するためにＲＮ
Ａ重合酵素の結合に携わった核酸配列として定義される。本明細書において「縦
列プロモーター」とは、その各々が解読配列と操作可能に連結し、ｍＲＮＡ中へ
の解読配列の転写を仲介する２つ以上のプロモーター配列として定義される。本
明細書において「操作可能に連結した」とは、制御配列、例えばプロモーター配
列が、制御配列が解読配列により符号化されたポリペプチドの生成を方向づける
ように、解読配列に対する位置に適正に配置されている構成として定義される。
本明細書において「解読配列」とは、適正な制御配列の制御の下に置かれたとき
、ｍＲＮＡ中に転写され、ポリペプチドに翻訳される核酸配列として定義される
。解読配列の境界は、通常ｍＲＮＡの５′末端にある読み取り枠のちょうど上流
に位置したリポソーム結合部位、およびｍＲＮＡの３′末端にある読み取り枠の
ちょうど下流に位置した転写ターミネーター配列により決定される。解読配列に
は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、合成、および組換えの核酸配列を含める
ことができるがこれには限定されない。本明細書において「核酸構築物」とは、
天然起源の遺伝子から単離するか、さもなければ天然には存在しない形に組み合
わせられ、並べられた核酸のセグメントを含有するように修飾された一本鎖また
は二本鎖いずれかの核酸分子として定義される。核酸構築物という用語は、核酸
構築物が解読配列の発現にとって必要な全ての制御配列を含有するとき、発現カ
セットという用語と同意語である。

【００１７】縦列プロモーターの各プロモーター配列は、変異、切端、および雑種プロモー
ターを含む選抜された桿菌細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であってもよ
く、また桿菌細胞にとって相同または非相同いずれかの遺伝子を符号化する細胞
外または細胞内ポリペプチドから得ることもできる。各プロモーター配列は、ポ
リペプチドを符号化する核酸配列にとって固有のものでも異質のものでもよく、
また桿菌細胞にとって固有のものでも異質のものでもよい。これらのプロモータ
ー配列は、同一のプロモーター配列でも、または異なるプロモーター配列でもよ
い。

【００１８】好ましい実施形態において、プロモーター配列は細菌の供給源から得ることが
できる。より好ましい実施形態において、プロモーター配列は、桿菌株、例えば
Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏ
ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓｔｈ
ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、あるいはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株、例えばＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｕ
ｒｉｎｕｓなどのグラム陽性細菌から得ることができ、あるいはグラム陰性細菌
、例えば大腸菌またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種から得ることもできる。

【００１９】本発明の方法において核酸配列の転写を目的とする好適なプロモーターの例に
は、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃのオペロンから得られたプロモーターがある。別の例
には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアガラーゼ遺伝子（
ｄａｇＡ）のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕ
ｓのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＨ）のプロモーターがある。別の例
には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのアルカリ性プロテアー
ゼ遺伝子（スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ遺伝子）のプロモーターがある。
別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓのレバンスクラーゼ遺伝子（
ｓａｃＢ）のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉ
ｌｉｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）のプロモーターがある。別の例には、
Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙ
Ｌ）のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの麦芽性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーターが
ある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの
αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーターがある。別の例には、「‐３５
」領域に対して配列ＴＴＧＡＣＡ、「‐１０」領域に対してＴＡＴＡＡＴを有す
る「コンセンサス」プロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）のプロモーターが
ある。別の例には、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｘｙＬＡおよびｘｙ
ＬＢ遺伝子のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉ
ｎｇｉｅｎｓｉｓの亜種のｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子（ｃ
ｒｙＩＩＩＡ、ＳＥＱＩＤＮＯ．１）、またはその部分のプロモーターがあ
る。別の例には、原核βラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ等
の論文、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄ
ｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵＳＡ，７５：３７２７〜３７３１，１９７
８）のプロモーターがある。別の例には、ｓｐｏｌ細菌ファージプロモーターの
プロモーターがある。別の例には、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ等の論文
、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ
ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵＳＡ，８０：２１〜２５，１９８３）がある。さ
らに別のプロモーターが、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ，２４２：
７４〜９４，１９８０，「ＵｓｅｆｕｌＰｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｔｅｒｉａ」およびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ、およびＭａｎｉａｔｕｓ編のＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載されている。

【００２０】縦列プロモーターの２つ以上のプロモーター配列が、同時に核酸配列の転写を
促進させる可能性がある。別法として、縦列プロモーターの１または複数のプロ
モーター配列が、桿菌細胞の増殖の異なる段階で核酸配列の転写を促進させる可
能性がある。好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、少なくともＢａｃｉｌｌｕ
ｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのαアミラーゼ遺伝子のａｍｙＱを含
有する。別の好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、少なくとも「‐
３５」領域に対して配列ＴＴＧＡＣＡ、「‐１０」領域に対してＴＡＴＡＡＴを
有する「コンセンサス」プロモーターを含有する。別の好ましい実施形態におい
て、縦列プロモーターは、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓのαアミラーゼ遺伝子のａｍｙＬプロモーターを含有する。別の好ましい
実施形態において、縦列プロモーターは、少なくともｃｒｙＩＩＩＡプロモータ
ーまたはその部分（ＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓの論文，ｓｕｐｒａ
）を含有する。

【００２１】より好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、少なくともａｍｙＬプ
ロモーターおよびｃｒｙＩＩＩＡプロモーターを含有する。別のより好ましい実
施形態において、縦列プロモーターは、少なくともａｍｙＱプロモーターおよび
ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターを含有する。別のより好ましい実施形態において、
縦列プロモーターは、「‐３５」領域に対して配列ＴＴＧＡＣＡ、「‐１０」領
域に対してＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーター、およびｃｒｙ
ＩＩＩＡプロモーターを少なくとも含有する。別のより好ましい実施形態におい
て、縦列プロモーターは、ａｍｙＬプロモーターの少なくとも２つのコピーを含
有する。別のより好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、ａｍｙＱプ
ロモーターの少なくとも２つのコピーを含有する。別のより好ましい実施形態に
おいて、縦列プロモーターは、「‐３５」領域に対して配列ＴＴＧＡＣＡ、「‐
１０」領域に対してＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーターの少な
くとも２つのコピーを含有する。別のより好ましい実施形態において、縦列プロ
モーターは、ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターの少なくとも２つのコピーを含有する
。

【００２２】「コンセンサス」プロモーターの構築は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ用の増殖性「シグマＡ型」プロモーターの「‐１０」および「‐３５」領域に
対して確立されたコンセンサス配列に、より完全に合致するプロモーターを創り
出す部位特異的変異誘発により達成することができる（Ｖｏｓｋｕｉｌ等の論文
、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７：２７１〜２７９，１
９９５）。「‐３５」領域に対するコンセンサス配列はＴＴＧＡＣＡであり、「
‐１０」領域に対してはＴＡＴＡＡＴである。コンセンサスプロモーターは、桿
菌宿主細胞中で機能することのできる任意のプロモーターから得ることができる
。

【００２３】好ましい実施形態において、「コンセンサス」プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃのオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアガ
ラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓのアルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子（ａｐｒＨ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ遺伝子）
、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓのレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）
、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ
）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの麦芽性アミラ
ーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓのペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔ
ｉｌｉｓｘｙＬＡおよびｘｙＬＢ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓの亜種のｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子（ｃｒｙ
ＩＩＩＡ、配列番号１（ＳＥＱＩＤＮＯ．１))、またはその部分、または原
核βラクタマーゼ遺伝子のｓｐｏｌ細菌ファージプロモーターから得られたプロ
モーターから得られる。

【００２４】より好ましい実施形態において、「コンセンサス」プロモーターは、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙ
Ｑ）から得られる。最も好ましい実施形態において、「コンセンサス」プロモー
ターは、ＳＥＱＩＤＮＯ．３またはＳＥＱＩＤＮＯ．４のヌクレオチド
１から１８５に含有された「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターである。別の
最も好ましい実施形態において、「コンセンサス」プロモーターは、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ．３またはＳＥＱＩＤＮＯ．４のヌクレオチド８６から１８５に含
有された短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターである。ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ．３の「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターは、野生型ａｍｙＱプロモータ
ー（ＳＥＱＩＤＮＯ．２）を含有する核酸配列の下記の変異、すなわち‐３
５領域（転写始動部位を基準にして）の位置１３５および１３６でそれぞれＴか
らＡ、およびＴからＣへ、また‐１０領域のＳＥＱＩＤＮＯ．２の位置１５
６でＡからＴへの変化を含む。「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ．２）は、図２１（ＳＥＱＩＤＮＯ．４）に示すように、さら
に‐３５領域の約２０塩基対上流の位置１１６でＴからＡへの変化を含む。この
変化は、それが重要な‐１０および‐３５領域から十分遮断されているので、プ
ロモーターの機能に有害な影響をおよぼさないことは明らかである。

【００２５】本明細書で「ｍＲＮＡプロセシング／安定化配列」とは、各プロモーター配列
から合成された全てのｍＲＮＡが処理されて写しの５′末端にスタビライザー配
列を備えたｍＲＮＡの写しを産生することができるように、１または複数の各プ
ロモーター配列の各々が操作可能に連結している、１または複数のプロモーター
配列の下流、かつ解読配列の上流に位置する配列として定義される。ｍＲＮＡの
写しの５′末端にこのようなスタビライザー配列が存在すると、それらの半減期
を増大させる（ＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓの論文、ｓｕｐｒａ，１
９９４、およびＨｕｅ等の論文、ｓｕｐｒａ，１９９５）。ｍＲＮＡプロセシン
グ／安定化配列は、細菌性１６ＳリボソームＲＮＡの３′末端に対して相補関係
にある。好ましい実施形態において、ｍＲＮＡプロセシング／安定化配列は、写
しの５′末端にスタビライザー配列を備えた本質的に単一サイズの写しを生ずる
。

【００２６】より好ましい実施形態において、ｍＲＮＡプロセシング／安定化配列は、国際
特許公開第９４／２５６１２号、ならびにＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕ
ｓの論文、ｓｕｐｒａ，１９９４に開示されたＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎ
ｇｉｅｎｓｉｓｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列、または
ｍＲＮＡプロセシング／安定化機能を保持するその部分である。別のより好まし
い実施形態において、ｍＲＮＡプロセシング／安定化配列は、Ｈｕｅ等の論文、
ｓｕｐｒａ，１９９５に記述されたＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＳＰ
８２のｍＲＮＡプロセシング／安定化配列、またはｍＲＮＡプロセシング／安定
化機能を保持するその部分である。

【００２７】ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターおよびそのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を
本発明の方法に使用する場合は、国際特許公開第９４／２５６１２号ならびにＡ
ｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓの論文、ｓｕｐｒａ，１９９４に開示され
た、ヌクレオチド−６３５から−２２（図１）（ＳＥＱＩＤＮＯ．１）、あ
るいはプロモーターおよびｍＲＮＡプロセシング／安定化機能を保持するその部
分により表わされる配列を含有するＤＮＡ断片を用いることができる。ｃｒｙＩ
ＩＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列がヌクレオチド−５５１から−２２
の範囲内に含有されるのに対し、ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターはヌクレオチド−
６３５から−５５２により表わされる。好ましい実施形態において、ｃｒｙＩＩ
ＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列はヌクレオチド−５６８から−２２を
備える断片中に含有される。別の好ましい実施形態において、ｃｒｙＩＩＩＡの
ｍＲＮＡプロセシング／安定化配列は、ヌクレオチド−３６７から−２１を備え
る断片中に含有される。さらに、様々な縦列プロモーターおよびｃｒｙＩＩＩＡ
のｍＲＮＡプロセシング／安定化配列の組み合わせを構築するために、ｃｒｙＩ
ＩＩＡプロモーターのみ、またはｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定
化配列のみを含有するＤＮＡ断片を、当業界でよく知られた方法を用いて調製す
ることができる。この実施形態において、好ましくはｃｒｙＩＩＩＡプロモータ
ーおよびそのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列は、今問題にしている遺伝子の
縦列プロモーターを構築するもう一方のプロモーター配列の下流、かつ解読配列
の上流に配置される。縦列プロモーターおよびｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡプロセ
シング／安定化配列を含有する様々な構築物を図２に示す。

【００２８】桿菌細胞は核酸構築物の１または複数のコピーを含有してもよい。好ましい実
施形態において、桿菌細胞は核酸構築物の単一コピーを含有する。さらに、核酸構築物は形質転換された細胞の選択を容易にする１または複数の
選択可能な標識を含有することができる。選択可能な標識は、その生成物が生物
致死剤耐性、重金属に対する抵抗性、栄養要求株に対するプロトトロピーなどを
備えている遺伝子である。細菌性で選択可能な標識の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来
のｄａｌ遺伝子、あるいはアンピシリン、カナマイシン、エリスロマイシン、ク
ロラムフェニコール、またはテトラサイクリン耐性など抗生物質耐性を授ける標
識がある。さらに、選択は、選択可能な標識が別のベクター上にある共形質転換
、例えば国際特許公開第９‐１０９１２９号の記載により達成することができる
。

【００２９】本発明の特別の利点は、選択可能な標識遺伝子のない桿菌細胞を産生すること
ができる、すなわち桿菌細胞中に核酸構築物を導入した後、桿菌細胞から選択可
能な標識遺伝子の欠失を引き起こして細胞標識をなくすことができることである
。ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーを含有する核酸構築物は、選
択可能な標識遺伝子の除去が規制または環境上の理由で好ましいこのような標識
のない桿菌細胞の生成を可能にする。

【００３０】遺伝子の欠失または置換の技術は、選択可能な標識遺伝子の完全な欠失のため
に用いることができる。このような方法において、選択可能な標識遺伝子の欠失
は、選択可能な標識遺伝子と隣接する５′および３′領域を接触して含有するよ
うに構築されたプラスミドを用いる相同性の組換えにより達成することができる
。隣接する５′および３′領域は、プラスミドが細胞中に定着するようになる許
容温度で第二の選択可能な標識と共同して、温度に敏感なプラスミド、例えばｐ
Ｅ１９４上で桿菌細胞に導入することができる。次いで細胞を非許容温度に移し
、相同性フランキング領域の一つが染色体に組込まれたプラスミドを有する細胞
を選択した。プラスミド組込みのための選択は、第二の選択可能な標識を選択す
ることにより行なわれた。組込み後、第二の相同性フランキング領域における組
換え事象は、選択することなく数世代の間、細胞を許容温度に移すことによりシ
ミュレートされる。細胞を塗布して単一コロニーを得、コロニーの選択可能な両
標識の喪失を試験する（例えば、Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｎｅｓｈｅｉｎ、Ｊ．Ａ．Ｈｏ
ｃｈ、およびＲ．Ｌｏｓｉｃｋ編「Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓａｎ
ｄＯｔｈｅｒＧｒａｍ−ＰｏｓｉｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉａ」，Ｃｈａｐ
ｔｅｒ４２，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９３の中のＰｉｒｅｇｏ，１９９
３の論文を参照されたい）。

【００３１】ポリペプチドは、桿菌細胞にとって固有のものでも異種のものでもよい。本明
細書における用語「ポリペプチド」は、特異な長さの符号化した生成物を参照す
ることを意味するもではなく、したがってペプチド、オリゴペプチド、およびタ
ンパク質を包含する。また、ポリペプチドは天然起源の対立性のまたは設計され
た変異型のポリペプチドであってもよい。

【００３２】好ましくは、ポリペプチドは、ホルモンまたはその変異体、酵素、受容体また
はその部分、抗体またはその部分、またはリポーターである。より好ましい実施
形態においてポリペプチドは酸化還元酵素である。別のより好ましい実施形態に
おいてポリペプチドは転移酵素である。別のより好ましい実施形態においてポリ
ペプチドは加水分解酵素である。別のより好ましい実施形態においてポリペプチ
ドは脱離酵素である。別のより好ましい実施形態においてポリペプチドは異性化
酵素である。別のより好ましい実施形態においてポリペプチドは合成酵素である
。さらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはアミノペプチダーゼであ
る。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはアミラーゼである
。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドは炭水化物分解酵素で
ある。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはカルボキシペプ
チダーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態において、ポリペプチドはカ
タラーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはセル
ラーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはキチナ
ーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはクチナー
ゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはシクロデキ
ストリングリコシルトランスフェラーゼである。別のさらに一層好ましい実施形
態においてポリペプチドはデオキシリボヌクレアーゼである。別のさらに一層好
ましい実施形態においてポリペプチドはエステラーゼである。別のさらに一層好
ましい実施形態においてポリペプチドはαガラクトシダーゼである。別のさらに
一層好ましい実施形態においてポリペプチドはβガラクトシダーゼである。別の
さらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはグルコアミラーゼである。
別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはαグルコシダーゼであ
る。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはβグルコシダーゼ
である。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはインベルター
ゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはラッカーゼ
である。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはリパーゼであ
る。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはマンノシダーゼで
ある。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはムタナーゼであ
る。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドは酸化酵素である。
別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはペクチン分解酵素であ
る。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはペルオキシダーゼ
である。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはフィターゼで
ある。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはポリフェノール
オキシダーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態において、ポリペプチド
はタンパク質分解酵素である。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペ
プチドはＲＮＡ分解酵素である。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリ
ペプチドはトランスグルタミナーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態に
おいてポリペプチドはキシラナーゼである。

【００３３】最も好ましい実施形態においてポリペプチドはセリンプロテアーゼ、例えばス
ブチリシンである。別の最も好ましい実施形態においてポリペプチドは麦芽性ア
ミラーゼである。別の最も好ましい実施形態においてポリペプチドはプルラナー
ゼである。また本発明の方法は、桿菌細胞に固有のポリペプチドの組換え生成物に用いる
ことができる。また本発明は、用語「非相同性ポリペプチド」の範囲内に、その
ような発現が桿菌細胞にとって固有のものでない遺伝因子の使用を含む程度まで
、または宿主細胞に通常は起こらない形で機能するように処理された固有の因子
の使用を含む程度までこのような固有のポリペプチドの組換え生成物を包含する
。

【００３４】また本発明の方法において、非相同性ポリペプチドは、別のポリペプチドがポ
リペプチドまたはその断片のＮ末端またはＣ末端で融合されている、融合または
混成ポリペプチドを含んでもよい。融合ポリペプチドは、一つのポリペプチドを
符号化する核酸配列（またはその部分）を、別のポリペプチドを符号化する核酸
配列（またはその部分）に融合することにより産生される。融合ポリペプチドを
産生する技術は当業界で知られており、この技術には、それらがフレーム中にあ
り、かつ融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーターおよびターミネーターの
制御下にあるように、ポリペプチドを符号化する解読配列を結合することが含ま
れる。混成ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られる
部分的または完全なポリペプチド配列の組み合わせを含んでもよく、その１つま
たは複数が桿菌細胞にとって非相同のものであってもよい。

【００３５】縦列または「コンセンサス」プロモーターを含む桿菌細胞の構築物、あるいは
今問題にしているポリペプチドを符号化する核酸配列に操作可能に連結したｍＲ
ＮＡプロセッシング／安定化配列は、修飾された配列をベクター中に挿入し、相
同性の組換えにより桿菌細胞の染色体中にベクターを導入するか、あるいは染色
体外自己複製因子、例えばプラスミドとして桿菌細胞中にベクターを導入して、
プロモーター、また別法としてｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列を核酸配列
に操作可能に連結させる、当業界ではよく知られた方法を用いてポリペプチドを
符号化する単離された核酸配列を修飾することにより達成することができる。し
かしながら、核酸配列はまた当業界でよく知られた方法を用いて桿菌細胞中で生
体内処理することができることも理解されるはずである。

【００３６】本発明の方法において、今問題にしているポリペプチドを符号化する核酸配列
は桿菌細胞に固有のものでも異質のものでもよい。非相同性のポリペプチドを符
号化する異質の核酸配列は、任意の原核、真核、またはその他の供給源、例えば
アルキバクテリアから得ることができる。好ましい実施形態において、核酸配列
はグラム陰性またはグラム陽性細菌細胞などの細菌株から得られる。より好まし
い実施形態において、ポリペプチドを符号化する核酸配列は桿菌細胞から得られ
る。本発明の目的に対して本明細書で所与の供給源と関係して用いられる用語「
から得られる」とは、ポリペプチドが供給源により、または供給源由来の遺伝子
が挿入されている細胞により産生されることを意味する。

【００３７】ポリペプチドを符号化する核酸配列の単離またはクローン化に用いられる技術
は当業界でよく知られており、例えばゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの
調製、またはその組み合わせがある。そのようなゲノムＤＮＡ由来の核酸配列の
クローニングは、例えば共同の構造的特徴を備えたクローン化されたＤＮＡ断片
を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、あるいはよく知られ
た重合酵素の連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより行なうことができる。例え
ば、Ｉｎｎｉｓ等の「ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭ
ｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋを参照されたい。合成酵素連鎖反応（ＬＣＲ
）、結合型活性化転写（ＬＡＴ）、および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）
などその他の核酸増幅手順を用いることもできる。クローニング手順には、ポリ
ペプチドを符号化する核酸配列を備える所望の核酸断片の切り出しおよび単離、
ベクター分子中への断片の挿入、およびそこで核酸配列のクローンが複製される
ことになる桿菌細胞への組換えベクターの組込みがある。核酸配列は、ゲノム、
ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源の、またはそれらの任意の組み合わせであ
ってもよい。

【００３８】次いで、今問題にしているポリペプチドを符号化する単離された核酸配列を処
理して、核酸配列を、制御配列に適合する条件下で桿菌細胞中に解読配列の発現
を方向づける１または複数の付加的制御配列だけでなく、縦列または「コンセン
サス」プロモーターに、また別法としてｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列に
操作可能に連結することにより核酸構築物を産生することができる。発現には、
これには限定されないが転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含
むポリペプチド生成に含まれる任意のステップが含まれると考えられるであろう
。クローニング法を利用する核酸配列の修飾技術は、当業界でよく知られている
。

【００３９】本明細書の用語「制御配列」とは、核酸配列の解読配列の発現にとって必要ま
たは有益な全ての成分を含むものと定義する。各制御配列は、ポリペプチドを符
号化する核酸配列に固有のものでも異質のものでもよい。前述の縦列または「コ
ンセンサス」プロモーターに加えて、このような制御配列には先導部位、シグナ
ル配列、および転写ターミネーターが含まれるがこれらには限定されない。制御
配列は、ポリペプチドを符号化する核酸配列の解読領域と制御配列の連結反応を
容易にする特異的な制限部位を導入する目的でリンカーを備えることができる。

【００４０】また制御配列は適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結させるた
めに桿菌細胞により認識される配列であってもよい。ターミネーター配列は、ポ
リペプチドを符号化する核酸配列の３′末端と操作可能に連結している。本発明
においては桿菌細胞の選択に役立つ任意のターミネーターを用いることができる
。

【００４１】また制御配列は適切な先導部位配列、すなわち桿菌細胞による翻訳にとって重
要なｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよい。先導部位配列は、ポリペプチドを符
号化する核酸配列の５′末端と操作可能に連結している。桿菌細胞の選択に役立
つ任意の先導部位配列を本発明において用いることができる。また制御配列は、細胞の分泌経路の中に発現されたポリペプチドを方向づける
ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコード化するシグナルペプ
チド解読領域であってもよい。シグナルペプチド解読領域はポリペプチドに固有
のものでもよく、また異質の供給源から得ることもできる。核酸配列の解読配列
の５′末端は、分泌されたポリペプチドを符号化する解読領域のセグメントと翻
訳の読み枠中で自然に連結したシグナルペプチド解読領域を先天的に含有しても
よい。別法として、解読配列の５′末端は、分泌されたポリペプチドを符号化す
る解読領域の部分にとって異質のシグナルペプチド解読領域を含有してもよい。
異質のシグナルペプチド解読領域は、解読配列が通常シグナルペプチド解読領域
を含有しないところで必要となる可能性がある。別法として、異質のシグナルペ
プチド解読領域は、通常解読領域に付随している固有のシグナルペプチド解読領
域と比べてポリペプチドの分泌を向上させるために、固有のシグナルペプチド解
読領域と簡単に置換することができる。シグナルペプチド解読領域は、桿菌種由
来のアミラーゼまたはプロテアーゼから得ることができる。しかしながら本発明
においては、発現したポリペプチドを選択した桿菌細胞の分泌経路の中に方向づ
けることができる任意のシグナルペプチド解読領域を用いることができる。

【００４２】桿菌細胞にとって有効なシグナルペプチド解読領域は、ＢａｃｉｌｌｕｓＮ
ＣＩＢ１１８３７麦芽性アミラーゼ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαアミラーゼ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓのスブチリシン遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｉｓのβラクタマーゼ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓの中性プロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ
）、およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｐｒｓＡ遺伝子から得られた
シグナルペプチド解読領域である。さらに、シグナルペプチドについては、Ｓｉ
ｍｏｎｅｎおよびＰａｌｖａの論文、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖ
ｉｅｗｓ５７‐１０９〜１３７，１９９３に記述されている。

【００４３】本発明の方法において、今問題にしているポリペプチドをコード（符号化）す
る核酸配列、縦列または「コンセンサス」プロモーター、また別法としてｍＲＮ
Ａプロセッシング／安定化配列、および転写と翻訳の終止シグナルを備える組換
え発現ベクターを、ポリペプチドの組換え生成に用いることができる。前述の様
々な核酸および制御配列を合わせて接合して、そこでポリペプチドを符号化する
核酸配列の挿入または置換を可能にするための１または複数の都合のよい制限部
位を含む組換え発現ベクターを産生することができる。別法として、核酸配列は
、核酸配列または配列を備える核酸構築物を発現用の適正なベクター中に挿入す
ることにより発現させてもよい。発現ベクターの創出において、解読配列は、解
読配列が縦列または「コンセンサス」プロモーター、また別法としてｍＲＮＡプ
ロセッシング／安定化配列、ならびに発現用の、ことによると分泌用の任意のそ
の他の適正な制御配列と操作可能に連結するようにベクター中に位置する。

【００４４】組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に従わせるのに都合のよい、また桿
菌細胞中に導入したとき核酸配列の発現を引き起こすことが可能な任意のベクタ
ーであってよい。ベクターの選択は、一般にベクターが導入される桿菌細胞とベ
クターとの適合性に左右されるはずである。ベクターは鎖状プラスミドでも閉環
状プラスミドでもよい。ベクターは、自己複製ベクター、すなわちその複製が染
色体の複製とは独立の染色体外の実体、例えばプラスミド、染色体外因子、ミニ
クロモソーム、または人工染色体として存在するベクターであってもよい。ベク
ターは自己複製を保証する任意の手段を含有することができる。別法として、ベ
クターは、桿菌細胞中に導入されたときゲノム中に組込まれ、またそれが組込ま
れる染色体と共に複製されるものであってもよい。ベクター系は、単一ベクター
またはプラスミド、あるいは２つ以上のベクターまたはプラスミド、あるいはト
ランスポゾンであってもよい。

【００４５】「導入」とは、ベクターが染色体の成分として、または自己複製染色体外ベク
ターとして維持されるように、核酸配列を備えるベクターを桿菌細胞中に導入す
ることを意味する。組込みは、細胞中では核酸配列がより安定に維持されやすい
ので、通常有利であると考えられる。染色体中へのベクターの組込みは、相同性
の組換え、非相同性の組換え、または転位により起こる。

【００４６】桿菌細胞中への発現ベクターの導入は、例えば、感応細胞（例えばＹｏｕｎｇ
およびＳｐｉｚｉｚｉｎの論文、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ８１：８２３〜８２９，１９６１、またはＤｕｂｎａｕおよびＤａｖｉｄ
ｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎの論文、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ５６：２０９〜２２１，１９７１を参照されたい）、エレクト
ロポレーション（例えばＳｈｉｇｅｋａｗａおよびＤｏｗｅｒの論文、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：７４２〜７５１，１９８８を参照されたい）、または
共役（例えばＫｏｅｈｌｅｒおよびＴｈｏｒｎｅの論文、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６９：５２７１〜５２７８，１９８７を参照さ
れたい）を用いる原形質体の形質転換（例えばＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎの論
文、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ１６８：１１１
〜１１５，１９７９を参照されたい）により行なうことができる。

【００４７】組込みにとってベクターは、ポリペプチドを符号化する核酸配列、またはベク
ターを相同性の組換えによりゲノム中に安定して組み込むためのベクターの任意
の他の因子に依拠する可能性がある。ベクターは、桿菌細胞のゲノム中への相同
性の組換えによる組込みを方向づけるために付加的な核酸配列を含有してもよい
。付加的な核酸配列は、ベクターが染色体中の正確な位置において桿菌細胞のゲ
ノム中に組込まれることを可能にする。正確な位置における組込みの可能性を増
すために、組込み因子は、好ましくは塩基対１００から１，５００のような十分
な数の核酸、より好ましくは塩基対４００から１，５００、最も好ましくは塩基
対８００から１，５００の核酸を含むべきであり、これらは相同性の組換えの可
能性を高めるために対応する標的配列と高度に相同性である。組込み因子は、桿
菌細胞のゲノム中の標的配列と相同性の任意の配列であってよい。さらに組込み
因子は、非符号化または符号化核酸配列であってもよい。

【００４８】自己複製のためには、ベクターはさらにベクターが問題の桿菌細胞中で自律的
に複製することを可能にするｏｒｉ領域を有してもよい。細菌性のｏｒｉ領域の
例には、大腸菌中で複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐ
ＡＣＹ１７７、およびｐＡＣＹＣ１８４、ならび桿菌中で複製を可能にするｐＵ
Ｂ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、およびｐＡＭβ１がある。複製開始点
は、桿菌細胞中でその機能を温度に敏感にするために変異を有するものであって
もよい（例えばＥｈｒｌｉｃｈの論文、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅ
ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵＳＡ７５
：１４３３，１９７８を参照されたい）。

【００４９】組換え発現ベクターを構築するために前述の因子を結合するのに用いた手順は
、当業技術者にはよく知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等の論文、ｓｕｐ
ｒａ，１９８９を参照されたい）。本発明の方法において、桿菌細胞は野生型桿菌細胞またはその変異体であって
もよい。さらに、桿菌細胞は好アルカリ性または好熱性の桿菌であってもよい。
好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌ
ｕｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ細胞である。別の好ましい実施形態におい
て桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ細胞である。別の好ましい実施形
態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ細胞である。別の
好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ細胞で
ある。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕ
ｌａｎｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕ
ｓｆｉｒｍｕｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃ
ｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞
はＢａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ細胞である。別の好ましい実施形態において
桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ細胞である。別の好
ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ細
胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍ
ｉｌｕｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕ
ｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞である。別の好ましい実施形態
において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞である。別の好ま
しい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓ細胞である。

【００５０】本発明の方法において、桿菌細胞は、例えば相同性のポリペプチドを符号化す
る核酸配列を備える組換え細胞であってもよい。細胞は、当業界で知られた方法を用いてポリペプチドの生成に適した栄養培地
中で培養される。例えば細胞は、適切な培地で、かつポリペプチドの発現および
／または単離を可能にする条件下で、実験室的または工業的発酵槽における振と
うフラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続、バッチ、流加、または固体発
酵）により培養することができる。培養は、当業界で知られた手順を用いて、炭
素と窒素の供給源および無機塩類を含む適切な栄養培地中で行なわれる。適切な
培地は営利目的の製造業者から入手でき、あるいは出版物に掲載された組成（例
えば「ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」
のカタログ中）に従って調製することができる。分泌されたポリペプチドは培地
から直接回収することができる。

【００５１】ポリペプチドは、当業界で知られたポリペプチドに特有の方法を用いて検出す
ることができる。これらの検出法には、特異抗体、酵素生成物の形成、酵素基質
の消滅、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥの使用を含むことができる。例えば、酵素検定
をポリペプチドの活動度の決定に用いることができる。ポリペプチドの活動度の
決定手順が多くの酵素に対して当業界で知られている。

【００５２】本発明の方法において、同一の生成条件下で培養した場合、桿菌細胞の生成は
、ポリペプチドを符号化する核酸と操作可能に連結した縦列または「コンセンサ
ス」プロモーターの唯一つのプロモーター配列を含有する桿菌細胞と比較して、
好ましくは少なくとも約２５％を超え、より好ましくは少なくとも約５０％を超
え、より好ましくは少なくとも約７５％を超え、より好ましくは少なくとも約１
００％を超え、さらにより好ましくは少なくとも約２００％を超え、最も好まし
くは少なくとも約３００％を超え、さらに最も好ましくは少なくとも約４００％
を超える。

【００５３】得られたポリペプチドは当業界で知られた方法により単離することができる。
例えばポリペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿を
含む通常の手順により栄養培地から単離することができるがこれには限定されな
い。次いで単離されたポリペプチドは、これには限定されないがクロマトグラフ
ィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水、クロマトフォーカシング、お
よびサイズ排除）、電気泳動操作（例えば分取等電点電気泳動）、示差溶解度（
例えば硫安沈殿）、または抽出（例えばＪ．‐Ｃ．ＪａｎｓｏｎおよびＬａｒｓ
Ｒｙｄｅｎ編、「ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，ＶＣＨＰ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９を参照されたい）を含む当業
界で知られた様々な手順によりさらに精製することができる。

【００５４】また本発明は、縦列プロモーターの各プロモーター配列が、ポリペプチドを符
号化する核酸配列の、また別法として縦列プロモーターの下流、かつポリペプチ
ドを符号化する核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセシング／安定化配列の
単一コピーに操作可能に連結している縦列プロモーターを備える桿菌細胞に関す
る。好ましい実施形態において、桿菌細胞は選択可能な標識遺伝子がない。

【００５５】また本発明は、（ｉ）ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作
可能に連結した縦列または「コンセンサス」プロモーター、および（ｉｉ）「コ
ンセンサス」プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上
流に位置するｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む桿菌
細胞に関する。

【００５６】また本発明は、ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に
連結した「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの１または複数のコピーを備え
る核酸構築物を含む桿菌宿主細胞に関する。また本発明は、（ｉ）縦列プロモーターの各プロモーター配列がポリペプチド
を符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している縦列プロモーター
、また別法として（ｉｉ）縦列プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化
する核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセシング／安定化配列も備える核酸
構築物を桿菌細胞中に導入することを含む、桿菌宿主細胞を得る方法に関する。

【００５７】また本発明は、（ｉ）ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作
可能に連結している「コンセンサス」プロモーター、および（ｉｉ）「コンセン
サス」プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位
置するｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を桿菌細胞中に導
入することを含む、桿菌宿主細胞を得る方法に関する。

【００５８】また本発明は、ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に
連結した「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの１または複数のコピーを備え
る核酸構築物を桿菌細胞中に導入することを含む、桿菌宿主細胞を得る方法に関
する。また本発明は、桿菌細胞の選択可能な標識遺伝子の欠失を引き起こすことを含
む、桿菌細胞の選択可能な標識のない変異物を産生する方法であって、その桿菌
細胞が、（ｉ）縦列プロモーターの各プロモーター配列がポリペプチドを符号化
する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している縦列プロモーター、また別
法として（ｉｉ）縦列プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸
配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセシング／安定化配列も備える核酸構築物を
含む、方法に関する。

【００５９】また本発明は、桿菌細胞の選択可能な標識遺伝子の欠失を引き起こすことを含
む、桿菌細胞の選択可能な標識のない変異物を産生する方法であって、その桿菌
細胞が、（ｉ）ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連
結した「コンセンサス」プロモーター、および（ｉｉ）「コンセンサス」プロモ
ーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置するｍＲＮ
Ａプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む、方法に関する。

【００６０】また本発明は、桿菌細胞の選択可能な標識遺伝子の欠失を引き起こすことを含
む、桿菌細胞の選択可能な標識のない変異物を産生する方法であって、その桿菌
細胞が、ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結した
「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの１または複数のコピー備える核酸構築
物を含む、方法に関する。

【００６１】また本発明は、本発明の方法により産生したこのような選択可能な標識のない
桿菌変異体に関する。また本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３またはＳＥＱＩＤＮＯ．４に含ま
れた「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターを備える単離した核酸配列に関する
。

【００６２】さらに本発明を下記の実施例により説明するが、これらは本発明の範囲を制限
するものと受け取られるべきではない。（実施例）細菌株：大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＪＭ１０１、およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌ
ｉｓＰＬ１８０１ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７（ａｍｙＥ，ａｐｒ，ｎｐｒ）。

【００６３】プライマーおよびオリゴ：全てのプライマーおよびオリゴは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｍｏｄｅｌ３９４Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）により合成された。実施例１：プラスミドｐＤＧ２６８ＭＣＳの構築：ｐＤＧ２６８（Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ等の論文、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７２：８６〜９３，１９９０）をＴｔｈ１１１Ｉお
よびＥｃｏＲＩで消化し、消化物を４５ｍＭのトリス−ホウ酸塩／１ｍＭのＥＤ
ＴＡ（ＴＢＥ）を有する０．７％のアガロースゲルを用いて電気泳動にかけた。
約６０２０ｂｐの最大のプラスミド断片がゲルから切り出し、ＤＮＡがＱｉａｑ
ｕｉｃｋのＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｗｏｒｔｈ，
ＣＡ）を用いて製造業者の手引書に従って回収した。次いで、回収されたＤＮＡ
を下記に示した合成ポリリンカーと結合させて特別なＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩ
部位をプラスミド中に導入した。

【００６４】

【化１】

【００６５】大腸菌ＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細
胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択し
た。プラスミドＤＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋ等の論文、ｓｕｐｒａ，１９８９に従
って精製し、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで消化して、これらの部位および上記に暗
に示されているポリリンカーを含有したプラスミドを同定した（ｐＤＧ２６８は
これら２つの制限部位を含まない）。制限部位を二つとも含有し、これに加えて
ｐＤＧ２６８のｌａｃＺ遺伝子を合成ポリリンカーで置換した結果としてｐＤＧ
２６８よりも約３．０ｋｂ小さい幾つかのプラスミドが同定された。このような
プラスミドの１つを選択し、ｐＤＧ２６８ＭＣＳ（ＭＣＳは多重クローニング部
位を指す）と呼称した（図３）。

【００６６】実施例２：ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／
ＳＡＶの構築：ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶは、
それらの３′末端にＳａｃＩ部位を含有するように設計されたプロモーター断片
のスワッピングを容易にするために、実施例１のｐＤＧ２６８ＭＣＳにおいてＳ
ａｃＩ部位の欠失を引き起こすように構築された。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_cr _yIIIA ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（実施例９および図１２を参照された
い）をＳｎａＢＩおよびＮｒｕＩ（両制限部位ともベクターのＳａｃＩ部位に隣
接する）で消化し、結合させ、大腸菌ＤＨ５α中で形質転換させた。アンピシリ
ン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプ
レート上で選択した。プラスミドＤＮＡを幾つかの形質転換細胞から精製し、実
施例１の記載に従って回収した。プラスミドＤＮＡをＳａｃＩで消化して、ベク
ター配列中に位置したＳａｃＩ部位の欠失が引き起こされた、すなわちｃｒｙＩ
ＩＩＡプロモーターの下流でＳａｃＩ部位により一度だけ切断されたプラスミド
を同定した。このようなプラスミドを同定し、ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△‐Ｐｒ_cryI _IIA ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶと呼称した（図４）。

【００６７】実施例３：ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔ
ａｂ／ＳＡＶの構築：ｐＤＧ２６８ＭＣＳまたはｐＤＧ２６８ＭＣＳ△誘導体中に含有された発現カ
セットの桿菌細胞の染色体中への導入は、染色体中への導入が二重乗換え（望ま
しい）対単一乗換え事象の結果であるかどうかを識別する方法がないので、ＰＣ
Ｒ分析により確かめなければならない。この問題を軽減するために、ｐＤＧ２６
８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶは、相同性
のａｍｙＥの「前面」およびａｍｙＥの「背後」領域の外側にネオマイシンに対
する抵抗性を授ける抗生物質耐性標識を含有するように構築された。二重乗換え
がＣｍ^r、Ｎｅｏ^s形質転換細胞をもたらすのに対して、単一乗換えは、ＰＣＲ
よりもむしろ薬剤耐性をスクリーニングすることにより所望の二重乗換え事象の
同定を可能にするＣｍ^r、Ｎｅｏ^r形質転換細胞をもたらす。

【００６８】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡ
Ｖは、まずＢａｌＩで実施例２のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙ
ＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶを消化し、子ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼで
処理することにより構築された。プラスミドｐＢＥＳＴ５０１（Ｉｔａｙａ等の
論文、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１７：４４１０，１９
８９）は、ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼＩで処
理してブラントエンドを生じさせ、実施例１の記載に従ってアガロースゲル精製
してネオマイシン耐性標識を宿す断片を単離した。ゲル精製した断片およびＢａ
ｌＩで消化したプラスミドを合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α中で形質転換さ
せた。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇ
を追加したＬＢプレート上で選択した。選択した形質転換細胞を、１ｍｌ当たり
ネオマイシン５０μｇを追加したＬＢプレート上にパッチ形成してネオマイシン
耐性形質転換細胞を同定した。プラスミドＤＮＡは、小数のネオマイシン耐性形
質転換細胞から実施例１の記載に従って精製し、４ｋｂの範囲の２個の断片を産
生するＢｇｌＩＩ（ネオマイシン耐性標識と共に導入された追加のＢｇｌＩＩ部
位により２回切断する）および約８ｋｂの断片を産生するＢａｍＨＩ（ＳＡＶＩ
ＮＡＳＥ（商標）プロテアーゼ遺伝子の下流で１回切断すると予想される）で消
化した。このようなプラスミドは同定し、ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cr _yIIIA ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶと呼称した（図５）。

【００６９】実施例４：ｐＨＰ１３ａｍｐＭＣＳの構築：ｐＨＰ１３（Ｈａｉｍａ等の論文、ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＧｅｎｅｒ
ａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ２０９：３３５〜３４２，１９８７）の変異体である
ｐＨＰ１３ａｍｐは、ｐＵＣ９をＡａｔＩＩで消化し、クレノウ断片およびデオ
キシリボヌクレオチドでブラント化し、次いでＨｉｎｄＩＩＩで消化することに
より構築された。より大きな２．２ｋｂ断片をＱｉａｅｘのキット（ＱＩＡＧＥ
Ｎ，ＴｈｏｕｓａｎｄＯａｋｓ，ＣＡ）でゲル精製した。ｐＨＰ１３をＨｐａ
Ｉ（エリスロマイシン耐性遺伝子の内部で切断する）で消化し、ブラント化し、
次いでＨｉｎｄＩＩＩで消化した。次いで、ｐＨＰ１３から放出された、より大
きな３．０ｋｂ断片を、ｐＵＣ９の複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を
含有する２．１ｋｂのｐＵＣ９断片と結合させた。連結反応混合物を大腸菌ＤＨ
５α中で形質転換した。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピ
シリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを実
施例１の記載に従って幾つかの形質転換細胞から精製した。ｐＨＰ１３ａｍｐと
呼称されるプラスミドが形質転換細胞の一つから回収された。

【００７０】プラスミドｐＨＰ１３ａｍｐをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ま
た下記のポリリンカ‐１００ｐモルを５０ｍＭのＮａＣｌ‐１０ｍＭのトリスｐ
Ｈ７．５、および１ｍＭのＥＤＴＡ中でアニールし、５分間沸騰させ、２時間か
けてゆっくり室温まで冷却することにより創出した新しいＭＣＳで、ｐＵＣ９Ｍ
ＣＳを置換した。

【００７１】

【化２】

【００７２】大腸菌ＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細
胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択し
た。プラスミドＤＮＡを実施例１の記載に従って幾つかの形質転換細胞から精製
し、ＮｏｔＩおよびＳａｃＩで消化した。これらの酵素で切断されたプラスミド
は合成ポリリンカーを含んでいる。このようなプラスミドの一つを同定し、ｐＨ
Ｐ１３ａｍｐ−ＭＣＳと呼称した（図６）。さらに、このプラスミドを、ポリリ
ンカー領域を介するＤＮＡシークエンシングにより検証した。ＤＮＡシークエン
シングは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ３７３ＡＡ
ｕｔｏｍａｔｅｄＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いて製造業者の手
引書に従って行なわれた。

【００７３】実施例５：セリンプロテアーゼ遺伝子ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の単離：桿菌セリンプロテアーゼ（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉ
ｓｋＡ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を符号化する遺伝子（以後
ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子と呼ぶ）を、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＳ
Ｘ２２２（図７、米国特許第５，６２１，０８９号）および下記の２つのプライ
マーを用いてＰＣＲ増幅を行なった（制限部位には下線が引かれている）。

【００７４】

【化３】

【００７５】増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＳＸ２２２、各５０ｐモル
のプライマー、１ＸのＴａｑＤＮＡ重合酵素緩衝液（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭ
ａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、各２００μＭのｄＡＴＰ
、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに２．５単位のＴａｑＤＮＡ重
合酵素（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｏｒｐ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ
）からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５
℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分
間の最終サイクルである。

【００７６】約１２３０ｂｐのＰＣＲ生成物が、製造業者の手引書に従って、ｐＣＲＩＩベ
クター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に直接サブクローン
化した。遺伝子の配列を、遺伝子特異プライマーを用いて実施例４の記述に従っ
てＤＮＡシークエンシングにより検証した。検証されたらプラスミドをＢａｍＨ
Ｉで消化し、クレノウ断片で充填し、ＡｐａＩで消化し、次いでＳＡＶＩＮＡＳ
Ｅ（商標）遺伝子を宿す断片をＡｐａＩ、すなわちｐＨＰ１３ａｍｐＭＣＳのＥ
ｃｉ１３６ＩＩ部位に結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質
転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μ
ｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶ（図８）と
呼称されるプラスミドを形質転換細胞の１つから単離し、構造特異的プライマー
を用いて実施例４の記述に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。Ｂａ
ｍＨＩ部位がこの連結反応の結果として再生した。

【００７７】実施例６：ａｍｙＬプロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセ
ットの構築：米国特許第５，６９８，４１５号に記載されたＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ（ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）、ＮｏｖｏＮｏ
ｒｄｉｓｋＡ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を符号化するａｍｙ
Ｌ遺伝子のプロモーターを、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＰＬ１７５９（米国
特許第５，６９８，４１５号）、下記の２つのプライマー（制限部位には下線が
引かれている）、およびＰＣＲキットＧＥＮＥＡＭＰ（商標）ＸＬ（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−ＥｌｍｅｒＣｏｒｐ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を用いて、製造業
者の手引書に従って、ＰＣＲ増幅を行なった。

【００７８】

【化４】

【００７９】増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＰＬ１７５９、各５０ｐモ
ルのプライマー、１ＸのＴａｑＤＮＡ重合酵素緩衝液、各２．５μＭのｄＡＴＰ
、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに１．０単位のＴａｑ重合酵素
からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃
で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間
の最終サイクルである。

【００８０】ａｍｙＬプロモーターを含む約６２０ｂｐのＰＣＲ生成物をＥｃｌ１３６ＩＩ
で消化したｐＵＣ１１８と結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で
形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１０
０μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＵＣ１１８−Ｐｒ_amyLと呼称さ
れるプラスミドを、５−ブロモ−４−クロロ−３−イノドリル（ｉｎｄｌｙｌ）
−ａ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在
下で白色を呈するアンピシリン耐性形質転換細胞から精製し，Ｍ１３／ｐＵＣシ
ークエンシングプライマーおよびａｍｙＬ特異プライマーを用いて、実施例４の
記述に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。

【００８１】実施例５のｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＳａｃＩで消化し、実
施例１の記述に従ってゲル電気泳動により精製した。ａｍｙＬプロモーターを担
持するｐＵＣ１１８−Ｐｒ_amyLの約６２０ｂｐのＳｆｉＩ−ＳａｃＩ断片を、実
施例１の記述に従ってゲル電気泳動により単離し、ＳｆｉＩ／ＳａｃＩで消化し
たｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶに結合した。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物
で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１
００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒ_amyL／
ＳＡＶと呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精
製した。

【００８２】ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒ_amyL／ＳＡＶを、ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し
、Ｐｒ_amyL／ＳＡＶカセットを担持する約１８４０ｂｐの断片を、実施例１の記
述に従って精製した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳを、ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化
し、実施例１の記述に従って精製し、Ｐｒ_amyL／ＳＡＶＳｆｉＩ／ＢａｍＨＩ
断片と結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピ
シリン耐性形質転換細胞を１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢ
プレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyL／ＳＡＶ（図９）と呼称
されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製した。

【００８３】実施例７：ａｍｙＱプロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセ
ットの構築：Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのαアミラーゼ（Ｂ
ＡＮ（商標）、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｒｄ，Ｄｅｎ
ｍａｒｋ）を符号化するａｍｙＬ遺伝子のプロモーターを、鋳型ＤＮＡとしてプ
ラスミドｐＳＸ２２２および下記のプライマー（制限部位には下線が引かれてい
る）を用いて、ＰＣＲ増幅を行なった。

【００８４】

【化５】

【００８５】増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＳＸ２２２、各５０ｐモル
のプライマー、１ＸのＴａｑＤＮＡ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、
ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに２．５単位のＴａｑ重合酵素か
らなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で
１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間の
最終サイクルである。

【００８６】約１８５ｂｐのＰＣＲ生成物を、製造業者の手引書に従ってｐＣＲＩＩベクタ
ー中に直接サブクローン化し、ｐＣＲＩＩ−Ｐｒ_amyQを産生する実施例４の記述
に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証された。ａｍｙＱプロモーターを担
持するｐＣＲＩＩ−Ｐｒ_amyQの約１８５ｂｐのＳｆｉＩ−ＳａｃＩ断片を、実施
例１の記述に従ってゲル電気泳動により単離し、ＳｆｉＩ／ＳａｃＩで消化した
ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶ（実施例５）に結合した。大腸菌ＤＨ５αをこの連結
反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を１ｍｌ当たりアンピ
シリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐ
ｒ_amyQ／ＳＡＶと呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１
つから精製した。

【００８７】ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒ_amyQ／ＳＡＶを、ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し
、Ｐｒ_amyQ／ＳＡＶ発現カセットを担持する約１４００ｂｐの断片を、実施例１
の記述に従って精製した。次いでＳｆｉＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ＳｆｉＩ−Ｂａ
ｍＨＩで消化したｐＤＧ２６８ＭＣＳ（実施例６）中に結合させた。大腸菌ＤＨ
５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を１ｍ
ｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ
２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyQ／ＳＡＶ（図１０）と呼称されるプラスミドを、アンピ
シリン耐性形質転換細胞の１つから精製した。

【００８８】実施例８：ｐＵＣ１８−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔｂ／ｃｒｙＩＩＩ
Ａの構築：Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの亜種のｔｅｎｅｂｒｉｏｎ
ｉｓの鞘翔目結晶タンパク質ＣｒｙＩＩＩＡを符号化するＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子
のプロモーターを、Ｐｉｔｃｈｅｒ等の論文、ＬｅｔｔｅｒｓｉｎＡｐｐｌ
ｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ８：１５１〜１５６，１９８９に従って単
離した、国際特許公開第９５／０２６９５号に記載のＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの亜種のｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ株ＮＢ１２５由来の染色
体ＤＮＡから下記のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行なった。

【００８９】

【化６】

【００９０】増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのＮＢ１２５染色体ＤＮＡ、各
５０ｐモルのプライマー、１ＸのＰｆｕ重合酵素緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
ＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、各２００μＭ
のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに１．０単位のＰｆ
ｕ重合酵素（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５
℃で１分間、５０℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、お
よび７２℃で５分間の最終サイクルである。

【００９１】約１０００ｂｐのＰＣＲ生成物をＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐ
ＵＣ１８のＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位中に結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこ
の連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当た
りアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＵＣ１８−
Ｐｒ_cryIIIAと呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つ
から単離した。

【００９２】プラスミドｐＵＣ１１８−Ｐｒ_cryIIIA（国際特許公開第９５／０２６９５号
）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子およびｍＲＮＡ安定化配列
を宿す約３０００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を実施例１の記載に従ってゲル精製
した。断片をｐＵＣ１８−Ｐｒ_cryIIIAのＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合させた。大
腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細
胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択し
た。ｐＵＣ１８−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ｃｒｙＩＩＩＡ（図
１１）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから単離
した。プラスミドをＥｃｏＲＩで消化することによって断片の配向が正しいこと
を確認した。

【００９３】実施例９：ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビラ
イザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子の配列を安定化させるプロモーターおよびｃｒｙＩＩＩ
ＡのｍＲＮＡを、ＤＮＡの鋳型として実施例８のプラスミドのｐＵＣ１８−Ｐｒ _cryIIIA ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ｃｒｙＩＩＩＡおよび下記の２つのプライ
マー（制限部位には下線が引かれている）を用いてＰＣＲ増幅を行なった。

【００９４】

【化７】

【００９５】増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＵＣ１８−Ｐｒ_cryIIIA／
ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ、各５０ｐモルのプライマー、１ＸのＴａｑ重合酵素緩
衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならび
に１．０単位のＴａｑ重合酵素からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイ
クル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サ
イクル、および７２℃で５分間の最終サイクルである。

【００９６】約６３０ｂｐのＰＣＲ生成物を、ｐＣＲＩＩベクター中で製造業者の手引書に
従ってクローン化してプラスミドｐＣＲＩＩ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓ
ｔａｂを産生し、これをＭ１３シークエンシングプライマーおよびｃｒｙＩＩＩ
Ａ特異プライマーを用いて実施例４の記載に従って検証した。ｍＲＮＡスタビライザー配列を備えたｃｒｙＩＩＩＡプロモーター（Ｐｒ_cryI _IIA ）を担持するｐＣＲＩＩ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂの約６３
０ｂｐのＳｆｉＩ−ＳａｃＩ断片を、実施例１の記載に従ってゲル電気泳動によ
り単離し、ＳｆｉＩ／ＳａｃＩで消化したｐＨ１３ａｍｐ−ＳＡＶ（実施例５）
に結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリ
ン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプ
レート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔ
ａｂ／ＳＡＶ（図１２）と呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換
細胞の１つから単離した。

【００９７】実施例１０：ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子
発現カセットの構築：ｐＤＧ２６８△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ＳＡＶを下記に従って構築した。Ｄｒ
ａＩＩＩ部位からｃｒｙＩＩＩＡ転写始動部位の６ヌクレオチド下流までの範囲
にある実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡ
ｓｔａｂ／ＳＡＶの約１６４０ｂｐの断片を、ＤＮＡの鋳型としてプラスミドｐ
ＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶお
よび下記の２つのプライマー（制限部位には下線が引かれている）を用いてＰＣ
Ｒ増幅を行なった。

【００９８】

【化８】

【００９９】増幅反応液（５０μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−
Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ、各５０ｐモルのプライマー、
１ＸのＴａｑ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、
およびｄＣＴＰ、ならびに１．２５単位のＤＮＡ重合酵素Ａｍｐｌｉｔａｑ（商
標）Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｒａｎ
ｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）からなる。増幅条件は、９５℃で９分間の１サイクル、９
５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、
および７２℃で３分間の最終サイクルである。ＰＣＲ生成物は、ＴＯＰＯ−ＴＡ
ＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）
を用いて製造業者の手引書に従って直接ｐＣＲ２．１中にクローン化してｐＣＲ
２．１−ＤｒａＩＩＩ／Ｐｒ_cryIIIAを産生し、これは実施例４の記載に従って
ＤＮＡシークエンシングにより検証された。

【０１００】実施例１２のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_amyL／Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙ
ＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＤｒａＩＩＩおよびＳａｃＩで消化して、Ｐｒ_amyL ／Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ縦列プロモーターおよびベクター部分
を除去し、約６４４０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳
動により単離した。ｐＣＲ２．１−ＤｒａＩＩＩ／Ｐｒ_cryIIIAの約１６４０ｂ
ｐのＤｒａＩＩＩ／ＳａｃＩ断片を単離し、ＤｒａＩＩＩ／ＳａｃＩで切断され
たベクターと結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、
アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加
したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／
ＳＡＶ（図１３）と呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の
１つから単離した。

【０１０１】実施例１１：ａｍｙＬプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザ
ー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：ｃｒｙＩＩＩのＡｍＲＮＡスタビライザー配列を、ＤＮＡの鋳型として実施例
８のプラスミドｐＵＣ１８−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ｃｒｙＩ
ＩＩＡおよび下記の２つプライマー（ＳａｃＩ制限部位には下線が引かれている
）、すなわち

【０１０２】

【化９】

【０１０３】を用いてＰＣＲ増幅を行なった。増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＵＣ１８−Ｐｒ_cryIIIA／
ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ｃｒｙＩＩＩＡ、各５０ｐモルのプライマー、１Ｘの
Ｔａｑ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、および
ｄＣＴＰ、ならびに２．５単位のＴａｑ重合酵素からなる。増幅条件は、９５℃
で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．
５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間の最終サイクルである。約３６
０ｂｐのＰＣＲ生成物をｐＣＲＩＩベクター中に製造業者の手引書に従ってサブ
クローン化し、構造特異的プライマーを用いて実施例４の記載に従ってＤＮＡシ
ークエンシングにより確証した。

【０１０４】得られたｐＣＲＩＩ−ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂと呼称されるプラスミドをＳａ
ｃＩで消化し、ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー配列を宿す断片を実施
例１の記載に従ってアガロースゲル電気泳動により精製した。実施例６のプラス
ミドｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒ_amyL／ＳＡＶをＳａｃＩで消化し、子ウシの腸のア
ルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して５′リン酸基を除去した。次いで
、スタビライザー配列およびＣＩＰ処理プラスミドを含有する精製された断片を
合わせて結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アン
ピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加した
ＬＢプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを幾つかの形質転換細胞から単離
し、ＳａｃＩで消化してｍＲＮＡスタビライザー配列を含有するものを同定した
。それらが同定されたら、プラスミドＤＮＡをＸｍｎＩで消化することにより断
片の配向を決定した。正しく配向したｃｒｙＩＩＩＡ安定化配列を含有するプラ
スミドを同定し、ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒ_amyL／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡ
Ｖと呼称した。

【０１０５】ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒ_amyL／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩお
よびＢａｍＨＩで消化し、発現カセットを宿す断片をｐＤＧ２６８−ＭＣＳのＳ
ｆｉＩ−ＢａｍＨＩ部位に結合させてｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyL／ｃｒｙＩ
ＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図１４）を産生した。実施例１２：縦列ａｍｙＬ−ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡの
ｍＲＮＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築
：実施例３のプラスミドｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩ
ＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し、Ｔ４重合酵素Ｉでブラントエン
ド化し、次いでＤｒａＩＩＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動によ
り分離し、約７０１０ｂｐのベクター断片をゲルから切り出し、ＤＮＡを実施例
１の記載に従って抽出した。

【０１０６】実施例６のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyL／ＳＡＶをＥｃｌ１３６ＩＩおよび
ＤｒａＩＩＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動により分離し、約２
１５０ｂｐのプロモーター断片をゲルから切り出し、ＤＮＡを実施例１の記載に
従って抽出した。精製したＤＮＡを合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α中で形質転換させた。ア
ンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加し
たＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_amyL／Ｐｒ_cr _yIIIA ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図１５）と呼称されるプラスミドを
、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから単離し、ＮｃｏＩによる消化と、続
くアガロースゲル電気泳動により検証した。

【０１０７】実施例１３：縦列ａｍｙＬ−ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ
（商標）遺伝子発現カセットの構築：実施例１０のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ＳＡＶをＰａｃＩ
およびＤｒａＩＩＩで消化し、約６４５０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載
に従ってゲル電気泳動により単離した。Ｐｒ_amyLおよびＰｒ_cryIIIAを担持する
実施例１２のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_amyL／Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩ
ＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの約２２３０ｂｐのＰａｃＩ−ＤｒａＩＩＩ断片を、実
施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離し、ベクター断片と結合させた。
大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換
細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択
した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_amyL／Ｐｒ_cryIIIA／ＳＡＶ（図１６
）と呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し
た。

【０１０８】実施例１４：ａｍｙＱプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡスタビライザー−ＳＡＶ
ＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：実施例７のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyQ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化し、Ｐｒ_amyQ／ＳＡＶカセットを担持する約１４００ｂｐを実施例１の
記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎ
ｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍ
ＨＩで消化し、約６７８０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電
気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５αをこ
の連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当た
りアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８
ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_amyQ／ＳＡＶ（図１６）と呼称されるプラスミドを、アン
ピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、続くアガ
ロースゲル電気泳動により検証した。

【０１０９】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_amyQ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶを
、まずｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_amyQ／ＳＡＶをＳａｃＩで消化し、子
ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して５′のリン酸基を除
去することにより構築した。ｃｒｙＩＩＩＡ先導部位を担持する実施例１１のｐ
ＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyL／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの約３６０ｂｐ
のＳａｃＩ断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により精製し、ＳａｃＩ
で切断し、脱リン酸したｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_amyQ／ＳＡＶと結合
させた。

【０１１０】大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転
換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選
択した。プラスミドＤＮＡを幾つかの形質転換細胞から単離し、ＳａｃＩで消化
してスタビライザー配列を含むものを同定した。それらが同定されたら、プラス
ミドＤＮＡをＸｍｎＩで消化することにより断片の配向を決定した。正しく配向
したｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡ安定化配列を含有するプラスミドを同定し、ｐＤ
Ｇ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_amyQ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図１７
）と呼称した。

【０１１１】実施例１５：縦列ａｍｙＱ−ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡの
ｍＲＮＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築
：実施例９のプラスミドｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓ
ｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼＩでブラントエンド化し
、次いでＤｒａＩＩＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約
６３６０ｂｐのベクター断片をゲルから切り出し、ＤＮＡを実施例１の記載に従
って抽出した。

【０１１２】実施例７のプラスミドｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyQ／ＳＡＶをＳａｃＩで消
化し、Ｔ４重合酵素Ｉでブラントエンド化し、ＤｒａＩＩＩで消化した。消化物
をアガロースゲル電気泳動にかけ、約１７１０ｂｐのプロモーター断片をゲルか
ら切り出し、ＤＮＡを実施例１の記載に従って抽出した。精製したＤＮＡを合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換した。
アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加
したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyQ／Ｐｒ_cryIIIA ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図１８）と呼称されるプラスミドを、アン
ピシリン耐性形質転換細胞の１つから単離した。プラスミド構造をＳａｃＩによ
る消化と、続くゲル電気泳動とにより検証した。

【０１１３】実施例１６：縦列ａｍｙＱ−ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ
（商標）遺伝子発現カセットの構築：実施例１０のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ＳＡＶをＰａｃＩ
およびＤｒａＩＩＩで消化し、約６４５０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載
に従ってゲル電気泳動により単離した。Ｐｒ_amyQおよびＰｒ_cryIIIAを担持する
ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyQ／Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡ
Ｖ（実施例１５）の約１７９０ｂｐのＰａｃＩ−ＤｒａＩＩＩ断片を、実施例１
の記載に従ってゲル電気泳動により単離し、ベクター断片と結合させた。大腸菌
ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を
、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。
ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_amyQ／Ｐｒ_cryIIIA／ＳＡＶ（図１９）と呼
称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから単離した。

【０１１４】実施例１７：ｃｒｙＩＩＩＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝
子発現カセットの構築：ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶを下記のとお
り構築した。すなわち、実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡ重合酵素
で処理して３′の張出し部を除去した。次いでプラスミドをＡｓｐ７１８で消化
した。消化物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約７５４０ｂｐのＡｓｐ７１８
／ブラント化ＳｆｉＩベクター断片をゲルから切り出し、ＤＮＡを実施例１の記
載に従って抽出した。

【０１１５】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡ
ＶをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡ重合酵素およびｄＮＴＰで処理して
陥凹した３′末端を充填した。次いでプラスミドをＡｓｐ７１８で消化した。消
化物を、アガロースゲル電気泳動および端を切り取ったｃｒｙＩＩＩＡプロモー
ター（「‐１０」領域のみ）を含有する約９２０ｂｐの断片により分離し、下流
のｃｒｙＩＩＩＡ安定化配列をゲルから切り出し、ＤＮＡを実施例１の記載に従
って抽出した。

【０１１６】精製したＤＮＡを合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換させた
。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追
加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ｃｒｙＩＩＩ
Ａｓｔａｂ／ＳＡＶ（図２０）と呼称されるプラスミドを形質転換細胞の１つか
ら精製した。

【０１１７】実施例１８：「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの構築：下記の２つのオリゴヌクレオチドを合わせてアニールし、クレノウ断片で延長
してａｍｙＱプロモーターの‐１０および‐３５領域中に変異（＊）を含有する
６８ｂｐの二重鎖断片を発生させた（太字で強調されている）。

【０１１８】

【化１０】

【０１１９】ａｍｙＱプロモーターの１３７ｂｐの上流領域を有する第二の二重鎖断片を、
下記をプライマーに用いてＰＣＲにより発生させた。

【０１２０】

【化１１】

【０１２１】次いで、両二重鎖ＤＮＡ断片を伝統的なＳＯＥ法（ＳＯＥのオーバーラップ部
は下線が引かれ、ラベルが付されている）により一緒に融合させて「コンセンサ
ス」ａｍｙＱと呼称されるａｍｙＱプロモーターの変異バージョンを発生させ
た。完全な長さの断片を得るためにＳＯＥ反応に用いたプライマーは、５′−ＧＧＣＣＴＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＣＡＴＴＴＴ
ＣＴＴＡＴＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＴ−３′であった。

【０１２２】増幅ＳＯＥ液（５０μｌ）の成分は、５０ｎｇの６８ｂｐのＳＯＥ断片および
５０ｎｇの１３７ｂｐのＳＯＥ断片、１ＸのＴａｑ重合酵素緩衝液、各２００μ
ＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに２．５単位のＴ
ａｑ重合酵素からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１
分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７
２℃で５分間の最終サイクルであった；上記３サイクルの後、上記２つのプライ
マーの各々５０ｐモルを、残りの２７サイクルの間に添加して、１８５ｂｐのプ
ロモーター断片を増幅した。

【０１２３】約１８５ｂｐのＰＣＲ生成物を、製造業者の手引書に従ってｐＣＲＩＩベクタ
ー中で直接サブクローン化し、前進および復帰Ｍ１３シークエンシングプライマ
ーを用いてｐＣＲＩＩ−Ｐｒ_{"consesus"amyQ}を産生し、実施例４の記載に従って
ＤＮＡシークエンシングにより検証した。フランキング制限部位を含む全ａｍｙＱプロモーターの配列を図２１（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ．２）に示した。次の変異、すなわちＳＥＱＩＤＮＯ．２の‐
３５領域における位置１３５および１３６でそれぞれＴからＡおよびＴからＣ（
転写始動部位に関して）、および‐１０領域における位置１５６でＴからＡへの
変換が、野生型ａｍｙＱプロモーター（ＳＥＱＩＤＮＯ．２）を含有する核
酸配列中に導入されて「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ．３）を生成した。また、図２１（ＳＥＱＩＤＮＯ．４）に示すように
ＴからＡへの変換が‐３５領域の約２０塩基対上流の位置１１６で偶然なされた
。この変換は、重要な‐１０および‐３５領域から十分遮断されているのでプロ
モーターの機能に有害な影響を与えなかった。

【０１２４】実施例１９：短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ
（商標）遺伝子発現カセットの構築：短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターを、ｐＣＲＩＩ−Ｐｒ_"consesus" _amyQ （実施例１８）から下記のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち

【０１２５】

【化１２】

【０１２６】を用いてＰＣＲ増幅した。増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＣＲＩＩ−Ｐｒ_"consesus" _amyQ 、各５０ｐモルのプライマー、１ＸのＴａｑ重合酵素緩衝液、各２００μＭ
のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに‐１０単位のＴａ
ｑ重合酵素からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分
間、５０℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクルであった。最
終サイクルは７２℃で５分間である。

【０１２７】約１００ｂｐのＰＣＲ生成物を製造業者の手引書に従ってｐＣＲＩＩベクター
中でクローン化し、前進および復帰Ｍ１３シークエンシングプライマーを用いて
プラスミドｐＣＲＩＩ−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}を産生し、それをＤＮＡシー
クエンシングにより実施例４の記載に従って検証した。Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}をＳｆｉＩおよびＳａｃＩで消化し、プロモーター
を担持する約１００ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単
離した。実施例５のｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＳａｃＩで消化
し、約６４３０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動によ
り単離した。精製物を合わせて結合させ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＰＬ１８０１ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７をこの連結反応混合物で形質転換し
、クロラムフェニコール耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりクロラムフェニコー
ル５μｇを追加したＴＢＡＢプレート上で選択した。ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒ_sh _{ort"consesus"amyQ} ／ＳＡＶと呼称されるプラスミドをクロラムフェニコール耐
性形質転換細胞の１つから精製した。

【０１２８】ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａ
ｍＨＩで消化し、Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／ＳＡＶカセットを担持する約１３
３０ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施例
１のｐＤＧ２６８ＭＣＳをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、約６０４０ｂｐ
のベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製し
た断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５αを連結反応物で形質転換し、アンピ
シリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬ
Ｂプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／Ｓ
ＡＶ（図２２）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つ
から精製し、ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩによる消化と、それに続くゲル電気泳動
により検証した。

【０１２９】実施例２０：短い「コンセンサス」ａｍｙＱの二量体プロモーター−ＳＡＶＩ
ＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：実施例１９のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／ＳＡＶをＳｆ
ｉＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡ重合酵素で処理してブラントエンドを生じさせ、Ｄ
ｒａＩＩＩで消化した。約５８３０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従っ
てゲル電気泳動により単離した。またｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_{short"consesus} _"amyQ ／ＳＡＶをＥｃｌ１３６ＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し、Ｐｒ_short"co _nsesus"amyQ ／ＳＡＶを担持する約１６４０ｂｐの断片を実施例１の記載に従っ
てゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ
５α細胞中で形質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たり
アンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８Ｍ
ＣＳ−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ dimer}／ＳＡＶ（図２３）と呼称されるプラス
ミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、構造特異的プライマー
を用いて実施例４の記載に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。

【０１３０】実施例２１：短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡス
タビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：実施例２のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／
ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、約５３９０ｂｐのベクター断片を
実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒ _{short"consesus"amyQ} ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｐｒ_shor _{t"consesus"amyQ} ／ＳＡＶを担持する約１３３０ｂｐの断片を実施例１の記載に
従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌
ＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１
ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤ
Ｇ２６８ＭＣＳ△−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／ＳＡＶと呼称されるプラスミド
をアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、そ
れに続くゲル電気泳動により検証した。

【０１３１】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／ＳＡＶをＳａｃＩで消化
し、子ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼで処理して５′のリン酸基を除去し
た。実施例１１のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyL／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／Ｓ
ＡＶをＳａｃＩで消化し、ｃｒｙＩＩＩＡスタビライザーを担持する約３５０ｂ
ｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ｐＤＧ２６８
ＭＣＳ△−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／ＳＡＶおよびスタビライザー断片を結合
させ、大腸菌ＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転
換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選
択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／ｃｒｙＩＩＩＡｓ
ｔａｂ／ＳＡＶ（図２４）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換
細胞の１つから精製し、構造特異的プライマーを用いて実施例４の記載に従って
ＤＮＡシークエンシングにより検証した。

【０１３２】実施例２２：縦列の短い「コンセンサス」ａｍｙＱ−ｃｒｙＩＩＩＡプロモー
ター−ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺
伝子発現カセットの構築：実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔ
ａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化した。約６７８０ｂｐのベクタ
ー断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ｐＤＧ２６８Ｍ
ＣＳ−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し
た。約１３００ｂｐの発現カセット断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動
により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形
質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１
００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−
Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／ＳＡＶと呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性
形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、それに続くゲル電気泳
動により検証した。

【０１３３】実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔ
ａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し、クレノウ断片で処理してブラントエンドを生
じさせ、ＤｒａＩＩＩで消化した。約７０６０ｂｐのベクター断片を実施例１の
記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ _{short"consesus"amyQ} ／ＳＡＶをＥｃｌ１３６ＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し
、短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターを担持する約１５４０ｂｐのベク
ター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片
を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換させた。アンピシリン耐
性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレー
ト上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／Ｐ
ｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図２５）と呼称されるプラスミ
ドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、
それに続くゲル電気泳動により検証した。

【０１３４】実施例２３：短い「コンセンサス」ａｍｙＱの三量体プロモーター−ＳＡＶＩ
ＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：実施例２０のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ dimer}／ＳＡＶ
をＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_short"conses _{us"amyQ dimer} ／ＳＡＶカセットを担持する約１２３０ｂｐの断片を実施例１の
記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎ
ｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍ
ＨＩで消化し、約６７５０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電
気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞
中を連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当
たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６
８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ dimer}／ＳＡＶと呼称されるプラ
スミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化
と、それに続くゲル電気泳動により検証した。

【０１３５】実施例２３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／ＳＡ
ＶをＥｃｌ１３６ＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、約６８４０ｂｐのベクター断
片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ
△ｎｅｏ−Ｐｒ_{"short consesus amyQ"dimer}／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し、Ｔ４
ＤＮＡ重合酵素で処理してブラントエンドを生じさせ、ＢａｍＨＩで消化した
。Ｐｒ_{"short consesus amyQ"dimer}／ＳＡＶカセットを担持する約１２３０ｂｐ
の断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を
合わせて結合させ、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＰＬ１８０１ｓｐ
ｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７を連結反応混合物で形質転換し、クロラムフェニコール
耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン５μｇを追加したＴＢＡＢプレ
ート上で選択した。Ｐｒ_{short"consesus"amyQ trimer}／ＳＡＶを含有するクロラ
ムフェニコール耐性のネオマイシン感受性成分を単離した。

【０１３６】ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮの細菌性ＤＮＡ分離実験計画書（ＱＩＡＧＥＮ
，Ｉｎｃ．，ＳａｎｔａＣｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を用いてこの成分から単離し
、短い「コンセンサス」ａｍｙＱの三量体プロモーターを担持する断片を、下記
のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち

【０１３７】

【化１３】

【０１３８】を用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅させた。増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇの６８ｂｐのゲノムＤＮＡ、５
０ｐモルの各プライマー、１ＸのＴａｑ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに１．０単位のＴａｑ重合酵
素からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５
℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分
間の最終サイクルである。

【０１３９】約１０７８ｂｐのＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮＩｎｃ．，ＳａｎｔａＣｌａｒｉｔａ
，ＣＡ）を用いて精製し、短い「コンセンサス」ａｍｙＱの三量体プロモーター
の配列を、構造特異的プライマーを用いる実施例４の記載に従ってＰＣＲ生成物
のＤＮＡシークエンシングにより検証した。

【０１４０】実施例２４：短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター−長いｃｒｙＩＩＩ
ＡのｍＲＮＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの
構築：実施例９のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／Ｓ
ＡＶをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡ重合酵素およびｄＮＴＰで処理し
てブラントエンドを生じさせ、Ａｓｐ７１８で消化した。長いｃｒｙＩＩＩＡス
タビライザーおよびＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子解読領域部分を担持する約
９１３ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施
例２３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／ＳＡＶをＥ
ｃｌ１３６ＩＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、約７７００ｂｐのベクター断片を
実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて
結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換した。アンピシリン耐性形質転換細
胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択し
た。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_{short"consesus"amyQ}／長いｃｒｙＩＩ
ＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図２６）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形
質転換細胞の１つから精製し、構造特異的プライマーを用いて実施例４の記載に
従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。

【０１４１】実施例２５：「短い」ａｍｙＱの二量体プロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商
標）遺伝子発現カセットの構築：「短い」ａｍｙＱプロモーターを下記のオリゴヌクレオチドプライマー、すな
わち

【０１４２】

【化１４】

【０１４３】を用いてｐＣＲＩＩ−Ｐｒ_amyQ（実施例７）からＰＣＲ増幅を行なった。増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＣＲＩＩ−Ｐｒ_amyQ、５０
ｐモルの各プライマー、１ＸのＴａｑ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ
、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに１．０単位のＴａｑ重合酵素
からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃
で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間
の最終サイクルである。

【０１４４】約１００ｂｐのＰＣＲ生成物を製造業者の手引書に従ってｐＣＲＩＩベクター
中でクローン化し、前進および復帰Ｍ１３シークエンシングプライマーを用いて
プラスミドｐＣＲＩＩ−Ｐｒ_"short"amyQを産生し、それをＤＮＡシークエンシ
ングにより実施例４の記載に従って検証した。次に、このプラスミドをＳｆｉＩ
およびＳａｃＩで消化し、約１００ｂｐのプロモーター断片を実施例１の記載に
従ってゲル電気泳動により単離した。実施例６のｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒ_amyL／
ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＳａｃＩで消化し、約６４００ｂｐのベクター断片を実
施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。次いでこれら２つの断片を
合わせて結合させ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８△４細胞（国
際特許公開第９８／２２５９８号）中で形質転換した。クロラムフェニコール耐
性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりクロラムフェニコール５μｇを追加したＴＢＡ
Ｂプレート上で選択し、形質転換細胞のコロニーの周囲にハローを形成させるこ
とによりＳＡＶＩＮＡＳＥが発現するクローンを同定するために２％の乾燥乳を
含むＴＢＡＢ寒天を被せた。ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒ_"short"amyQ／ＳＡＶと呼
称されるプラスミドをクロラムフェニコール耐性の、ハローを形成する形質転換
細胞の１つから精製し、ＰｖｕＩＩによる消化と、これに続くゲル電気泳動によ
り検証した。次に、このプラスミドをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、約１
３００ｂｐの発現カセットの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により
単離した。実施例４のｐＤＧ２６８ＭＣＳをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し
た。次いで２つの断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換さ
せた。アンピシリン耐性形質転換細胞を１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを
追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_"short"amyQ／
ＳＡＶ（図２７）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１
つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、それに続くゲル電気泳動により検証した
。

【０１４５】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_"short"amyQ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩ
で消化し、Ｐｒ_"short"amyQ／ＳＡＶ発現カセットを担持する約１３３０ｂｐの
断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施例３のｐＤＧ
２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆ
ｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、約６７５０ｂｐのベクター断片を実施例１の記
載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大
腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍ
ｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ
２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_"short"amyQ／ＳＡＶと呼称されるプラスミドをア
ンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、それに
続くゲル電気泳動により検証した。

【０１４６】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_"short"amyQ／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し
、Ｔ４ＤＮＡ重合酵素で処理してブラントエンドを生じさせ、ＤｒａＩＩＩで
消化した。約６５３０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳
動により単離した。また、ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_"short"amyQ／Ｓ
ＡＶをＤｒａＩＩＩおよびＥｃｌ１３６ＩＩで消化し、「短い」ａｍｙＱプロモ
ーターを実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を
結合させ、大腸菌ＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換させ、アンピシリン耐性
形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート
上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_{"short"amyQ dimer}／ＳＡＶ
（図２８）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから
精製し、構造特異的プライマーを用いて実施例４の記載に従ってＤＮＡシークエ
ンシングにより検証した。

【０１４７】実施例２６：「短い」ａｍｙＱの二量体プロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲ
ＮＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：実施例２５のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_{"short"amyQ dimer}／ＳＡＶ
をＳａｃＩで消化し、子ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼで処理して５′の
リン酸基を除去した。実施例１１のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyL／ｃｒｙＩＩ
ＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳａｃＩで消化し、ｃｒｙＩＩＩＡスタビライザーを担
持する約３５０ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離し
た。ｃｒｙＩＩＩＡスタビライザー断片を、ＳａｃＩで切断したｐＤＧ２６８Ｍ
ＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_{"short"amyQ dimer}／ＳＡＶに結合させた。大腸菌ＤＨ５α
を連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当た
りアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８
ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ_{"short"amyQ dimer}／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（
図２９）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精
製し、構造特異的プライマーを用いて実施例４の記載に従ってＤＮＡシークエン
シングにより検証した。

【０１４８】実施例２７：ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＰＬ１８０１ｓｐｏＩ
ＩＥ：：Ｔｎ９１７成分中のＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットのコ
ピー数：ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットを、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ株ＰＬ１８０１ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７のａｍｙＥ坐中に各々
組込んだ。特に、発現カセットを含有するｐＤＧ２６８ＭＣＳ誘導体をＳｃａＩ
で消化してプラスミドを線状にした。線状プラスミドＤＮＡ１μｇが、クロラム
フェニコール耐性に対して応答能のあるＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌｉｓ
ＰＬ１８０１ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７の形質転換を起こすために用いら
れた。

【０１４９】全ての形質転換細胞が、二重乗換えの結果としてａｍｙＥ坐中に発現カセット
の単一コピーを含有するべきである。これは、アンピシリン耐性遺伝子（ｐＤＧ
２６８ＭＣＳまたはｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ベースのプラスミドから誘導された成
分中の）の不在を示すための染色体ＤＮＡ上のＤＮＡドットブロット分析により
、またはネオマイシン感受性（ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏベースのプラスミド
から誘導された組み込み体内）により確認された。

【０１５０】ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮの細菌性ＤＮＡ分離実験計画書を用いてＢａｃ
ｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ成分から分離した。ドットブロット分析用には、
ゲノムＤＮＡ約３μｇを、総体積１０μｌ中４００ｍＭのＮａＯＨ‐１０ｍＭの
ＥＤＴＡにより室温で１０分間培養して変性した。変性したＤＮＡ１μｌによっ
てＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍのプラスに帯電させたナイロン膜（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−ＭａｎｎｈｅｉｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉ
ａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）上に斑点を付け、ＵＶＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（
商標）２４００（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，Ｌ
ａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いたＵＶ架橋により固定した。膜は、ＧＥＮＩＵＳ
（商標）Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用
いてアンピシリン耐性遺伝子ｂｌａ専用のＤＮＡプローブで探査された。ブロッ
トは、検出試薬ＡＴＴＯＰＨＯＳ（商標）（ＡｍｅｅｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ，ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いて、ＧＥＮＩＵ
Ｓの実験計画書に従って開発された。プローブは、光学的スキャナーＳＴＯＲＭ
（商標）８６０およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔのソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて検出された。プロ
ーブがゲノムＤＮＡと結合不能であることはｂｌａ遺伝子の不在を示し、それは
二重乗換えによるプラスミドの挿入を立証した。

【０１５１】ｂｌａプローブは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−ＭａｎｎｈｅｉｍＰＣＲＤＩ
ＧＰｒｏｂｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用
いてジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰでＰＣＲ断片を標識することにより創出さ
れた。ＰＣＲは、ＤＮＡ重合酵素Ａｍｐｌｉｔａｑ（商標）Ｇｏｌｄおよび熱循
環器Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（商標）４０（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎ
ｇＳｙｓｔｅｍｓ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、９５℃で９分、９５
℃、５５℃、および７２℃で各１分の３０サイクル、および７２℃で３分の温度
プロファイルにより行なった。プローブは下記のオリゴヌクレオチドプライマー
、すなわち

【０１５２】

【化１５】

【０１５３】を用いてｐＵＣ１１８から増幅された。形質転換細胞がＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）発現カセットの単一コピーを含有す
ることが確認されたならば、各発現カセットの単一コピー成分を振とうフラスコ
分析により分析した。実施例２８：ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＰＬ１８０１ｓｐｏＩ
ＩＥ：：Ｔｎ９１７中のＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の発現：実施例１９に記載した各発現カセットの単一コピー成分を、ＬＢブロス１ｍｌ
中、３７℃で中間対数期まで増殖させた。次いで、中間対数期の各培養物を１０
％のスクロース、４％の大豆粉、１％のＮａ₂ＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．５％の
ＣａＣＯ₃、および０．０１％のプルロン酸からなるＰＳ−１培地５０ｍｌ中で
培養した。培養物を３７℃で５日間激しく振とうした。分割量１ｍｌを３、４、
および５日目に取り除き、１２，０００Ｘｇで２分間遠心分離し、各上澄み液０
．５ｍｌを全試料が採取されるまで−２０℃で凍結させた。次いで凍結した試料
を解凍し、下記の実験計画を用いてＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の活性を検定し、
相対的な収率を決定した。

【０１５４】ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の活性の検定は、基質としてカゼイン・フルオレセ
イン・イソチオシアネートを用いて行なった。カゼイン・フルオレセイン・イソ
チオシアネートの原液は、Ｔｗｉｎｉｎｇの論文、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１４３：３０〜３４，１９８４に従って調製され、５０
ｍＭのトリス−ＣｌｐＨ７．２緩衝液１００ｍｌ当たりカゼインフルオレセイン
イソチオシアネート０．５ｍｇを含有した。検定反応は、適当量の０．２５Ｍの
ホウ酸塩ｐＨ９．０緩衝液で希釈した酵素試料１０μｌに対して０．２５Ｍのホ
ウ酸塩ｐＨ９．０緩衝液を１：１ｖ／ｖで混合した原液４０μｌを添加すること
により開始させた。反応物を３７℃で１０分間培養し、次いで５％のトリクロロ
酢酸１５０μｌを加えることにより冷却した。冷却した反応物を低温室中に１０
分間置き、次いで最高速度で２分間遠心分離した。上澄み液の分割量１０μｌを
、０．５Ｍのホウ酸塩ｐＨ９．０緩衝液２ｍｌを含有する試験管に移し、よく混
合した。この溶液の分割量２００μｌを黒い「Ｕ」底の９６ウェルプレート（Ｄ
ｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｔａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，
ＶＡ）に移し、蛍光を、蛍光光度計Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ‐１０００（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈＬａｂｏｔａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）
を使用して基準設定値１１７６でチャンネル３およびランプ電圧４．１Ｖを用い
て測定した。ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の活性は、１ｍｌ当たり１．８〜９．０
ＮＰＵ（ＮｏｖｏＰｒｏｔｅａｓｅＵｎｉｔ）の範囲にあるＳＡＶＩＮＡ
ＳＥ（商標）標準（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ，Ｂａｓｖａｒｄ，Ｄｅ
ｎｍａｒｋ）により作成した標準曲線を参照して計算された。標準の活性は、要
求に応じてＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ，Ｂａｓｖａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒ
ｋから入手可能なＮｏｖｏＡｎａｌｙｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄＡＦ２２
０／１−ＧＢに従って決定される。

【０１５５】結果を表１に示す。ａｍｙＱ、ａｍｙＬ、およびｃｒｙＩＩＩＡプロモーター
（スタビライザー配列のない）のＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）検定の結果に基づく
強度は、全てほぼ等しい。ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー配列がこれ
らのプロモーターの下流に置かれた場合、これらの活性はかなり増加した（発現
レベルにおいて少なくとも１．７倍の増加）。しかしながら、ｃｒｙＩＩＩＡの
ｍＲＮＡスタビライザー配列が縦列プロモーターの下流に含まれた場合、活性は
、単一型プロモーター単独よりも４倍を超えて高く、ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡ
スタビライザー配列が含まれた単一型プロモーターよりも２倍を超えて高い。ｃ
ｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー配列がプロモーターなしで用いられた場
合、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の発現はきわめて低く、スタビライザー配列の増
進効果がスタビライザー配列内のプロモーターの活性のせいではないことを示し
た。したがって、ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターの上流にａｍｙＱまたはａｍｙＬ
プロモーターなどのプロモーターおよびそのｍＲＮＡ安定化配列を配置すること
によって、任意の単一型プロモーター単独よりもかるかに優れた縦列プロモータ
ーを創出することができる。

【０１５６】また、より強いプロモーター、すなわち「コンセンサス」ａｍｙＱおよび「短
いコンセンサス」ａｍｙＱプロモーターにするために本明細書に記載のようにａ
ｍｙＱプロモーターなどのプロモーターを修飾することによって、より高レベル
の遺伝子の発現を得ることが可能であることをこの結果は示した。これらのプロ
モーターは両者とも、それらが導き出された野生型ａｍｙＱプロモーターよりも
約４倍強い。さらに、より高レベルの発現を、「短いコンセンサス」プロモータ
ーの下流にｃｒｙＩＩＩＡの長いｍＲＮＡスタビライザー配列を配置することに
より得ることができた。この特殊な組み合わせは、ｍＲＮＡの飽和レベルおよび
ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の発現の最大レベル、すなわち十分に増幅された株に
匹敵するレベル（野生型ａｍｙＱプロモーター単独の６倍を超える増加）をもた
らす。

【０１５７】さらに結果は、より高いレベルの発現が「頭から尾まで」の方式で単一型プロ
モーターの２つ以上のコピーを組合わせることにより得られることを示した。こ
れは、単一の短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター、二量体の短い「コン
センサス」ａｍｙＱプロモーター、および三量体の短い「コンセンサス」ａｍｙ
Ｑプロモーターから得られた発現レベルを比較することによりはっきりと例示さ
れる。ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の発現レベルは、モノマーのプロモーターと比
較して後者の２つはそれぞれ１．５倍および１．８倍高かった。

【０１５８】全体の結果は、下記の方法を用いて単一コピーの転写を増加することができる
ことを示した。すなわちｃｒｙＩＩＩＡプロモーターの上流にａｍｙＱおよびａ
ｍｙＬプロモーターなどのプロモーターおよびそのｍＲＮＡ安定化配列を配置す
ることによる縦列プロモーターの創出、ｃｒｙＩＩＩＡｍＲＮＡ安定化配列に
よる「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの創出、および短い「コンセンサス
」ａｍｙＱ二量体および三量体プロモーターなどの単一型プロモーターの縦列コ
ピーの創出である。これら全ての方法は、ａｍｙＱおよびａｍｙＬなどの単一型
プロモーターを用いて得られたレベルと比較した場合、著しく高レベルの遺伝子
の発現につながる。

【０１５９】

【表１】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターおよびｃｒｙＩＩＩＡプロセシング／安定化配列
の地図を示す図である。

【図２】縦列プロモーターおよびｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列
を含有する様々な構築物を図式的に示す図である。

【図３】ｐＤＧ２６８ＭＣＳの制限酵素地図を示す図である。

【図４】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制
限酵素地図を示す図である。

【図５】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡ
Ｖの制限酵素地図を示す図である。

【図６】ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＭＣＳの制限酵素地図を示す図である。

【図７】ｐＳＸ２２２の制限酵素地図を示す図である。

【図８】ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。

【図９】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyL／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。

【図１０】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyQ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。

【図１１】ｐＵＣ１８−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ｃｒｙＩＩＩＡの制限
酵素地図を示す図である。

【図１２】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限
酵素地図を示す図である。

【図１３】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒ_cryIIIA／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図
である。

【図１４】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyL／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素
地図を示す図である。

【図１５】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒ_amyL／Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔ
ａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。

【図１６】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒ_amyL／Ｐｒ_cryIIIA／ＳＡＶの制限酵素地
図を示す図である。

【図１７】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒ_amyQ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの
制限酵素地図を示す図である。

【図１８】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_amyQ／Ｐｒ_cryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／Ｓ
ＡＶの制限酵素地図を示す図である。

【図１９】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒ_amyQ／Ｐｒ_cryIIIA／ＳＡＶの制限酵素地
図を示す図である。

【図２０】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−ｌｏｎｇｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの
制限酵素地図を示す図である。

【図２１】「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターを含有する核酸配列を示す図である。

【図２２】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_{short"consensus"amyQ}／ＳＡＶの制限酵素地図を示
す図である。

【図２３】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_{short"consensus"amyQ dimer}／ＳＡＶの制限酵素地
図を示す図である。

【図２４】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔ−Ｐｒ_{short"consensus"amyQ}／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ
／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。

【図２５】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒ_{short"consensus"amyQ}／Ｐｒ_cryIIIA／ｃ
ｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。

【図２６】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒ_{short"consensus"amyQ}／ｌｏｎｇｃｒｙ
ＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。

【図２７】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ_"short"amyQ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図であ
る。

【図２８】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒ_{"short"amyQ dimer}／ＳＡＶの制限酵素地
図を示す図である。

【図２９】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒ_{"short"amyQ dimer}／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔ
ａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者トーマス，マイケルディー．アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616，デイビス，リラードドライブ 3000 ＃270 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA08 BA10 BA12 BA13 BA14 CA03 DA06 DA07 EA04 FA02 FA10 GA11 HA01 HA12 4B050 CC03 DD02 4B065 AA19X AA26X AB01 AC14 BA02 BA25 CA28 CA29 CA31 CA32 CA33 4H045 AA10 AA20 BA10 CA11 DA83 EA06 FA74 【要約の続き】セッシング／安定化配列とを含む核酸構築物を含む前記バチルス細胞を、培養し；そして（ｂ）上記培養培地から上記ポリペプチドを単離する、を含む、ポリペプチドの製法にも関する。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地中でバチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）細胞であって、そのタンデム・プロモーターの各プロモーター
配列が上記ポリペプチドをコードする核酸配列と操作可能に連結しているところ
のタンデム・プロモーターを含む核酸構築物を含む前記バチルス細胞を培養し；
そして（ｂ）上記培養培地から上記ポリペプチドを単離する、ことを含む、前記ポリペプチドの製法。
【請求項２】前記核酸構築物が、タンデム・プロモーターの下流に、かつ
、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセッシ
ング／安定化配列を含む、請求項１に記載の製法。
【請求項３】前記タンデム・プロモーターが２以上のバクテリア・プロモ
ーター配列を含む、請求項１または２に記載の製法。
【請求項４】前記２以上のバクテリア・プロモーター配列を１以上のバチ
ルス遺伝子から得る、請求項３に記載の製法。
【請求項５】前記タンデム・プロモーターがａｍｙＱプロモーターを含む
、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製法。
【請求項６】前記タンデム・プロモーターが「‐３５」領域について配列
ＴＴＧＡＣＡを、そして「‐１０」領域について配列ＴＡＴＡＡＴを有する「コ
ンセンサス」プロモーターを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製法。
【請求項７】前記タンデム・プロモーターがａｍｙＬプロモーターを含む
、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製法。
【請求項８】前記タンデム・プロモーターがｃｒｙＩＩＩＡプロモーター
を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製法。
【請求項９】前記タンデム・プロモーターがａｍｙＱプロモーターおよび
ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製法
。
【請求項１０】前記タンデム・プロモーターが「‐３５」領域について配
列ＴＴＧＡＣＡを、そして「‐１０」領域について配列ＴＡＴＡＡＴを有する「
コンセンサス」プロモーターと、ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターを含む、請求項１
〜９のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１１】前記タンデム・プロモーターがａｍｙＬプロモーターおよ
びｃｒｙＩＩＩＡプロモーターを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の
製法。
【請求項１２】前記タンデム・プロモーターがａｍｙＱプロモーターの２
つのコピーを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１３】前記タンデム・プロモーターが「‐３５」領域について配
列ＴＴＧＡＣＡを、そして「‐１０」領域について配列ＴＡＴＡＡＴを有する「
コンセンサス」プロモーターの２つのコピーを含む、請求項１〜１２のいずれか
１項に記載の製法。
【請求項１４】前記タンデム・プロモーターがａｍｙＬプロモーターの２
つのコピーを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１５】前記タンデム・プロモーターがｃｒｙＩＩＩＡプロモータ
ーの２つのコピーを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１６】前記タンデム・プロモーターの２以上のプロモーター配列
が同時に前記核酸配列の転写を促進する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載
の製法。
【請求項１７】前記タンデム・プロモーターの２以上のプロモーター配列
の中の１以上がバチルス細胞の増殖の異なる段階で前記核酸配列の転写を促進す
る、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１８】前記ｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列がｃｒｙＩＩＩ
ＡのｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列である、請求項１〜１７のいずれか１
項に記載の製法。
【請求項１９】前記ｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列がＳＰ８２ｍ
ＲＮＡプロセッシング／安定化配列である、請求項１〜１８のいずれか１項に記
載の製法。
【請求項２０】前記ｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列が本質的に同一
サイズのｍＲＮＡ転写産物を生成する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の
製法。
【請求項２１】前記バチルス細胞が前記核酸構築物の１以上コピーを含有
する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２２】前記バチルス細胞が前記核酸構築物の１のコピーを含有す
る、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２３】前記核酸構築物が選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求
項１〜２２のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２４】前記バチルス細胞が選択マーカー遺伝子を含まない、請求
項１〜２３のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２５】前記核酸配列が前記バチルス細胞にとって異種のポリペプ
チドをコードする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２６】前記ポリペプチドがホルモンまたはその変異体、酵素、受
容体またはその部分、抗体またはその部分、あるいはリポーターである、請求項
１〜２５のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２７】前記酵素が酸化還元酵素（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ
）、転移酵素（ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、加水分解酵素（ｈｙｄｒｏｌａｓｅ
）、脱離酵素（ｌｙａｓｅ）、異性化酵素（ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、あるいは合
成酵素（ｌｉｇａｓｅ）である、請求項２６に記載の製法。
【請求項２８】前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、炭水化物
分解酵素（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｓｅ）、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ
、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン・グリコシルトラ
ンスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、αガラクトシダー
ゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、βグルコシダ
ーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、
酸化酵素（ｏｘｉｄａｓｅ）、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィター
ゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、ＲＮＡ分解酵素（ｒｉ
ｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、トランスグルタミナーゼ、あるいはキシラナーゼであ
る、請求項２７に記載の製法。
【請求項２９】前記核酸配列がバチルス細胞の染色体中に包含される、請
求項１〜２８のいずれか１項に記載の製法。
【請求項３０】前記核酸配列が染色体外要素上に包含される、請求項１〜
２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】前記バチルスの宿主細胞が、バチルス・アルカロフィラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミノリクエフ
ァシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチ
ルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュラン
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファームス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｍｕ
ｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レ
ンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、あるいはバチルス・チューリンギエンシス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の細胞である、請求項１〜３
０のいずれか１項に記載の製法。
【請求項３２】前記バチルス宿主細胞がバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である、請求項３１に記載の製法。
【請求項３３】（ａ）そのタンデム・プロモーターの各プロモーター配列
がポリペプチドをコードする核酸配列の単一コピーに操作可能に連結していると
ころのタンデム・プロモーター、および場合により（ｂ）上記タンデム・プロモ
ーターの下流に、かつ、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の上流に位置す
るｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列を含む核酸構築物を含むバチルス細胞。
【請求項３４】前記核酸構築物が選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求
項３３に記載の細胞。
【請求項３５】選択マーカー遺伝子を含まない、請求項３３または３４に
記載の細胞。
【請求項３６】（ｉ）そのタンデム・プロモーターの各プロモーター配列
がポリペプチドをコードする核酸配列の単一コピーに操作可能に連結していると
ころのタンデム・プロモーター、及び場合により（ｉｉ）上記タンデム・プロモ
ーターの下流に、かつ、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の上流に位置す
るｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列をも含む核酸構築物をバチルス細胞の中
に導入することを含む、バチルス宿主細胞の獲得方法。
【請求項３７】バチルス細胞の選択マーカー遺伝子を欠失させることを含
む、バチルス細胞の選択マーカーを含まない突然変異体の製法であって、上記バ
チルス細胞が、（ｉ）そのタンデム・プロモーターの各プロモーター配列がポリ
ペプチドをコードする核酸配列の単一コピーに操作可能に連結しているところの
タンデム・プロモーター、及び場合により（ｉｉ）上記タンデム・プロモーター
の下流に、かつ、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の上流に位置するｍＲ
ＮＡプロセッシング／安定化配列をも含む核酸構築物を含む、前記製法。
【請求項３８】請求項３７の製法により得られたバチルス細胞の選択マー
カーを含まない突然変異体。
【請求項３９】（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地中でバチルス細
胞であって、（ｉ）前記ポリペプチドをコードする核酸配列の単一コピーに操作
可能に連結した、「‐３５」領域について配列ＴＴＧＡＣＡを、そして「‐１０
」領域について配列ＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーターと、（
ｉｉ）上記コンセンサス・プロモーターの下流に、かつ、上記ポリペプチドをコ
ードする核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列とを含
む核酸構築物を含む前記バチルス細胞を、培養し；そして（ｂ）上記培養培地か
ら上記ポリペプチドを単離する、を含む、ポリペプチドの製法。
【請求項４０】前記コンセンサス・プロモーターを任意のバクテリア・プ
ロモーターから得る、請求項３９に記載の製法。
【請求項４１】前記「コンセンサス」プロモーターをバチルス・プロモー
ターから得る、請求項４０に記載の製法。
【請求項４２】前記コンセンサス・プロモーターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ｌａｃオペロン、ストレプトミセス・コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、バチルス・レン
タス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（ａ
ｐｒＨ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ）のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（サブチリシンＣａｒｌｓｂｅ
ｒｇ遺伝子）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）
のレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）のαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）、バチルス・リケ
ニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のαアミラー
ゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の麦芽生成アミラーゼ遺伝子（ａｍ
ｙＭ）、バチルス・アミロリックエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌ
ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・
リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のペニシ
リナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）のｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンギエン
シス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の亜種のテネブリオニ
ス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子（ｃｒｙＩＩＩＡ、配列番
号１）またはそれらの部分、あるいは原核βラクタマーゼ遺伝子のｓｐｏ１細菌
ファージプロモーターから得られたプロモーターから得る、請求項４０に記載の
製法。
【請求項４３】前記「コンセンサス」プロモーターをバチルス・アミロリ
クエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）
のαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）から得る、請求項４０に記載の製法。
【請求項４４】前記「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターが配列番号３
または配列番号４の核酸配列を有する、請求項４３に記載の製法。
【請求項４５】前記ｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列がｃｒｙＩＩＩ
ＡのｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列である、請求項３９〜４４のいずれか
１項に記載の製法。
【請求項４６】前記ｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列がＳＰ８２ｍ
ＲＮＡプロセッシング／安定化配列である、請求項３９〜４４のいずれか１項に
記載の製法。
【請求項４７】前記ｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列が本質的に同一
サイズのｍＲＮＡの転写産物を生成する、請求項３９〜４４のいずれか１項に記
載の製法。
【請求項４８】前記バチルス細胞が前記核酸構築物の１以上のコピーを含
有する、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の製法。
【請求項４９】前記バチルス細胞が前記核酸構築物の単一のコピーを含有
する、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の製法。
【請求項５０】前記核酸構築物が選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求
項３９〜４９のいずれか１項に記載の製法。
【請求項５１】前記バチルス細胞が選択マーカー遺伝子を含有しない、請
求項３９〜４９のいずれか１項に記載の製法。
【請求項５２】前記核酸配列が前記バチルス細胞にとって異種のポリペプ
チドをコードする、請求項３９〜５１のいずれか１項に記載の製法。
【請求項５３】前記ポリペプチドが、ホルモンまたはその変異体、酵素、
受容体またはその部分、抗体またはその部分、あるいはリポーターである、請求
項３９〜５２のいずれかに記載の製法。
【請求項５４】前記酵素が、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱
離酵素、異性化酵素、あるいは合成酵素である、請求項５３に記載の製法。
【請求項５５】前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、炭水化物
分解酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、ク
チナーゼ、シクロデキストリン・グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボ
ヌクレアーゼ、エステラーゼ、αガラクトシダーゼ、βガラクトシダーゼ、グル
コアミラーゼ、αグルコシダーゼ、βグルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカ
ーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、酸化酵素、ペクチン分解酵素、
ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解
酵素、ＲＮＡ分解酵素、トランスグルタミナーゼ、あるいはキシラナーゼである
、請求項５３に記載の製法。
【請求項５６】前記核酸配列がバチルス細胞の染色体内に包含される、請
求項３９〜５５のいずれか１項に記載の製法。
【請求項５７】前記核酸配列が染色体外要素上に包含される、請求項３９
〜５５のいずれか１項に記載の製法。
【請求項５８】前記バチルス宿主細胞が、バチルス・アルカロフィルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファ
シエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチル
ス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃ
ｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｍｕｓ
）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レン
タス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｉｕｍ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、あるいはバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の細胞である、請求項３９〜５７
のいずれか１項に記載の製法。
【請求項５９】前記バチルス細胞がバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である、請求項５８に記載の製法。
【請求項６０】（ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列の単一コピーに
操作可能に連結した、「‐３５」領域について配列ＴＴＧＡＣＡを、そして「‐
１０」領域について配列ＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーターと
、（ｂ）上記「コンセンサス」プロモーターの下流に、かつ、上記ポリペプチド
をコードする核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列と
を含む核酸構築物を含むバチルス細胞。
【請求項６１】前記核酸構築物が選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求
項６０に記載の細胞。
【請求項６２】選択マーカー遺伝子を含有しない、請求項６０または６１
に記載の細胞。
【請求項６３】（ｉ）ポリペプチドをコードする核酸配列の単一コピーに
操作可能に連結した、「‐３５」領域について配列ＴＴＧＡＣＡを、そして「‐
１０」領域について配列ＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーターと
、（ｉｉ）上記「コンセンサス」プロモーターの下流に、かつ、上記ポリペプチ
ドをコードする核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列
とを含む核酸構築物をバチルス細胞中に導入することを含む、バチルス宿主細胞
の獲得方法。
【請求項６４】バチルス細胞の選択マーカー遺伝子を欠失させることを含
む、バチルス細胞の選択マーカーを含まない突然変異体の製法であって、前記バ
チルス細胞が、（ｉ）ポリペプチドをコードする核酸配列の単一コピーに操作可
能に連結した、「‐３５」領域について配列ＴＴＧＡＣＡを、そして「‐１０」
領域について配列ＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーターと、（ｉ
ｉ）上記「コンセンサス」プロモーターの下流に、かつ、上記ポリペプチドをコ
ードする核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列とを含
む核酸構築物を含む、前記製法。
【請求項６５】請求項６４の製法により得られた、バチルス細胞の選択マ
ーカーを含まない突然変異体。
【請求項６６】配列番号３または配列番号４内に包含された核酸配列を有
する単離された「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター配列。
【請求項６７】請求項６６のプロモーターの１以上のコピーに操作可能に
連結した、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物。
【請求項６８】請求項６７の核酸構築物を含む組換え発現ベクター。
【請求項６９】請求項６７の核酸構築物を含む組換えバチルス細胞。
【請求項７０】（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地中でバチルス細
胞であって、請求項６５の「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの１以上のコ
ピーと操作可能に連結した、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む前記バチ
ルス細胞を培養し；そして、（ｂ）上記培養培地から上記ポリペプチドを単離す
る、を含む、ポリペプチドの製法。
【請求項７１】バチルス細胞の選択マーカー遺伝子を欠失させることを含
む、バチルス細胞の選択マーカーを含まない突然変異体の製法であって、上記バ
チルス細胞が請求項６６の「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの１以上のコ
ピーと操作可能に連結した、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、前記製法。
【請求項７２】請求項７１の製法により得られたバチルス細胞の選択マー
カーを含まない突然変異体。
【請求項７３】前記バチルス細胞が前記核酸配列のコピーを１つだけ含む
前記請求項のいずれか１項に記載の方法。