DE69637036T2

DE69637036T2 - Amylase Varianten

Info

Publication number: DE69637036T2
Application number: DE1996637036
Authority: DE
Inventors: Henrik Bisgard-Frantzen; Allan Svendsen; Torben Vedel Borchert
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1996-02-05
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2016-02-06
Also published as: JP4116074B2; EP1538155A2; DE96900894T1; ES2269020T3; DK0815208T3; CN1624124A; DE69636408T2; EP2465930A3; ATE335077T1; AU4483396A; AR000862A1; EP2455465A3; DE69636408D1; EP1538155A3; EP1752525A1; ES2269020T1; JPH11503003A; EP2455468A3; ES2226609T1; AR053946A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft α-Amylase-Varianten mit verbesserten Eigenschaften in Bezug auf das Ursprungsenzym (z.B. verbesserte Wärme- und/oder Oxidationsstabilität und/oder reduzierte Calciumionenabhängigkeit) und dadurch einer verbesserte Leistungsfähigkeit beim Waschen und/oder Geschirrspülen (und/oder Textilentschlichten). Die Erfindung betrifft auch die Varianten kodierende DNA-Konstrukte und Vektoren und die DNA-Konstrukte beherbergende Zellen. Die Erfindung betrifft des Weiteren Verfahren zur Herstellung der Amylase-Varianten und die Amylase-Varianten umfassende Detergenszusätze und Detergenszusammensetzungen. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der Amylase-Varianten zur Textilentschlichtung und zur Herstellung von Süßstoffen und Ethanol aus Stärke.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
α-Amylaseenzyme wurden jahrelang industriell und für eine Vielfalt von verschiedenen Zwecken verwendet, deren wichtigsten die Stärkeverflüssigung, Textilentschlichtung, Stärkemodifikation in der Papier- und Zellstoffindustrie, und für das Brauen und Backen sind. Eine weitere Verwendung von α-Amylasen, die zunehmend wichtig wird, ist die Entfernung von stärkehaltigen Flecken während des Waschens oder Geschirrspülens.
In den letzten Jahren wurden Versuche unternommen, α-Amylase-Varianten zu konstruieren, die verbesserte Eigenschaften in Bezug auf spezifische Verwendungen, wie Stärkeverflüssigung und Textilentschlichtung, aufweisen.
Zum Beispiel offenbart US 5,093,257 chimere α-Amylasen, die einen N-terminalen Teil einer α-Amylase von B. stearothermophilus und einen C-terminalen Teil einer α-Amylase von B. lichenformis umfassen. Es wird angegeben, dass die chimeren α-Amylasen, verglichen mit deren Ursprungs-α-amylase einzigartige Eigenschaften, wie eine unterschiedliche Wärmestabilität, aufweisen. Jedoch zeigte es sich, dass alle der spezifisch beschriebenen chimeren α-Amylasen verglichen mit deren Ursprungs-α-amylasen eine verminderte enzymatische Aktivität aufweisen.
EP 252 666 beschreibt Hybridamylasen der allgemeinen Formel Q-R-L, wobei Q ein N-terminaler Polypeptidrest mit 55 bis 60 Aminosäureresten ist, der zu mindestens 75% homolog zu den 57 N-terminalen Aminosäureresten einer spezifizierten α-Amylase von B. amyloliquefaciens ist, R ein spezifiziertes Polypeptid ist und L ein 390 bis 400 Aminosäurereste umfassendes C-terminales Polypeptid ist, das zu mindestens 75% homolog zu den 395 C-terminalen Aminosäureresten einer spezifizierten α-Amylase von B. lichenformis ist.
Suzuki et al. (1989) offenbaren chimere α-Amylasen, in welchen spezifizierte Bereiche einer α-Amylase von B. amyloliquefaciens für die entsprechenden Bereiche einer α-Amylase von B. licheniformis substituiert wurden. Die chimeren α-Amylasen wurden mit dem Zweck des Identifizierens von Bereichen konstruiert, die für die Wärmestabilität verantwortlich sind. Es wurde gefunden, dass derartige Bereiche die Aminosäurereste 177–186 und die Aminosäurereste 255–270 der α-Amylase von B. amyloliquefaciens einschließen. Die Abänderungen von Aminosäureresten in den chimeren α-Amylasen scheint andere Eigenschaften der Enzyme als deren Wärmestabilität nicht zu beeinflussen.
WO 91/00353 offenbart α-Amylase-Mutanten, die sich von deren Ursprungs-α-amylase in mindestens einem Aminosäurerest unterscheiden. Es wird angegeben, dass die in der Patentanmeldung offenbarten α-Amylase-Mutanten aufgrund ihrer Aminosäuresubstitutionen verbesserte Eigenschaften zur Anwendung beim Abbau von Stärke und/oder bei der Textilentschlichtung zeigen. Einige der Mutanten zeigen verbesserte Stabilität, jedoch wurden keine Verbesserungen in der enzymatischen Aktivität erörtert oder angedeutet. Die einzigen veranschaulichten Mutanten werden aus einer Ursprungs-α-amylase von B. licheniformis hergestellt und tragen eine der folgenden Mutationen: H133Y oder H133Y + T149I. Eine andere vorgeschlagene Mutation ist A111T.
FR 2,676,456 offenbart Mutanten der α-Amylase von B. licheniformis, in welchen ein Aminosäurerest in der Nähe von His 133 und/oder ein Aminosäurerest in der Nähe von Ala 209 durch einen hydrophoberen Aminosäurerest ersetzt wurden. Es wird angegeben, dass die erhaltenen α-Amylase-Mutanten eine verbesserte Wärmestabilität aufweisen und in der Textil-, Papier-, Brau- und Stärkeverflüssigungsindustrie nützlich sind.
EP 285 123 offenbart ein Verfahren zum Durchführen einer statistischen Mutagenese einer Nukleotidsequenz. Beispielsweise wird eine derartige Sequenz einer Nukleotidsequenz erwähnt, die eine α-Amylase von B. stearothermophilus kodiert. Nach dem Mutieren wird eine α-Amylase-Variante mit verbesserter Aktivität bei niedrigen pH-Werten erhalten.
In keiner der vorstehenden Bezugnahmen wird erwähnt oder auch nur vorgeschlagen, dass α-Amylase-Mutanten konstruiert werden können, die verbesserte Eigenschaften in Bezug auf die Detergensindustrie aufweisen.
EP 525 610 betrifft mutante Enzyme mit verbesserter Stabilität gegenüber ionischen Tensiden (oberflächenaktiven Mitteln). Die mutanten Enzyme wurden durch Ersetzen eines Aminosäurerests im Oberflächenteil des Ursprungsenzyms durch einen anderen Aminosäurerest hergestellt. Das einzige mutante Enzym, das spezifisch in EP 525 610 beschrieben ist, ist eine Protease. Amylase wird als Beispiel für ein Enzym erwähnt, das eine verbesserte Stabilität gegenüber ionischen Tensiden erhalten kann, jedoch sind der Amylasetyp, dessen Ursprung oder spezifische Mutationen nicht spezifiziert.
WO 94/02597 offenbart α-Amylase-Mutanten, die in Gegenwart von Oxidationsmitteln verbesserte Stabilität und Aktivität zeigen. In den mutanten α-Amylasen wurde(n) ein oder mehrere Methioninreste durch andere Aminosäurereste als Cys und Met ersetzt. Es wird angegeben, dass die α-Amylase-Mutanten als Detergens- und/oder Geschirrspülzusätze sowie zum Textilentschlichten nützlich sind.
WO 94/18314 offenbart oxidativ stabile α-Amylase-Mutanten, einschließlich Mutationen in der Position M197 der α-Amylase von B. lichenformis.
EP 368 341 beschreibt die Verwendung von Pullulanase und anderen amylolytischen Enzymen, wahlweise in Kombination mit einer α-Amylase zum Waschen und Geschirrspülen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, α-Amylase-Varianten bereitzustellen, die – in Bezug auf deren Ursprungs-α-amylase – verbesserte Eigenschaften von Wichtigkeit, u.a. in Bezug auf die Leistungsfähigkeit beim Waschen und/oder Geschirrspülen der fraglichen Varianten, z.B. verbesserte Wärmestabilität, verbesserte Stabilität gegenüber Oxidation, reduzierte Abhängigkeit von Ca²⁺-Ionen und/oder verbesserte Stabilität oder Aktivität in dem pH-Bereich von Relevanz, z.B. beim Wäschewaschen oder Geschirrspülen, besitzen. Derartige α-Amylasen-Varianten weisen unter anderem den Vorteil auf, dass sie in einer niedrigeren Dosierung als deren Ursprungs-α-amylase eingesetzt werden können. Weiterhin können die α-Amylase-Varianten stärkehaltige Flecken entfernen, die nicht oder nur schwierig durch heutzutage bekannte α-Amylase-Detergensenzyme entfernt werden können.
KURZE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der Arbeit, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, war es, falls möglich, u.a. die Stabilität von bestimmten α-Amylasen, die von Bacillus-Stämmen erhältlich sind und selbst auf der Basis ihrer Leistungsfähigkeit bei der Stärkeentfernung in alkalischen Medien (wie Detergenslösungen, wie sie typischerweise beim Wäschewaschen oder Geschirrspülen eingesetzt werden) ausgewählt sind, in Bezug auf viele der gegenwärtig im Handel erhältlichen α-Amylasen zu verbessern. In diesem Zusammenhang fanden die Erfinder überraschenderweise, dass es tatsächlich möglich ist, die Eigenschaften der früher erwähnten Typen (siehe vorstehend) einer derartigen Ursprungs-α-amylase durch besonnene Modifikation von einem oder mehreren Aminosäurerest(en) in verschiedenen Bereichen der Aminosäuresequenz der Ursprungs-α-amylase zu verbessern. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesem Fund.
Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt Varianten einer Ursprungs-α-amylase, wobei die Ursprungs-α-amylase eine mindestens 80%ige Identität mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NR. 3 zeigt, wobei die Variante eine Deletion von mindestens zwei Aminosäuren umfasst, die zu R179 und G180 der in SEQ ID NR. 3 dargestellten Aminosäuresequenz äquivalent sind, wobei die Variante eine α-Amylase-Aktivität aufweist und mindestens eine der folgenden Eigenschaften in Bezug auf die Ursprungs-α-amylase zeigt: erhöhte Wärmestabilität; erhöhte Stabilität gegenüber Oxidation; und reduzierte Ca²⁺-Abhängigkeit.
Eine α-Amylase-Variante der Erfindung ist Gegenstand für die Maßgabe, dass sie eine Variante ist, die keine Aminosäuresequenz aufweist, die mit der in SEQ ID Nr. 1, in SEQ ID Nr. 2, in SEQ ID Nr. 3 oder in SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenz identisch ist.
DNA-Sequenzen, die die ersten drei der fraglichen α-Amylase-Aminosäuresequenzen kodieren, sind in SEQ ID Nr. 4 (kodierend die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte) Aminosäuresequenz, SEQ ID Nr. 5 (kodierend die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz) und SEQ ID Nr. 6 (kodierend die in SEQ ID Nr. 3 dargestellte Aminosäuresequenz) dargestellt.
Die Aminosäuresequenzen der Ursprungs-α-amylasen von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 und die entsprechenden DNA-Sequenzen (SEQ ID Nr. 4 bzw. SEQ ID Nr. 5) sind auch in WO 95/26397 (unter denselben SEQ ID Nrn. wie in der vorliegenden Anmeldung) offenbart.
Die Varianten der Erfindung weisen selbst α-Amylase-Aktivität auf und zeigen mindestens eine der folgenden Eigenschaften in Bezug auf die Ursprungs-α-amylase:
eine erhöhte Wärmestabilität, d.h. eine zufrieden stellende Bewahrung der enzymatischen Aktivität bei einer höheren Temperatur als derjenigen, die zur Verwendung mit dem Ursprungsenzym geeignet ist;
eine erhöhte Oxidationsstabilität, d.h. einen erhöhten Widerstand gegenüber dem Abbau durch Oxidationsmittel (wie Sauerstoff, oxidierende Bleichmittel und dergleichen);
eine reduzierte Ca² ⁺-Abhängigkeit, d.h. die Fähigkeit, in Gegenwart einer niedrigeren Ca² ⁺-Konzentration als im Falle der Ursprungs-α-amylase zufrieden stellend zu wirken. α-Amylasen mit einer derartigen reduzierten Ca² ⁺-Abhängigkeit sind zur Verwendung in Detergenszusammensetzungen äußerst erwünscht, da derartige Zusammensetzungen typischerweise relativ große Mengen an Substanzen (wie Phosphaten, EDTA und dergleichen) enthalten, die Calciumionen stark binden können.
Beispiele für andere erwünschte Verbesserungen oder Modifikationen von Eigenschaften (in Bezug auf die fragliche Ursprungs-α-amylase), die mit einer erfindungsgemäßen Variante erzielt werden können, sind: erhöhte Stabilität und/oder α-amylolytische Aktivität bei neutralen bis relativ hohen pH-Werten, z.B. bei pH-Werten im Bereich von 7–10,5, wie im Bereich von 8,5 bis 10,5;
erhöhte α-amylolytische Aktivität bei relativ hohen Temperaturen, z.B. Temperaturen im Bereich von 40–70°C;
Erhöhung oder Verminderung des isoelektrischen Punkts (pI) derart, dass der pI-Wert der fraglichen α-Amylase-Variante mit dem pH-Wert des Mediums (z.B. einem Wäschewaschmedium, Geschirrspülmedium oder Textilentschlichtungsmedium), in welchem die Variante einzusetzen ist (siehe nachstehend), besser übereinstimmt; und
verbesserte Bindung eines bestimmten Substrattyps, verbesserte Spezifität gegenüber einem Substrat und/oder verbesserte Spezifität in Bezug auf die Abspaltung (Hydrolyse) des Substrats.
Eine Aminosäuresequenz wird als X% homolog zu der Ursprungs-α-amylase betrachtet, wenn ein Vergleich der entsprechenden Aminosäuresequenzen, durchgeführt über bekannte Algorithmen, wie demjenigen beschrieben von Lipman und Pearson in Science 227 (1985) S. 1435, eine Identität von X% zeigt. Das GAP-Computerprogramm des GCG-Pakets, Version 7.3 (Juni 1993), kann geeigneterweise verwendet werden, wobei Vorgabewerte für GAP-Strafen eingesetzt werden [Genetic Computer Group (1991) Programme Manual fort he GCG Package, Version 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711].
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll „verbesserte Leistungsfähigkeit", wie in Verbindung mit dem Waschen und Geschirrspülen verwendet, wie schon vorstehend angegeben, eine verbesserte Entfernung von stärkehaltigen Flecken, d.h. Flecken, die Stärke enthalten, während des Waschens bzw. Ge schirrspülens, bedeuten. Die Leistungsfähigkeit kann in herkömmlichen Wasch- und Geschirrspülversuchen bestimmt und die Verbesserung als Vergleich mit der Leistungsfähigkeit der fraglichen Ursprungs-α-amylase bewertet werden. Ein Beispiel für einen klein angelegten „Mini-Geschirrspültest", der als Indikator für die Leistungsfähigkeit beim Waschen verwendet werden kann, ist im nachstehenden Experimentalteil beschrieben.
Es ist klar, dass eine Vielfalt von verschiedenen Eigenschaften einer α-Amylase-Variante, einschließlich spezifische Aktivität, Substratspezifität, K_m (die so genannte „Michaelis-Konstante" in der Michaelis-Menten-Gleichung), V_max [die maximale Geschwindigkeit (Plateauwert) der Umwandlung eines vorgegebenen Substrats, bestimmt auf der Basis der Michaelis-Menten-Gleichung], pI, pH-Optimum, Temperaturoptimum, Wärmeaktivierung, Stabilität gegenüber Oxidationsmitteln oder oberflächenaktiven Mitteln (z.B. in Detergenzien) usw., allein oder in Kombination, zur verbesserten Leistungsfähigkeit beitragen kann. Dem Fachmann ist bewusst, dass die Leistungsfähigkeit der Variante nicht allein auf der Basis der vorstehenden Eigenschaften vorhergesagt werden kann, sondern von Tests der Leistungsfähigkeit beim Waschen und/oder Geschirrspülen begleitet sein sollte.
In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung ein DNA-Konstrukt, umfassend eine eine α-Amylase-Variante der Erfindung kodierende DNA-Sequenz, einen rekombinanten das DNA-Konstrukt tragenden Expressionsvektor, eine mit dem DNA-Konstrukt oder dem Vektor transformierte Zelle, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer α-Amylase-Variante durch Züchten einer derartigen Zelle unter für die Herstellung der α-Amylase-Variante förderlichen Bedingungen, wonach die α-Amylase-Variante aus der Kultur gewonnen wird.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Variante einer Ursprungs-α-amylase, die aufgrund ihrer wie vorstehend beschriebenen verbesserten Eigenschaften verglichen mit der Ursprungs-α-amylase eine verbesserte Leistungsfähigkeit beim Waschen und/oder Geschirrspülen zeigt. Das Verfahren umfasst:

a) Konstruieren einer Zellpopulation, die die Varianten der Ursprungs-α-amylase kodierende Gene enthält,
b) Durchmustern der Zellpopulation auf α-Amylase-Aktivität unter zumindest eine Bedingung beim Waschen und/oder Geschirrspülen simulierenden Bedingungen,
c) Isolieren einer Zelle aus der Population, die ein Gen enthält, das eine Variante der Ursprungs-α-amylase kodiert, die verglichen mit der Ursprungs-α-amylase unter den in Schritt b) ausgewählten Bedingungen eine verbesserte Aktivität aufweist,
d) Züchten der in Schritt c) isolierten Zelle unter geeigneten Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium, und
e) Gewinnen der α-Amylase-Variante aus der in Schritt d) erhaltenen Kultur.

Die Erfindung betrifft auch eine Variante (bei welcher es sich um eine erfindungsgemäße Variante handelt), die durch das letztere Verfahren hergestellt wur de.
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff „mindestens eine Bedingung beim Waschen und/oder Geschirrspülen simulierend" bedeuten, dass er eine Simulation z.B. der Temperatur oder des pH-Werts, die/der während des Waschens oder Geschirrspülens vorherrscht, oder der bei der Wasch- oder Geschirrspülbehandlung zu verwendenden chemischen Zusammensetzung einer Detergenszusammensetzung angibt. Der Begriff „chemische Zusammensetzung" soll einen, oder eine Kombination von zwei oder mehreren Bestandteilen der fraglichen Detergenszusammensetzung einschließen. Die Bestandteile einer Anzahl von verschiedenen Detergenszusammensetzungen sind weiter nachstehend aufgelistet.
Die in Schritt a) genannte „Zellpopulation" kann geeigneterweise durch Klonieren einer eine Ursprungs-α-amylase kodierenden DNA-Sequenz und Unterziehen der DNA einer wie hier beschriebenen stellengerichteten oder statistischen Mutagenese konstruiert werden.
Im vorliegenden Zusammenhang wird der Begriff „Variante" austauschbar mit dem Begriff „Mutante" verwendet. Der Begriff „Variante" soll Hybrid-α-amylasen, d.h. α-Amylasen, die Teile von mindestens zwei verschiedenen α-amylolytischen Enzymen umfassen, einschließen. So kann ein derartiges Hybrid z.B. aus einem oder mehreren jeweils von einer wie schon vorstehend definierten Variante abgeleiteten Teil(en) oder einem oder mehreren jeweils von einer schon vorstehend definierten Variante abgeleiteten Teil(en) und einem oder mehreren jeweils von einer unmodifizierten Ursprungs-α-amylase abgeleiteten Teil(en) konstruiert werden. In diesem Zusammenhang betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Hybrid-α-Amylase mit verglichen mit beliebigen ihrer Enzymbestandteile (d.h. verglichen mit beliebigen der Enzyme, die zu einem Teil des Hybrids beitragen) verbesserter Leistungsfähigkeit beim Waschen und/oder Geschirrspülen, wobei das Verfahren umfasst:

a) Rekombinieren in vivo oder in vitro des N-terminalen kodierenden Bereichs eines α-Amylase-Gens oder einer entsprechenden cDNA von einer der konstituierenden α-Amylasen mit dem C-terminalen kodierenden Bereich eines α-Amylase-Gens oder einer entsprechenden cDNA einer anderen konstituierenden α-Amylase unter Bildung von Rekombinanten,
b) Auswählen von Rekombinanten, die verglichen mit beliebigen ihrer konstituierenden α-Amylasen eine Hybrid-α-Amylase mit verbesserter Leistungsfähigkeit beim Waschen und/oder Geschirrspülen herstellen,
c) Züchten von in Schritt b) ausgewählten Rekombinanten unter geeigneten Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium und
d) Gewinnen der Hybrid-α-Amylase aus der in Schritt c) erhaltenen Kultur.

In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung die Verwendung einer α-Amylase-Variante der Erfindung [einschließlich einer beliebigen Variante oder eines beliebigen Hybrids, die/das durch eines der vorstehend erwähnten Verfahren hergestellt wurde] als Detergensenzym, insbesondere zum Waschen oder Geschirrspülen, einen Detergenszusatz und eine Detergenszusammensetzung, umfassend die α-Amylase-Variante, und die Verwendung einer α-Amylase-Variante der Erfindung zum Textilentschlichten.
Eine statistische Mutagenese kann zum Bilden von erfindungsgemäßen Varianten verwendet werden, und die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung einer Variante einer Ursprungs-α-amylase, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Unterziehen einer die Ursprungs-α-amylase kodierenden DNA-Sequenz einer statistischen Mutagenese,
(b) Exprimieren der in Schritt (a) erhaltenen, mutierten DNA-Sequenz in einer Wirtszelle, und
(c) Durchmustern auf Wirtszellen, die ein mutiertes amylolytisches Enzym exprimieren, das verglichen mit der Ursprungs-α-amylase wie vorstehend beschriebene verbesserte Eigenschaften (z.B. Eigenschaften wie verminderte Calciumabhängigkeit, erhöhte Oxidationsstabilität, erhöhte Wärmestabilität und/oder verbesserte Aktivität bei relativ hohem pH-Wert) aufweist.

DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Nomenklatur
In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen werden die herkömmlichen Einbuchstabenkodes für Nukleotide und die herkömmlichen Einbuchstaben- und Dreibuchstabenkodes für Aminosäurereste verwendet. Zur Leichtigkeit der Bezugnahme sind α-Amylase-Varianten der Erfindung durch die Verwendung der folgenden Nomenklatur beschrieben:
Ursprüngliche Aminosäure(n):Position(en):substituierte Aminosäure(n)
Gemäß dieser Nomenklatur und beispielsweise ist die Substitution von Alanin für Asparagin in Position 30 dargestellt als:
Ala 30 Asn oder A30N
ist eine Deletion von Alanin in derselben Position dargestellt als:
Ala 30* oder A30*
und ist eine Einfügung eines zusätzlichen Aminosäurerests, wie Lysin, dargestellt als:
Ala 30 AlaLys oder A30AK
Eine Deletion einer fortlaufenden Länge von Aminosäureresten, veranschaulicht durch die Aminosäurereste 30–33, ist als (30–33)^* angegeben.
Wo eine spezifische α-Amylase eine verglichen mit anderen α-Amylasen „Deletion" enthält (d.h. ein Aminosäurerest fehlt) und eine Einfügung in einer derartigen Position durchgeführt wurde, wird dies angegeben als:
*36 Asp oder *36D
für eine Einfügung einer Aspartamsäure in Position 36.
Mehrfache Mutationen werden durch Pluszeichen getrennt, d.h.:
Ala 30 Asp + Glu 34 Ser oder A30N+E34S,
wodurch Mutationen in den Positionen 30 und 34 dargestellt werden (in welchen Alanin und Glutaminsäure ersetzen, d.h. für Asparagin bzw. Serin substituiert sind).
Falls ein oder mehrere alternative Aminosäurereste in eine vorgegebene Position eingefüngt werden kann (können), wird dies angegeben als:
A30N,E oder
A30N oder A30E
Weiterhin ist es klar, dass wenn eine zur Modifikation geeignete Position hier angegeben ist, ohne dass eine spezifische Modifikation vorgeschlagen wurde, ein beliebiger anderer Aminosäurerest für den in dieser Position vorliegenden Aminosäurerest substituiert sein kann (d.h. ein beliebiger anderer Aminosäurerest als derjenige, der normalerweise in der fraglichen Position vorliegt – ausgewählt unter A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y und V). So ist es klar, dass wenn z.B. eine Modifikation (ein Ersatz) eines Methionins in Position 202 erwähnt, jedoch nicht spezifiziert ist, jede beliebige der anderen Aminosäuren für das Methionin, d.h. jede beliebige andere Aminosäure, ausgewählt aus A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, F, P, S, T, W, Y und V, substituiert sein kann.
Die Ursprungs-α-amylase
Wie schon angegeben wird eine α-Amylase-Variante der Erfindung sehr geeignet auf der Basis einer Ursprungs-α-amylase mit einer der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 bzw. SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen hergestellt (siehe nachstehend).
Die Ursprungs-α-amylasen mit den in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenzen sind von alkaliphilen Bacillus-Stämmen (Stamm NCIB 12512 bzw. Stamm NCIB 12513) erhältlich, wobei beide davon detailliert in EP 0 277 216 B1 beschrieben sind. Die Herstellung, Reinigung und Sequenzierung dieser beiden Ursprungs-α-amylasen ist in WO 95/26379 beschrieben [siehe den Experimentalteil hier (siehe nachstehend)].
Die Ursprungs-α-amylase der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz ist von Bacillus stearothermophilus erhältlich und unter anderem in J. Bacteriol. 166 (1986) S. 635–643 beschrieben.
Die Ursprungs-α-amylase mit der in SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenz (die dieselbe Sequenz wie diejenige mit der Nummer 4 in 1 ist) ist von einem Bacillus sp. #707" erhältlich und von Tsukamoto et al. in Biochem. Biophys. Res. Commun. 151 (1988) S. 25–31 beschrieben.
Abgesehen von Varianten der vorstehend beschriebenen Ursprungs-α-amylasen mit den in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 bzw. SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen schließen andere interessante erfindungsgemäße Varianten Varianten von Ursprungs-α-amylasen ein, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die einen hohen Homologiegrad wie eine mindestens 80%ige Homologie, erwünschtermaßen mindestens 85%ige Homologie und stärker bevorzugt mindestens 90%ige Homologie, z.B. ≥95%ige Homologie mit mindestens einer der letzteren 4 Aminosäuresequenzen aufweisen.
Wie schon vorstehend angegeben, handelt es sich bei weiteren Kriterien zum Identifizieren einer geeigneten Ursprungs-α-amylase darum: a) dass die α-Amylase eine immunologische Kreuzreaktion mit einem Antikörper zeigt, der gegen eine α-Amylase mit einer der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 bzw. SEQ ID NR. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen bereitegestellt wurde, und/oder b) dass die α-Amylase durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, die mit derselben Sonde wie eine DNA-Sequenz hybridisiert, die eine α-Amylase mit einer der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 bzw. SEQ ID NR. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen kodiert.
Wie schon erwähnt, können Aminosäuresequenzvergleiche in Bezug auf die Bestimmung des Homologiegrads von Polypeptiden (wie Enzymen) unter Verwendung von Algorithmen wie demjenigen, beschrieben von Lipman und Pearson (1985), durchgeführt werden.
Tests auf die immunologische Kreuzreaktivität können unter Verwendung eines Antikörpers durchgeführt werden, der gegen mindestens ein Epitop der α-Amylase mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz oder der α-Amylase mit der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder der α-Amylase mit der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz oder der α-Amylase mit der in SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenz bereitgestellt wurde oder damit reaktiv ist.
Der Antikörper, der entweder monoklonal oder polyklonal sein kann, kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, z.B. wie beschrieben von Hudson et al. (1989) hergestellt werden. Beispiele für geeignete auf dem Fachgebiet bekannte Testtechniken schließen Western-Blotten und Radial-Immundiffusions-Test, z.B. wie beschrieben von Hudson et al. (1989), ein.
Die Oligonukleotidsonde zur Verwendung bei der Identifikation von geeigneten α-Amylasen auf der Basis der Sondenhybridisierung [vorstehendes Kriterium b)] kann z.B. geeigneterweise auf der Basis der vollständigen oder teilweisen Aminosäuresequenz einer α-Amylase mit einer der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 bzw. SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenzen oder auf der Basis der diesen entsprechenden vollständigen oder teilweisen Nukleotidsequenz hergestellt werden.
Geeignete Bedingungen für das Testen der Hybridisierung bedingen das vorherige Eintauchen und Vorhybridisieren für eine Dauer von 1 Std. bei –40°C in eine Lösung von 20% Formamid, 5× Denhardt-Lösung, 50 mM Natriumphosphatlösung, pH 6,8, und 50 μg denaturierter mit Ultraschall behandelter Kälberthymus-DNA, gefolgt von Hybridisierung in derselben Lösung, ergänzt mit 100 μM ATP für eine Dauer von 18 Std. bei –40°C,0 oder die Verwendung von anderen Verfahren, die z.B. von Sambrook et al. (1989) beschrieben sind.
Einfluss von Mutationen auf bestimmte Eigenschaften
Aus den durch die Erfinder erhaltenen Ergebnissen scheint es, dass Veränderungen einer bestimmten Eigenschaft, z.B. der Wärmestabilität oder Oxidationsstabilität, die von einer Variante in Bezug auf die fragliche Ursprungs-α-amylase gezeigt wird, zu einem deutlichen Grad mit dem Typ und der Positionierung einer (von) Mutation(en) (Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -einfügungen) in der Variante in Beziehung gesetzt werden können. Es sollte jedoch klar sein, dass die Beobachtung, dass eine bestimmte Mutation oder ein bestimmtes Muster von Mutationen zu Veränderungen einer vorgegebenen Eigenschaft führt, keinesfalls die Möglichkeit ausschließt, dass die fragliche(n) Mutation(en) auch andere Eigenschaften beeinflussen kann (können).
Oxidationsstabilität: In Bezug auf die Erhöhung der Oxidationsstabilität einer α-Amylase-Variante in Bezug auf ihre Ursprungs-α-amylase scheint es besonders erwünscht zu sein, dass mindestens ein und vorzugsweise mehrere oxidierbare Aminosäurerest(e) des Ursprungs deletiert oder durch einen anderen Aminosäurerest, der weniger oxidationsempfindlich als der ursprüngliche oxidierbare Aminosäurerest ist, ersetzt (d.h. substituiert) worden ist (sind).
Besonders relevante oxidierbare Aminosäurereste in diesem Zusammenhang sind Cystein, Methionin, Tryptophan und Tyrosin. So ist z.B. zu erwarten, dass im Falle von Cystein enthaltenden Ursprungs-α-amylasen eine Deletion von Cysteinresten oder Substitution davon durch weniger oxidierbare Aminosäurereste beim Erhalt von Varianten mit verbesserter Oxidationsstabilität in Bezug auf die Ursprungs-α-Amylase wichtig ist.
Im Falle der vorstehend erwähnten Ursprungs-α-amylasen mit den in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 bzw. SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen, wobei alle davon keine Cysteinreste, jedoch einen beträchtlichen Methioningehalt aufweisen, ist die Deletion oder Substitution von Methioninresten in Bezug auf das Erzielen einer verbesserten Oxidationsstabilität der erhaltenen Varianten besonders relevant. So scheint eine Deletion oder Substitution [z.B. durch Threonin (T) oder durch eine der anderen vorstehend aufgelisteten Aminosäuren] von einem oder mehreren der Methioninreste in den Positionen M9, M10, M105, M202, M208, M261, M309, M382, M430 und M440 der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen und/oder in Position M323 der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz (oder Deletion oder Substitution von Methioninresten in äquivalenten Positionen in der Sequenz einer anderen α-Amylase, die eines der anderen Kriterien für eine vorstehend erwähnte Ursprungs-α-Amylase erfült) in Bezug auf das Erhöhen der Oxidationsstabilität besonders wirksam zu sein.
Im Falle einer Ursprungs-α-amylase mit der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz schließen relevante Aminosäurereste, die im Hinblick auf die Verbesserung der Oxidationsstabilität deletiert oder substituiert werden können, den einzelnen Cysteinrest (C363) und – analog zu den in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3 dargestellten Sequenzen – die Methioninreste, die in den Positionen M8, M9, M96, M200, M206, M284, M307, M311, M316 und M438 lokalisiert sind, ein.
In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff „äquivalente Position" eine Position, die auf der Basis eines Abgleichs der Aminosäuresequenz der fraglichen Ursprungs-α-amylase mit der Aminosäuresequenz der fraglichen „Bezugs-"α-Amylase (z.B. der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Sequenz) derart, dass ein Nebeneinanderstellen der Aminosäurerestemereiche, die beide gemein haben, besonders eng einer bestimmten Position in der fraglichen Bezugssequenz (z.B. durch Belegung mit demselben Aminosäurerest wie diese) entspricht.
Besonders interessante Mutationen in Zusammenhang mit der (Verbesserung) der Oxidationsstabilität der α-Amylasen mit den in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 bzw. SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen sind eine oder mehrere der folgenden Methioninsubstitutionen (oder Äquivalente davon in den Aminosäuresequenzen von anderen α-Amylasen, die die Erfordernisse einer Ursprungs-α-amylase in Zusammenhang mit der Erfindung erfüllen): M202A,R,N,D,Q,E,G,H,I,L,K,F,P,S,T,W,Y,V.
Weitere relevante Methioninsubstitutionen in der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz sind: M323A,R,N,D,Q,E,G,H,I,L,K,F,P,S,T,W,Y,V.
Besonders interessante Mutationen in Zusammenhang mit der Modifikation (Verbesserung) der Oxidationsstabilität der α-Amylase mit der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz sind eine oder mehrere der folgenden Methioninsubstitutionen:
M200A,R,N,D,Q,E,G,H,I,L,K,F,P,S,T,W,Y,V;
M311A,R,N,D,Q,E,G,H,I,L,K,F,P,S,T,W,Y,V; und
M316A,R,N,D,Q,E,G,H,I,L,K,F,P,S,T,W,Y,V.
Wärmestabilität: In Bezug auf das Erhöhen der Wärmestabilität einer α-Amylase-Variante in Bezug auf ihre Ursprungs-α-amylase scheint es besonders erwünscht zu sein, mindestens einen, und vorzugsweise zwei oder sogar drei der folgenden Aminosäurereste in der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz (oder ihre Äquivalente) zu deletieren: F180, R181, G182, T183, G184 und K185. Die entsprechenden besonders relevanten (und äquivalenten) Aminosäurereste in den in SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 bzw. SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen sind: F180, R181, G182, D183, G184 und K185 (SEQ ID Nr. 2); F178, R179, G180, I181, G182 und K183 (SEQ ID Nr. 3); und F180, R181, G182, H183, G184 und K185 (SEQ ID Nr. 7).
Besonders interessante paarweise Deletionen dieses Typs lauten wie folgt:
R181* + G182*; und 7183* + G184* (SEQ ID Nr. 1);
R181* + G182*; und D183* + G184* (SEQ ID Nr. 2);
R179* + G180*; und 1181* + G182* (SEQ ID Nr. 3); und
R181* + G182; und H183* + G184* (SEQ ID Nr. 7.).
(oder Äquivalente dieser paarweisen Deletionen in einer anderen α-Amylase, die die Erfordernisse einer Ursprungs-α-amylase in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung erfüllen).
Andere Mutationen, die in Zusammenhang mit der Wärmestabilität wichtig zu sein scheinen, sind Substitutionen von einem oder mehreren der Aminosäurereste von P260 bis 1275 in der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Sequenz (oder Äquivalente davon in einer anderen Ursprungs-α-amylase in Zusammenhang mit der Erfindung), wie eine Substitution des Lysinrests in Position 269.
Beispiele für spezifische Mutationen, die in Zusammenhang mit der Wärmestabilität einer α-Amylase-Variante in Bezug auf die fragliche Ursprungs-α-amylase wichtig zu sein scheinen, sind eine oder mehrere der folgenden Substitutionen in der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz (oder Äquivalente davon in einer anderen Ursprungs-α-amylase in Zusammenhang mit der Erfindung): K269R; P260E; R124P; M105F,I,L,V; M208F,W,Y; L2171; V206I,L,F.
Für die Ursprungs-α-amylase mit der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz sind wichtige weitere (äquivalente) Mutationen dementsprechend eine oder mehrere der Substitutionen: M105F,I,L,V; M208F,W,Y; L217I; V2061,L,F; und K269R.
Für die Ursprungs-α-amylase mit der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz sind wichtige weitere (äquivalente) Mutationen dementsprechend eine oder beide der Substitutionen: M206F,W,Y; und L2151.
Für die Ursprungs-α-amylase mit der in SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenz sind wichtige weitere (äquivalente) Mutationen dementsprechend eine oder mehrere der Substitutionen: M105F,I,L,V; M208F,W,Y; L217I; und K269R.
Noch weitere Beispiele für Mutationen, die unter anderem beim Erzielen einer verbesserten Wärmestabilität einer α-Amylase-Variante in Bezug auf die fragliche Ursprungs-α-amylase wichtig zu sein scheinen, sind eine oder mehrere der folgenden Substitutionen in den in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen (oder Äquivalente davon in einer anderen Ursprungs-α-amylase in Zusammenhang mit der Erfindung): A354C + V479C; L351C + M430C; N457D,E + K385R; L355D,E + M430R,K; L355D,E + 1411R,K; und N457D,E.
Ca²⁺-Abhängigkeit: In Bezug auf das Erzielen einer verminderten Ca²⁺-Abhängigkeit einer α-Amylase-Variante in Bezug auf ihre Ursprungs-α-amylase [d.h. in Bezug auf den Erhalt einer Variante, die in Gegenwart einer niedrigeren Calciumionenkonzentration in einem Fremdmedium, als es für das Ursprungsenzym nötig ist, eine zufrieden stellende amylolytische Aktivität zeigt und deshalb z.B. weniger empfindlich als der Ursprung für Calciumionen-vermindernde Bedingungen, wie diejenigen, die in Calciumkomplexierungsmittel (wie bestimmte Detergensgerüststoffe) enthaltenden Medien erhalten werden, scheint es besonders erwünscht zu sein, eine oder mehrere der folgenden Substitutionen in die in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen (oder eine äquivalente Substitution in eine andere Ursprungs-α-amylase in Zusammenhang mit der Erfindung) einzubringen: Y243F, K108R, K179R, K239R, K242R, K269R, D163N, D188N, D192N, D199N, D205N, D207N, D209N, E190Q, E194Q und N106D.
Im Falle der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz scheinen besonders erwünschte Substitutionen dementsprechend (äquivalent) eine oder mehrere der folgenden zu sein: K107R, K177R, K237R, K240R, D162N, D186N, D190N, D197N, D203N, D205N, D207N, E188Q und E192Q.
Ebenso wie die vorstehend erwähnten Ersetzungen von D-Resten mit N-Resten oder von E-Resten mit Q-Resten sind andere relevante Substitutionen in Zusammenhang mit dem Reduzieren der Ca² ⁺-Abhängigkeit der Ersatz des fraglichen D- und/oder E-Rests mit einem beliebigen anderen Aminosäurerest.
Weitere Substitutionen, die in Zusammenhang mit dem Erzielen einer reduzierten Ca² ⁺-Abhängigkeit wichtig zu sein scheinen, sind paarweise Substitutionen der Aminosäurereste, die an den Positionen 113 und 151 und Positionen 351 und 430 in den in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen und an den Positionen 112 und 150 und Positionen 349 und 428 in der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz vorliegen (oder äquivalente paarweise Substitutionen in einer anderen Ursprungs-α-amylase in Zusammenhang mit der Erfindung), d.h. paarweise Substitutionen der folgenden Aminosäurereste:
G113 + N151 (in Bezug auf SEQ ID Nr. 1); A113 + T151 (in Bezug auf SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 7); und G112 + T150 (in Bezug auf SEQ ID Nr. 3); und
L351 + M430 (in Bezug auf SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 7); und L349 + I428 (in Bezug auf SEQ ID Nr. 3).
Besonders interessante paarweise Substitutionen dieses Typs in Bezug auf das Erzielen einer verminderten Ca² ⁺-Abhängigkeit sind die folgenden:
G113T + N151I (in Bezug auf SEQ ID Nr. 1); A113T + T151I (in Bezug auf SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 7); und G112T + T150I (in Bezug auf SEQ ID Nr. 3); und
L351C + M430C (in Bezug auf SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 7); und L349C + 1428C (in Bezug auf SEQ ID Nr. 3).
In Zusammenhang mit den Substitutionen von Relevanz für die Ca²⁺-Abhängigkeit sind einige andere Substitutionen, die beim Stabilisieren der Enzymkonformation wichtig zu sein scheinen und von welchen erwogen wird, dass sie dies z.B. durch Verbessern der Bindungsstärke oder der Retention von Calciumionen an oder in der Calciumbindungsstelle mit dem α-amylolytischen Enzym erzielen, eine oder mehrere der folgenden Substitutionen in den in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen (oder eine äquivalente Substitution in einer anderen Ursprungs-α-amylase in Zusammenhang mit der Erfindung): G304W,F,Y,R,I,L,V,Q,N; G305A,S,N,D,Q,E,R,K; und H408Q,E.
Entsprechende (äquivalente) Substitutionen in der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz sind: G302W,F,Y,R,I,L,V,Q,N; und G303A,S,N,D,Q,E,R,K.
Weitere Mutationen, die in Zusammenhang mit dem Erzielen einer reduzierten Ca² ⁺-Abhängigkeit wichtig zu sein scheinen, sind paarweise Deletionen von Aminosäuren (d.H. Deletion von zwei Aminosäuren) an Positionen, ausgewählt unter R181, G182, T183 und G184 in der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz (oder äquivalente Positionen in der Aminosäuresequenz einer anderen α-Amylase, die die Erfordernisse einer Ursprungs-α-amylase in Zusammenhang mit der Erfindung erfüllt). Derartige paarweise Deletionen sind folglich die folgenden:

R181* + G182*; T182* + G184*; R181* + T183*; G182* + T183*;
G182* + G184*; und R181* + G184* (SEQ ID Nr. 1);

R181* + G182*; D183* + G184*; R181* + D183*; G182* + D183*;
G182* + G184*; und R181* + G184* (SEQ ID Nr. 2);

R179* + G180*; 1181* + G182*; R179* + 1181*; G180* + 1181*;
G180* + G182*; und R179* + G182* (SEQ ID Nr. 3); und

R181* + G182*; H183* + G184*; R181* + H183*; G182* + H183*;
G182* + G184*; und R181* + G184* (SEQ ID Nr. 7);

(oder Äquivalente dieser paarweisen Deletionen in einer anderen α-Amylase, die die Erfordernisse einer Ursprungs-α-amylase in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung erfüllt).
Isoelektrischer Punkt (pI): Vorläufige Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Leistungsfähigkeit beim Waschen, z.B. die Leistungsfähigkeit beim Wäschewaschen einer α-Amylase optimal ist, wenn der pH-Wert der Waschlauge (des Waschmediums) eng an dem pI-Wert der fraglichen α-Amylase liegt. Es ist folglich erwünscht, falls geeignet, eine α-Amylase-Variante mit einem isoelektrischen Punkt (pI-Wert) herzustellen, der mit dem pH-Wert eines Mediums (wie eines Waschmediums), in welchem das Enzym einzusetzen ist, besser übereinstimmt als der isoelektrische Punkt der fraglichen Ursprungs-α-amylase.
In Bezug auf das Vermindern des isoelektrischen Punkts schließen bevorzugte Mutationen in der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz eine oder mehrere der folgenden Substitutionen ein: Q88E, R124P, S154D, T183D, V222E, P260E, R310A, Q348E, Q391E, N437E, K444Q und R452H. Geeignete Kombinationen dieser Substitutionen in Zusammenhang mit dem Vermindern des isoelektrischen Punkts schließen ein: Q391E + K444Q; und Q391E + K444Q + S154D.
Dementsprechend schließen bevorzugte Mutationen in der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz in Bezug auf das Vermindern des isoelektrischen Punkts eine oder mehrere der folgenden Substitutionen ein: L85E, S153D, 1181D, K220E, P258E, R308A, P344E, Q358E und S435E.
In Bezug auf das Erhöhen des isoelektrischen Punkts schließen bevorzugte Mutationen in der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz eine oder mehrere der folgenden Substitutionen ein: E86Q,L; D154S; D183T,I; E222V,K; E260P; A310R; E346Q,P; E437N,S; und H452R.
Im nachstehenden Experimentalteil ist die Konstruktion einer Anzahl an erfindungsgemäßen Varianten beschrieben.
α-Amylase-Varianten der Erfindung sind, abgesehen davon, dass sie eine oder mehrere, wie vorstehend erörterte, verbesserte Eigenschaften aufweisen, vorzugsweise derart, dass sie eine höhere Stärkehydrolysegeschwindigkeit bei geringen Substratkonzentrationen als die Ursprungs-α-amylase aufweisen. Alternativ dazu ist eine α-Amylase-Variante der Erfindung vorzugsweise eine, die einen höheren V_max und/oder einen niedrigeren K_m als die Ursprungs-α-amylase aufweist, wenn sie unter denselben Bedingungen getestet wird. Im Falle einer Hybrid-α-amylase sollte die für den Vergleich zu verwendende „Ursprungs-α-amylase" diejenige der konstituierenden Enzyme mit der besten Leistungsfähigkeit sein.
V_max und K_m (Parameter der Michaelis-Menten-Gleichung) können durch bekannte Verfahren bestimmt werden.
Verfahren der Herstellung von α-Amylase-Varianten
Etliche Verfahren zum Einbringen von Mutationen in Gene sind auf dem Fachgebiet bekannt. Nach einer kurzen Erörterung des Klonierens von α-Amylasekodierenden DNA-Sequenzen werden Verfahren zum Bilden von Mutationen an spezifischen Stellen in der α-Amylase-kodierenden Sequenz erörtert.
Klonieren einer eine α-Amylase kodierenden DNA-Sequenz
Die eine Ursprungs-α-amylase kodierende DNA-Sequenz kann aus einer beliebigen Zelle oder, einem beliebigen Mikroorganismus, die/der die fragliche α-Amylase herstellt, unter Verwendung von verschiedenen auf dem Fachgebiet be kannten Verfahren isoliert werden. Zuerst sollte eine genomische DNA- und/oder cDNA-Bibliothek unter Verwendung von chromosomaler DNA oder Boten-RNA von dem Organismus, der die zu untersuchende α-Amylase herstellt, konstruiert werden. Dann, wenn die Aminosäuresequenz der α-Amylase bekannt ist, können homologe, markierte Oligonukleotidsonden synthetisiert und zum Identifizieren von α-Amylase-kodierenden Klonen aus einer von dem fraglichen Organismus hergestellten genomischen Bibliothek verwendet werden. Alternativ dazu könnte eine markierte Oligonukleotidsonde, die zu einem bekannten α-Amylase-Gen homologe Sequenzen enthält, als Sonde zum Identifizieren von α-Amylase-kodierenden Klonen unter Verwendung von Hybridisierungs- und Waschbedingungen mit niedrigerer Stringenz verwendet werden.
Noch ein anderes Verfahren zum Identifizieren von α-Amylase-kodierenden Klonen würde das Einfügen von Fragmenten von genomischer DNA in einen Expressionsvektor, wie ein Plasmid, Transformieren von α-Amylase-negativen Bakterien mit der erhaltenen genomischen DNA-Bibliothek und dann Aufstreichen der transformierten Bakterien auf ein Substrat für α-Amylase enthaltendes Agar, wodurch man die Klone die zu identifizierende α-Amylase exprimieren lässt, einbeziehen.
Alternativ dazu kann die das Enzym kodierende DNA-Sequenz synthetisch durch etablierte Standardverfahren, z.B. das Phosphoamidit-Verfahren, beschrieben von S.L. Beaucage und M.H. Caruthers (1981), oder das Verfahren, beschrieben von Matthes et al. (1984), hergestellt werden. Im Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonukleotide z.B. in einer automatischen DNA-Syntheseapparatur synthetisiert, gereinigt, verbunden, ligiert und in geeignete Vektoren kloniert.
Schließlich kann die DNA-Sequenz gemischten genomischen und synthetischen Ursprungs, gemischten synthetischen und cDNA-Ursprungs oder gemischten genomischen und cDNA-Ursprungs, hergestellt durch Ligieren von Fragmenten synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (wie geeignet, wobei die Frag mente den verschiedenen Teilen der gesamten DNA-Sequenz entsprechen) gemäß Standardtechniken, sein. Die DNA-Sequenz kann auch durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von spezifischen Primern, z.B. wie beschrieben in US 4,683,202 oder R.K. Saiki et al. (1988), hergestellt werden.
Stellengerichtete Mutagenese
Nachdem eine α-Amylase-kodierende DNA-Sequenz isoliert wurde und erwünschte Stellen zur Mutation identifiziert wurden, können Mutationen unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden eingebracht werden. Diese Oligonukleotide enthalten Nukleotidsequenzen, die die gewünschten Mutationsstellen eingrenzen; mutante Nukleotide werden während der Oligonukleotidsynthese eingefügt. In einem spezifischen Verfahren wird eine die α-Amylase-kodierende Sequenz verbrückende Einzelstrang-Lücke von DNA in einem das α-Amylase-Gen tragenden Vektor gebildet. Dann wird das die gewünschte Mutation tragende synthetische Nukleotid an ein homologes Teil der Einzelstrang-DNA verbunden. Die verbleibende Lücke wird dann mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) gefüllt und das Konstrukt unter Verwendung von T4-Ligase ligiert. Ein spezifisches Beispiel für dieses Verfahren ist in Morinaga et al. (1984) beschrieben. US 4,760,025 offenbart die Einbringung von mehrfache Mutationen kodierenden Oligonukleotiden durch Durchführen von geringfügigen Abänderungen der Kassette. Jedoch kann eine noch größere Vielfalt an Mutationen zu jedem beliebigen Zeitpunkt durch das Morinaga-Verfahren eingebracht werden, da eine große Anzahl an Oligonukleotiden von verschiedenen Längen eingebracht werden kann.
Ein anderes Verfahren des Einbringens von Mutationen in α-Amylase-kodierende DNA-Sequenzen ist in Nelson und Long (1989) beschrieben. Es bezieht die 3-stufige Bildung eines PCR-Fragments ein, das die gewünschte Mutation enthält, die unter Verwendung eines chemisch synthetisierten DNA-Strangs als einer der Primer in den PCR-Reaktionen eingebracht wurde. Aus dem durch PCR gebildeten Fragment kann ein die Mutation tragendes DNA-Fragment durch Spaltung mit Restriktionsendonukleasen isoliert und erneut in ein Expressionsplasmid eingefügt werden.
Statistische Mutagenese
Statistische Mutagenese wird geeigneterweise entweder als lokalisierte oder bereichsspezifische statistische Mutagenese in mindestens drei Teilen des Gens, das zu der fraglichen dargestellten Aminosäuresequenz translatiert, oder im gesamten Gen, durchgeführt.
Für eine bereichsspezifische statistische Mutagenese im Hinblick auf die Verbesserung der Wärmestabilität können insbesondere die folgenden Kodon-Positionen geeignet angezielt werden (unter Verwendung von einbuchstabigen Aminosäureabkurzungen und der Nummerierung der Aminosäurereste in der fraglichen Sequenz):
In der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz:

120–140 = VEVNRSNRNQETSGEYAIEAW
178–187 = YKFRGTGKAW
264–277 = VAEFWKNDLGAIEN

In der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz:

120–140 = VEVNPNNRNQEISGDYTIEAW
178–187 = YKFRGDGKAW
264–277 = VAEFWKNDLGALEN

In der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz:

119–139 = VEVNPSDRNQEISGTYQIQAW
176–185 = YKFRGIGKAW
262–275 = VGEYWSYDINKLHN

In der in SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenz:

120–140 = VEVNPNNRNQEVTGEYTIEAW
178–187 = YKFRGHGKAW
264–277 = VAEFWKNDLGAIEN

Im Hinblick auf das Erzielen von reduzierter Ca² ⁺-Abhängigkeit können insbesondere die folgenden Kodon-Positionen geeignet angezielt werden:
In der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz:

178–209 = YKFRGTGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADVDMD
237–246 = AVKHIKYSFT

In der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz:

178–209 = YKFRGDGKAWDWEVDSENGNYDYLMYADVDMD
237–246 = AVKHIKYSFT

In der in SEQ ID Nr. 7 dargestellten Aminosäuresequenz:

178–209 = YKFRGHGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADIDMD
237–246 = AVKHIKYSFT

Im Hinblick auf das Erzielen der verbesserten Bindung an ein Substrat (d.h. der verbesserten Bindung einer Kohlenhydrat-Spezies – wie Amylose oder Amylopektin –, die ein Substrat für α-amylolytische Enzyme ist) durch eine α-Amylase-Variante, modifizierte (z.B. höhere) Substratspezifität und/oder modifizierte (z.B. höhere) Spezifität in Bezug auf die Spaltung (Hydrolyse) von Substrat, scheint es, dass die folgenden Kodon-Positionen für die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz (oder äquivalente Kodon-Positionen für andere Ursprungs-α-amylase in Zusammenhang mit der Erfindung) besonders geeignet angezielt werden können:
In der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz:

15–20 = WYLPND
52–58 = SQNDVGY
72–78 = KGTVRTK
104–111 = VMNHKGGA
165–174 = TDWDQSRQLQ
194–204 = ENGNYDYLMYA
234–240 = RDAVKH
332–340 = HDSQPGEAL

Die statistische Mutagenese einer eine Ursprungs-α-amylase kodierenden DNA-Sequenz, die gemäß Schritt a) des vorstehend beschriebenen Verfahrens der Erfindung durchzuführen ist, kann günstigerweise durch Verwendung eines beliebigen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrens durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die statistische Mutagenese durch Verwendung eines geeigneten physikalischen oder chemischen Mutagenisierungsmittels, durch Verwendung eines geeigneten Oligonukleotids oder durch Unterziehen der DNA-Sequenz einer durch PCR gebildeten Mutagenese durchgeführt werden. Weiterhin kann die statistische Mutagenese durch Verwendung einer beliebigen Kombination dieser Mutagenisierungsmittel durchgeführt werden.
Das Mutagenisierungsmittel kann z.B. eines sein, das Transitionen, Transversionen, Inversionen, Verschlüsselungen, Deletionen und/oder Einfügungen induziert.
Beispiele für ein physikalisches oder chemisches Mutagenisierungsmittel, das für den vorliegenden Zweck geeignet ist, schließen Ultraviolett-(UV)-Strahlung, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), O-Methylhydroxylamin, salpetrige Säure, Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, Ameisensäure und Nukleotidanaloga ein.
Werden derartige Mittel verwendet, wird die Mutagenese typischerweise durch Inkubieren der DNA-Sequenz, die das zu mutagenisierende Ursprungsenzym kodiert, in Gegenwart des Mutagenisierungsmittels der Wahl unter geeigneten Bedingungen für das Stattfinden der Mutagenese und Selektieren auf mutierte DNA mit den gewünschten Eigenschaften durchgeführt.
Wird die Mutagenese durch die Verwendung eines Oligonukleotids durchgeführt, kann das Oligonukleotid mit den drei Nicht-Ursprungsnukleotiden während der Synthese des Oligonukleotids an den Positionen, die zu verändern sind, dotiert oder bespickt werden. Das Dotieren oder Bespicken kann derart durchgeführt werden, dass Kodone für unerwünschte Aminosäuren vermieden werden. Das dotierte oder bespickte Oligonukleotid kann in die das amylolytische Enzym kodierende DNA durch jede beliebige veröffentlichte Technik unter Verwendung z.B. von PCR, LCR oder einer beliebigen DNA-Polymerase und -Ligase eingebracht werden.
Wird eine durch PCR gebildete Mutagenese verwendet, wird entweder ein chemisch behandeltes oder unbehandeltes Gen, das ein Ursprungs-α-amylase-Enzym kodiert, unter die Fehleinbringung von Nukleotiden erhöhenden Bedingungen, einer PCR unterzogen (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Bd. 1, 1989, S. 11–15).
Ein Mutatorstamm von E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, S. 179–191), S. cerevisiae oder eines anderen Mikrobenorganismus kann für die statistische Mutagenese der das amylolytische Enzym kodierenden DNA z.B. durch Transformieren eines des Ursprungsenzym enthaltenden Plasmids, in den Mutatorstamm, Wachsenlassen des Mutatorstamms mit dem Plasmid und Isolieren des mutierten Plasmids aus dem Mutatorstamm verwendet werden.
Das mutierte Plasmid kann anschließend in den Expressionsorganismus transformiert werden.
Die zu mutagenisierende DNA-Sequenz kann günstigerweise in einer genomischen oder cDNA-Bibliothek vorliegen, die aus einem Organismus hergestellt ist, der das amylolytische Ursprungsenzym exprimiert. Alternativ dazu kann die DNA-Sequenz auf einem geeigneten Vektor, wie einem Plasmid oder einem Bakteriophagen, vorliegen, der als solches mit dem Mutagenisierungsmittel inkubiert oder diesem auf andere Weise ausgesetzt werden kann. Die zu mutagenisierende DNA kann auch in einer Wirtszelle vorliegen, indem es entweder in das Genom der Zelle integriert ist oder auf einem in der Zelle beherbergten Vektor vorliegt. Schließlich kann die zu mutagenisierende DNA in isolierter Form vorliegen. Es ist klar, dass die einer statistischen Mutagenese zu unterziehende DNA-Sequenz vorzugsweise eine cDNA- oder eine genomische DNA-Sequenz ist.
In manchen Fällen kann es günstig sein, die mutierte DNA-Sequenz vor dem Durchführen des Expressionsschritts (b) oder des Durchmusterungsschritts (c) zu amplifizieren. Eine derartige Amplifikation kann gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt werden, wobei das gegenwärtig bevorzugte Verfahren eine durch PCR gebildete Amplifikation unter Verwendung von auf der Basis der DNA- oder Aminosäuresequenz des Ursprungsenzyms hergestellten Oligonukleotid-Primern ist.
Nach der Inkubation mit dem oder Einwirkung des Mutagenisierungsmittel/s wird die mutierte DNA durch Züchten einer geeigneten die DNA-Sequenz tragenden Wirtszelle unter das Stattfinden einer Expression erlaubenden Bedingungen exprimiert. Die zu diesem Zweck verwendete Wirtszelle kann eine sein, die mit der mutierten DNA-Sequenz wahlweise vorliegend auf einem Vektor transformiert wurde oder die die das Ursprungsenzym kodierende DNA-Sequenz während der Mutagenesebehandlung trug. Beispiele für geeignete Wirtszellen sind folgende: grampositive Bakterien wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus; und gramnegative Bakterien wie E. coli.
Die mutierte DNA-Sequenz kann des Weiteren eine DNA-Sequenz umfassen, die Funktionen kodiert, die die Expression der mutierten DNA-Sequenz erlauben.
Lokalisierte statistische Mutagenese: Die statistische Mutagenese kann vorteilhafterweise an einem Teil der fraglichen Ursprungs-α-amylase lokalisiert sein. Dies kann z.B. vorteilhaft sein, wenn bestimmte Bereiche des Enzyms als für eine vorgegebene Eigenschaft des Enzyms besonders wichtig identifiziert wurden und nach dem Modifizieren erwartet wird, dass sie zu einer Variante mit verbesserten Eigenschaften führen. Derartige Bereiche können normalerweise identifiziert werden, wenn die tertiäre Struktur des Ursprungsenzyms geklärt und mit der Funktion des Enzyms in Beziehung gesetzt wurde.
Die lokalisierte statistische Mutagenese wird günstigerweise durch Verwendung von wie vorstehend beschriebenen durch PCR gebildeten Mutagenesetechniken oder eine beliebige andere geeignete auf dem Fachgebiet bekannte Technik durchgeführt.
Alternativ dazu kann die DNA-Sequenz, die den zu modifizierenden Teil der DNA-Sequenz kodiert, z.B. dadurch isoliert werden, dass sie in einen geeigneten Vektor eingefügt wird, und der Teil kann anschließend durch Verwendung von beliebigen der vorstehend erörterten Mutageneseverfahren einer Mutagenese unterzogen werden.
In Bezug auf den Durchmusterungsschritt in dem vorstehend erwähnten Verfahren der Erfindung kann dieser günstigerweise durch Verwendung eines Filtertests auf der Basis des folgenden Prinzips durchgeführt werden:
Ein Mikroorganismus, der das mutierte amylolytische Enzym von Interesse exprimieren kann, wird auf einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen für das Sezernieren des Enzyms inkubiert, wobei das Medium mit einem Doppelfilter versehen ist, der einen ersten Proteinbindungsfilter und auf dem oberen Teil davon einen zweiten Filter, der eine niedrige Proteinbindungsfähigkeit zeigt, umfasst. Der Mikroorganismus wird auf dem zweiten Filter lokalisiert. Nach der Inkubation wird der erste Filter, der von den Mikroorganismen sezernierte Enzyme umfasst, von dem die Mikroorganismen umfassenden zweiten Filter abgetrennt. Der erste Filter wird dem Durchmustern auf die gewünschte enzymatische Aktivität unterzogen, und die entsprechenden Mikrobenkolonien, die auf dem zweiten Filter vorliegen, werden identifiziert.
Der für die Bindung der enzymatischen Aktivität verwendete Filter kann ein beliebiger proteinbindender Filter, z.B. Nylon oder Nitrocellulose, sein. Der die Kolonien des Expressionsorganismus tragende obere Filter kann ein beliebiger Filter, der keine oder eine geringe Affinität für bindende Proteine aufweist, z.B. Celluloseacetat oder Durapore^TM, sein. Der Filter kann nach einer beliebigen der zum Durchmustern zu verwendenden Bedingungen vorbehandelt oder während des Nachweises von enzymatischer Aktivität behandelt werden.
Die enzymatische Aktivität kann durch einen Farbstoff, Fluoreszenz, Ausfällung, pH-Indikator, IR-Absorption oder eine beliebige andere bekannte Technik zum Nachweis der enzymatischen Aktivität nachgewiesen werden.
Die Nachweisverbindung kann durch jedes beliebige Immobilisierungsmittel, z.B. Agarose, Agar, Gelatine, Polyacrylamid, Stärke, Filterpapier, Stoff oder eine beliebige Kombination von Immobilisierungsmitteln immobilisiert werden.
Die α-Amylase-Aktivität wird durch mit Cibacron Red markiertes Amylopektin nachgewiesen, das auf Agarose immobilisiert ist. Zum Durchmustern auf Varianten mit erhöhter Wärmestabilität und Stabilität bei hohem pH-Wert wird der Filter mit gebundenen α-Amylase-Varianten in einem Puffer bei pH 10,5 und 60°C oder 65°C für eine bestimmte Zeitdauer inkubiert, kurz in entionisiertem Wasser gespült und für den Aktivitätsnachweis auf die Amylopektin-Agarose-Matrix gegeben. Die Restaktivität ist als Lyse von Cibacron Red durch Amylopektin-Abbau zu sehen. Die Bedingungen sind derart ausgewählt, dass die Aktivität aufgrund dessen, dass die α- Amylase die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist, gerade noch nachgewiesen werden kann. Stabilisierte Varianten zeigen unter denselben Bedingungen aufgrund der erhöhten Freisetzung von Cibacron Red eine erhöhte Farbintensität.
Zum Durchmustern auf Varianten mit einem Aktivitätsoptimum bei einer niedrigeren Temperatur und/oder über einen breiteren Temperaturbereich wird der Filter mit gebundenen Varianten direkt auf die Substratplatte aus Amylopektin und Cibacron Red gegeben und bei der gewünschten Temperatur (z.B. 4°C, 10°C oder 30°C) für eine spezifizierte Zeitdauer inkubiert. Nach dieser Zeitdauer kann die Aktivität aufgrund dessen, dass die α-Amylase die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist, gerade noch nachgewiesen werden, wohingegen Varianten mit optimaler Aktivität bei einer niedrigeren Temperatur eine erhöhte Amylopektin-Lyse zeigen. Vor der Inkubation auf die Amylopektinmatrix kann die Inkubation in allen Sorten von möglichen gewünschten Medien – z.B. Lösungen, die Ca² ⁺, Detergenzien, EDTA oder andere relevante Zusätze enthalten – durchgeführt werden, um auf eine veränderte Abhängigkeit oder auf eine Reaktion der fraglichen Varianten mit derartigen Zusätzen durchzumustern.
Verfahren zur Herstellung von Hybrid-α-amylasen
Als Alternative zur stellengerichteten Mutagenese können α-Amylase-Varianten, die Hybride von mindestens zwei konstituierenden α-Amylasen sind, durch Kombinieren der relevanten Teile der jeweiligen fraglichen Gene hergestellt werden.
Natürlich vorkommende Enzyme können durch wie vorstehend beschriebene statistische oder stellengerichtete Mutagenese genetisch modifiziert werden. Alternativ dazu kann ein Teil eines Enzyms durch einen Teil eines anderen ersetzt werden, um ein chimeres Enzym zu erhalten. Dieser Ersatz kann entweder durch herkömmliche Genverbindungstechniken in vitro oder durch Rekombination in vivo oder durch Kombinationen beider Techniken erzielt werden. Bei Verwendung von herkömmlichen Genverbindungstechniken in vitro kann ein gewünschter Teil der α-Amylase-Gen-kodierenden Sequenz unter Verwendung von geeigneten stellenspezifischen Restriktionsenzymen deletiert werden; kann der deletierte Teil der kodierenden Sequenz dann durch die Einfügung eines gewünschten Teils einer anderen α-Amylase-kodierenden Sequenz ersetzt werden, sodass eine chimere Nukleotidsequenz, die eine neue α-Amylase kodiert, hergestellt wird. Alternativ dazu können α-Amylase-Gene, z.B. durch Verwendung des PCR-Überlagerungsverlängerungsverfahrens, beschrieben von Higuchi et al., 1988, verbunden werden.
Die Rekombinationstechniken in vitro hängen von der Tatsache ab, dass verschiedene DNA-Segmente mit äußerst homologen Bereichen (Identität der DNA-Sequenz) rekombinieren, d.h. DNA aufspalten und austauschen und neue Bindungen in den homologen Bereichen aufbauen können. Demzufolge führt, wenn die kodierenden Sequenzen für zwei verschiedene, jedoch homologe Amylaseenzyme zum Transformieren einer Wirtszelle verwendet werden, die Rekombination von homologen Sequenzen in vivo zur Herstellung von chimeren Gensequenzen. Die Translation dieser kodierenden Sequenzen durch die Wirtszelle führt zur Herstellung eines chimeren Amylase-Genprodukts. Spezifische Rekombinationstechniken in vivo sind in US 5,093,257 und EP 252 666 beschrieben.
Alternativ dazu kann das Hybridenzym durch auf dem Fachgebiet bekannte chemische Standardverfahren synthetisiert werden. Siehe z.B. Hunkapiller et al. (1984). Demzufolge können Peptide mit den geeigneten Aminosäuresequenzen vollständig oder teilweise synthetisiert und unter Bildung von Hybridenzymen (Varianten) der Erfindung verbunden werden.
Expression von α-Amylase-Varianten
Erfindungsgemäß kann eine mutierte α-Amylase-kodierende DNA-Sequenz, die durch vorstehend beschriebene Verfahren oder durch beliebige alternative, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt wurde, unter Verwendung eines Expressionsvektors, der typischerweise Steuerungssequenzen, kodierend einen Promotor, Operator, eine ribosombindende Stelle, ein Translationsinitiierungssignal und wahlweise ein Regressorgen oder verschiedene Aktivatorgene einschließt, in Enzymform exprimiert werden.
Der rekombinante Expressionsvektor, der die eine α-Amylase-Variante der Erfindung kodierende DNA-Sequenz trägt, kann ein beliebiger Vektor sein, der günstigerweise rekombinanten DNA-Prezeduren unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors hängt häufig von der Wirtszelle ab, in welche er einzubringen ist. Folglich kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d.h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit vorliegt, wobei dessen Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z.B. ein Plasmid, ein Bakteriophage oder ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom sein. Alternativ dazu kann der Vektor einer sein, der nach dem Einbringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in welches (welche) er integriert wurde, repliziert wird.
Im Vektor sollte die DNA-Sequenz funktionsfähig an eine geeignete Promotorsequenz gebunden sein. Der Promotor kann eine beliebige in der Wirtszelle der Wahl Transkriptionsaktivität zeigende DNA-Sequenz und von Proteine entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle kodierenden Genen abgeleitet sein. Beispiele für geeignete Promotoren zum Leiten der Transkription der eine α-Amylase-Variante der Erfindung kodierenden DNA-Sequenz, insbesondere in einem Bakterienwirt, sind die Promotoren des lac-Operons von E. coli, die dagA-Promotoren des Agarasegen von Streptomyces coelicolor, die Promotoren des α-Amylase-Gens (amyL) von Bacillus licheniformis, die Promotoren des maltogenen Amylase-Gens (amyM) von Bacillus stearothermophilus, die Promotoren der α-Amylase (amyQ) von Bacillus amyloliquefaciens, die Promotoren der xylA- und xy1B-Gene von Bacillus subtilis usw. Zur Transkription in einem Pilzwirt sind Beispiele für nützliche Promotoren diejenigen, die von dem Gen abgeleitet sind, das TAKA-Amylase von A. oryzae, Aspartamproteinase von Rhizomucor miehei, neutrale α-Amylase von A. niger, säurestabile α-Amylase von A. niger, Glucoamylase von A. niger, Lipase von Rhizomucor miehei, alkalische Protease von A. oryzae, Triosephosphat-Isomerase von A. oryzae oder Acetamidase von A. nidulans kodiert.
Der Expressionsvektor der Erfindung kann auch einen geeigneten Transkriptionsterminator und, in Eukaryonten, Polyadenylierungssequenzen, die funktionsfähig an die die α-Amylase-Variante der Erfindung kodierende DNA-Sequenz gebunden sind, umfassen. Die Terminierungs- und Polyadenylierungssequenzen können geeigneterweise von denselben Quellen wie der Promotor abgeleitet sein.
Der Vektor kann des Weiteren eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor ermöglicht, in die fragliche Wirtszelle zu replizieren. Beispiele für derartige Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pUC 19, pACYC 177, pUB 110, pE 194, pAMB 1 und pIJ702.
Der Vektor kann auch eine selektierbare Markierung, z.B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle ergänzt, wie die dal-Gene von B. subtilis oder B. licheniformis, oder eines, das Antibiotikum-Resistenz, wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol-, oder Tetracyklin-Resistenz verleiht, umfassen. Weiterhin kann der Vektor Aspergillus-Selektionsmarkierungen, wie amdS, argB, niaD und sC, eine Markierung, die zu einer Hygromycin-Resistenz führt, umfassen, oder eine Auswahl kann durch gemeinsame Transformation, z.B. wie beschrieben in WO 91/17243 , erzielt werden.
Während unter gewissen Umständen eine intracelluläre Expression vorteilhaft sein kann, z.B. unter Verwendung von Bakterien als Wirtszellen, ist es im Allgemeinen bevorzugt, dass die Expression extracellulär ist.
Prozeduren, die zum Konstruieren von Vektoren der Erfindung, die eine α-Amylase-Variante kodieren und den Promotor, Terminator bzw. andere Elemente enthalten, geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt [siehe z.B. Sambrook et al. (1989)].
Die Zelle der Erfindung, entweder umfassend ein DNA-Konstrukt oder einen Expressionsvektor der Erfindung, wie vorstehend definiert, wird vorteilhafterweise als Wirtszelle bei der rekombinanten Herstellung einer α-Amylase-Variante der Erfindung verwendet. Die Zelle kann mit dem die Variante kodierenden DNA-Konstrukt der Erfindung günstigerweise durch Integrieren des DNA-Konstrukts (in einer oder mehreren Kopien) in das Wirtschromosom transformiert werden. Diese Integration wird im Allgemeinen als Vorteil betrachtet, da die DNA-Sequenz wahrscheinlicher in der Zelle stabil gehalten wird. Die Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann gemäß herkömmlichen Verfahren, z.B. durch homologe oder heterologe Rekombination, durchgeführt werden. Alternativ dazu kann die Zelle mit einem Expressionsvektor transformiert werden, der wie vorstehend in Verbindung mit den verschiedenen Typen von Wirtszellen beschrieben wurde.
Die Zelle der Erfindung kann eine Zelle eines höheren Organismus, wie eines Säugers oder eines Insekts, sein, ist jedoch vorzugsweise eine Mikrobenzelle, z.B. eine Bakterien- oder eine Pilz- (einschließlich Hefe-) -Zelle.
Beispiele für geeignete Bakterien sind grampositive Bakterien, wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder gramnegative Bakterien, wie E. coli. Die Transformation der Bakterien kann z.B. durch Protoplastentransformation oder unter Verwendung von kompetenten Zellen in einer an sich bekannten Weise bewirkt werden.
Der Hefeorganismus kann vorteilhafterweise ausgewählt sein aus einer Spezies von Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, z.B. Saccharomyces cerevisiae. Der Fadenpilz kann vorteilhafterweise zu einer Spezies von Aspergillus, z.B. Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger, gehören. Pilzzellen können durch ein Verfahren unter Einbeziehung von Protoplastenbildung und Transformation der Protoplasten, gefolgt von Regeneration der Zellenwand in einer an sich bekannten Weise transformiert werden. Ein geeignetes Verfahren zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen ist in EP 238 023 beschrieben.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer α-Amylase-Variante der Erfindung, wobei das Verfahren das Züchten einer wie vorstehend beschriebenen Wirtszelle unter für die Herstellung der Variante förderlichen Bedingungen und Gewinnen der Variante aus den Zellen und/oder dem Kulturmedium umfasst.
Das zum Züchten der Zellen verwendete Medium kann ein beliebiges herkömmliches Medium sein, das zum Wachsen der fraglichen Wirtszelle und Erhalten der Expression der α-Amylase-Variante der Erfindung geeignet ist. Geeignete Medien sind von Händlern erhältlich oder können gemäß veröffentlichten Rezepturen (z.B. wie in Katalogen der American Type Culture Collection beschrieben) hergestellt werden.
Die aus den Wirtszellen sezernierte α-Amylase-Variante kann günstigerweise durch bekannte Prozeduren, einschließlich Abtrennen der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, und Ausfallen der proteinhaltigen Bestandteile des Mediums mit Hilfe eines Salzes wie Ammoniumsulfat, gefolgt von der Verwendung von chromatographischen Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen, aus dem Kulturmedium gewonnen werden.
Industrielle Anwendungen
Aufgrund ihrer Aktivität bei alkalischen pH-Werten sind die α-Amylase-Varianten der Erfindung zur Verwendung in einer Vielfalt von industriellen Verfahren gut geeignet. Insbesondere finden sie mögliche Anwendungen als Bestandteil in Wasch-, Geschirrspül- und Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen (siehe nachstehend), können jedoch auch bei der Herstellung von Süßstoffen und Ethanol aus Stärke nützlich sein. Bedingungen für herkömmliche Stärkeumwandlungsverfahren und Verflüssigungs- und/oder Versüßungsverfahren sind z.B. in US 3,912,590 , EP 252,730 und EP 63,909 beschrieben.
Einige Anwendungsgebiete für α-Amylase-Varianten der Erfindung sind nachstehend umrissen.
Papier betreffende Anwendungen: α-Amylase-Varianten der Erfindung besitzen wertvolle Eigenschaften bei der Herstellung von Holzcellulose-Materialien, wie Zellstoff, Papier und Karton aus durch Stärke verstärktem Altpapier und Altkarton, insbesondere wo die Zellstoffwiederbildung bei einem pH-Wert über 7 stattfindet und wobei Amylasen die Aufspaltung des Altmaterials durch Abbau der verstärkenden Stärke erleichtern. α-Amylase-Varianten der Erfindung sind zur Verwendung bei Tintenentfernungs-/Recycling-Verfahren bei der Herstellung von Papier aus stärkebeschichteten oder stärkehaltigem bedrucktem Altpapier gut geeignet. Es ist gewöhnlich erwünscht, die Druckerschwärze zu entfernen, um neues Papier von großer Helligkeit herzustellen; Beispiele dafür, wie Varianten der Erfindung in dieser Weise verwendet werden können, sind in PCT/DK94/00437 beschrieben.
α-Amylase-Varianten der Erfindung können auch sehr nützlich beim Modifizieren von Stärke sein, wo enzymatisch modifizierte Stärke bei der Papierherstellung zusammen mit alkalischen Füllstoffen, wie Calciumcarbonat, Kaolin und Tonen, verwendet wird. Mit alkalischen α-Amylase-Varianten der Erfindung ist es möglich, die Stärke in Gegenwart des Füllstoffs zu modifizieren, wodurch ein einfacheres, integriertes Verfahren gewährt wird.
Textilentschlichten: α-Amylase-Varianten der Erfindung sind auch zur Verwendung beim Textilentschlichten gut geeignet. In der Textilverarbeitungsindustrie werden α-Amylasen traditionell als Hilfsmittel im Entschlichtungsverfahren verwendet, um die Entfernung von stärkehaltiger Schlichte zu erleichtern, die als Schutzbeschichtung von Schussgarnen während des Webens dienten.
Eine vollständige Entfernung der Schlichtebeschichtung nach dem Weben ist wichtig, um optimale Ergebnisse in den anschließenden Verfahren zu erhalten, in welchen das Gewebe gereinigt, gebleicht und gefärbt wird. Ein enzymatischer Stärkeabbau ist bevorzugt, da er den Fasern des Stoffs oder Gewebes nicht schadet.
Zum Reduzieren der Verarbeitungskosten und Erhöhen des Walzendurchsatzes wird die Entschlichtungsverarbeitung manchmal mit den Reinigungs- und Bleichschritten kombiniert. In derartigen Fällen werden typischerweise nicht-enzymatische Hilfsstoffe, wie Alkali oder Oxidationsmittel, verwendet, um die Stärke aufzuspalten, da traditionelle α-Amylasen mit hohen pH-Gehalten und Bleichmitteln nicht sehr verträglich sind. Die nicht-enzymatische Aufspaltung der Stärkeschlichte führt aufgrund der ziemlich aggressiven verwendeten Chemikalien zu einer gewissen Faserschädigung.
α-Amylase-Varianten der Erfindung, die bei relativ hohen pH-Graden und in Gegenwart von Oxidations-(Bleich-)-mitteln eine verbesserte Leistungsfähigkeit beim Stärkeabbau zeigen, sind folglich zur Verwendung in wie vorstehend beschriebenen Entschlichtungsverfahren, insbesondere für den Ersatz von gegenwärtig verwendeten nicht-enzymatischen Entschlichtungsmitteln gut geeignet. Die α-Amylase-Variante kann allein oder in Kombination mit einer Cellulase verwendet werden, wenn cellulosehaltiges Gewebe oder cellulosehaltiger Stoff entschlichtet wird.
Bierherstellung: Es wird angenommen, dass α-Amylase-Varianten der Erfindung auch bei Bierherstellungsverfahren sehr nützlich sind; in derartigen Verfahren werden die Varianten typischerweise während des Maischverfahrens zugesetzt.
Anwendungen in Detergenszusätzen und Detergenszusammensetzungen zum Waschen oder Geschirrspülen: Aufgrund der verbesserten Leistungsfähigkeit beim Waschen und/oder Geschirrspülen, die häufig eine Folge der Verbesserungen der wie vorstehend erörterten Eigenschaften ist, sind zahlreiche α-Amylase-Varianten (einschließlich Hybride) der Erfindung besonders zum Einbringen in Detergenszusammensetzungen, z.B. Detergenszusammensetzungen, die für eine Leistungsfähigkeit im pH-Bereich von 7–13, insbesondere im pH-Bereich von 8–11 beabsichtigt sind, gut geeignet. Erfindungsgemäß kann die α-Amylase-Variante als Bestandteil einer Detergenszusammensetzung zugesetzt werden. Als solche kann sie in die Detergenszusammensetzung in Form eines Detergenszusatzes eingeschlossen werden.
Folglich betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung einen Detergenszusatz, der eine erfindungsgemäße α-Amylase-Variante umfasst. Die Enzyme können durch Zugabe von getrennten, ein oder mehrere Enzym(e) enthaltenden Zusätzen oder durch Zugabe eines kombinierten, all diese Enzyme umfassenden Zusatzes in einer Detergenszusammensetzung eingeschlossen werden. Ein Detergenszusatz der Erfindung, d.h. ein getrennter Zusatz oder ein kombinierter Zusatz, kann z.B. als Granulat, Flüssigkeit, Aufschlämmung usw. formuliert werden. Bevorzugte Enzymformulierungen für Detergenszusätze sind Granulate (insbesondere nicht-stäubende Granulate), Flüssigkeiten (insbesondere stabilisierte Flüssigkeiten), Aufschlämmungen oder geschützte Enzyme (siehe nachstehend).
Die Detergenszusammensetzung sowie der Detergenszusatz können zusätzlich ein oder mehrere andere Enzyme, die herkömmlich in Detergenzien verwendet werden, wie Proteasen, Lipasen, amylolytische Enzyme, Oxidasen (einschließlich Peroxidasen) oder Cellulasen, umfassen.
Es wurde gefunden, dass wesentliche Verbesserungen in der Leistungsfähigkeit beim Waschen und/oder Geschirrspülen erhalten werden können, wenn α-Amylase mit einem anderen amylolytischen Enzym, wie einer Pullulanase, einer Isoamylase, einer Betaamylase, einer Amyloglucosidase oder einer CTGase, kombiniert wird. Beispiele für im Handel erhältliche amylolytische Enzyme, die für den vorgegebenen Zweck geeignet sind, sind AMG^TM, Novamyl^TM und Promozyme^TM, wobei alle davon von Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich sind. Demzufolge betrifft eine besondere Ausführungsform der Erfindung einen Detergenszusatz, der eine α-Amylase-Variante der Erfindung in Kombination mit mindestens einem anderen amylolytischen Enzym (z.B. ausgewählt unter denjenigen, die vorstehend erwähnt sind) umfasst.
Nicht-stäubende Granulate können z.B. wie in US 4,106,991 und US 4,661,452 offenbart, hergestellt und wahlweise durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren beschichtet werden; weitere Details bezüglich Beschichtungen sind nachstehend angegeben. Ist eine Kombination aus verschiedenen Detergensenzymen einzusetzen, können die Enzyme vor oder nach der Granulierung gemischt werden.
Flüssige Enzymzubereitungen können, z.B., durch Zugabe eines Polyols, wie von Propylenglycol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, von Milchsäure oder Borsäure gemäß etablierten Verfahren stabilisiert werden. Andere Enzymstabilisatoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Geschützte Enzyme können gemäß dem in EP 238 216 offenbarten Verfahren hergestellt werden.
Wie schon angegeben, betrifft ein noch weiterer Aspekt der Erfindung eine Detergenszusammensetzung, z.B. zum Wäschewaschen, zum Geschirrspülen oder zum Reinigen von harten Oberflächen, die eine α-Amylase-Variante (einschließlich eines Hybrids) der Erfindung und ein oberflächenaktives Mittel umfasst.
Die Detergenszusammensetzung der Erfindung kann in jeder beliebigen günstigen Form, z.B. als Pulver, Granulat oder Flüssigkeit, vorliegen. Ein flüssiges Detergens kann wässrig sein, wobei es typischerweise bis zu 90% Wasser und 0–20% organisches Lösungsmittel enthält, oder nicht-wässrig, z.B. wie beschrieben in EP-Patent 120,659 , sein.
Detergenszusammensetzungen
Wird eine α-Amylase-Variante der Erfindung als Bestandteil einer Detergenszusammensetzung (z.B. einer Detergenszusammensetzung zum Wäschewaschen oder einer Detergenszusammensetzung zum Geschirrspülen) eingesetzt, kann sie z.B. in Form eines nicht-stäubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms in der Detergenszusammensetzung eingeschlossen sein. Wie vorstehend erwähnt, können nicht-stäubende Granulate, z.B. wie in US 4,106,991 und 4,661,452 (beide an Novo Industri A/S) offenbart, hergestellt und wahlweise durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren beschichtet werden. Beispiele für wachsartige Beschichtungsmaterialien sind Poly(ethylenoxid)-Produkte (Polyethylenglycol, PEG) mit mittleren Molekulargewichten von 1000 bis 20000; ethoxylierte Nonylphenole mit 16 bis 50 Ethylenoxideinheiten; ethoxylierte Fettalkohole, in welchen der Alkohol 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und in welchen 15 bis 80 Ethylenoxideinheiten vorliegen; Fettalkohole; Fettsäuren; und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren.
Beispiele für Film-bildende Beschichtungsmaterialien, die zur Anwendung durch Wirbelschichttechniken geeignet sind, sind in GB 1483591 angegeben.
Enzyme, die in Form von flüssigen Enzympräparaten zugesetzt werden, können, wie vorstehend angegeben, z.B. durch die Zugabe eines Polyols, wie von Propylenglycol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, von Milchsäure oder Borsäure gemäß etablierten Verfahren beschichtet werden. Andere Enzymstabilisatoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Geschützte Enzyme zum Einschluss in eine Detergenszusammensetzung der Erfindung können, wie vorstehend erwähnt, gemäß dem in EP 238,216 offenbarten Verfahren hergestellt werden.
Die Detergenszusammensetzung der Erfindung kann in jeder beliebigen günstigen Form, z.B. als Pulver, Granulat, Paste oder Flüssigkeit, vorliegen. Ein flüssiges Detergens kann wässrig, wobei es typischerweise bis zu 70% Wasser und 0–30% organisches Lösungsmittel enthält, oder nicht-wässrig sein.
Die Detergenszusammensetzung umfasst ein oder mehrere oberflächenaktive Mittel, wobei jedes davon anionisch, nicht-ionisch, kationisch oder amphoter (zwitterionisch) sein kann. Das Detergens enthält üblicherweise 0–50% anionisches oberflächenaktives Mittel, wie lineares Alkylbenzolsulfonat (LAS), alpha-Olefinsulfonat (AOS), Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat) (AS), Alkoholethoxysulfat (AEOS oder AES), sekundäre Alkansulfonate (SAS), alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure oder Seife. Es kann auch 0–40% nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, wie Alkoholethoxylat (AEO oder AE), Alkoholpropoxylat, carboxylierte Alkoholethoxylate, Nonylphenolethoxylat, Alkylpolyglycosid, Alkyldimethylaminoxid, ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid, Fettsäuremonoethanolamid oder Polyhydroxyalkylfettsäureamid (z.B. wie beschrieben in WO 92/06154 ), enthalten.
Die Detergenszusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere andere Enzym(e), wie Pullulanase, Esterase, Lipase, Cutinase, Protease, Cellulase, Peroxidase oder Oxidase, z.B. Laccase, umfassen.
Normalerweise enthält das Detergens 1–65% eines Detergensgerüststoffs (obwohl einige Geschirrspüldetergenzien sogar bis zu 90% eines Detergensgerüststoffs enthalten können) oder Komplexbildners, wie Zeolith, Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Zitrat, Nitrilotriessigsäure (NTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTMPA), Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure, lösliche Silicate oder geschichtete Silicate (z.B. SKS-6 von Hoechst).
Die Detergensgerüststoffe können in phosphorhaltige und nicht-phosphorhaltige Typen unterteilt werden. Beispiele für phosphorhaltige anorganische alkalische Detergensgerüststoffe schließen die wasserlöslichen Salze, insbesondere Alkalimetallpyrophosphate, -orthophosphate, -polyphosphate und -phosphonate ein. Beispiele für nicht-phosphorhaltige anorganische Gerüststoffe schließen wasserlösliche Alkalimetallcarbonate, -borate und -silicate, sowie geschichtete Disilicate und die verschiedenen Typen von wasserunlöslichen kristallinen oder amorphen Aluminiumsilicaten ein, unter welchen Zeolithe die bekanntesten Vertreter sind.
Beispiele für geeignete organische Gerüststoffe schließen Alkalimetall-, Ammonium- oder substituierte Ammoniumsalze von Succinaten, Malonaten, Fettsäuremalonaten, Fettsäuresulfonaten, Carboxymethoxysuccinaten, Polyacetaten, Carboxylaten, Polycarboxylaten, Aminopolycarboxylaten und Polyacetylcarboxylaten ein.
Das Detergens kann auch ohne Gerüststoff vorliegen, d.h. frei von einem Detergensgerüststoff sein.
Das Detergens kann ein oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind Carboxymethylcellulose (CMC; typischerweise in Form des Natriumsalzes), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Polyethylenglycol (PEG), Poly(vinylalkohol) (PVA), Polycarboxylate, wie Polyacrylate, Polymaleate, Malein-/Acrylsäure-Copolymere und Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymere.
Die Detergenszusammensetzung kann Bleichmittel vom Chlor-Brom-Typ oder des Sauerstoff-Typs enthalten. Die Bleichmittel können beschichtet oder eingekapselt sein. Beispiele für anorganische Bleichen vom Chlor-Brom-Typ sind Lithium-, Natrium- oder Calciumhypochlorit oder -hypobromit sowie chloriertes Trinatriumphosphat. Das Bleichsystem kann auch eine H₂O₂-Quelle wie Perborat oder Percarbonat umfassen, die mit säurebildendem Bleichaktivator wie Tetraacetylethylendiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzolsulfonat (NOBS) kombiniert werden können.
Beispiele für organische Bleichen vom Chlor-Brom-Typ sind heterozyklische N-Brom- und N-Chlorimide, wie Trichlorisocyanur-, Tribromisocyanur-, Dibromisocyanur- und Dichlorisocyanursäuren und Salze davon, mit Wasser anlösenden Kationen, wie Kalium und Natrium. Hydantoinverbindungen sind ebenfalls geeignet. Das Bleichsystem kann auch Peroxysäuren z.B. vom Amid-, Imid- oder Sulfontyp umfassen.
In Geschirrspüldetergenzien sind die Sauerstoffbleichen, z.B. in Form eines anorganischen Persalzes, vorzugsweise mit einem Bleichvorläufer oder als Peroxidsäureverbindung, bevorzugt. Typische Beispiele für geeignete Peroxidbleichverbindungen sind Alkalimetallperborate, sowohl -tetrahydrate als auch -monohydrate, Alkalimetallpercarbonate, -persilicate und -perphosphate. Bevorzugte Aktivatormaterialien sind TAED oder NOBS.
Die Enzyme der Detergenszusammensetzung der Erfindung können unter Verwendung von herkömmlichen Stabilisatoren, z.B. eines Polyols wie eines Propylenglycols oder Glycerin, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, von Milchsäure, Borsäure oder einem Borsäurederivat, wie z.B. eines aromatischen Borsäureesters, stabilisiert werden, und die Zusammensetzung kann z.B. wie in WO 92/19709 und WO 92/19708 beschrieben formuliert werden. Die Enzyme der Erfindung können auch durch Zugabe von reversiblen Enzymhemmern, z.B. vom Protein-Typ (wie beschrieben in EP 0 544 777 B1 ) oder vom Borsäure-Typ, stabilisiert werden.
Das Detergens kann auch andere herkömmliche Detergensinhaltsstoffe, wie z.B. Gewebeweichmacher, einschließlich Tone, Entflockungsmaterial, Schaumverstärker/Schaumunterdrücker (in Geschirrspüldetergenzien Schaumunterdrücker), Seifenschaumunterdrücker, Antikorrosionsmittel, Schmutzsuspensionsmittel, Mittel gegen die Wiederablagerung von Schmutz, Farbstoffe, Entwässerungsmittel, Bakterizide, optische Aufheller oder Parfüm enthalten.
Der pH-Wert (gemessen in wässriger Lösung bei Verwendungskonzentration) ist üblicherweise neutral oder alkalisch, liegt z.B. im Bereich von 7–11.

Bestimmte Formen von Wäschedetergenszusammensetzungen im Umfang der Erfindung schließen ein: 1) Detergenszusammensetzung, formuliert als Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend:

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	7–12%
Alkoholethoxysulfat (z.B. C_12-18-Alkohol, 1-2 EO) oder Alkylsulfat (z.B. C_16-18)	1–4%
Alkoholethoxylat (z.B. C_14-15-Alkohol, 7 EO)	5–9%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	14–20%
Lösliches Silicat (als Na₂O,2SiO₂)	2–6%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	15–22%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	0–6%
Natriumcitrat/Zitronensäure (als C₆H₅Na₃O₇/ C₆H₆O₇)	0–15%
Natriumperborat (als NaBO₃·H₂O)	11–18%
TAED	2–6%
Carboxymethylcellulose	0–2%
Polymere (z.B. Malein-/Acrylsäure-Copolymer, PVP, PEG)	0–3%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. Seifenschaumunterdrücker, Parfüm, optische Aufheller, Fotobleiche)	0–5%

2) Detergenszusammensetzung, formuliert als Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend:

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	6–11%
Alkoholethoxysulfat (z.B. C_12-18-Alkohol, 1-2 EO) oder Alkylsulfat (z.B. C_16-18)	1–3%
Alkoholethoxylat (z.B. C_14-15-Alkohol, 7 EO)	5–9%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	15–21%
Lösliches Silicat (als Na₂O,2SiO₂)	1–4%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	24–34%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	4–10%
Natriumcitrat/Zitronensäure (als C₆H₅Ha₃O₇/ C₆H₆O₇)	0–15%
Carboxymethylcellulose	0–2%
Polymere (z.B. Malein-/Acrylsäure-Copolymer, PVP, PEG)	1–6%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. Seifenschaumunterdrücker, Parfüm, optische Aufheller, Fotobleiche)	0–5%

3) Detergenszusammensetzung, formuliert als Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend:

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	5–9%
Alkoholethoxylat (z.B. C_12-15-Alkohol, 7 EO)	7–14%
Seife als Fettsäure (z.B. C_16-22-Fettsäure)	1–3%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	10–17%
Lösliches Silicat (als Na₂O,2SiO₂)	3–9%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	23–33%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	0–4%
Natriumperborat (als NaBO₃·H₂O)	8–16%
TAED	2–8%
Phosphonat (z.B. EDTMPA)	0–1%
Carboxymethylcellulose	0–2%
Polymere (z.B. Malein-/Acrylsäure-Copolymer, PVP, PEG)	0–3%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. Seifenschaumunterdrücker, Parfüm, optische Aufheller, Fotobleiche)	0–5%

4) Detergenszusammensetzung, formuliert als Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend:

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	8–12%
Alkoholethoxylat (z.B. C_12-15-Alkohol, 7 EO)	10–25%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	14–22%
Lösliches Silicat (als Na₂O,2SiO₂)	1–5%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	25–35%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	0–10%
Carboxymethylcellulose	0–2%
Polymere (z.B. Malein-/Acrylsäure-Copolymer, PVP, PEG)	1–3%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. Seifenschaumunterdrücker, Parfüm, optische Aufheller, Fotobleiche)	0–5%

5) Wässrige flüssige Detergenszusammensetzung, umfassend:

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	15–21%
Alkoholethoxylat (z.B. C_12-15-Alkohol, 7 EO, oder C_12-15-Alkohol, 5 EO)	12–18%
Seife als Fettsäure (z.B. Ölsäure)	3–13%
Alkenylbernsteinsäure (C_12-14)	0–13%
Aminoethanol	8–18%
Zitronensäure	2–8%
Phosphonat	0–3%
Polymere (z.B. PVP, PEG)	0–3%
Borat (als B₄O₇2⁺)	0–2%
Ethanol	0–3%
Propylenglycol	8–14%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. Dispergiermittel, Seifenschaumunterdrücker, Parfüm, optische Aufheller)	0–5%

6) Wässrige strukturierte flüssige Detergenszusammensetzung, umfassend:

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	15–21%
Alkoholethoxylat (z.B. C_12-15-Alkohol, 7 EO, oder C_12-15-Alkohol, 5 EO)	3–9%
Seife als Fettsäure (z.B. Ölsäure)	3–10%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	14–22%
Kaliumcitrat	9–18%
Borat (als B₄O₇ ²⁺)	0–2%
Carboxymethylcellulose	0–2%
Polymere (z.B. PVP, PEG)	0–3%
Verankerungspolymere, wie z.B. Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymer; Molverhältnis 25:1; MW 3800	0–3%
Glycerin	0–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. Dispergiermittel,	0–5%
Seifenschaumunterdrücker, Parfüm, optische Aufheller)

7) Detergenszusammensetzung, formuliert als Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend:

Fettalkoholsulfat	5–10%
Ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid	3–9%
Seife als Fettsäure	0–3%
Natriumcarbonate (als Na₂CO₃)	5–10%
Lösliches Silicat (als Na₂O·2SiO₂)	1–4%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	20–40%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	2–8%
Natriumperborat (als NaBO₃·H₂O)	12–18%
TAED	2–7%
Polymere (z.B. Malein-/Acrylsäure-Copolymer, PEG)	1–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. optische Aufheller, Seifenschaumunterdrücker, Parfüm)	0–5%

8) Detergenszusammensetzung, formuliert als Granulat, umfassend:

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	8–14%
Ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid	5–11%
Seife als Fettsäure	0–3%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	4–10%
Lösliches Silicat (als Na₂O·2SiO₂)	1–4%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	30–50%
Natriumsulfat (als Na₂So₄)	3–11%
Natriumcitrat (als C₆H₅Na₃O₇)	5–12%
Polymere (z.B. PVP, Malein-/Acrylsäure-Copolymer, PEG)	1–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. Seifenschaumunterdrücker, Parfüm)	0–5%

9) Detergenszusammensetzung, formuliert als Granulat, umfassend:

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	6–12%
Nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel	1–4%
Seife als Fettsäure	2–6%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	14–22%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	18–32%
Natriumsulfat (als Na₂So₄)	5–20%
Natriumcitrat (als C₆H₅Na₃O₇)	3–8%
Natriumperborat (als NaBO₃·H₂O)	4–9%
Bleichaktivator (z.B. NOBS oder TAED)	1–5%
Carboxymethylcellulose	0–2%
Polymere (z.B. Polycarboxylat oder PEG)	1–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. optische Aufheller, Parfüm)	0–5%

10) Wässrige flüssige Detergenszusammensetzung, umfassend:

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	15–23%
Alkoholethoxysulfat (z.B. C_12-15-Alkohol, 2-3 EO)	8–15%
Alkoholethoxylat (z.B. C_12-15-Alkohol, 7 EO, oder C_12-15-Alkohol, 5 EO)	3–9%
Seife als Fettsäure (z.B. Laurinsäure)	0–3%
Aminoethanol	1–5%
Natriumcitrat	5–10%
Hydrotrog (z.B. Natriumtoluolsulfonat)	2–6%
Borat (als B₄O₇ ^2–)	0–2%
Carboxymethylcellulose	0–1%
Ethanol	1–3%
Propylenglycol	2–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. Polymere, Dispergiermittel, Parfüm, optische Aufheller)	0–5%

11) Wässrige flüssige Detergenszusammensetzung, umfassend:

Lineares Alkylbenzolsulfonat (berechnet als Säure)	20–32%
Alkoholethoxylat (z.B. C_12-15-Alkohol, 7 EO, oder C_12-15-Alkohol, 5 EO)	6–12%
Aminoethanol	2–6%
Zitronensäure	8–14%
Borat (als B₄O₇ ^2–)	1–3%
Polymer (z.B. Malein-/Acrylsäure-Copolymer, Verankerungspolymer, wie z.B. Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymer)	0–3%
Glycerin	3–8%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. Hydrotrope, Dispergiermittel, Parfüm, optische Aufheller)	0–5%

12) Detergenszusammensetzung, formuliert als Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, umfassend:

Anionisches oberflächenaktives Mittel (lineares Alkylbenzol-sulfonat, Alkylsulfat, alpha-Olefinsulfonat, alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkansulfonate, Seife)	25–40%
Nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (z.B. Alkoholethoxylat)	1–10%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	8–25%
Lösliche Silicate (als Na₂O·2SiO₂)	5–15%
Natriumsulfat (als Na₂SO₄)	0–5%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	15–28%
Natriumperborat (als NaBO₃·4H₂O)	0–20%
Bleichaktivator (TAED oder NOBS)	0–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. Parfüm, optische Aufheller)	0–3%

13) Detergensformulierungen, wie beschrieben in 1) – 12), wobei das gesamte oder ein Teil des linearen Alkylbenzolsulfonats durch (C₁₂-C₁₈)-Alkylsulfat ersetzt wurde.

(C₁₂-C₁₈)-Alkylsulfat	9–15%
Alkoholethoxylat	3–6%
Polyhydroxyalkylfettsäureamid	1–5%
Zeolith (als NaAlSiO₄)	10–20%
Geschichtetes Disilicat (z.B. SK56 von Hoechst)	10–20%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	3–12%
Lösliches Silicat (als Na₂O,2SiO₂)	0–6%
Natriumcitrat	4–8%
Natriumpercarbonat	13–22%
TAED	3–8%
Polymere (z.B. Polycarboxylate und PVP)	0–5%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. optischer Aufheller, Fotobleiche, Parfüm,	0–5%
Seifenschaumunterdrücker)

(C₁₂-C₁₈)-Alkylsulfat	4–8%
Alkoholethoxylat	11–15%
Seife	1–4%
Zeolith MAP oder Zeolith A	35–45%
Natriumcarbonat (als Na₂CO₃)	2–8%
Lösliches Silicat (als Na₂O,2SiO₂)	0–4%
Natriumpercarbonat	13–22%
TAED	1–8%
Carboxymethylcellulose	0–3%
Polymere (z.B. Polycarboxylate und PVP)	0–3%
Enzyme (berechnet als reines Enzymprotein)	0,0001–0,1%
Nebenbestandteile (z.B. optischer Aufheller, Phosphonat, Parfüm)	0–3%

16) Detergensformulierungen, wie in 1)–15) beschrieben, die eine stabilisierte oder eingekapselte Persäure entweder als zusätzlichen Bestandteil oder als Ersatz für schon spezifizierte Bleichsysteme enthalten.
17) Detergenszusammensetzungen, wie in 1), 3), 7), 9) und 12) beschrieben, wobei Perborat durch Percarbonat ersetzt wurde.
18) Detergenszusammensetzungen, wie in 1), 3), 7), 9), 12), 14) und 15) beschrieben, die zusätzlich einen Mangankatalysator enthalten. Der Mangankatalysator kann z.B. eine der in „Efficient manganese catalysts for lowtemperature bleaching", Nature 369, 1994, S. 637–639, beschriebenen Verbindungen sein.
19) Detergenszusammensetzung, formuliert als nicht-wässrige Detergensflüssigkeit, umfassend ein flüssiges nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, wie z.B. linearen alkoxylierten primären Alkohol, ein Gerüststoffsystem (z.B. Phosphat), Enzym und Alkali. Das Detergens kann auch anionisches oberflächenaktives Mittel und/oder ein Bleichsystem umfassen.

Besondere Ausführungsformen von Geschirrspül-Detergenszusammensetzungen im Umfang der Erfindung schließen ein: 1) PULVERZUSAMMENSETZUNG FÜR GESCHIRRSPÜLAUTOMATEN

Nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel	0,4–2,5%
Natriummetasilicat	0–20%
Natriumdisilicat	3–20%
Natriumtriphosphat	20–40%
Natriumcarbonat	0–20%
Natriumperborat	2–9%
Tetraacetylethylendiamin (TAED)	1–4%
Natriumsulfat	5–33%
Enzyme	0,0001–0,1%

2) PULVERZUSAMMENSETZUNG FÜR GESCHIRRSPÜLAUTOMATEN

Nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (z.B. Alkoholethoxylat)	1–2%
Natriumdisilicat	2–30%
Natriumcarbonat	10–50%
Natriumtriphosphonat	0–5%
Natriumcarbonat	0–20%
Trinatriumcitratdihydrat	9–30%
Nitrilotrinatriumacetat (NTA)	0–20%
Natriumperboratmonohydrat	5–10%
Tetraacetylethylendiamin (TAED)	1–2%
Polyacrylatpolymer (z.B. Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer	6–25%
Enzyme	0,0001–0,1%
Parfüm	0,1–0,5%
Wasser	5–10

3) PULVERZUSAMMENSETZUNG FÜR GESCHIRRSPÜLAUTOMATEN

Nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel	0,5–2,0%
Natriumdisilicat	25–40%
Natriumcarbonat	0–29%
Natriumbicarbonat	0–20%
Natriumperboratmonohydrat	0–15%
Tetraacetylethylendiamin (TAED)	0–6%
Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer	0–5%
Ton	1–3%
Poly(aminosäuren)	0–20%
Natriumpolyacrylat	0–8%
Enzyme	0,0001–0,1%

4) PULVERZUSAMMENSETZUNG FÜR GESCHIRRSPÜLAUTOMATEN

Nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel	1–2%
Zeolith MAP	15–42%
Natriumdisilicat	30–34%
Natriumcitrat	0–12%
Natriumcarbonat	0–20%
Natriumperboratmonohydrat	7–15%
Tetraacetylethylendiamin (TAED)	0–3%
Polymer	0–4%
Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer	0–5%
Organisches Phosphonat	0–4%
Ton	1–2%
Enzyme	0,0001–0,1%
Natriumsulfat	Rest

5) PULVERZUSAMMENSETZUNG FÜR GESCHIRRSPÜLAUTOMATEN

Nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel	1–7%
Natriumdisilicat	18–30%
Trinatriumcitrat	10–24%
Natriumcarbonat	12–20%
Monopersulfat (2 KHSO₅·KHSO₄·K₂SO₄)	15–21%
Bleichstabilisator	0,1–2%
Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer	0–6%
Diethylentriaminpentaacetat, Pentanatriumsalz	0–2,5%
Enzyme	0,0001–0,1%
Natriumsulfat, Wasser	Rest

6) PULVERFÖRMIGE UND FLÜSSIGE GESCHIRRSPÜLZUSAMMENSETZUNG MIT EINEM OBERFLÄCHENAKTIVEN REINIGUNGSSYSTEM

Nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel	0–1,5%
Octadecyldimethylamin-N-oxiddihydrat	0–5%
80:20 Gew. C18/C16-Mischung von Octadecyldimethylamin-N-Oxid- dihydrat und Hexadecyldimethylamin-N-oxiddihydrat	0–4%
70:30 Gew. C18/C16-Mischung von wasserfr. Octadecyl-bis(hydroxyethyl)amin-N-oxid und wasserfr. Hexadecyl-bis-(hydroxyethyl)amin-N-oxid	0–5%
C₁₃-C₁₅-Alkylethoxysulfat mit einem durchschnittlichen Ethoxylierungsgrad von 3	0–10%
C₁₂-C₁₅-Alkylethoxysulfat mit einem durchschnittlichen Ethoxylierungsgrad von 3	0–5%
C₁₃-C₁₅-ethoxylierter Alkohol mit einem durchschnittlichen Ethoxylierungsgrad von 12	0–5%
Eine Mischung von C₁₂-C₁₅-ethoxylierten Alkoholen mit einem durchschnittlichen Ethoxylierungsgrad von 9	0–6,5%
Eine Mischung von C₁₃-C₁₅-ethoxylierten Alkoholen mit einem durchschnittlichen Ethoxylierungsgrad von 30	0–4%
Natriumdisilicat	0–33%
Natriumtripolyphosphat	0–46%
Natriumcitrat	0–28%
Zitronensäure	0–29%
Natriumcarbonat	0–20%
Natriumperboratmonohydrat	0–11,5%
Tetraacetylethylendiamin (TAED)	0–4%
Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer	0–7,5%
Natriumsulfat	0–12,5%
Enzyme	0,0001–0,1%

7) NICHT-WÄSSRIGE FLÜSSIGE ZUSAMMENSETZUNG FÜR GESCHIRRSPÜLAUTOMATEN

Flüssiges nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (z.B. Alkoholethoxylate)	2,0–10,0%
Alkalimetallsilicat	3,0–15,0%
Alkalimetallphosphat	20,0–40,0%
Flüssiger Träger, ausgewählt aus höheren Glycolen, Polyglycolen, Polyoxiden, Glycolethern	25,0–45,0%
Stabilisator (z.B. ein Teilester von Phosphorsäure und einem C₁₆-C₁₈-Alkanol)	0,5–7,0%
Schaumunterdrücker (z.B. Silicon)	0–1,5%
Enzyme	0,0001–0,1%

8) NICHT-WÄSSRIGE FLÜSSIGE GESCHIRRSPÜLZUSAMMENSETZUNG

Flüssiges nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (z.B. Alkoholethoxylat)	2,0–10,0%
Natriumsilicat	3,0–15,0%
Alkalimetallcarbonat	7,0–20,0%
Natriumcitrat	0,0–1,5%
Stabilizierungssystem (z.B. Gemische von fein verteiltem Silicon und Dialkylpolyglycolethern mit niedrigem Molekulargewicht)	0,5–7,0%
Polyacrylatpolymer mit niedrigem Molekulargewicht	5,0–15,0%
Ton-Gelverdickungsmittel (z.B. Bentonit)	0,0–10,0%
Hydroxypropylcellulosepolymer	0,0–0,6%
Enzyme	0,0001–0,1%
Flüssiger Träger, ausgewählt aus höheren Glycolen, Polyglycolen, Polyoxiden und Glycolethern	Rest

9) THIXOTROPE FLÜSSIGE ZUSAMMENSETZUNG FÜR GESCHIRRSPÜLAUTOMATEN

C₁₂-C₁₄-Fettsäure	0–0,5%
Oberflächenaktives Blockklopolymer	1,5–15,0%
Natriumcitrat	0–12%
Natriumtripolyphosphat	0–15%
Natriumcarbonat	0–8%
Aluminiumtristearat	0–0,1%
Natriumcumolsulfonat	0–1,7%
Polyacrylatverdickungsmittel	1,32–2,5%
Natriumpolyacrylat	2,4–6,0%
Borsäure	0–4,0%
Natriumformiat	0–0,45%
Calciumformiat	0–0,2%
Natrium-n-decydiphenyloxiddisulfonat	0–4,0%
Monoethanolamin (MEA)	0–1,86%
Natriumhydroxid (50%)	1,9–9,3%
1,2-Propandiol	0–9,4%
Enzyme	0,0001–0,1%
Seifenschaumunterdrücker, Farbstoff, Parfüms, Wasser	Rest

10) FLÜSSIGE ZUSAMMENSETZUNG FÜR GESCHIRRSPÜLAUTOMATEN

Alkoholethoxylat	0–20%
Fettsäureestersulfonat	0–30%
Natriumdodecylsulfat	0–20%
Alkylpolyglykosid	0–21%
Ölsäure	0–10%
Natriumdisilicatmonohydrat	18–33%
Natriumcitratdihydrat	18–33%
Natriumstearat	0–2,5%
Natriumperboratmonohydrat	0–13%
Tetraacetylethylendiamin (TAED)	0–8%
Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer	4–8%
Enzyme	0,0001–0,1%

11) FLÜSSIGE ZUSAMMENSETZUNG FÜR GESCHIRRSPÜLAUTOMATEN, ENTHALTEND GESCHÜTZTE BLEICHTEILCHEN

Natriumsilicat	5–10%
Tetrakaliumpyrophosphat	15–25%
Natriumtriphosphat	0–2%
Kaliumcarbonat	4–8%
Geschützte Bleichteilchen, z.B. Chlor	5–10%
Polymeres Verdickungsmittel	0,7–1,5%
Kaliumhydroxid	0–2%
Enzyme	0,0001–0,1%
Wasser	Rest

11) Zusammensetzungen für Geschirrspülautomaten, wie in 1), 2), 3), 4), 6) und 10) beschrieben, wobei Perborat durch Percarbonat ersetzt wurde.
12) Zusammensetzungen für Geschirrspülautomaten, wie in 1)–6) beschrieben, die zusätzlich einen Mangankatalysator enthalten. Der Mangankatalysator kann z.B. eine der in „Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, S. 637–639, beschriebenen Verbindungen sein.
Eine α-Amylase-Variante der Erfindung kann in herkömmlich in Detergenzien eingesetzten Konzentrationen eingebracht werden. Es wird gegenwärtig erwogen, dass in der Detergenszusammensetzung der Erfindung die α-Amylase-Variante in einer Menge, entsprechend 0,00001–1 mg (berechnet als reines Enzymprotein) einer α-Amylase pro Liter Wasch-/Geschirrspüllauge, zugesetzt werden kann.
Die vorliegende Erfindung wird weiter mit Bezug auf die beiliegende Zeichnung beschrieben, in welcher:
1 ein Abgleich der Aminosäuresequenzen für vier Ursprungs-α-amylasen in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist. Die Zahlen am äußersten linken Ende bezeichnen die jeweiligen Aminosäuresequenzen wie folgt:

1: die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz;
2: die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz;
3: die in SEQ ID Nr. 3 dargestellte Aminosäuresequenz; und
4: die in SEQ ID Nr. 7 dargestellte Aminosäuresequenz.

Die Zahlen am äußersten rechten Ende der Figur geben die fortlaufende Gesamtanzahl von Aminosäuren für jede der fraglichen Sequenzen an. Es sollte angemerkt werden, dass für die Sequenz mit der Nummer 3 (entsprechend der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz) die Abgleichsergebnisse in „Lücken" an den Positionen, entsprechend der Aminosäure Nr. 1 bzw. Aminosäure Nr. 175, in den Sequenzen mit der Nummer 1 (SEQ ID Nr. 1), 2 (SEQ ID Nr. 2) und 4 (SEQ ID Nr. 7) führt.
2 ist eine Restriktionsabbildung des Plasmids pTVB 106.
3 ist eine Restriktionsabbildung des Plasmids pPM103.
4 ist eine Restriktionsabbildung des Plasmids pTVB 112.
5 ist eine Restriktionsabbildung des Plasmids pTVB 114.
EXPERIMENTALTEIL
Die Herstellung, Reinigung und Sequenzierung der Ursprungs-α-amylasen mit den in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenzen (von den Bacillus-Stämmen NCIB 12512 bzw. NCIB 12513) ist in WO 95/26397 beschrieben. Die pI-Werte und Molekulargewichte dieser beiden Ursprungs-α-amylasen (angegeben in WO 95/26397 ) lauten wie folgt: SEQ ID Nr. 1: pI etwa 8,8–9,0 (bestimmt durch isoelektrisches Fokussieren auf LKB-Ampholine^TM-PAG-Platten); Molekulargewicht etwa 55 kD (bestimmt durch SDS-PAGE).
SEQ ID Nr. 2: pI etwa 5,8 (bestimmt durch isoelektrisches Fokussieren auf LKB-Ampholine^TM-PAG-Platten); Molekulargewicht etwa 55 kD (bestimmt durch SDS-PAGE).
Reinigung von α-Amylase-Varianten der Erfindung
Die Konstruktion und Expression von erfindungsgemäßen Varianten ist im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben. Die Reinigung von Varianten der Erfindung ist hier in Bezug auf Varianten der in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenzen veranschaulicht:
Reinigung von Varianten der SEQ ID Nr. 1 (pI etwa 9,0): Die die exprimierte α-Amylase-Variante enthaltende Fermentationsflüssigkeit wird filtriert, und Ammoniumsulfat wird auf eine Konzentration von 15%iger Sättigung zugesetzt. Die Flüssigkeit wird dann auf eine hydrophobe Säule (Toyopearl Butyl/TOSOH) aufgebracht. Die Säule wird mit 20 mM Dimethylglutarsäurepuffer, pH 7,0, gewaschen. Die α-Amylase ist sehr eng gebunden und wird mit 25 Gew.-% 2-Propanol in 20 mM Dimethylglutarsäurepuffer, pH 7,0, eluiert. Nach der Flution wird das 2-Propanol durch Abdampfen entfernt und das Konzentrat auf einen Kationenaustauscher (S-Sepharose^TM FF, Pharmacia, Schweden), äquilibriert mit 20 mM Dimethylglutarsäurepuffer, pH 6,0, aufgebracht.
Die Amylase wird unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0–250 mM NaCl im selben Puffer eluiert. Nach der Dialyse gegen 10 mM Borat/KCl-Puffer, pH 8,0, wird die Probe auf pH 9,6 eingestellt und auf einen Anionenaustauscher (Q-Sepharose^TM FF, Pharmacia), äquilibriert mit 10 mM Borat/KCl-Puffer, pH 9,6, aufgebracht. Die Amylase wird unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0–250 mM NaCl eluiert. Der pH-Wert wird auf 7,5 eingestellt. Die Amylase ist, wie durch rSDS-PAGE beurteilt, rein. Alle Puffer enthalten 2 mM CaCl, zum Stabilisieren der Amylase.
Reinigung von Varianten der SEQ ID Nr. 2 (pI etwa 5,8): Die die exprimierte α-Amylase-Variante enthaltende Fermentationsflüssigkeit wird filtriert, und Ammoniumsulfat wird auf eine Konzentration von 15%iger Sättigung zugesetzt. Die Flüssigkeit wird dann auf eine hydrophobe Säule (Toyopearl Butyl/TOSOH) aufgebracht. Die gebundene Amylase wird mit einem linearen Gradienten von 15–0 Gew.-% Ammoniumsulfat in 10 mM Tris-Puffer, pH 8,0, eluiert. Nach der Dialyse des Eluats gegen 10 mM Borat/KCl-Puffer, pH 8,0, wird die Flüssigkeit auf pH 9,6 eingestellt und auf einen Anionenaustauscher (Q-Sepharose^TM FF, Pharmacia), äquilibriert mit demselben Puffer, aufgebracht. Die Amylase wird unter Verwendung von 150 mM NaCl schrittweise eluiert.
Nach der Flution wird die Amylaseprobe gegen denselben Puffer, pH 8,0, dialysiert, um das NaCl zu entfernen. Nach der Dialyse wird der pH-Wert auf 9,6 eingestellt und die Amylase noch einmal an den Anionenaustauscher gebunden. Die Amylase wird unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0–250 mM NaCl eluiert. Der pH-Wert wird auf 7,5 eingestellt. Die Amylase ist, wie durch rSDS-PAGE beurteilt, rein. Alle Puffer enthalten 2 mM CaCl, zum Stabilisieren der Amylase.
Bestimmung der α-Amylase-Aktivität
Die α-Amylase-Aktivität wird durch ein Verfahren unter Einsatz von Phadebas^®-Tabletten als Substrat bestimmt. Phadebas-Tabletten (Phadebas^® Amylase Test, geliefert von Pharmacia Diagnostic) enthalten ein vernetztes unlösliches blaugefärbtes Stärkepolymer, das mit Rinderserumalbumin und einer Puffersubstanz gemischt und tablettiert wurde. Zur Bestimmung von jeder einzelnen Messung wird eine Tablette in einem Röhrchen, enthaltend 5 ml 50 mM Britton-Robinson-Puffer (50 mM Essigsäure, 50 mM Phosphorsäure, 50 mM Borsäure, 0,1 mM CaCl₂, pH-Wert eingestellt mit NaOH auf einen Wert von Interesse) suspendiert. Der Test wird in einem Wasserbad bei der Temperatur von Interesse durchgeführt. Die zu testende α-Amylase wird × ml 50 mM Britton-Robinson-Puffer verdünnt. 1 ml dieser α-Amylase-Lösung wird zu den 5 ml 50 mM Britton-Robinson-Puffer zugesetzt. Die Stärke wird durch die α-Amylase unter Erhalt von blauen Fragmenten hydrolysiert. Die spektrofotometrisch bei 620 nm gemessene Absorption der erhaltenen blauen Lösung ist eine Funktion der α-Amylase-Aktivität.
Es ist wichtig, dass die gemessene Absorption bei 620 nm nach 15-minütiger Inkubation (Testzeit) im Bereich von 0,2 bis 2,0 Absorptionseinheiten bei 620 nm liegt. In diesem Absorptionsbereich liegt eine Linearität zwischen Aktivität und Absorption vor (Lambert-Beer-Gesetz). Die Verdünnung des Enzyms muss deshalb derart eingestellt werden, dass dieses Kriterium erfüllt wird.
Unter einem spezifischen Satz an Bedingungen (Temperatur, pH-Wert, Reaktionszeit, Pufferbedingungen hydrolysiert 1 mg einer vorgegebenen α-Amylase eine bestimmte Menge Substrat, und eine blaue Farbe wird hergestellt. Die Farbintensität wird bei 620 nm gemessen. Die gemessene Absorption ist direkt proportional zu der spezifischen Aktivität (Aktivität/mg reines α-Amylase-Protein) der fraglichen α-Amylase unter dem vorgegebenen Satz an Bedingungen. Folglich kann das Testen von unterschiedlichen α-Amylasen von Interesse (einschließlich einer Bezugs-α-Amylase, in diesem Falle der fraglichen Ursprungs-α-amylase) unter identischen Bedingungen, die spezifische Aktivität von jeder der α-Amylasen bei einer vorgegebenen Temperatur und einem vorgegebenen pH-Wert direkt verglichen und das Verhältnis der spezifischen Aktivität von jeder der α-Amylasen von Inte resse in Bezug zu der spezifischen Aktivität der Bezugs-α-Amylase bestimmt werden.
Minigeschirrspültest
Der folgende Minigeschirrspültest wurde verwendet: Eine Suspension aus stärkehaltigem Material wurde gekocht und auf 20°C abgekühlt. Die abgekühlte Stärkesuspension wurde auf kleine, einzeln gekennzeichnete Glasplatten (etwa 2 × 2 cm) aufgebracht und bei einer Temperatur von ca. 140°C in einer Trockenkammer getrocknet. Die einzelnen Platten wurden dann gewogen. Für Testzwecke wurde eine Lösung aus einem europäischen Standard-Detergens für Geschirrspülautomaten (5 g/l) mit einer Temperatur von 55°C hergestellt. Man ließ das Detergens 1 Minuten auflösen, wonach die fragliche α-Amylase der Detergenslösung (enthalten in einem Becherglas, ausgestattet mit einer magnetischen Rührung) derart zugesetzt wurde, dass eine Enzymkonzentration von 0,5 mg/l erhalten wurde. Gleichzeitig wurden die gewogenen Glasplatten, gehalten in kleinen Stützklemmen, in im Wesentlichen senkrechter Position in eine α-Amylase/Detergens-Lösung getaucht, die dann für eine Dauer von 15 Minuten bei 55°C gerührt wurde. Die Glasplatten wurden dann aus der α-Amylase/Detergens-Lösung entfernt, mit destilliertem Wasser gespült, bei 60°C in einer Trockenkammer getrocknet und erneut gewogen. Die Leistungsfähigkeit der fraglichen α-Amylase [ausgedrückt als Index in Bezug auf eine ausgewählte Bezugs-α-Amylase (Index 100) – wobei in dem nachstehenden Beispiel (Beispiel 1) die Ursprungs-α-amylase die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz aufwies] wurde dann aus der Differenz des Gewichts der Glasplatten vor und nach der Behandlung wie folgt bestimmt:
Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiter die vorliegende Erfindung. Sie sollen keinesfalls den wie beanspruchten Umfang der Erfindung beschränken.
BEISPIEL 1
Minigeschirrspültest von Varianten der Ursprungs-α-amylase mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz
Der vorstehend beschriebene Minigeschirrspültest wurde bei pH 10,5 mit der Ursprungs-α-Amylase mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz und den folgenden Varianten davon (deren Konstruktion und Reinigung nachstehend beschrieben ist): T183^* + G184^*; Y243F; und K269R, durchgeführt. Der Test ergab die folgenden Ergebnisse:

Ursprung (SEQ ID Nr. 1) Index: 100

T183^* + G184^* Index: 120

Y243F Index: 120

K269R Index: 131
Es ist klar, dass jede der getesteten Varianten T183^* + G184^* (die u.a. eine höhere Wärmestabilität als die Ursprungs-α-amylase zeigt), Y243F (die eine niedrigere Calciumionenabhängigkeit als die Ursprungs-α-amylase zeigt) und K269R (die eine niedrigere Calciumionenabhängigkeit und höhere Stabilität bei hohem pH als die Ursprungs-α-amylase zeigt) eine deutlich verbesserte Leistungsfähigkeit beim Geschirrspülen in Bezug auf die Ursprungs-α-amylase zeigen.
BEISPIEL 2
Konstruktion von Varianten der Ursprungs-α-amylasen mit den in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenzen
Primer: DNA-Primer, die bei der Konstruktion von Varianten, wie nachstehend beschrieben, eingesetzt wurden, schließen die folgenden ein [alle DNA-Primer sind in der Richtung von 5' bis 3' (links nach rechts) geschrieben; P bedeutet ein 5'-Phosphat]:

#7113:
GCT GCG GTG ACC TCT PTA AAA AAT AAC GGC

Y296:
CC ACC GCT ATT AGA TGC ATT GTA C

#6779:
CTT ACG TAT GCA GAC GTC GAT ATG GAT CAC CC

#6778:
G ATC CAT ATC GAC GTC TGC ATA CGT AAG ATA GTC

#3811:
TT A(C/G)G GGC AAG GCC TGG GAC TGG

#7449: C CCA GGC CTT GCC C(C/G)T AAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG

#3810:
G GTT TCG GTT CGA AGG ATT CAC TTC TAC CGC

#7450:
GCG GTA GAA GTG AAT CCT TCG AAC CGA AAC CAG

B1:
GGT ACT ATC GTA ACA ATG GCC GAT TGC TGA CGC TGT TAT TTG C

#6616:
P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C

#8573:
CTA CTT CCC AAT CCC AAG CTT TAC CTC GGA ATT TG

#8569:
CAA ATT CCG AGG TAA AGC TTG GGA TTG GGA AGT AG

#8570:
TTG AAC AAC CGT TCC ATT AAG AAG
A: Konstruktion von Varianten der Ursprungs-α-amylase mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz
Beschreibung von Plasmid pTVB106: Die Ursprungs-α-amylase mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz und Varianten davon werden aus einem Plasmid- getragenen Gen, SF16, dargestellt in 2, exprimiert. Das Plasmid, pTVB106, enthält einen Replikationsursprung, erhalten von Plasmid pUB110 (Gryczan et al., 1978), und das cat-Gen, das Resistenz gegen Chloramphenicol verleiht. Eine Sezernierung der Amylase wird durch die Termamyl^TM-Signalsequenz unterstützt, die genau verbunden ist, d.h. Kodon Nr. 1 des reifen Proteins, an das Gen, das die Ursprungs-α-amylase mit dem/der in SEQ ID Nr. 4 bzw. SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nukleotid und Aminosäuresequenz (reifes Protein) kodiert. Der Termamyl-Promotor initiiert die Transkription des Gens.
Plasmid pPVB106 gleicht pDN1528 (siehe die dänische Patentoffenlegung Nr. 1155/94). Einige einzigartige Restriktionsstellen sind auf der Plasmidabbildung in 2 angegeben, einschließlich BstBI, BamHI, BstEII, EcoM, DrdI, AflIII, DraIII, XmaI, SalI and BglII.
Konstruktion von Variante M202T: Das PCR-Überlappungsverlängerungsmutagenese-Verfahren wird zum Konstruieren dieser Variante verwendet (Higuchi et al., 1988). Ein DNA-Fragment mit etwa 350 bp von pTVB106 wird in einer PCR-Reaktion A unter Verwendung der Primer #7113 und des mutagenen Primers #6778 amplifiziert. In einer ähnlichen PCR-Reaktion B wird ein DNA-Fragment mit etwa 300 bp unter Verwendung der Primer Y296 und #6779 amplifiziert. Das vollständige DNA-Fragment, das die Mutationsstelle (M202) von Primer #7113 bis Primer Y296 umspannt, wird in PCR C unter Verwendung dieser Primer und gereinigter DNA-Fragmente aus den Reaktionen A und B amplifiziert.
PCR-C-DNA wird mit den Restriktionsendonukleasen BstEII und AflIII verdaut, und das Fragment mit 480 bp wird mit Plasmid pTVB 106, verdaut mit denselben Enzymen, ligiert und in einen Stamm von Bacillus subtilis mit geringem Protease- und geringem Amylasegehalt (z.B. Stamm SHA273, erwähnt in WO 92/11357 ) transformiert.
Andere M202-Varianten werden in einer ähnlichen Weise konstruiert.
Konstruktion der Varianten T183^* + G184* und R181^* + G182^*: Das PCR-Überlappungsverlängerungsmutagenese-Verfahren wird zum Konstruieren dieser Varianten verwendet (Higuchi et al., 1988). Die mutagenen Oligonukleotide werden unter Verwendung eines Gemischs (gleiche Teile) von C und G in einer Position synthetisiert; zwei unterschiedliche Mutationen können deshalb durch dieses Verfahren konstruiert werden. Ein DNA-Fragment mit etwa 300 bpvon pTVB 106 wird in einer PCR-Reaktion A unter Verwendung der Primer #7113 und des mutagenen Primers #7449 amplifiziert. In einer ähnlichen PCR-Reaktion B wird ein DNA-Fragment mit etwa 400 bp unter Verwendung der Primer Y296 und #3811 amplifiziert. Das vollständige DNA-Fragment, das die Mutationsstelle (Aminosäuren 181–184) von Primer #7113 bis Primer Y296 umspannt, wird in PCR C unter Verwendung dieser Primer und gereinigter DNA-Fragmente aus den Reaktionen A und B amplifiziert.
PCR-C-DNA wird mit den Restriktionsendonukleasen BstEII und AflIII verdaut, und das Fragment mit 480 bp wird mit Plasmid pTVB106 ligiert, mit denselben Enzymen verdaut und in einen Stamm von B. subtilis mit niedrigem Protease- und niedrigem Amylasegehalt (z.B. Stamm SHA273, erwähnt in WO 92/11357 ) transformiert. Das Sequenzieren von Plasmid-DNA aus diesen Transformanten identifiziert zwei korrekte Mutationen: d.h. R181^* + G182^* und T183^* + G184*.
Konstruktion der Variante R124P: Das PCR-Überlappungsverlängerungsmutagenese-Verfahren wird zum Konstruieren dieser Variante in einer ähnlichen Weise wie die Konstruktion der Variante M202T (siehe vorstehend) verwendet. Die PCR-Reaktion A (mit den Primer #3810 und B1) bildet ein Fragment mit etwa 500 bp, und die PCR-Reaktion B (Primer 7450 und Y296) bildet ein Fragment mit etwa 550 bp. Die PCR-Reaktion C auf der Basis des Produkts der PCR-Reaktion A und B und der Primer B1 und Y296 wird mit Restriktionsendonukleasen BstEII und AflIII verdaut, und das erhaltene Fragment mit 480 bp, das Aminosäureposition 124 umspannt, wird in pTVB 106, verdaut mit denselben Enzymen, subkloniert und in B. subtilis, wie vorstehend beschrieben, transformiert.
Konstruktion der Variante R124P + T183^* + G184^*: Für die Konstruktion der Variante, die die Mutationen R124P und T183^* + G184^* kombiniert, wurden zwei EcoM-Restriktionsstellen (eine lokalisiert an Position 1,774 kb, d.h. zwischen der Mutation R124P und der Mutation T183^* + G184^*, und eine lokalisiert an Position 0,146 kb) verwendet. Das EcoNI-Fragment mit etwa 1630 bp des pTVB106-artigen Plasmids, enthaltend die Mutation T183^* + G184^* wurde in den Vektorteil (ein DNA-Fragment mit etwa 3810 bp, enthaltend den Replikationsursprung) eines anderen pTVB106-artigen Plasmids, enthaltend die Mutation R124P, verdaut mit demselben Enzym, subkloniert. Die Transformation in Bacillus subtilis wurde, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt.
Konstruktion der Varianten G182^* + G184^*; R181^* + T183^*; Y243F; K269R; und L351C + M430C: Diese Varianten wurden wie folgt konstruiert:
Ein spezifischer Mutagenesevektor, enthaltend einen Hauptteil der kodierenden Region für die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz, wurde hergestellt. Die wichtigen Merkmale dieses Vektors (der als pPM103 bezeichnet ist) schließen einen Replikationsursprung, abgeleitet vom pUC-Plasmid, das cat-Gen, das Resistenz gegen Chloramphenicol verleiht, und eine Rahmenverschiebungsmutation-enthaltende Version des bla-Gens, deren Wildtyp-Version normalerweise Resistenz gegen Ampicillin verleiht (amp^R-Phänotyp), ein. Diese mutierte Version des bla-Gens führt zu einem amp^s-Phänotyp. Das Plasmid pPM103 ist in 3 dargestellt, und der Replikationsursprung von E. coli, die 5'-verkürzte Version des SF16-Amylasegens und ori, bla, cat und ausgewählte Restriktionsstellen sind auf dem Plasmid angegeben.
Mutationen werden in das Gen von Interesse, wie beschrieben von Deng und Nickoloff [Anal. Biochem. 200 (1992), S. 81–88] eingebracht, außer dass Plasmide, in welche der „Selektionsprimer” (#6616) eingebracht ist, auf der Basis des amp^R-Phänotyps von transformierten Zellen von E. coli, die ein Plasmid mit einem reparierten bla-Gen beherbergten, statt der von Deng und Nickoloff umrissenen Verwendung der Selektion durch Restriktionsenzymverdau beherbergten, ausgewählt werden. Chemikalien und Enzyme, die zur Mutagenese verwendet wurden, wurden von dem Chameleon-Mutagenese-Kit von Strategene (Katalognummer 200509) erhalten.
Nach dem Nachweis der DNA-Sequenz in Variantplasmiden, wird das verkürzte Gen, enthaltend die gewünschte Abänderung, von dem pPM103-artigen Plasmid in pTVB106 als BstBI-SaII-Fragment mit etwa 1440 bp subkloniert und in Bacillus subtilis zur Expression des Variantenenzyms transformiert.
Für die Konstruktion der Variante mit der paarweisen Deletion G182^* + G184^* wurde der folgende Mutageneseprimer verwendet:
P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT TGT CCT GAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG AAG
Für die Konstruktion der Variante mit der paarweisen Deletion R181* + T183^* wurde der folgende Mutageneseprimer verwendet:
P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT GCC TCC GAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG AAG
Für die Konstruktion der Substitutionsvariante Y243F wurde der folgende Mutageneseprimer verwendet:
P ATG TGT AAG CCA ATC GCG AGT AAA GCT AAA TTT TAT ATG TTT CAC TGC ATC
Für die Konstruktion der Substitutionsvariante K269R wurde der folgende Mutageneseprimer verwendet:
P GC ACC AAG GTC ATT TCG CCA GAA TTC AGC CAC TG
Für die Konstruktion der Variante mit der paarweisen Substitution L351C + M430C wurden die folgenden Mutageneseprimer gleichzeitig verwendet:

1) P TGT CAG AAC CAA CGC GTA TGC ACA TGG TTT AAA CCA TTG
2) P ACC ACC TGG ACC ATC GCT GCA GAT GGT GGC AAG GCC TGA ATT

Konstruktion der Variante L351C + M430C + T183^* + G184^*: Diese Variante wurde durch Kombinieren der Mutation mit der paarweisen Substitution L351C + M430C und der Mutation mit der paarweisen Deletion T183^* + G184^* durch Subklonieren eines HindIII-AfIIII-Fragments mit etwa 1430 bp, enthaltend L351C + M430C, in ein pTVB106-artiges Plasmid (mit den Mutationen T183^* + G184^*), verdaut mit denselben Enzymen, konstruiert.
Konstruktion der Variante Y243F + T183* + G184^*: Diese Variante wurde durch Kombinieren der Mutation Y243F und der Mutation T183^* + G184^* durch Subklonieren eines DrdI-Fragments mit etwa 1148 bp, enthaltend T183^* + G184^*, in ein pTVB106-artiges Plasmid (mit der Mutation Y243), verdaut mit demselben Enzym, konstruiert.
Transformanten von Bacillus subtilis wurden auf α-Amylase-Aktivität auf stärkehaltigen Agarplatten durchgemustert und die Gegenwart der korrekten Mutationen wurde durch DNA-Sequenzieren überprüft.
Konstruktion der Variante Y243F + T183^* + G184^* + L351C + M430C: Die Mutation mit der paarweisen Substitution L352C + M430C wurde als XmaI-SaII--Fragment mit etwa 470 bp in einen TVB106-artigen Vektor (enthaltend Y243F + T183^* + G184^*), verdaut mit denselben Enzymen, subkloniert.
Konstruktion der Variante Y243F + T183^* + G184^* + L351C + M430C + Q391E + K444Q: Ein pPM103-artiger Vektor, enthaltend die Mutationen Y243F + T183^* + G184^* + L351C + M430C, wurde durch Substituieren der verkürzten Version von SF 16 in pPM103 mit dem BstB1-SaII-Fragment des pTVB106-artigen Vektors, enthaltend die fünf fraglichen Mutationen, konstruiert. Die Mutationen Q391 E und K444Q wurden gleichzeitig in den pPM103-artigen Vektor (enthaltend Y243F + T183^* + G184^* + L351C + M430C) durch die Verwendung der folgenden zwei Mutageneseprimer in einer ähnlichen Weise wie die vorstehend beschriebene Mutagenese an pPM103 eingebracht.
P GGC AAA AGT TTG ACG TGC CTC GAG AAG AGG GTC TAT
P TTG TCC CGC TTT ATT CTG GCC AAC ATA CAT CCA TTT
B: Konstruktion von Varianten der Ursprungs-α-amylase mit der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz
Beschreibung von Plasmid pTVB112: Ein Vektor, bezeichnet mit pTVB112, wurde zur Expression der α-Amylase mit der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz in B. subtilis konstruiert. Dieser Vektor gleicht dem pTVB106 sehr, außer dass das Gen, das die reife α-Amylase in SEQ ID Nr. 2 kodiert, zwischen der PstI- und der HindIII-Stelle in pTVB106 eingefügt ist. Folglich wird die Expression dieser α-Amylase (SEQ ID Nr. 2) auch durch den amyL-Promotor und die Signalsequenz geleitet. Das Plasmid pTVB112 ist in 4 dargestellt.
Konstruktion der Variante D183^* + G184^*: Die Konstruktion dieser Variante wurde unter Verwendung des vorher genannten PCR-Überlappungsverlängerungsmutagenese-Verfahrens (siehe vorstehend) erzielt. Die Primer #8573 und B1 wurden in der PCR-Reaktion A verwendet und die Primer #8569 und #8570 wurden in der PCR-Reaktion B verwendet. Die gereinigten Fragmente aus Reaktion A und Reaktion B und die Primer 1B und #8570 wurden in der PCR-Reaktion C verwendet, was zu einem DNA-Fragment mit etwa 1020 bp führte. Dieses Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen PstI und MIuI verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert und in B. subtilis transformiert.
Konstruktion von weiteren Varianten: Analog zur Konstruktion (siehe vorstehend) des Plasmids pPM103, das bei der Herstellung der Mutanten der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 verwendet wurde, wurde ein Plasmid (mit der Bezeichnung pTVB114; dargestellt in 5) für die fortgesetzte Mutagenese von Variante D183^* + G184^* (SEQ ID Nr. 2) konstruiert. Mutationen wurden in pTVB114 (SEQ ID Nr. 2; D183^* + G184^*) in einer ähnlichen Weise wie diejenige für pPM103 (SEQ ID Nr. 1) eingebracht.
Für die Konstruktion der Variante mit der paarweisen Deletion R181^* + D183^* und R181^* + G182^* wurde ausgewählt, die eingrenzenden Aminosäuren in der Variante D183^* + G184^* abzuändern, statt die spezifizierten Aminosäuren im Wildtyp-Gen für SEQ ID Nr. 2 zu deletieren. Der folgende Mutageneseprimer wurde für die Mutagenese mit pTVB 114 als Templat verwendet:
PCC CAA TCC CAA GCT TTA CCA (T/C)CG AAC TTG TAG ATA CG
Die Gegenwart eines Gemischs aus zwei Basen (T/C) an einer Position ermöglicht die Gegenwart von zwei verschiedenen Deletioneingrenzungsaminosäuren auf der Basis eines Mutageneseprimers. Das DNA-Sequenzieren der erhaltenen Plasmide verifiziert die Gegenwart von entweder der einen oder der anderen Mutation. Das mutierte Gen von Interesse wird als ein PstI-DraIII-Fragment in pTVB112, verdaut mit denselben Enzymen, subkloniert, und in B. subtilis transformiert.
Für die Konstruktion von G182^* + G184^* und R181^* + G184^* wurde der folgende Mutageneseprimer mit pTVB114 als Templat verwendet:
PCC CAA TCC CAA GCT TTA TCT C(C/G)G AAC TTG TAG ATA CG
Wie vorstehend, ermöglicht die Gegenwart eines Gemischs aus zwei Basen (C/G) an einer Position die Gegenwart von zwei verschiedenen Deletioneingrenzungsaminosäuren auf der Basis eines Mutageneseprimers. Das DNA-Sequenzieren der erhaltenen Plasmide verifiziert die Gegenwart von entweder der einen oder der anderen Mutation. Das mutierte Gen von Interesse wird als PstI-DraIII-Fragment in pTVB112, verdaut mit denselben Enzymen, subkloniert und in B. subtilis transformiert.
Für die Konstruktion von D183^* + G184^* + M202L wurde der folgende Mutageneseprimer verwendet:
PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAC AGT AAA TAA TC
Für die Konstruktion von D183^* + G184^* + M202I wurde der folgende Mutageneseprimer verwendet:
PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAA ATT AAA TAA TC
BEISPIEL 3
Bestimmung der Oxidationsstabilität der Substitutionsvarianten M202 der Ursprungs-α-amylasen mit den in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenzen
A: Oxidationsstabilität von Varianten der Sequenz in SEQ ID Nr. 1
Die Messungen wurden unter Verwendung von Lösungen der jeweiligen Varianten in 50 mM Britton-Robinson-Puffer (50 mM Essigsäure, 50 mM Phosphorsäure, 50 mM Borsäure, 0,1 mM CaCl₂, pH-Wert eingestellt mit NaOH auf den Wert von Interesse), pH 9,0, welchem Wasserstoffperoxid zugesetzt wurde (zum Zeitpunkt t = 0), um eine Endkonzentration von 200 mM H₂O₂ zu erhalten, durchgeführt. Die Lösungen wurden dann bei 40°C in einem Wasserbad inkubiert.
Nach der Inkubation für eine Dauer von 5, 10, 15 und 20 Minuten nach der Zugabe von Wasserstoffperoxid wurde die α-Amylase-Restaktivität unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Phadebas-Tests gemessen. Die Restaktivität in den Proben wurde unter Verwendung von 50 mM Britton-Robinson-Puffer, pH 7,3, bei 37°C gemessen (siehe Novo analytische Publikation AF207-1/1, erhältlich auf Anfrage von Novo Nordisk A/S). Der Aktivitätsabfall wurde in Bezug auf eine entsprechende Bezugslösung desselben Enzyms bei 0 Minuten, die mit Wasserstoffperoxid nicht inkubiert wurde (100%ige Aktivität) gemessen.

Der Prozentanteil der anfänglichen Aktivität als Zeitfunktion ist in der nachstehenden Tabelle für das Ursprungsenzym (SEQ ID Nr. 1) und für die fraglichen Varianten dargestellt.

Variante	% Aktivität nach Inkubation für (Minuten)
	0	5	10	15	20
M202L	100	90	72	58	27
M202F	100	100	87	71	43
M202A	100	99	82	64	30
M202I	100	91	75	59	28
M2O2T	100	87	65	49	20
M202V	100	100	87	74	43
M202S	100	100	85	68	34
Ursprung	100	51	26	13	2

Alle der getesteten Substitutionsvarianten M202 zeigen klar eine deutlich verbesserte Stabilität gegenüber Oxidation in Bezug auf die Ursprungs-α-amylase (SEQ ID Nr. 1).
B: Oxidationsstabilität von Varianten der Sequenz in SEQ ID Nr. 2
Messungen wurden, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung der fraglichen Ursprungs-α-amylase (SEQ ID Nr. 2), der Variante M202L + D183^* + G184* (bezeichnet in der nachstehenden Tabelle mit L) bzw. der Variante M202I + D183* + G184^* (bezeichnet in der nachstehenden Tabelle mit I) durchgeführt. In diesem Fall wurden Inkubationszeiten (nach der Zugabe von Wasserstoffperoxid) von 5, 10, 15 und 30 Minuten eingesetzt. Wie in der vorstehenden Tabelle ist der Prozentanteil der anfänglichen Aktivität als Zeitfunktion in der nachstehenden Tabelle für das Ursprungsenzym und für die fraglichen Varianten dargestellt.

Variante % Aktivität nach Inkubation für (Minuten)

0 5 10 15 30

L 100 91 85 71 43

I 100 81 61 44 18

Ursprung 100 56 26 14 4
Die zwei getesteten Varianten mit der „Substitution + paarweisen Deletion" (die beide die Substitution M202 umfassen), zeigen klar eine deutliche verbesserte Stabilität gegenüber Oxidation in Bezug auf die Ursprungs-α-amylase (SEQ ID Nr. 2).
BEISPIEL 4
Bestimmung der Wärmestabilität von Varianten der Ursprungs-α-amylasen mit den in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenzen
A: Wärmestabilität von Varianten mit der paarweisen Deletion der Sequenz in SEQ ID Nr. 1
Messungen wurden unter Verwendung von Lösungen der jeweiligen Varianten in 50 mM Britton-Robinson-Puffer (siehe vorstehend), pH 9,0, durchgeführt. Die Lösungen wurden bei 65°C in einem Wasserbad inkubiert und Proben wurden nach der Inkubation für die angegebene Zeitdauer entnommen. Die α-Amylase-Restaktivität von jeder entnommenen Probe wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Phadebas-Tests gemessen. Der Aktivitätsabfall wurde in Bezug auf eine entsprechende Bezugslösung desselben Enzyms bei 0 Minuten, die nicht inkubiert wurde (100%ige Aktivität), gemessen.

Der Prozentanteil der anfänglichen Aktivität als Zeitfunktion ist in der nachstehenden Tabelle für das Ursprungsenzym (SEQ ID Nr. 1) und für die folgenden fraglichen Varianten mit der paarweisen Deletion dargestellt:
Variante 1: R181* + G182*
Variante 2: R181* + T183*
Variante 3: G182* + G184*
Variante 4: T183* + G184*
Variante 5: T183* + G184* + R124P

Variante	% Aktivität nach Inkubation für (Minuten)
	0	5	10	15	30	45	60
1	100	81	66	49	24	14	8
2	100	80	53	39	17	8	3
3	100	64	40	28	10	4	2
4	100	64	43	34	20	8	5
5	100	78	73	66	57	47	38
Ursprung	100	13	2	0	0	0	0

Es ist ersichtlich, dass alle der getesteten Varianten mit der paarweisen Deletion eine deutlich verbesserte Wärmestabilität in Bezug auf die Ursprungs-α-amylase (SEQ ID Nr. 1) zeigen und dass die Wärmestabilität von Variante 5, die zusätzlich zu der Mutation mit der paarweisen Deletion von Variante 4 die Substitution R124P umfasst, deutlich höher als diejenige der anderen Varianten ist. Da kalorimetrische Ergebnisse für die Substitutionsvariante R124P (umfassend nur die Substitution R124P) eine Wärmestabilisation bei etwa 7°C in Bezug auf die Ursprungs-α-amylase zeigen, scheint es, dass die wärmestabilisierenden Wirkungen der Mutation R124P bzw. der paarweisen Deletion einander verstärken.
B: Wärmestabilität der Varianten mit der paarweisen Deletion der Sequenz in SEQ ID Nr. 2
Entsprechende Messungen wurden für das Ursprungsenzym (SEQ ID Nr. 2) und für die folgenden Varianten mit der paarweisen Deletion durchgeführt:
Variante A: D183* + G184*
Variante B: R181* + G182*
Variante C: G182* + G184*

Variante % Aktivität nach Inkubation für (Minuten)

0 5 10 15 30

A 100 87 71 63 30

B 100 113 85 76 58

C 100 99 76 62 34

Ursprung 100 72 55 44 18
Wiederum ist es ersichtlich, dass die fraglichen Varianten mit der paarweisen Deletion eine deutlich verbesserte Wärmestabilität in Bezug auf die Ursprungs-α-amylase (SEQ ID Nr. 2) aufweisen.
C: Wärmestabilität einer Multikombinationsvariante der Sequenz in SEQ ID Nr. 1
Entsprechende vergleichende Messungen wurden auch für die folgenden Varianten der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz durchgeführt:
Variante 4: T183* + G184*
Variante 6: L351C + M430C
Variante 7: Y243F
Variante 8: Q391E + K444Q
Variante 9: T183* + G184* + L351C + M430C + Y243F + Q391E + K444Q

Variante % Aktivität nach Inkubation für (Minuten)

0 5 10 15 30

4 100 66 41 22 7

6 100 87 73 65 43

7 100 14 2 1 0

8 100 69 46 31 14

9 100 92 93 89 82
Wiederum scheint es, dass die wärmestabilisierende Wirkung von mehrfachen Mutationen, von denen jede eine wärmestabilisierende Wirkung aufweist, zumindest qualitativ kumulativ ist.
BEISPIEL 5
Calciumbindungsaffinität von α-Amylase-Varianten der Erfindung
Das Entfalten von Amylasen durch Aussetzung an Wärme oder Denaturanzien, wie Guanidinhydrochlorid, wird von einer Verminderung der Fluoreszenz begleitet. Der Verlust an Calciumionen führt zum Entfalten und die Affinität einer Reihe von α-Amylasen für Calcium kann durch Fluoreszenzmessungen vor und nach der Inkubation von jeder α-Amylase (z.B. bei einer Konzentration von 10 μg/ml) in einem Puffer (z.B. 50 mM HEPES, pH 7) mit unterschiedlichen Calciumkonzentrationen (z.B. im Bereich von 1 μM-100 mM) oder von EGTA (z.B. im Bereich von 1–1000 μM) [EGTA = 1,2-Di(2-aminoethoxy)ethan-N,N,N',N'- tetraessigsäure] für eine ausreichend lange Zeitdauer (wie 22 Stunden bei 55°C) gemessen werden.
Die gemessene Fluoreszenz F ist aus Beiträgen der gefalteten und ungefalteten Formen des Enzyms zusammengesetzt. Die folgende Gleichung kann abgeleitet werden, um die Abhängigkeit von F von der Calciumkonzentration ([Ca]) zu beschreiben: F = [Ca]/(Kdiss + [Ca])(αN – βNlog([Ca])) + Kdiss/(Kdiss + [Ca])(αU – βUlog([Ca]))wobei α_N die Fluoreszenz der nativen (gefalteten) Form des Enzyms ist, β_N die lineare Abhängigkeit von α_N von dem Logarithmus der Calciumkonzentration (wie experimentell beobachtet) ist, α_U die Fluoreszenz der ungefalteten Form ist und β_U die lineare Abhängigkeit von α_U von dem Logarithmus der Calciumkonzentration ist. K_diss ist die scheinbare Calciumbindungskonstante für einen Äquilibriumprozess wie folgt:
Tatsächlich verläuft das Entfalten extrem langsam und ist nicht umkehrbar. Die Geschwindigkeit der Entfaltung hängt von der Calciumkonzentration ab, und die Abhängigkeit für eine vorgegebene α-Amylase stellt ein Maß für die Ca-Bindungsaffinität des Enzyms bereit. Durch Definieren eines Standardsatzes an Reaktionsbedingungen (z.B. 22 Stunden bei 55°C) kann ein bedeutungsvoller Vergleich von K_diss für verschiedene α-Amylasen hergestellt werden. Die Calciumdissoziationskurven für α-Amylasen können im Allgemeinen der vorstehenden Gleichung angepasst werden, was die Bestimmung der entsprechenden Werte für K_diss ermöglicht.

Die folgenden Werte für K_diss wurden für die Ursprungs-α-amylasen mit den in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenzen und für die angegebenen erfindungsgemäßen α-Amylase-Varianten (wobei die α-Amylase in Klammern angegeben ist) erhalten:

Variante	K_diss (mol/l)
D183* + G184* (SEQ ID Nr. 2)	1,2 (±0,5) × 10^–4
L351C + M430C + T183* + G184* (SEQ ID Nr. 1)	1,7 (±0,5) × 10^–3
T183* + G184* (SEQ ID Nr. 1)	4,3 (±0,7) × 10^–3
SEQ ID Nr. 2 (Ursprung)	4,2 (±1,2) × 10^–2
SEQ ID Nr. 1 (Ursprung)	3,5 (±1,1) × 10^–1

Es ist aus Vorstehendem ersichtlich, dass die Calciumbindungsaffinität der letzteren α-amylolytischen Enzyme in einer Stromabwärtsrichtung durch die vorstehende Tabelle abnimmt, d.h. dass die Variante mit der paarweisen Deletion D183^* + G184^* (SEQ ID Nr. 2) Calcium am stärksten bindet (d.h. die niedrigste Calciumabhängigkeit aufweist), während die Ursprungs-α-amylase von SEQ ID Nr. 1 Calcium am wenigstens stark bindet (d.h. die höchste Calciumabhängigkeit aufweist).
IN DER LITERATURBESCHREIBUNG GENANNTE LITERATURANGABEN

Suzuki et al., The Journal of Biological Chemistry, Bd. 264, Nr. 32, Ausgabe vom 15. November, S. 18933–18938 (1989).
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Sequenz Liste

Claims

Variante einer Usprungs-α-amylase, wobei die Ursprungs-α-amylase eine mindestens 80%ige Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 zeigt, wobei die Variante eine Deletion von Aminosäuren umfasst, die mit R179 und G180 der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz äquivalent sind, wobei die Variante α-Amylaseaktivität aufweist und mindestens eine der folgenden Eigenschaften in Bezug auf die Ursprungs-α-amylase zeigt: erhöhte Wärmestabilität, erhöhte Stabilität gegenüber Oxidation und reduzierte Ca²⁺-Abhängigkeit.
Variante gemäß Anspruch 1, wobei mindestens ein oxidierbarer Aminosäurerest der Ursprungs-α-amylase durch einen anderen Aminosäurerest, der weniger oxidationsempfindlich ist als der oxidierbare Aminosäurerest, deletiert oder ersetzt worden ist.
Variante gemäß Anspruch 2, wobei der oxidierbare Aminosäurerest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methionin, Tryptophan, Cystein und Tyrosin.
Variante gemäß Anspruch 3, wobei der Methionin-Rest durch Threonin ersetzt worden ist.
DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, die eine α-Amylase-Variante gemäß einem der Ansprüche 1–4 kodiert.
Rekombinanter Expressionsvektor, der ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 5 trägt.
Wirtszelle, die mit einem DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 5 oder einem Vektor gemäß Anspruch 6 transformiert ist.
Zelle nach Anspruch 7, die ein Mikroorganismus ist.
Zelle nach Anspruch 8, die ein Bakterium oder ein Pilz ist.
Zelle nach Anspruch 8, die ein gramposititves Bakterium wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder ein gramnegatives Bakterium wie E. coli ist.
Verfahren zum Herstellen einer α-Amylase-Variante gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 7–10 unter zur Herstellung der α-Amylase-Variante förderlichen Bedingungen gezüchtet und die α-Amylase-Variante anschließend aus der Kultur erhalten wird.
Verwendung einer α-Amylase-Variante gemäß einem der Ansprüche 1–4 zum Waschen und/oder Geschirrspülen.
Detergenszusatz, der eine α-Amylase-Variante gemäß einem der Ansprüche 1–4, wahlweise in Form eines nicht-stäubenden Granulates, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms umfasst.
Detergenszusatz gemäß Anspruch 13, der 0,02–200 mg Enzymprotein pro Gramm des Zusatzes enthält.
Detergenszusatz gemäß Anspruch 13 oder 14, der ferner ein weiteres Enzym wie eine Protease, eine Lipase, eine Peroxidase, ein weiteres amylolytisches Enzym und/oder eine Cellulase umfasst.
Detergenszusammensetzung, umfassend eine α-Amylase-Variante gemäß einem der Ansprüche 1–4 und ein oberflächenaktives Mittel.
Detergenszusammensetzung gemäß Anspruch 16, die zusätzlich ein weiteres Enzym wie eine Protease, eine Lipase, eine Peroxidase, ein weiteres amylolytisches Enzym und/oder eine Cellulase umfasst.
Hand- oder Maschinendetergenszusammensetzung zum Geschirrspülen, umfassend eine α-Amylase-Variante gemäß einem der Ansprüche 1–4 und ein oberflächenaktives Mittel.
Geschirrspüldetergenszusammensetzung gemäß Anspruch 18, die zusätzlich ein weiteres Enzym wie eine Protease, eine Lipase, eine Peroxidase, ein weiteres amylolytisches Enzym und/oder eine Cellulase umfasst.
Hand- oder Maschinendetergenszusammensetzung zum Wäschewaschen, umfassend eine α-Amylase-Variante gemäß einem der Ansprüche 1–4 und ein oberflächenaktives Mittel.
Wäschewaschzusammensetzung nach Anspruch 20, umfassend zusätzlich ein anderes Enzym wie eine Protease, eine Lipase, eine Peroxidase, ein weiteres amylolytisches Enzym und/oder eine Cellulase.
Verwendung einer α-Amylase-Variante nach einem der Ansprüche 1–4 zum Textilentschlichten.
Verwendung einer α-Amylase-Variante nach einem der Ansprüche 1–4 zur Herstellung von Süßstoffen und Ethanol aus Stärke.