KR20100014500A - 성숙 아밀라아제 단백질에 ｎ-말단 첨가에 의한 아밀라아제 생성 향상 - Google Patents

Abstract

알파-아밀라아제 생성 및 이에 의해 생성된 알파-아밀라아제를 증가시키는 바실러스 (Bacillus) 알파-아밀라아제 변이체의 제조 방법. 재조합 알파-아밀라아제는 조성물에 위치할 수 있고, 세탁 세제, 세정 및 식기 세정 세제, 직물 발호, 전분 액화, 곡물 액화, 전분 당화, 균막 제거, 및 사탕수수 당 가공에서의 전분 가수분해를 목적으로 사용될 수 있다.

Description

성숙 아밀라아제 단백질에 Ｎ-말단 첨가에 의한 아밀라아제 생성 향상 {ENHANCED AMYLASE PRODUCTION BY N-TERMINAL ADDITION TO MATURE AMYLASE PROTEIN}

관련 특허에 대한 상호-참조

본 출원은 2007 년 3 월 23 일에 출원된, 표제 "Enhanced Amylase Production by N-Terminal Addition to Mature Amylase Protein" 의 미국 가 특허 출원 일련 번호 60/907,174 호의 우선권을 주장한다.

서열 목록

본원에는 SEQ ID NO: 1 ~ 12 를 포함하는 서열 목록이 참조로서 인용된다.

폴리펩티드가 바실러스 (Bacillus)

-아밀라아제, 예컨대 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis)

-아밀라아제로부터 변형된 아밀라아제 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 기재되어 있다.

전분은 아밀로오스 (15-30% w/w) 와 아밀로펙틴 (70-85% w/w) 의 혼합물로 이루어진다. 아밀로오스는 분자량 (MW) 이 약 60,000 내지 약 800,000 인

- 1,4-연결 글루코오스 단위의 선형 사슬로 이루어진다. 아밀로펙틴은 매 24 내지 30 개의 글루코오스 단위마다

-1,6 분지점을 함유하는 분지 중합체이고; 이의 MW 는 10⁸ 정도로 클 수 있다.

농축된 덱스트로오스 시럽 형태의, 전분으로부터의 당은 현재 (1)

-아밀라아제로 고체 전분의 약 7 - 10 의 평균 중합도를 갖는 덱스트린으로의 액화 (또는 점도 감소), 및 (2) 수득된 액화 전분 (즉, 전분 가수분해물) 의 아밀로글루코시다아제 (또한 글루코아밀라아제 또는 GA 로 불림) 로의 당화를 포함하는 효소 촉매 방법에 의해 생성된다. 수득된 시럽은 글루코오스 함량이 높다. 시판되는 대부분의 글루코오스 시럽은 그 후에 이소시럽 (isosyrup) 으로 알려진 덱스트로오스/프룩토오스 혼합물과 효소적으로 이성화된다.

-아밀라아제 (EC 3.2.1.1) 는 내부

-1,4-글루코시드 결합을 랜덤하게 분할하여 전분, 글리코겐, 및 관련 다당류를 가수분해한다. 상기 효소는 예를 들어 당, 양조, 알코올 및 직물 산업에서 다수의 중요한 상업적 적용을 갖는다.

-아밀라아제는 다양한 박테리아, 진균류, 식물 및 동물 공급원으로부터 단리된다. 산업적으로는, 많은 중요한

-아밀라아제는 바실리 (Bacilli) 로부터 단리된 것이다.

수 년동안,

-아밀라아제 효소는 전분 액화, 직물 발호 (desizing), 종이 및 펄프 산업에서의 전분 변형, 및 양조를 비롯한 다양한 상이한 목적에 사용되어 왔다. 또한 이들 효소는 식기세정 및 세탁 동안 녹말성 오염물을 제거하는데 사용될 수 있다.

바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) 및 기타 바실러스 종은 성장 배지 내로 (이종) 단백질 (예를 들어, 아밀라아제, 프로테아제 등) 을 분비하는 고 역량을 갖는다. 세포 외부의 이러한 단백질을 지시하기 위해, 이들은 아미노-말단 신호 펩티드를 가진 전-단백질로서 합성된다. 일반적으로, 통상 18 내지 35 개 아미노산 길이의 신호 펩티드는 엄격한 일치 서열을 함유하지 않는다. 그러나, 신호 펩티드는 (1) 양성 전하의 아미노 말단 (N-도메인) 및 더욱 극성인 영역, 그 다음 (2) 소수성 코어 (H-도메인), 및 (3) 신호 펩티드 분할 부위를 함유하는 더욱 극성인 영역 (C-도메인) 에 의해 형성된 3 구획 구조를 공유한다. 아미노산 -3 및 -1 (성숙 단백질의 출발에 대해) 은 통상 작은 중성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 글리신 및 세린) 를 가진 잔기이다. B 서브틸리스 (B. subtilis) 에서, 성숙 사슬의 위치 1 에서의 잔기는 대부분의 경우 알라닌이다 (Tjalsma, 1999, "Signal Peptidases of Bacillus subtilis: A Functional Analysis," Ph.D. thesis, University of Groningen, ISBN 90-367-1086-3). 신호 펩티다아제에 의한 전-단백질의 가공, 즉 신호 펩티드의 분할이 일부 단백질의 생성을 위한 분비의 진행을 방해 (bottleneck) 하는 것을 나타내는 것이 관찰되었다 (Bolhuis, 1999, "A Genetic Analysis of Determinants for Efficient Protein Secretion in Bacillus subtilis," Ph.D. thesis, University of Groningen, ISBN 90-367-1055-3).

그러므로, 유기체에서

-아밀라아제의 더 많은 양을 생성할 수 있는

-아 밀라아제에 대한 지속적인 필요가 있다. 생성이 증가하면 다른 것 중에서도 감소된 비용, 개선된 비용 마진, 설비 용량 절약, 및 더 높은 활성 생성물을 야기할 것이다.

발명의 요약

따라서, 하나의 양상은 좀더 낮은 비용으로 증가된 양을 생성할 수 있는

-아밀라아제 변이체에 관한 것이다. 이들 변이체는

-아밀라아제를 사용하는 다양한 조성물 및 방법에 사용할 수 있다.

고려되는 하나의 양상은 SEQ ID NO: 1 또는 신호 펩티드가 없는 SEQ ID NO: 1 에 묘사된 모티프를 포함하는 단리된 폴리펩티드, 예컨대 성숙

-아밀라아제 또는 변이체이다. 그러므로, 하나의 양상에는 SEQ ID NO: 20, 21 또는 25 를 포함하는 SEQ ID NO: 1 이 고려된다. 또다른 양상에는 SEQ ID NO: 2 및 21 을 둘 다 포함하는 SEQ ID NO: 1 이 고려된다. 또다른 양상에는 SEQ ID NO: 2 (신호 펩티드) 를 포함하는 SEQ ID NO: 1 이 고려된다. 또다른 양상에는 신호 펩티드가 없는 SEQ ID NO: 1 이 고려되고, 상기 SEQ ID NO: 1 은 신호 펩티드 없이 SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 24, 25, 또는 27 을 포함한다. 또다른 양상에는 SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 23, 26, 또는 28 을 포함하는 SEQ ID NO: 1 이 고려된다. 그러므로, 고려되는 폴리펩티드 서열은 전-단백질의 형태로, 또는 성숙 단백질로서 신호 펩티드를 가질 수 있다. 전-단백질에는

-아밀라아제를 생성하는 동일한 종으로부터의 신호 펩티드가 포함될 수 있거나, 성숙 단백질과 이종일 수 있다 (즉, 신호 펩티드는 성숙 단백질 외의 또 다른 미생물로부터 유래되었다).

또다른 구현예에는 상기 논의된 단리된 폴리펩티드 서열 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 서열이 고려된다.

또다른 양상은 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열 중 임의의 것을 포함하는 벡터를 제공한다.

추가 양상에는 핵산 서열 또는 상기 언급된 핵산 서열 중 임의의 것을 포함하는 벡터를 포함하는 단리된 세포가 고려된다. 단리된 세포는 미생물일 수 있다. 미생물은 박테리아 또는 진균일 수 있다. 예시적인 박테리아에는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), B. 리케니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필러스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 써큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 또는 S. 뮤리누스 (S. murinus) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 그람 (Gram) 양성 박테리아; 또는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 인 그람 음성 박테리아가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 고려되는 것은 세정 (수동 또는 자동 제형), 식기세정 (수동 또는 자동 제형), 직물 발호, 균막 (biofilm) 가수분해, 전분 당화, 전분 액화, 또는 사탕수수 설탕으로부터 전분 가공을 위한 조성물에서의 상기 폴리펩티드에 대한 용도이다.

추가 양상에는 상기 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함하는 세제 첨가제가 고려되고, 상기 세제 첨가제는 임의로 비-분진 과립, 안정화된 액체 또는 보호된 효소의 형태이다. 첨가제는 셀룰라아제, 프로테아제, 또는 아밀라아제, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 아밀라아제는

-아밀라아제, β-아밀라아제, 또는 글루코아밀라아제, 또는 이의 조합일 수 있다.

또한 추가 양상에는 상기 언급된 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함하는 세제 조성물이 고려된다. 대안적으로는, 세제 조성물은 상기 언급된 세제 첨가제를 포함할 수 있다. 세제 조성물은 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 만난나아제, 펙테이트 리아제, 또는 상기 효소의 조합인 효소를 추가로 포함할 수 있다.

또다른 양상에는 상기 언급된 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함하는 수동 또는 자동 식기세정 세제 조성물이 고려된다. 수동 또는 자동 식기세정 세제는 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 만난나아제, 펙테이트 리아제, 또는 상기 효소의 조합인 효소를 추가로 포함할 수 있다.

또한 또다른 구현예에서, 상기 언급된 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함하는 수동 또는 자동 세탁 세정 조성물이 고려된다. 수동 또는 자동 세탁 세정 조성물은 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 만난나아제, 펙테이트 리아제, 또는 효소의 조합인 효소를 포함하는 것으로 추가로 고려된다.

또다른 구현예에는 수용액에 상기 언급된 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함하고 임의로 효소를 포함하는 발호 (desizing) 조성물이 고려된다.

또다른 양상에는 수용액에 상기 언급된 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함하는 전분 가공 조성물이 고려된다. 전분 가공 조성물은 글루코아밀라아제, 이소아밀라아제, 풀라나아제, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 전분 가공 조성물은 전분을 액화하거나, 전분을 당화하는데, 또는 전분의 액화 및 당화 모두에 충분한 시간 동안 조성물을 투여하는 것을 포함하는 전분 가공 방법에 사용될 수 있다.

또한 추가의 양상은 조성물이 용액 또는 젤이고, 임의로 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 프로테아제, 펙티나아제, 항균제, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는, 상기 언급된 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함하는 균막 가수분해 조성물을 제공한다. 또한 고려되는 것은 균막을 부분적으로 또는 완전히 가수분해하기에 충분한 시간 동안 조성물을 투여하는 것을 포함하는 균막의 가수분해 방법이다.

첨부 도면은 본 명세서에 인용되고, 본 명세서의 일부를 구성하고, 구현예를 설명한다. 도면에서:

도 1 은 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 에서의 2 개 배치 AlT 및 Spezyyme® FRED 사이의 생산 역량 비교이다.

도 2A 는 pICatH-FREDori1 의 도식이다. 도 2B 는 pICatH-FRED(AlT)ori1 의 도식이다.

도 3 은 아밀로오스 소화에서의 AlT

-아밀라아제 변이체 (하부) 를 발현하는 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 균주 대 FRED (Spezyme® FRED)

-아밀라아제를 발현하는 균주의 HI 아가 시험의 결과를 나타낸다. 아밀로오스 소화는 AlT 변이체에서 향상된 것으로 보인다.

도 4 는 pH 5.8 에서 검정하였을 때 AlT 변이체와 비교하여 Spezyme® FRED 의 DE 전개를 묘사한다.

도 5 는 pH 5.8 에서 칼슘이 첨가되지 않은 AlT 변이체와 비교하여 Spezyme® FRED 의 DE 전개를 묘사한다.

도 6. 부가적인 칼슘은 없으나 pH 5.4 에서 AlT 변이체와 비교한 Spezyme® FRED (야생형).

상세한 설명

본 출원은 성숙

-아밀라아제의 폴리펩티드 서열을 변형시켜 바실러스 종 (Bacillus sp.)

-아밀라아제의 양을 향상시키는 방법을 다룬다. 대안적으로는, 상기 방법은 임의의 야생형 또는 재조합 바실러스 종 (Bacillus sp.)

-아밀라아제에 사용될 수 있다. 다음은 수행될 수 있는 방식에 대한 상세한 사항 뿐 아니라 이에 의해 제조되는

-아밀라아제 변이체에 대한 조성물 및 용도를 제공한다.

1. 정의 & 약어

본 상세한 설명에 따르면, 하기 약어 및 정의를 적용한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 단수형에는 문맥상 다르게 명확하게 제시되지 않는 경우 복수형 참조가 포함되는 것으로 유념해야만 한다. 그러므로, 예를 들어, "효소" 에 대한 참조에는 다수의 이러한 효소가 포함되며, "제형" 에 대한 참조에는 당업자에게 공지된 하나 이상의 제형 및 이의 등가물, 등에 대한 참조가 포함된다.

다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학적 용어는 당업자에게 통상 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 하기 용어는 이하에 제공된다.

1.1 정의

용어 "아밀라아제" 는 임의의 아밀라아제, 예컨대 글루코아밀라아제,

-아밀라아제, β-아밀라아제, 및 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 및 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 와 같은 바실러스 종의 야생형

-아밀라아제가 포함되는 것을 의미한다. 예시적인 생산 균주는 KLM3' 단백질, 곡물 가공을 위한 아밀라아제 (SGA), 및 섬유 및 가정용 세정을 위한 아밀라아제에 대해 사용되는 균주이다. "아밀라아제" 는 그 중에서도 전분의 분해를 촉매화할 수 있는 효소를 의미할 것이다. 아밀라아제는 전분 내의

-D-(1→4) O-글리코시드 연결을 분할하는 가수분해효소이다. 일반적으로,

-아밀라아제 (EC 3.2.1.1;

-D-(1→4)-글루칸 글루카노히드롤라아제) 는 전분 분자 내의

-D-(1→4) O-글리코시드 연결을 랜덤 하게 분할하는 내부-작용 효소로서 정의된다. 대조적으로, 외부-작용 녹말가수분해 효소, 예컨대 β-아밀라아제 (EC 3.2.1.2;

-D-(1→4)-글루칸 말토히드롤라아제) 및 말토오스 생성

-아밀라아제 (EC 3.2.1.133) 와 같은 일부 생성물-특이적 아밀라아제는 기질의 비-환원 말단으로부터 전분 분자를 분할한다. β-아밀라아제,

-글루코시다아제 (EC 3.2.1.20;

-D-글루코시드 글루코히드롤라아제), 글루코아밀라아제 (EC 3.2.1.3;

-D-(1→4)-글루칸 글루코히드롤라아제), 및 생성물-특이적 아밀라아제는 전분으로부터 특정 길이의 말토-올리고당을 생성할 수 있다.

"

-아밀라아제 변이체", "

-아밀라아제 변이체 폴리펩티드", 및 "변이체 효소" 는 성숙

-아밀라아제 단백질의 아미노 말단에서 아미노산 잔기를 치환하여 개질된

-아밀라아제 단백질을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "모 효소," "모 서열", "모 폴리펩티드", "야생형

-아밀라아제 단백질", 및 "모 폴리펩티드" 는

-아밀라아제 변이체 폴리펩티드가 유래된 효소 및 폴리펩티드를 의미할 것이다. 모 효소는 야생형 효소 또는 미리 재조합적으로 조작된

-아밀라아제일 수 있다.

-아밀라아제 변이체에는

-아밀라아제 모 폴리펩티드의 신호 서열에, 또는 그 밖에

-아밀라아제 모 폴리펩티드에 돌연변이가 추가로 포함될 수 있다. 그러므로,

-아밀라아제 폴리펩티드는 재조합적으로 조작된 효소일 수 있다.

-아밀라아제 변이체는 또한 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 에 내 생이 아닌 폴리펩티드 서열 또는 SEQ ID NO: 1 서열을 포함하는 융합 단백질, 또는 "혼성" 또는 "키메라성 단백질" 일 수 있다. 하나의 구현예에서, 폴리펩티드 서열은 발현된 단백질의 정제를 용이하게 한다. 또다른 양상에서, 이종 서열은 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 와 상이한 속 또는 종 유래의

-아밀라아제 폴리펩티드이다. 예를 들어,

-아밀라아제 변이체는 또다른 바실러스

-아밀라아제, 예컨대 B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus) (그러나 이에 제한되지 않음) 의 신호 펩티드에 연결된 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis)

-아밀라아제의 변이체를 포함할 수 있다. 대안적으로는,

-아밀라아제 단백질은 또다른 바실러스 (Bacillus)

-아밀라아제의 성숙 단백질에 연결된 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 의 신호 펩티드 (LAT) 를 포함할 수 있으며, 여기서 융합 단백질은 또한 성숙 단백질의 X₂ 잔기에서 발생하는 효소-생성이 향상된 돌연변이를 갖는다. 여기에는 X₂ 에서 알라닌 또는 발린 잔기 이외의 임의의 아미노산으로의 치환이 포함될 수 있다. X₂ 는 알라닌에 대해 치환되는 잔기 이외의 부가적인 아미노산을 추가로 가질 수 있다. 용어 "변이체" 는 용어 "돌연변이체" 와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 변이체에는 폴리펩티드 뿐 아니라 핵산이 포함될 수 있다. 변이체에는 삽입이 포함될 수 있고; 이들 변이체는 하나 이상의 위치에서, 부가적인 치환, 삽입, 전환, 절단 및/또는 역위를 추가로 함유한다. 변이체에는 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 서열과 상보적인 서열이 포함될 수 있다. 예를 들어, 변이체 서열은 본원 에 제시된 뉴클레오티드 서열에 엄격한 조건하에서 (예를 들어, 50℃ 및 0.2X SSC {1X SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na₃ 시트레이트, pH 7.0}) 혼성화할 수 있는 서열과 상보적이다. 용어 변이체는 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 높은 엄격함 조건하에서 (예를 들어, 65℃ 및 0.1X SSC {1X SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na₃ 시트레이트, pH 7.0}) 혼성화할 수 있는 서열과 상보적인 서열을 추가로 포함할 수 있다. 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 또는 70 개 아미노산 치환, 결실 또는 삽입, 또는 변이체가

-아밀라아제 활성을 보유한다면 그 사이의 임의의 정수 값을 포함할 수 있다. 변이체의 표면 전하는 또한 임의의 수로 변형될 수 있다. 예를 들어, 효소 표면 상의 양성 전하 아미노산 잔기의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개로 감소될 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 다른 것 중에서도 변이체의 등전위점 (pi) 을 변화시킬 것으로 기대된다. 변이체의 기타 특징은 본원에 기재된 바와 같은 야생형 효소와 상이할 수 있다.

"단리된" 은 서열이 자연적으로 관련되고 자연에서 발견되는 하나 이상의 다른 성분이 서열에 적어도 실질적으로 없는 것을 의미한다.

"정제된" 은 물질이 비교적 순수한 상태, 예를 들어, 약 90% 이상의 순수, 또는 약 95% 이상의 순수, 또는 약 98% 이상의 순수한 상태인 것을 의미한다.

"열안정성" 은 승온에 노출 후 활성을 보유하는 효소의 능력을 의미한다.

-아밀라아제 효소와 같은 효소의 열안정성은 반감기에 의해 측정된다. 반감기 (t_½) 는 효소 활성의 반이 정의된 조건하에 상실되는 시간 (분), (시간), 또는 (일) 이다. 반감기 값은 잔류

-아밀라아제 활성을 측정하여 계산한다.

"pH 범위" 는 5 이상의 pH 단위 범위의 산성에서 염기성 조건으로부터 촉매 활성을 나타내기 위한 효소의 능력을 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같은, "pH 안정한" 은 넓은 범위의 pH 에 걸쳐 활성을 보유하기 위한 효소의 능력에 관한 것이다.

본원에 사용되는 바와 같은, "음식" 에는 제조된 음식 뿐 아니라, 음식 성분, 예컨대 밀가루가 모두 포함될 것이다.

본원에 사용되는 바와 같은, "음식 성분" 에는 기능 음식 또는 식품류인 또는 이에 첨가될 수 있는 제형이 포함될 것이고, 예를 들어, 산성화 또는 유화를 필요로 하는 다양한 생성물에 낮은 수준으로 사용되는 제형이 포함된다. 음식 성분은 용도 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라 용액 또는 고체의 형태일 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, "기능 음식" 은 영양 효과 및/또는 미감 만족을 제공할 수 있을 뿐 아니라, 또한 소비자에게 추가의 이로운 효과를 전달할 수 있는 음식을 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같은, "아미노산 서열" 은 용어 "폴리펩티드" 및/또는 용어 "단백질" 과 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열" 은 용어 "펩티드" 와 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열" 은 용어 "효소" 와 동의어이다.

본원에 사용되는 바와 같은, "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열" 은 올리 고뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이의 변이체, 상동, 분절 및 유도체 (예컨대 이의 일부) 를 말한다. 뉴클레오티드 서열은 게놈성 또는 합성 또는 재조합 기원일 수 있고, 센스 또는 안티-센스 가닥을 나타내는 지의 여부와는 관계없이 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은, 용어 뉴클레오티드 서열에는 게놈성 DNA, cDNA, 합성 DNA, 및 RNA 가 포함된다. DNA 에는

-아밀라아제 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 서열이 포함된다.

"상동 ("homologue" 및 "homology")" 은 대상 아미노산 서열 및 대상 뉴클레오티드 서열과 특정 정도의 일치성을 갖는 실재 (entity) 를 의미할 것이다. 상동 서열은 대상 서열과 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상 일치하는, 또는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 일치하는 아미노산 서열이 포함되는 것으로 여겨진다. 전형적으로, 상동은 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위를 포함할 것이다.

본원에 사용되는 바와 같은, "혼성화" 에는 핵산 가닥을 염기 짝짓기를 통해 상보성 가닥과 연결시키는 방법 뿐 아니라, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 기술로 수행되는 바와 같은 증폭 방법이 포함될 것이다.

-아밀라아제 변이체 핵산은 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, RNA/DNA 이종이량체 (heteroduplex) 또는 RNA/DNA 공중합체로 존재할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, "공중합체" 는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드를 모두 포함하는 단일 핵산 가닥을 말한다.

-아밀라아제 변이체 핵산은 심지어 발현을 추가로 증가시키기 위해 최적화된 코돈일 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, "합성" 은 시험관 내 화학 또는 효소 합성에 의해 제조되는 것을 말할 것이다. 이것에는 비제한적으로 메탄올자화균 피치아 (Pichia), 한세눌라 (Hansenula), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei), 또는 기타 선택되는 발현 균주, 예컨대 바실러스 (Bacillus) 와 같은 숙주 유기체에 대한 최적 코돈을 사용하여 제조된

-아밀라아제 변이체 핵산이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용되는 바와 같은, "형질전환된 세포" 에는 재조합 DNA 기술을 사용하여 형질전환된 세포가 포함될 것이다. 형질전환은 전형적으로 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 세포 내에 삽입하여 일어난다. 삽입된 뉴클레오티드 서열은 이종 뉴클레오티드 서열일 수 있다 (즉, 변형되는 세포에 대해 자연적이지 않은 서열, 예컨대 융합 단백질을 코딩하는 서열임).

본원에 사용되는 바와 같은, "작동가능하게 연결된" 은 기재된 성분이 의도되는 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 것을 의미할 것이다. 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 상용성인 조건하에서 달성되는 방식으로 연결된다.

본원에 사용되는 바와 같은, "생물학적으로 활성인" 은 자연 발생적 서열의 유사한 구조 기능 (그러나 반드시 동일한 정도는 아님), 및/또는 유사한 조절 기능 (그러나 반드시 동일한 정도는 아님) 및/또는 유사한 생화학적 기능 (그러나 반드시 동일한 정도는 아님) 을 갖는 서열을 말할 것이다.

1.2 약어

다르게 정의되지 않는다면 하기 약어가 적용된다:

AlT 바실러스 (Bacillus)

-아밀라아제의 위치 1 (X₂) 에서의 알라닌에서 트레오닌으로의 치환 (또는 Al→T)

AE 알코올 에톡실레이트

AEO 알코올 에톡실레이트

AEOS 알코올 에톡시술페이트

AES 알코올 에톡시술페이트

AFAU 산 진균류

-아밀라아제 단위

AGU 글루코아밀라아제 활성 단위

AOS

-올레핀술포네이트

AS 알코올 술페이트

BSA 소혈청 알부민

cDNA 상보성 DNA

CMC 카르복시메틸셀룰로오스

DNA 데옥시리보핵산

DP3 3 개의 서브단위로의 중합도

DPn n 개의 서브단위로의 중합도

DS 또는 ds 건조 고체

DTMPA 디에틸렌트리아민펜타아세트산

EC 효소 분류를 위한 효소 위원회

EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산

EO 에틸렌 옥시드

F&HC 섬유 & 생활 캐어 (fabric & household care)

FAU 진균류 아밀라아제 단위

GA 글루코아밀라아제

HFCS 고 프룩토오스 옥수수 시럽

HFSS 고 프룩토오스 전분계 시럽

IPTG 이소프로필 β-D-티오갈락토시드

LAS 선형 알킬벤젠술포네이트

LAT B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 아밀라아제에 속함

LU 리퀴폰 단위

MW 분자량

NOBS 노나노일옥시벤젠술포네이트

NTA 니트릴로아세트산

OxAm Purastar® HPAM 5000L

PCR 폴리머라아제 연쇄 반응

PEG 폴리에틸렌글리콜

PVA 폴리(비닐 알코올)

PVP 폴리(비닐피롤리돈)

RNA 리보핵산

SAS 2차 알칸 술포네이트

TAED 테트라아세틸에틸렌디아민

TCA 트리클로로아세트산

w/v 중량/부피

w/w 중량/중량

wt 야생형

2.

- 아밀라아제 변이체

아밀라아제 변이체는 야생형 형태 뿐 아니라, 향상된 특이적 활성, pH 프로파일, 열안정성, 및 온도 범위 프로파일, 칼슘 이온 요구성, 및 기타 향상된 특징을 위해 조작되어진 조작된 형태를 포함하여, 임의의 바실러스 (Bacillus) 아밀라아제로부터 제작될 수 있다. 본원에 기재된 변이체는 생성된 모 균주보다 더 많은 단백질을 세포 배지 내에 분비할 수 있는 향상된 생산 역량을 갖는다.

상기 변이체의 모티프는 하기와 같다:

여기서, X₁ 은 크기가 18 내지 35 개 아미노산의 범위인 신호 펩티드 내의 마지막 아미노산이고; 신호 펩티드는 자연에서 아미노-말단에서 전하된 부분, 소수성인 H-도메인, 및 전하된 카르복시 도메인을 갖는 3 부분으로 나뉘어져 있고; X₂ 도메인은 동일한 모

-아밀라아제로부터 유래될 수 있거나, 이종 또는 키메라성 단백질일 수 있고;

X₁ 은 신호 서열 내의 최종 아미노산이고;

X₂ 는 A'-B' 로, X₂ 가 알라닌인 경우, A' 는 알라닌 또는 발린 이외의 임의의 아미노산이고, B' 는 임의의 아미노산 잔기이거나 아미노산 잔기가 없고; X₂ 가 발린, 히스티딘, 또는 아스파르트산인 경우, A' 는 임의의 아미노산이고 B' 는 임의의 아미노산 잔기이거나 아미노산 잔기가 없고;

X₃ 은 아스파라긴, 알라닌, 히스티딘, 또는 글리신이고;

X₄ 는 류신, 글리신, 프롤린 또는 아스파라긴이고;

Y 는 성숙 박테리아

-아밀라아제 또는

-아밀라아제 변이체의 나머지 부분이다. 하나의 양상에서, X₂ 는 A' 를 트레오닌으로서 가지고, B' 는 아미노산이 없거나, 또는 B' 는 5 개 이하 잔기의 임의의 하나 이상의 아미노산이다. 성숙 단백질은 또다른 바실러스 종 (Bacillus spp.) 유래의 또는 모 서열과 동일한 종 유래의 신호 펩티드에 대한 융합 단백질의 시초 형태일 수 있다. 이들은 야생형 바실러스 (Bacillus)

-아밀라아제 또는 재조합

-아밀라아제, 예컨대 테르아밀-유사

-아밀라아제, 뿐 아니라 미국 특허 제 6,979,731 호; 제 6,338,959 호; 제 6,638,748 호; 제 6,440,716 호; 제 5,989,169 호; 제 6,022,724 호; 제 6,197,565 호; 제 6,887,986 호; 제 6,162,628 호; 제 6,482,622 호; 제 6,876,932 호; 제 6,093,562 호; 제 6,297,038 호; 제 6,867,031 호; 제 5,824531 호; 제 5,856,164 호; 제 6,939,703 호; 제 6,218,164 호; 제 6,432,689 호; 제 5,316,691 호; 제 5,429,766 호; 제 6,197,565 호; 제 6,617,143 호; 제 6,916,645 호; 제 6,403,355 호; 제 6,982,159 호; 제 7,005,289 호; 제 7,041,488 호; 제 7,045,332 호; 제 6,001639 호; 제 6,387,690 호; 제 6,855,531 호; 제 5,912,157 호; 제 6,117,664 호; 및 미국 공개 번호 2005176000; 2005181493; 2005250663; 2005261156; 2005261158; 2006014265; 2006019856; 2006051849; 2005214920; 및 국제 PCT 출원 번호 WO 06/002643; WO 94/02597; WO 94/18314; WO 96/23873; WO 97/43424; WO 97/41213; WO 99/19467; WO 95/26397; WO 99/19467; 및 유럽 특허 번호 1050579; EP 1131418; EP 1226236; EP 1307547; EP 815209; EP 753057; EP 772684; EP 850307; 및 EP 749473 에 기재되는 아밀라아제일 수 있다. 또한 고려되는 것은 다양한

-아밀라아제 변이체를 코딩하는 핵산으로, 예컨대 바실러스 종 (Bacillus sp.) A7-7 (DSMl2368)

-아밀라아제, Stainzyme®

-아밀라아제, 바실러스 종 (Bacillus sp.) AA560 -아밀라아제 (미국 특허 제 6,528,298 호의 SEQ ID NO: 24), B. 할마팔루스 (B. halmapalus)

-아밀라아제 (미국 특허 제 6,093,562 호의 SEQ ID NO: 2, Natalase®), 바실러스 종 (Bacillus sp.) 번호 707

-아밀라아제, 바실러스 종 (Bacillus sp.) KSM-AP 1378

-아밀라아제 (GenBank Accession No. AX428291 및 EP 1199356 의 SEQ ID NO: 3), 바실러스 종 (Bacillus sp.) KSM-K38

-아밀라아제 (미국 특허 제 6,403,355 호의 SEQ ID NO: 4), 바실러스 종 (Bacillus sp.) KSM-K36

-아밀라아제 (미국 특허 제 6,403,355 호의 SEQ ID NO: 2; GenBank Accession No. AAN18957), B. 클라우시 (B. clausii) KSM-K16

-아밀라아제, B. 할로듀란스 (B. halodurans)

-아밀라아제, B. 클라우시 (B. clausii) BT-21

-아밀라아제 (GenBank Accession No. AX037557), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens)

-아밀라아제, 미국 특허 번호 5,856,164 의 SEQ ID NO: 2, OxAm®

-아밀라아제, Duramyl®, 및 B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus)

-아밀라아제가 있으나 이에 제한되지 않는다.

B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 에서 단백질을 분비하기 위해, B. 리케니포르미스 (B. licheniformis)

-아밀라아제의 신호 펩티드 (LAT) 가 종종 사용된다. 그러나, 기타 바실러스 (Bacillus)

-아밀라아제로부터의 신호 단백질이 또한 치환될 수 있다. LAT 신호 펩티드의 아미노산 서열은 하기와 같다:

상기 신호 펩티드의 하나의 분할 부위는 상기 기재된 바와 같은 일반적인 모티프: Ala-Ser-Ala/Ala 에 매치된다. Spezyme® FRED (B. 리케니포르미스 (B. licheniformis)

-아밀라아제 돌연변이체) 의 생성/분비가, 알라닌이 위치 +1 (X₂) 에서 트레오닌으로 치환되어 20% 초과로 증가하였다는 것이 관찰되었다. 그러므로, LAT 신호 펩티드에 의해 전위된 단백질의 분비 진행을 방해하는 부분은 Ala-Ser-Ala/Ala 에서 Ala-Ser-Ala/Thr 로 분할 부위를 변경하여 극복된다. 그러므로, 하나의 양상은 X₂ 가 알라닌 또는 발린 이외의 임의의 아미노산인 재조합 단백질에 대해 제공된다. 예를 들어, X₂ 는 트레오닌일 수 있다. 또 다른 양상에는 위치 X₂ 에서 (여기서, X₂ 는 A-B 이고, A 는 알라닌 또는 발린 이외의 임의의 아미노산이고, B 는 알라닌을 포함하는 임의의 아미노산임) 2 개의 아미노산이 치환되는 것이 고려된다. "B" 에는 또한 잔기가 없을 수 있고 "A" 는 알라닌 또는 발린 이외의 임의의 아미노산이다. 예를 들어, 신호 펩티드 및 성숙 사슬의 접합점에서의 서열은: Ala-Ser-Ala/Thr-Ala (여기서, Thr-Ala 은 X₂ 에 도입된 A-B 임) 일 수 있다. 이러한 경우에서 분할 부위는 알라닌이 +1 에서 Thr: Ala-Ser-Ala/Thr 로 치환되어 수득된 것과 동일하다. 바실러스 (Bacillus)

-아밀라아제, 예컨대 Spezyme® FRED 의 성숙 사슬의 N-말단 측면에 트레오닌 잔기 (또는 Ala 를 제외한 또다른 잔기) 의 첨가, 또는 LAT 신호 펩티드에 의해 전위된 임의의 기타 이종 단백질이 생성/분비를 증가시키는 것으로 고려된다.

2.1

- 아밀라아제 변이체 특징

효소 변이체는 핵산 및 폴리펩티드 서열, 이의 2 차, 3 차 및/또는 4 차 구조, 및/또는 이의 특이적 활성에 의해 특징지어 질 수 있다.

-아밀라아제 변이체의 부가적인 특징에는 안정성, 칼슘 이온 (Ca^{2 +}) 의존성, pH 범위, 산화 안정성 및 열안정성이 포함된다. 생성이 향상된

-아밀라아제 변이체는 모 단백질과 동일한 특징, 예를 들어, 동일한 특이적 활성을 본질적으로 가질 것이다.

하나의 양상에서, 돌연변이 (단백질 생성을 증가시키기 위해 치환되거나 첨 가된 아미노산에 더해 아미노산 치환 및 결실을 포함) 는 특히 고온 (즉, 70 내지 120℃) 및/또는 극 pH (즉, 저 또는 고 pH, 즉, pH 4.0 내지 6.0 또는 pH 8.0 내지 11.0, 각각), 및 60 ppm 미만의 칼슘 농도 (즉, 미결합됨, 그러므로 용액에서) 에서 변경된 안정성, 특히 개선된 안정성 (즉, 좀더 높거나 좀더 낮은) 을 달성하는 관점에서 중요하다.

변경된 Ca^{2 +} 안정성은 Ca^{2 +} 고갈 (depletion) 하에서 효소의 안정성이 개선되었다는 것, 즉, 좀더 높은 또는 좀더 낮은 안정성을 의미한다. 중요한 돌연변이 (성숙 단백질의 아미노 말단의 X₂ 위치에 도입된 Thr-Ala 또는 A-B 외의) 는 특히 고 pH (즉, pH 8.0 내지 10.5) 에서 변형된 Ca^{2 +} 안정성, 특히 개선된 Ca^{2 +} 안정성, 즉, 좀더 높은 또는 좀더 낮은 안정성을 달성하는 것이다. 그러므로, 향상된 생산 역량을 갖는 돌연변이체에는 칼슘 이온 안정성을 향상시키는 돌연변이가 추가로 포함될 수 있다.

추가의 양상에서, 변이체를 수득하는 것과 관련하여 중요한 돌연변이 (아미노산 치환 및 결실을 포함) 는 변경된 특이적 안정성, 특히 증가된 또는 감소된 특이적 활성 및 조성물에서 사용하기 위해, 특히 10 내지 60℃, 20 내지 50℃, 및 30 내지 40℃ 의 온도에서 X₂ 돌연변이에 의해 수득되는 향상된 생산 역량을 나타낸다. 제빵용 제품에 대한 특이적 활성 온도 범위는 좀더 높을 수 있다.

-아밀라아제 변이체는 또한 모

-아밀라아제에 비해, 변형된 산화 안정 성, 특히 좀더 높은 산화 안정성을 가질 수 있다. 증가된 산화 안정성은, 예를 들어, 세제 조성물에 유리하고, 감소된 산화 안정성은 전분 액화용 조성물에 유리할 수 있다.

-아밀라아제 변이체는 또한 열안정성을 위한 돌연변이를 가질 수 있다. 이러한

-아밀라아제 변이체는 제빵 또는 승온을 필요로 하는 기타 조건하에서 사용될 수 있다. 예를 들어,

-아밀라아제 변이체는 약 55℃ 내지 약 80℃ 이상의 온도에서 전분을 분해할 수 있다.

-아밀라아제 변이체는 약 95 ℃ 이하의 온도에 노출 후에 활성을 유지할 수 있다.

본원에 기재된

-아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 또한 예를 들어 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상, 약 55℃ 내지 약 95℃ 이상, 예컨대 약 80℃ 이상의 승온에서 모 효소에 비해 반감기가 확장된 돌연변이를 가질 수 있다. 예를 들어,

-아밀라아제 변이체는 80℃ 이상에서 약 1 내지 10 분 동안 가열될 수 있다.

-아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 그것이 유래된 모 서열과 동일한 폴리펩티드 안정성을 갖는다. 그러나, 안정성을 향상시키는 것 뿐 아니라 효소의 생성을 향상시키는 것으로 고려되는 추가의 돌연변이는 위치 X₂ 에 대해 본원에 기재된 바와 같이 조합될 수 있다.

그러므로,

-아밀라아제 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 또한 상기 언급된 것 외에도 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. X₂ 이외의 하나 이 상의 위치에서의 기타 돌연변이, 예컨대 결실, 삽입, 치환, 전위, 변이 및 역위는, 또한 필요한 대로 상기 특정 중 하나 이상을 가질 수 있도록 포함될 수 있다. 마찬가지로, 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드는 상기 언급된 치환 중 하나 이상이 상실될 수 있다.

핵산에 의해 코딩된

-아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 모 서열과 동일한 pH 안정성 또는 상이한 안정성을 가질 수 있다. 예를 들어, 변이체는 또한 좀더 큰 pH 안정성 범위를 부여하거나, 효소의 최종 상업적인 목적을 위해 원하는 범위까지 pH 를 변동시키는 돌연변이를 가질 수 있다. 변이체는 약 5.0 내지 약 10.5 의 pH 에서 전분을 분해할 수 있다. 특이적 pH 조건은 pH 5.0 내지 pH 10.5 사이의 임의의 pH 일 수 있다. 핵산에 의해 코딩된

-아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 동일한 조건 하에서 모 폴리펩티드와 비교할 때 긴 반감기, 또는 큰 활성 (검정에 따라 다름) 을 가질 수 있거나, 또는 모 폴리펩티드와 동일한 활성을 가질 수 있다.

-아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 또한 동일한 pH 조건하에서 모 폴리펩티드와 비교할 때 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상의 긴 반감기를 가질 수 있다. 대안적으로는, 또는 부가적으로는, 효소 변이체는 동일한 pH 조건하에서 모 폴리펩티드와 비교할 때 높은 활성을 가질 수 있다.

기타 구현예에서, 본원에 언급된

-아밀라아제 변이체 중 임의의 것을 코딩하는 핵산에 상보적인 핵산이 제공된다. 부가적으로는, 보체에 혼성화될 수 있 는 핵산이 제공된다. 또다른 양상에서, 상기 언급된 서열 중 임의의 것에 특이적으로 혼성화될 수 있는 기능적 등가물을 코딩하는 핵산 뿐 아니라, 그의 보체가 본원에 제공된다.

추가의 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 서열은 합성 서열이다. 여기에는 메탄올자화성 효모 피치아 (Pichia) 및 한세눌라 (Hansenula) 와 같은 숙주 유기체에서의 발현을 위한 최적 코돈을 사용하여 제작된 서열이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

3.

- 아밀라아제 변이체의 생성

본원에 기재된 방법에 의해, 또는 당업계에 공지된 임의의 대안적인 방법에 의해 생성된 효소 변이체를 코딩하는 DNA 서열은, 적합한 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호 및 임의로 억제자 유전자 또는 다양한 활성자 유전자를 코딩하는 조절 서열을 전형적으로 포함하는 발현 벡터를 사용하여 효소 형태로 발현될 수 있다.

-아밀라아제 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 종종 벡터가 도입되게 되는 숙주 세포에 따라 다를 것이다. 그러므로, 벡터는 자발적 복제 벡터, 즉, 염색체외 실재로서 존재하는 벡터, 염색체 복제와 독립적인 복제, 예를 들어, 플라스미드, 박테리오파지 또는 염색체외 요소, 미니-염색체 또는 인공 염색체일 수 있다. 대안적으로는, 벡터는 숙주 세포에 도입되는 경우, 숙주 세포 게놈에 통합되고 통합된 염색체(들) 과 함께 복제되는 벡터일 수 있다. 통합된 유전자는 또한 항생제 선별 또는 기타 선별압에 의해 제작된 증폭가능 구축물, 예컨대 필수 조절 유전자의 사용 또는 필수 대사 경로 유전자의 용량 효과를 통한 상보성에 의해 염색체에서 유전자의 다중 카피를 제작하기 위해 증폭될 수 있다.

벡터에서, DNA 서열은 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어야만 한다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 DNA 서열일 수 있고, 숙주 세포에 상동 또는 이종인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래될 수 있다.

-아밀라아제 변이체를 코딩하는 DNA 서열의 전사를, 특히 박테리아 숙주에서 지시하기 위한 적합한 프로모터의 예는, E. 콜라이 (E. coli) 의 lac 오페론의 프로모터, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 (Streptomyces coelicolor) 아가라아제 유전자 dagA 또는 celA 프로모터, 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis)

-아밀라아제 유전자 (amyL) 의 프로모터, 바실러스 스테아로테르모필루스 (Bacillus stearothermophilus) 말토오스 생성 아밀라아제 유전자 (amyM) 의 프로모터, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens)

-아밀라아제 (amyQ) 의 프로모터, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) xylA 및 xylB 유전자의 프로모터 등이다. 진균류 숙주에서의 전사를 위해, 유용한 프로모터의 예는 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 아스파르트산 프로테이나아제, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 중성

-아밀라아제, A. 니게르 (A. niger) 산 적합성

-아밀라아제, A. 니게르 (A. niger) 글루코아밀라아제, 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 리파아제, A. 오리자에 (A. oryzae) 알칼리성 프로테아제, A. 오리자에 (A. oryzae) 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 또는 A. 니둘란스 (A. nidulans) 아세타미다아제를 코딩하는 유전자로부터 유래된 것들이다.

-아밀라아제 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 E. 콜라이 (E. coli) 와 같은 박테리아 종에서 발현되는 경우, 적합한 프로모터는, 예를 들어 T7 프로모터 및 파지 람다 프로모터를 비롯한 박테리오파지 프로모터로부터 선택될 수 있다. 효모 종에서의 발현에 적합한 프로모터의 예에는 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 의 Gal 1 및 Gal 10 프로모터 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) AOX1 또는 AOX2 프로모터가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei) 에서의 발현을 위해, CBHII 프로모터가 사용될 수 있다. 또한 발현 벡터는 적합한 전사 종결자 및, 진핵생물에서는

-아밀라아제 변이체를 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 종결 및 폴리아데닐화 서열은 프로모터와 동일한 공급원으로부터 유래될 수 있다.

벡터는 의문의 숙주 세포에서 벡터를 복제시킬 수 있는 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, pICatH, pHPLT (Genencor International, Inc.) 및 pIJ702 의 복제 기원이다.

또한 벡터는 선별가능 마커, 예를 들어, 숙주 세포에서 결점을 보완하는 생성물을 생성하는 유전자, 예컨대 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 또는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 로부터의 dal 유전자, 또는 항생제 내성 예컨대, 암피실린, 카나마이신, 클로르암페니콜 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 게다가, 벡터는 amdS, argB, niaD 및 xxsC 와 같은 아스페리길루스 (Aspergillus) 선별 마커를 포함할 수 잇으며, 마커는 하이그로마이신 내성을 부여하거나, 선별은 당업계에 공지된 바와 같은 공동-형질전환에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 국제 PCT 출원 WO 91/17243 참조.

세포내 발현 또는 고체 상태 발효가 일부 양상에서 유리할 수 있으나 (예를 들어, 숙주 세포로서 특정 박테리아 또는 진균을 사용하는 경우), 일반적으로, 변이체의 발현은 세포외적이고, 배양 배지 내로 이루어진다. 일반적으로, 본원에 언급된 바실러스 (Bacillus)

-아밀라아제는 배양 배지 내로 발현된 프로테아제의 분비가 가능한 전-단백질 형태를 포함한다. 원하는 경우, 상기 전-단백질 펩티드는 각 전-단백질을 코딩하는 DNA 서열의 치환에 의해 편리하게 달성되는, 상이한 전-펩티드 또는 신호 서열에 의해 대체될 수 있다. 전-단백질은 전형적으로는 3 개의 도메인, N-말단 도메인, H-도메인, 및 C-말단 도메인을 갖는 것을 특징으로 하고, 전형적으로는 길이가 18 내지 35 개의 잔기 범위이다.

발현 벡터에는 전형적으로 클로닝 벡터의 성분, 예를 들어, 선택된 숙주 유기체 내에서 벡터의 자발적 복제를 가능하게 하는 요소 및 선별 목적을 위한 하나 이상의 표현형으로 검출가능한 마커가 포함된다. 발현 벡터는 정상적으로 조절 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호 및 임의로, 억제자 유전자 또는 하나 이상의 활성자 유전자를 포함한다. 신호 서열은 일반적으로 좀더 용이한 효소 수집, 및 임의로 정제를 위한 세포 배양 배지에 대해 물질을 표적화시키는데 사용된다.

-아밀라아제 변이체, 프로모터, 종결자 및 기타 요소를 각각 코딩하는 DNA 구축물을 연결하고, 이들을 복제에 필요한 정보를 함유하는 적합한 벡터 내에 삽입하는데 사용되는 절차는, 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2^nd ed., Cold Spring Harbor, 1989, 및 3^rd ed., 2001 참조).

DNA 구축물 또는 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포는, 유리하게는

-아밀라아제 변이체의 재조합 생성에 숙주 세포로서 사용된다. 세포는 편리하게는 숙주 염색체 내에 DNA 구축물 (하나 이상의 카피) 을 통합하여, 변이체를 코딩하는 DNA 구축물로 형질전환될 수 있다. 상기 통합은 일반적으로는 DNA 서열이 세포내에 안정적으로 유지되는 것 같다면 유리한 것으로 고려된다. 숙주 염색체 내로의 DNA 구축물의 통합은 통상적인 방법에 따라, 예를 들어 상동 또는 이종 재조합에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로는, 세포는 상이한 유형의 숙주 세포와 관련해 상기 기재된 바와 같은 발현 벡터로 형질전환될 수 있다.

적합한 박테리아 숙주 유기체의 예는 그람 양성 박테리아 종, 예컨대 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실러스 스테아로테르모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 바실러스 알칼로필러스 (Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 라우투스 (Bacillus lautus), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 및 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 를 비롯한 바실라세아에 (Bacillaceae); 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종, 예컨대 스트렙토마이세스 뮤리너스 (Streptomyces murinus); 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis) 와 같은 락토코쿠스 종 (Lactococcus spp.) 을 비롯한 락트산 박테리아 종; 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) 를 비롯한 락토바실러스 종 (Lactobacillus spp.); 류코노스토크 종 (Leuconostoc spp.); 페디오코쿠스 종 (Pediococcus spp.); 및 스트렙토코쿠스 종 (Streptococcus spp.) 이다. 대안적으로는, E. 콜라이 (E. coli) 를 비롯한 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae), 또는 슈도모나다세아에 (Pseudomonadaceae) 에 속하는 그람 음성 박테리아 종의 균주가 숙주 유기체로서 선택될 수 있다. 적합한 효모 숙주 유기체는 효모 종, 예컨대 피샤 종 (Pichia sp.), 한세눌라 종 (Hansenula sp.), 또는 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 야로위니아 (Yarrowinia) 종 또는 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 를 비롯한 사카로마이세스 (Saccharomyces) 의 종 또는 예를 들어, S. 폼베 (S. pombe) 종과 같은 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 에 속하는 종과 같으나 이에 제한되지 않는 생물공학적으로 관련된 효모 종으로부터 선택될 수 있다. 메틸영양 효모 종의 균주 피샤 파스토리스 (Pichia pastoris) 는 숙주 유기체로서 사용될 수 있다. 대안적으로는, 숙주 유기체는 한세눌라 (Hansenula) 종일 수 있다. 사상 진균 중 적합한 숙주 유기체에는 아스페르길루스 (Aspergillus) 의 종, 예를 들어, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 투비겐시스 (Aspergillus tubigensis), 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori), 또는 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 가 포함된다. 대안적으로는, 푸사리움 (Fusarium) 종, 예를 들어, 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) 또는 리조무코르 (Rhizomucor) 종, 예컨대 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 의 균주가 숙주 유기체로서 사용될 수 있다. 기타 적합한 균주에는 테르모마이세스 (Thermomyces) 및 무코르 (Mucor) 종이 포함된다.

고려되는 효모 종에는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 또는 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 의 종, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 사상 진균은 유리하게는 아스페르길루스 (Aspergillus) 의 종, 예를 들어, 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) 또는 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 에 속할 수 있다. 진균 세포는 단독으로 공지된 방식으로 원형질체 형성 및 원형질체 형질전환 후 세포벽의 재생을 포함하는 방법에 의해 형질전환될 수 있다. 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주 세포의 형질전환에 적합한 절차에는 예를 들 어 EP 238023 에 기재된 것이 포함된다.

또다른 추가의 양상에서,

-아밀라아제 변이체의 제조 방법은 변이체의 생성에 도움이 되는 조건하에서 상기 기재된 숙주 세포를 배양하고, 세포 및/또는 배양 배지로부터 효소를 회수하는 것을 포함하여 제공된다.

세포를 배양하는데 사용되는 배지는 문제의 숙주 세포를 성장시키고

-아밀라아제 변이체의 발현을 수득하는데 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지 및 배지 성분은 시판 공급처에서 입수가 가능하거나, 공개된 처방에 따라 (예를 들어, American Type Culture Collection 의 카달로그에 기재된 바와 같이) 제조할 수 있다. 예시적인 배양 배지에는 하기 제공되는 실시예에서 사용되었던 삼천 리터 (3,000 L) 교반 탱크 발효기에서 수행되는 공급식-배치 발효용 배지가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 사용된 배지는 사용되는 숙주 세포에 가장 적합한 것, 예를 들어 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) 를 배양하기 위해 하기 논의된 배지일 것이다. 이러한 경우 성장 배지는 유기 화합물의 공급원으로서 옥수수 침지 고체 및 대두분과 함께 나트륨, 칼륨, 포스페이트, 마그네슘, 술페이트의 공급원으로서 무기 염 및 미량 원소로 이루어질 수 있다. 전형적으로는, 탄수화물 공급원, 예컨대 글루코오스는 또한 초기 배지의 일부이다. 배양이 스스로 성립되고 성장하기 시작하면, 배양을 지속시키기 위해 탱크 내에서 탄수화물을 당업계에 공지된 바와 같이 측정한다. 예를 들어 비색계 검정법을 사용하여 효소 적정 농도를 측정하기 위해 일정한 간격으로 발효기로부터 샘플을 제거한다. 측정에 따라 효소 생산 속도가 증가 하는 것이 멈출 때 발효 공정을 중단한다.

숙주 세포로부터 분비된

-아밀라아제 변이체는 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 분리하고, 암모늄 술페이트와 같은 염에 의해 배지의 단백질 성분을 침전시킨 후, 크로마토그래피 절차, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 등을 사용하는 것을 포함하는, 잘 공지된 절차에 의해 배양 배지로부터 편리하게 회수될 수 있다.

일반적으로, 벡터 중의 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 의해 코딩 서열을 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결되는, 즉, 벡터는 발현 벡터이다. 조절 서열은 예를 들어 추가의 전사 조절 요소의 첨가에 의해 조절 서열에 의해 지시되는 전사 수준을 전사 조절자에 더욱 민감하도록 변형할 수 있다. 조절 서열은 특히 프로모터를 포함할 수 있다.

숙주 세포는

-아밀라아제 변이체 단백질의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 단백질의 발현은 지속적으로 생성되거나, 발현 개시에 대한 자극을 필요로 하는 유도성인 식으로 구조적일 수 있다. 유도성 발현의 경우, 단백질 생성은 예를 들어, 배양 배지에 유도자 성분을 (예를 들어 덱사메타손 또는 IPTG 또는 Sepharose) 첨가하여 필요할 때 개시될 수 있다. 또한 폴리펩티드는 TnT™ (Promega) 토끼 망상적혈구 시스템과 같은, 시험관 내 무세포 시스템에서 재조합적으로 생성될 수 있다.

-아밀라아제 변이체를 발현하는 숙주는 또한 호기성 조건 하에서, 숙주에 적합한 배지에서 배양할 수 있다. 교반 또는 진탕과 통기의 조합이 제공될 수 있으며, 숙주의 요구 및 바람직한

-아밀라아제 변이체의 생성에 따라, 숙주에 적합한 온도, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 75℃ 에서 생성된다. 배양은 약 12 내지 약 100 시간 이상 (및 그 사이의 임의의 시간 값) 또는 예를 들어, 24 내지 72 시간에서 일어날 수 있다. 전형적으로는, 배양 브로스의 pH 는 약 5.5 내지 약 8.0 이며, 또한

-아밀라아제 변이체의 제조에 관해 숙주가 필요로 하는 배양 조건에 따라 다를 수 있다.

4.

- 아밀라아제 변이체의 정제

발효, 분리 및 농축 기술이 당업계에 잘 알려져 있으며, 농축된

-아밀라아제 변이체 함유 용액을 제조하기 위해 통상적인 방법이 사용될 수 있다.

발효 후, 발효 브로스를 수득하고, 잔류 생 발효 물질을 비롯한 미생물 세포 및 다양한 현탁 고체를, 아밀라아제 용액을 수득하기 위해 통상적인 분리 기술에 의해 제거한다. 여과, 원심분리, 초여과, 회전 진공 드럼 여과, 초여과, 원심분리 후 초여과, 추출 또는 크로마토그래피, 등이 일반적으로 사용된다.

회수를 최적화하기 위해

-아밀라아제 변이체 함유 용액을 농축하는 것이 바람직하다. 미농축 용액의 사용은 정제된

-아밀라아제 변이체 함유 침전물을 수집하기 위해 인큐베이션 시간을 증가시켜야 할 필요가 있다.

-아밀라아제 변이체 함유 용액은 원하는 효소 수준이 달성될 때까지 통상적인 농축 기술을 사용하여 농축 용액으로 농축된다. 효소 변이체 함유 용액의 농축은 상기 논의된 기술 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 초 여과가 사용될 수 있다.

효소 변이체 용액은 상기 농축된

-아밀라아제 변이체 함유 용액의 효소 변이체 활성이 일반적으로 약 4 g/L 이상 (예를 들어, 25 g/L 또는 4 내지 25 g/L 사이의 임의의 양) 이 될 때까지 농축 효소 변이체 용액으로 농축한다. 상기 농도는 용액에 가용화될 수 있는 효소의 양에 의해서만 제한된다.

정제를 목적으로 하는 "침전제" 는 그의 성분이 고체 형태의 농축된 효소 변이체 용액으로부터

-아밀라아제 변이체를 침전시키는데 유효한 화합물을 의미한다 (즉 특성이 결정질, 비결정질 또는 둘의 혼화물일 수 있는지의 여부와는 관계없다).

침전은 예를 들어, 금속 할라이드 침전제를 사용하여 수행될 수 있다. 금속 할라이드 침전제에는 알칼리 금속 클로라이드, 알칼리 금속 브로마이드 및 상기 금속 할라이드의 2 가지 이상의 혼화물이 포함된다. 금속 할라이드는 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨, 브롬화칼륨 및 상기 금속 할라이드의 2 가지 이상의 혼화물 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 금속 할라이드는 염화나트륨 및 염화칼륨 중에서 선택된다. 염화나트륨의 경우, 이것은 또한 방부제로서 사용될 수 있다.

금속 할라이드 침전제는

-아밀라아제 변이체를 침전시키는데 유효한 양으로 사용된다. 효소 변이체의 침전에 유효한 금속 할라이드의 적어도 유효한 양 및 최적 양 뿐 아니라, 인큐베이션 시간, pH, 온도 및

-아밀라아제 변이체의 농 도를 비롯한 최대 회수를 위한 침전 조건의 선택은, 통상의 시험 후에 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.

일반적으로, 약 5% w/v (중량/부피) 이상 내지 약 25% w/v 의 금속 할라이드를 농축 효소 변이체 용액에 첨가한다 (통상 8% w/v 이상임). 일반적으로, 약 25% w/v 이하의 금속 할라이드를 농축 효소 변이체 용액에 첨가한다 (통상 약 20% w/v 이하임). 금속 할라이드 침전제의 최적 농도는 그 중에서도, 특이적

-아밀라아제 변이체의 특성 및 농축

-아밀라아제 변이체 용액에서의 그의 농도에 따라 다를 것이다.

효소의 침전에 영향을 주는 또다른 대안은 농축 효소 변이체 용액에 첨가될 수 있는 유기 화합물을 사용하는 것이다. 유기 화합물 침전제의 예에는 4-히드록시벤조산, 4-히드록시벤조산의 알칼리 금속 염, 4-히드록시벤조산의 알킬 에스테르, 및 2 가지 이상의 상기 유기 화합물의 혼화물이 포함될 수 있다. 상기 유기 화합물 침전제의 첨가는 금속 할라이드 침전제의 첨가 전, 이와 동시에 또는 그 후에 일어날 수 있고, 두 가지 침전제인 유기 화합물 및 금속 할라이드의 첨가는 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다.

추가의 기재를 위해 예를 들어, 미국 특허 제 5,281,526 호를 참조한다. 일반적으로, 유기 화합물 침전제는 4-히드록시벤조산의 알칼리 금속염, 예컨대 나트륨 또는 칼륨염, 및 4-히드록시벤조산의 선형 또는 분지형 알킬 에스테르 (여기서 알킬기는 탄소수가 1 내지 12 임), 및 상기 유기 화합물의 2 가지 이상의 혼련물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 유기 화합물 침전제는 예를 들어 4-히드 록시벤조산의 선형 또는 분지형 알킬 에스테르 (여기서 알킬기는 탄소수가 1 내지 10 임), 및 상기 유기 화합물의 2 가지 이상의 혼련물일 수 있다. 예를 들어, 유기 화합물은 4-히드록시벤조산의 선형 알킬 에스테르 (여기서 알킬기는 탄소수가 1 내지 6 임), 및 상기 유기 화합물의 2 가지 이상의 혼련물일 것이다. 4-히드록시벤조산의 메틸 에스테르, 4-히드록시벤조산의 프로필 에스테르, 4-히드록시벤조산의 부틸 에스테르, 4-히드록시벤조산의 에틸 에스테르 및 상기 유기 화합물의 2 가지 이상의 혼련물이 또한 사용될 수 있다. 부가적인 유기 화합물에는 또한 4-히드록시벤조산 메틸 에스테르 (메틸 파라벤 (PARABEN) 으로 불림), 4-히드록시벤조산 프로필 에스테르 (프로필 파라벤 (PARABEN) 으로 불림) (또한 둘다 아밀라아제 방부제임) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유기 화합물 침전제의 첨가는 pH, 온도,

-아밀라아제 변이체 농도, 침전제 농도, 및 인큐베이션 시간에 대해 침전 조건의 높은 융통성의 장점을 제공한다.

유기 화합물 침전제는 금속 할라이드 침전제에 의해 효소 변이체의 침전을 개선하기에 유효한 양으로 사용된다. 유기 화합물 침전제의 적어도 유효한 양 및 최적 양 뿐 아니라, 인큐베이션 시간, pH, 온도 및 효소 변이체의 농도를 비롯한 최대 회수를 위한 침전 조건의 선택은, 통상의 시험 후에 본 명세서의 견지에서, 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.

일반적으로, 약 0.01% w/v 이상의 유기 화합물 침전제를 농축 효소 변이체 용액에 첨가한다 (통상 약 0.02% w/v 이상임). 일반적으로, 약 0.3% w/v 이하 의 유기 화합물 침전제를 농축 효소 변이체 용액에 첨가한다 (통상 약 0.2% w/v 이하임).

금속 할라이드 침전제, 및 예를 들어, 유기 화합물 침전제를 함유하는 농축 효소 변이체 용액은, 필요한 경우 정제되는 효소 변이체에 따라 pH 를 조정할 수 있다. 일반적으로, pH 는 아밀라아제의 등전위점 근처의 수준으로 조정된다. 일반적으로, pH 는 등전위점 (pI) 약 2.5 pH 단위 미만 내지 등전위점 약 2.5 pH 단위 초과의 범위의 pH 로 조정된다. 설명하자면, 효소 변이체가 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) 유래의

-아밀라아제 변이체인 경우, 농축 효소 변이체 용액은 통상 pH 약 5.5 내지 9.7 또는 pH 약 6.5 내지 9.0 로 조정된다. 기타 바실러스 (Bacillus)

-아밀라아제 변이체에 대한 pH 변화는 유사하게 제조될 수 있다.

정제된 효소 변이체 침전물을 수득하기에 필요한 인큐베이션 시간은 특이적 효소 변이체의 특성, 효소의 농도, 및 특이적 침전제(들) 및 그의 농도에 따라 다르다. 일반적으로, 효소 변이체를 침전시키는데 유효한 시간은 약 1 내지 약 30 시간이고; 통상 이것은 약 25 시간을 초과하지 않는다. 유기 화합물 침전제의 존재하에서, 인큐베이션 시간은 여전히 약 10 시간 미만으로, 대부분의 경우는 심지어 약 6 시간으로 감소될 수 있다.

일반적으로, 인큐베이션 동안의 온도는 약 4℃ 내지 약 50℃ 이다. 통상, 상기 방법은 약 10℃ 내지 약 45℃, 또는 약 20℃ 내지 약 40℃ 의 온도에서 수행된다. 침전 유도를 위한 최적 온도는 사용되는 용액 조건 및 효소 변이체 또는 침전제(들) 에 따라 다르다.

정제 효소 변이체 침전물의 전체적인 회수 및, 방법이 수행되는 효율은 효소 변이체, 첨가된 금속 할라이드 및 첨가된 유기 화합물을 포함하는 용액을 진탕하여 향상된다. 진탕 단계는 금속 할라이드와 유기 화합물의 첨가 동안, 및 연이은 인큐베이션 기간 동안에 수행된다. 적합한 진탕법에는 기계적 교반 또는 쉐이킹, 강한 진탕 또는 임의의 유사한 기술이 포함된다.

인큐베이션 기간 후, 그 다음 정제된 효소 변이체를 분리된 안료 및 기타 불순물로부터 분리하고, 통상의 분리 기술, 예컨대 여과, 원심분리, 정밀여과, 회전 진공 여과, 초여과, 압축 여과, 십자 막 정밀여과, 십자 흐름 막 정밀여과, 등에 의해 수집한다. 십자 막 정밀여과가 사용되는 하나의 방법일 수 있다. 정제된 효소 변이체 침전물의 추가 정제는 침전물을 물로 세정하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 정제된 효소 변이체 침전물을 금속 할라이드 침전제를 함유하는 물, 또는 예를 들어 금속 할라이드와 유기 화합물 침전제를 함유하는 물로 세정한다.

배양 동안, 열안정성 아밀라아제가 배양 브로스에 세포외적으로 축적된다. 바람직한

-아밀라아제 변이체의 단리 및 정제를 위해, 배양 브로스를 원심분리 또는 여과하여 세포를 제거하고, 산출된 무세포 액체는 효소 정제에 사용된다. 하나의 구현예에서, 무세포 브로스를 약 70% 포화 암모늄 술페이트를 사용하여 염석 (salting out) 에 적용하고; 그 다음 70% 포화-침전 분획을 완충액에 용해하고, Sephadex G-100 컬럼과 같은 컬럼에 적용하고, 용리하여 효소 변이체 활성 분획을 회수한다. 추가 정제를 위해, 통상의 절차, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피 를 사용할 수 있다.

정제된 효소 변이체는 효소 변이체가 일반적으로 이용되는 모든 적용에 유용하다. 예를 들어, 이들은 세탁 세제 및 오염 제거제, 식품 산업, 전분 가공 및 제빵, 및 소화 보조제로서 약학 조성물에 사용될 수 있다. 이들은 액체 (용액, 슬러리) 또는 고체 (과립, 분말) 인 최종 생성물로 제조될 수 있다.

대안적으로는, 효소 생성물은 회수될 수 있고, 효소의 추가 정제 없이 여과 또는 원심분리에 의해 세포 및 세포 데브리스를 제거하기 위해 플록킹제 (floccing agent) 가 배지에 첨가된다.

5.

- 아밀라아제 변이체를 포함하는 조성물

-아밀라아제 변이체는 다양한 산업 적용을 가능하게 하는 가치있는 특성을 소유하고 있다. 효소 변이체는 세정, 식기세정 및 경질표면 (바닥·타일) 세정 세제 조성물에서의 성분으로 사용될 수 있다. 다양한 변이체는 전분으로부터 에탄올 및 감미료의 생성에, 및/또는 직물 발호에 특히 유용하다. 전분 액화 및/또는 당화 공정을 비롯한 통상의 전분-전환 공정에 대한 조건은, 예를 들어, 미국 특허 제 3,912,590 호 및 EP 특허 공개 번호 252,730 및 63,909 에 기재된다.

약학 적용에서

-아밀라아제 변이체는 예컨대 동결건조에 의해 통상 건조된다.

5.1 세정 및 식기세정 조성물 및 용도

본원에 논의되는

-아밀라아제 변이체는 식기 세정 또는 기타 세정 조성물 에 사용하기 위해 세제 조성물로 제형화될 수 있다. 이들은 분말 또는 액체일 수 있다. 조성물은

-아밀라아제 변이체를 단독으로, 기타 녹말가수분해 효소, 기타 세정 효소, 및 세정 조성물에 통상인 기타 성분을 포함할 수 있다.

그러므로, 식기세정 세제 조성물은 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 음이온성, 비이온성, 양이온성, 양쪽이온성이거나 이러한 유형의 혼합물일 수 있다. 세제는 저-발포 내지 비-발포의 에톡실화 프로폭실화 직쇄 알코올과 같은 비이온성 계면활성제 0% 내지 약 90 중량% 를 함유할 수 있다.

세제 적용에서,

-아밀라아제 변이체는 통상 프로필렌 글리콜 함유 액체 조성물에 사용된다.

-아밀라아제 변이체는 예를 들어 10% 염화칼슘을 함유하는 프로필렌 글리콜 용액 25% 부피/부피에 순환하여 프로필렌 글리콜에 가용화된다.

세제 조성물은 무기 및/또는 유기 유형의 세제 강화제 염을 함유할 수 있다. 세제 강화제는 인-함유 및 비-인-함유 유형으로 다시 나뉠 수 있다. 세제 조성물은 통상 세제 강화제 약 1% 내지 약 90% 를 함유한다. 인-함유 무기 알칼리 세제 강화제의 예에는, 존재하는 경우, 수용성 염, 특히 알칼리 금속 파이로포스페이트, 오르토포스페이트, 및 폴리포스페이트가 포함된다. 인-함유 유기 알칼리 세제 강화제의 예에는, 존재하는 경우, 포스포네이트의 수용성 염이 포함된다. 비-인-함유 무기 강화제의 예에는, 존재하는 경우, 수용성 알칼리 금속 카르보네이트, 보레이트 및 실리케이트 뿐 아니라 다양한 유형의 수불용성 결정형 또는 무정형 알루미노 실리케이트가 포함되며, 이 중 제올라이트가 가장 잘 알려진 대표 물질이다.

적합한 유기 강화제의 예에는 알칼리 금속; 암모늄 및 치환된 암모늄; 시트레이트; 숙시네이트; 말로네이트; 지방산 술포네이트; 카르복시메톡시 숙시네이트; 암모늄 폴리아세테이트; 카르복실레이트; 폴리카르복실레이트; 아미노폴리카르복실레이트; 폴리아세틸 카르복실레이트; 및 폴리히드록시술포네이트가 포함된다.

기타 적합한 유기 강화제에는 강화 특성을 갖는 것으로 알려진 고급 분자량 중합체 및 공중합체, 예를 들어 적합한 폴리아크릴산, 폴리말레산 및 폴리아크릴산/폴리말레산 공중합체, 및 그의 염이 포함된다.

세정 조성물은 염소/브롬-유형 또는 산호-유형의 표백제를 함유할 수 있다. 무기 염소/브롬-유형 표백제의 예는 리튬, 나트륨 또는 칼슘 하이포클로라이트, 및 하이포브로마이트 뿐 아니라 염소화 트리나트륨 포스페이트이다. 유기 염소/브롬-유형 표백제의 예는 헤테로환형 N-브로모- 및 N-클로로-이미드, 예컨대 트리클로로이소시아누산, 트리므로모이소시아누산, 이브로모이소시아누산, 및 디클로로이소시아누산, 및 칼륨 및 나트륨과 같은 수용성 양이온과의 이의 염이다. 히단토인 화합물이 또한 적합하다.

세정 조성물은 산소 표백제를, 예를 들어 무기 과산의 형태, 표백 전구체로, 또는 퍼옥시 산 화합물로서 함유할 수 있다. 적합한 퍼옥시 표백제 화합물의 전형적인 예는 알칼리 금속 퍼보레이트 (테트라히드레이트 및 모노히드레이트 모두), 알칼리 금속 퍼카르보네이트, 퍼실리케이트 및 퍼포스페이트이다. 예시적인 활성화제 물질은 TAED, 및 글리세롤 트리아세테이트이다. 효소 표백 작용 시스템은 또한 예를 들어, 국제 PCT 출원 WO 2005/056783 에 기재된 바와 같이 예를 들어, 퍼보레이트 또는 퍼카르보네이트, 글리세롤 트리아세테이트 및 퍼히드롤라아제와 같이 존재할 수 있다.

세정 조성물은 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 당 또는 당 알코올, 락트산, 붕산 또는 붕산 유도체 (예를 들어, 방향족 보레이트 에스테르) 와 같은 폴리올과 같은 효소(들) 에 대한 통상의 안정화제를 사용하여 안정화될 수 있다.

세정 조성물은 또한 기타 통상의 세제 성분, 예를 들어 해교제 (deflocculant) 물질, 충전제 물질, 발포 억제제, 항부식제, 오염 현탁화제, 격리제, 오염 재침작 방지제, 탈수제, 염료, 살균제, 형광제, 증점제 및 향수를 함유할 수 있다.

마지막으로,

-아밀라아제 변이체는 통상의 식기세정 세제에, 예를 들어 개질된

-아밀라아제가 향상된 생산을 위해 SEQ ID NO: 1 의 X₂ 에서 개질된 바실러스 (Bacillus)

-아밀라아제이거나 본원에 기재된

-아밀라아제 변이체 외에도 사용되는 특허 및 특허 출원에 열거된

-아밀라아제임을 고려하여 하기 특허 공개 중 임의의 것에 기재된 세제 중 임의의 것에 사용될 수 있다: CA 2006687, GB 2200132, GB 2234980, GB 2228945, DE 3741617, DE 3727911, DE 4212166, DE 4137470, DE 3833047, DE 4205071, WO 93/25651, WO 93/18129, WO 93/04153, WO 92/06157, WO 92/08777, WO 93/21299, WO 93/17089, WO 93/03129, EP 481547, EP 530870, EP 533239, EP 554943, EP 429124, EP 346137, EP 561452, EP 318204, EP 318279, EP 271155, EP 271156, EP 346136, EP 518719, EP 518720, EP 518721, EP 516553, EP 561446, EP 516554, EP 516555, EP 530635, EP 414197, 미국 특허 제 5,112,518 호, 미국 특허 제 5,141,664 호, 및 미국 특허 제 5,240,632 호.

5.2 세탁 세제 조성물 및 용도

구현예에 따르면, 하나 이상의

-아밀라아제 변이체는 전형적으로 세제 조성물의 성분일 수 있다. 이처럼, 이것은 비분진 과립, 안정화된 액체, 또는 보호된 효소의 형태로 세제 조성물에 포함될 수 있다. 비분진 과립은 미국 특허 제 4,106,991 호 및 제 4,661,452 호 (모두 Novo Industri A/S 에 해당) 에 기재되는 바와 같이 제조될 수 있고, 임의로 당업계에 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 왁스성 코팅 물질의 예는 평균 몰 중량이 1,000 내지 20,000 인 폴리(에틸렌 옥시드) 생성물 (폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50 개의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 에톡실화 노닐페놀; 에톡실화 지방 알코올 (여기서 알코올의 탄소수는 12 내지 20 이고, 15 내지 80 개의 에틸렌 옥시드 단위가 있음); 지방 알코올; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리글리세라이드이다. 유동층 기술에 의해 적용하기에 적합한 막-형성 코팅 물질의 예는 예를 들어, GB 특허 번호 1483591 에 제시된다. 액체 효소 제제는 예를 들어, 수립된 방법에 따라 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산 또는 붕산을 첨가하여 안정화될 수 있다. 기타 효소 안정화제는 당업계에 잘 알려져 있다. 보호된 효소는 예를 들어 EP 238,216 에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 폴리올은 단백질의 안정화제 뿐 아니라, 단백질 가용성 개선용으로서 인지되어 왔고, 예를 들어, [J. K. Kaushik et al., "Why is trehalose an exceptional protein stabilizer? An analysis of the thermal stability of proteins in the presence of the compatible osmolyte trehalose" J. Biol. Chem. 278: 26458-65 (2003)] 및 여기에 언급된 참조; 및 [M. Conti et al., "Capillary isoelectric focusing: the problem of protein solubility," J. Chromatography 757: 237-245 (1997)] 를 참조한다.

세제 조성물은 임의의 편리한 형태, 예를 들어 분말, 과립, 페이스트 또는 액체일 수 있다. 액체 세제는, 전형적으로 약 70% 이하의 물 및 0% 내지 약 30% 의 유기 용매를 함유하는 수성일 수 있고, 또한 약 30% 물만을 함유하는 컴팩트 젤 유형의 형태일 수 있다.

세제 조성물은 하나 이상의 계면활성제를 포함하고, 이들 각각은 음이온성, 비이온성, 양이온성 또는 양쪽이온성일 수 있다. 세제는 통상 0% 내지 약 50% 의 음이온성 계면활성제, 예컨대 선형 알킬벤젠술포네이트 술포네이트 (LAS);

-올레핀술포네이트 (AOS); 알킬 술페이트 (지방 알코올 술페이트) (AS); 알코올 에톡시술페이트 (AEOS 또는 AES); 2차 알칸술포네이트 (SAS);

-술포 지방산 메틸 에스테르; 알킬- 또는 알케닐숙신산; 또는 비누를 함유할 것이다. 조성물은 또한 0% 내지 약 40% 의 비이온성 계면활성제, 예컨대 알코올 에톡실레이트 (AEO 또는 AE), 카르복실화 알코올 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민옥시드, 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 또는 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드 (예를 들어 WO 92/06154 에 기재 된 바와 같음) 를 함유할 수 있다.

세제 조성물은 부가적으로는 하나 이상의 기타 효소, 예컨대 리파아제, 큐티나아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 및/또는 락카아제를 임의의 조합으로 포함할 수 있다.

세제는 약 1% 내지 약 65% 의 세제 강화제 또는 복합제, 예컨대 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산 (NTA), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTMPA), 알킬- 또는 알케닐숙신산, 가용성 실리케이트 또는 층 실리케이트 (예를 들어, SKS-6, Hoechst 사 제조) 를 함유할 수 있다. 세제는 또한 미강화 (unbuilt), 즉 본질적으로 세제 강화제가 없는 것일 수 있다. 효소는 효소의 안정성과 상용성인 임의의 조성물로 사용될 수 있다. 효소는 일반적으로 공지된 형태의 캡슐화, 예를 들어, 히드로겔 내에 과립화 또는 격리에 의해 유해한 성분에 대해 보호될 수 있다. 효소, 및 구체적으로

-아밀라아제는 전분 결합 도메인의 유무와 관계없이, 세탁 및 식기세정 적용 뿐 아니라, 경질표면 (바닥·타일) 세척제 및 전분 또는 바이오매스로부터의 에탄올 생성을 위한 조성물에 사용될 수 있다.

세제는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 예에는 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리카르복실레이트, 예컨대 폴리아크릴레이트, 말레산/아크릴산 공중합체 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체가 포함된다.

세제는 과산 (peracid)-형성 표백 활성화제, 예컨대 테트라아세틸에틸렌디아민 (TAED) 또는 노나노일옥시벤젠술포네이트 (NOBS) 와 조합될 수 있는, 퍼보레이트 또는 퍼카르보네이트와 같은 H₂O₂ 공급원을 포함할 수 있는 표백 시스템을 함유할 수 있다. 대안적으로는, 표백 시스템은 퍼옥시산 (예를 들어, 아미드, 이미드, 또는 술폰 유형의 퍼옥시산) 을 포함할 수 있다. 표백 시스템은 또한 효소 표백 시스템, 예를 들어, 퍼히드롤라아제, 예컨대 국제 PCT 출원 WO 2005/056783 에 기재된 것일 수 있다.

세제 조성물의 효소는 통상의 안정화제, 예를 들어 폴리올, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤; 당 또는 당 알코올; 락트산; 붕산 또는 붕산 유도체, 예컨대, 예를 들어, 방향족 보레이트 에스테르를 사용하여 안정화될 수 있고; 조성물은 예를 들어, WO 92/19709 호 및 WO 92/19708 호에 기재된 바와 같이 제형화될 수 있다.

또한 세제는 기타 통상의 세제 성분, 예컨대 예를 들어, 점토를 비롯한 섬유 유연제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 항부식제, 오염 현탁화제, 오염 재침착방지제, 염료, 살균제, 변색 억제제, 형광 증백제, 또는 향수를 함유할 수 있다.

예를 들어, pH (사용 농도로 수용액에서 측정됨) 는 통상 중성 또는 알칼리성, 예를 들어 pH 약 7.0 내지 약 11.0 이다.

-아밀라아제 변이체는 세제에 통상 사용되는 농도로 혼입될 수 있다. 현재, 세제 조성물에,

-아밀라아제 변이체가 액체 리터 당

-아밀라아제 변이체 0.00001-1.0 mg (순소 효소 단백질로서 계산됨) 에 해당하는 양으로 첨가될 수 있는 것으로 고려된다.

-아밀라아제 변이체를 포함하는 세제 조성물의 특정 형태는 하기를 비롯해 제형화될 수 있다:

1) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로서 계산됨) 약 7% 내지 약 12%; 알코올 에톡시술페이트 (예, C_{12 -18} 알코올, 1-2 에틸렌 옥시드 (EO)) 또는 알킬 술페이트 (예, C_{16 -18}) 약 1% 내지 약 4%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_{14 -15} 알코올, 7 EO) 약 5% 내지 약 9%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 14% 내지 약 20%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 약 2 내지 약 6%; 제올라이트 (예, NaAlSiO₄) 약 15% 내지 약 22%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 0% 내지 약 6%; 나트륨 시트레이트/시트르산 (예, C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇) 약 0% 내지 약 15%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO₃H₂O) 약 11% 내지 약 18%; TAED 약 2% 내지 약 6%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 및 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 0-3%; 효소 (순수 효소로서 계산됨) 0.0001-0.1% 단백질; 및 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수, 형광 증백제, 광표백제) 0-5%.

2) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 6% 내지 약 11%; 알코올 에톡시술페이트 (예, C_{12 -18} 알코올, 1-2 EO) 또는 알킬 술페이트 (예, C_{16 -18}) 약 1% 내지 약 3%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_{14 -15} 알코올, 7 EO) 약 5% 내지 약 9%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 15% 내지 약 21%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 (예, NaAlSiO₄) 약 24% 내지 약 34%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 약 4% 내지 약 10%; 나트륨 시트레이트/시트르산 (예, C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇) 0% 내지 약 15%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 1-6%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수) 0-5%.

3) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 5% 내지 약 9%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_{12 -15} 알코올, 7 EO) 약 7% 내지 약 14%; 지방산으로서 비누 (예, C_{16 -22} 지방산) 약 1 내지 약 3%; 나트륨 카르보네이트 (Na₂CO₃ 으로서) 약 10% 내지 약 17%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 약 3% 내지 약 9%; 제올라이트 (NaAlSiO₄ 로서) 약 23% 내지 약 33%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 0% 내지 약 4%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO₃H₂O) 약 8% 내지 약 16%; TAED 약 2% 내지 약 8%; 포스포네이트 (예, EDTMPA) 0% 내지 약 1%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 0-3%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수, 형광 증 백제) 0-5%.

4) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 8% 내지 약 12%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_{12 -15} 알코올, 7 EO) 약 10% 내지 약 25%; 나트륨 카르보네이트 (Na₂CO₃ 으로서) 약 14% 내지 약 22%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 약 1% 내지 약 5%; 제올라이트 (예, NaAlSiO₄) 약 25% 내지 약 35%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 0% 내지 약 10%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 1-3%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수) 0-5%.

5) 하기를 포함하는 수성액 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 15% 내지 약 21%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_{12 -15} 알코올, 7 EO 또는 C_12-15 알코올, 5 EO) 약 12% 내지 약 18%; 지방산으로서 비누 (예, 올레산) 약 3% 내지 약 13%; 알케닐숙신산 (C_{12 -14}) 0% 내지 약 13%; 아미노에탄올 약 8% 내지 약 18%; 시트르산 약 2% 내지 약 8%; 포스포네이트 0% 내지 약 3%; 중합체 (예, PVP, PEG) 0% 내지 약 3%; 보레이트 (예, B₄O₇) 0% 내지 약 2%; 에탄올 0% 내지 약 3%; 프로필렌 글리콜 약 8% 내지 약 14%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 분산제, 비누거품 억제제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.

6) 하기를 포함하는 수성 구성 액체 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 15% 내지 약 21%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_{12 -15} 알코올, 7 EO, 또는 C_{12 -15} 알코올, 5 EO) 3-9%; 지방산으로서 비누 (예, 올레산) 약 3% 내지 약 10%; 제올라이트 (NaAlSiO₄ 로서) 약 14% 내지 약 22%; 칼륨 시트레이트 약 9% 내지 약 18%; 보레이트 (예, B₄O₇) 0% 내지 약 2%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, PEG, PVP) 0% 내지 약 3%; 부착 중합체, 예를 들어, 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체; 몰비 25:1, MW 3800) 0% 내지 약 3%; 글리세롤 0% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 분산제, 비누거품 억제제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.

7) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 지방 알코올 술페이트 약 5% 내지 약 10%; 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드 약 3% 내지 약 9%; 지방산으로서 비누 0-3%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 5% 내지 약 10%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 (예, NaAlSiO₄) 약 20% 내지 약 40%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 약 2% 내지 약 8%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO₃H₂O) 약 12% 내지 약 18%; TAED 약 2% 내지 약 7%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PEG) 약 1% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 형광 증백제, 비누거품 억제제, 향수) 0-5%.

8) 하기를 포함하는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네 이트 (산으로 계산됨) 약 8% 내지 약 14%; 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드 약 5% 내지 약 11%; 지방산으로서 비누 0% 내지 약 3%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 4% 내지 약 10%; 가용성 실리케이트 (Na₂O, 2SiO₂) 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 (예, NaAlSiO₄) 약 30% 내지 약 50%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 약 3% 내지 약 11%; 나트륨 시트레이트 (예, C₆H₅Na₃O₇) 약 5% 내지 약 12%; 중합체 (예, PVP, 말레산/아크릴산 공중합체, PEG) 약 1% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수) 0-5%.

9) 하기를 포함하는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 6% 내지 약 12%; 비이온성 계면활성제 약 1% 내지 약 4%; 지방산으로서 비누 약 2% 내지 약 6%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 14% 내지 약 22%; 제올라이트 (예, NaAlSiO₄) 약 18% 내지 약 32%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 약 5% 내지 약 20%; 나트륨 시트레이트 (예, C₆H₅Na₃O₇) 약 3% 내지 약 8%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO₃H₂O) 약 4% 내지 약 9%; 표백 활성화제 (예, NOBS 또는 TAED) 약 1% 내지 약 5%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 폴리카르복실레이트 또는 PEG) 약 1% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 형광 증백제, 향수) 0-5%.

10) 하기를 포함하는 수성액 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 15% 내지 약 23%; 알코올 에톡시술페이트 (예, C_{12 -15} 알코올, 2-3 EO) 약 8% 내지 약 15%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_{12 -15} 알코올, 7 EO, 또는 C_{12 -15} 알코올, 5 EO) 약 3% 내지 약 9%; 지방산으로서 비누 (예, 라우르산) 0% 내지 약 3%; 아미노에탄올 약 1% 내지 약 5%; 나트륨 시트레이트 약 5% 내지 약 10%; 하이드로트롭 (예, 나트륨 톨루엔술포네이트) 약 2% 내지 약 6%; 보레이트 (예, B₄O₇) 0% 내지 약 2%; 카르복시메틸셀룰로오스 0% 내지 약 1%; 에탄올 약 1% 내지 약 3%; 프로필렌 글리콜 약 2% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 중합체, 분산제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.

11) 하기를 포함하는 수성액 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 20% 내지 약 32%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_{12 -15} 알코올, 7 EO, 또는 C_12-15 알코올, 5 EO) 6-12%; 아미노에탄올 약 2% 내지 약 6%; 시트르산 약 8% 내지 약 14%; 보레이트 (예, B₄O₇) 약 1% 내지 약 3%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, 부착 중합체, 예를 들어, 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체) 0% 내지 약 3%; 글리세롤 약 3% 내지 약 8%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 하이드로트롭, 분산제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.

12) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 음이온성 계면활성제 (선형 알킬벤젠술포네이트, 알킬 술페이트,

-올레핀술포네이트,

-술포 지방산 메틸 에스테르, 알칸술포네이트, 비누) 약 25% 내지 약 40%; 비이온성 계면활성제 (예, 알코올 에톡실레이트) 약 1% 내지 약 10%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 8% 내지 약 25%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 약 5% 내지 약 15%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 0% 내지 약 5%; 제올라이트 (NaAlSiO₄) 약 15% 내지 약 28%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO₃·4H₂O) 0% 내지 약 20%; 표백 활성화제 (TAED 또는 NOBS) 약 0% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 미량 성분 (예, 향수, 형광 증백제) 0-3%.

13) 상기 조성물 1)- 12) 에 기재된 바와 같은 세제 조성물 (여기서 선형 알킬벤젠술포네이트 모두 또는 이의 일부는 (C₁₂-C₁₈) 알킬 술페이트로 대체됨).

14) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: (C₁₂-C₁₈) 알킬 술페이트 약 9% 내지 약 15%; 알코올 에톡실레이트 약 3% 내지 약 6%; 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드 약 1% 내지 약 5%; 제올라이트 (예, NaAlSiO₄) 약 10% 내지 약 20%; 층화 디실리케이트 (예, SK56, Hoechst 사 제조) 약 10% 내지 약 20%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 3% 내지 약 12%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 0% 내지 약 6%; 나트륨 시트레이트 약 4% 내지 약 8%; 나트륨 퍼카르보네이트 약 13% 내지 약 22%; TAED 약 3% 내지 약 8%; 중합체 (예, 폴리카르복실레이트 및 PVP) 0% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 형광 증백제, 광표백제, 향수, 비누거품 억제제) 0-5%.

15) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: (C₁₂-C₁₈) 알킬 술페이트 약 4% 내지 약 8%; 알코올 에톡실레이트 약 11% 내지 약 15%; 비누 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 MAP 또는 제올라이트 A 약 35% 내지 약 45%; 나트륨 카르보네이트 (Na₂CO₃ 으로서) 약 2% 내지 약 8%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 0% 내지 약 4%; 나트륨 퍼카르보네이트 약 13% 내지 약 22%; TAED 1-8%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 3%; 중합체 (예, 폴리카르복실레이트 및 PVP) 0% 내지 약 3%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 형광 증백제, 포스포네이트, 향수) 0-3%.

16) 상기 1) - 15) 에 기재된 바와 같은 세제 제형 (이것은 안정화되거나 캡슐화된 과산을 부가적인 성분 또는 이미 구체화된 표백 시스템에 대한 치환제로서 함유함).

17) 상기 1), 3), 7), 9), 및 12) 에 기재된 바와 같은 세제 조성물 (여기서 퍼보레이트는 퍼카르보네이트로 대체됨).

18) 상기 1), 3), 7), 9), 12), 14), 및 15) 에 기재된 바와 같은 세제 조성물 (이것은 부가적으로 망간 촉매를 함유함).

19) 선형 알콕실화 1차 알코올과 같은 액체 비이온성 계면활성제, 강화제 시스템 (예, 포스페이트), 효소(들), 및 알칼리를 포함하는 비-수성 세제 액체로서 제형화된 세제 조성물. 또한 세제는 음이온성 계면활성제 및/또는 표백 시스템을 포함할 수 있다.

-아밀라아제 변이체는 세제에 통상적으로 사용되는 농도로 도입될 수 있 다. 현재, 세제 조성물 중에 효소는 세정액 1 리터 당

-아밀라아제 변이체 0.00001-1.0 mg (순수 효소 단백질로서 계산됨) 에 해당하는 양으로 첨가될 수 있다고 고려된다.

또다른 구현예에서, 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제는 세제 조성물에 도입될 수 있고, 가정용 및/또는 산업용 직물/세탁물에 존재하는 균막을 제거/세정하는데 사용될 수 있다.

세제 조성물은 예를 들어 오염된 섬유의 예비 처리에 적합한 세탁 첨가 조성물 및 린스가 첨가된 섬유 유연제 조성물을 비롯한 손세탁 또는 세탁기 세탁 세제 조성물로서 제형화될 수 있거나, 일반적인 가정용 경질표면 (바닥·타일) 세정 작업에 사용하기 위한 세제 조성물로서 제형화되거나, 설겆이 또는 식기세척기 작업을 위해 제형화될 수 있다.

특정 양상에서, 세제 조성물은 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제, 하나 이상의

-아밀라아제 변이체 및 하나 이상의 기타 세정 효소, 예컨대 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제, 카르보히드라아제, 셀룰라아제, 펙티나아제, 만난나아제, 아라비나아제, 갈락타나아제, 자일라나아제, 옥시다아제, 락카아제, 및/또는 퍼옥시다아제, 및/또는 이의 조합을 포함할 수 있다.

일반적으로 선택된 효소의 특성은 선택되는 세제와 상용성이어야만 하고 (예, pH-최적화, 기타 효소 및 비-효소 성분과의 상용성, 등), 효소는 효과적인 양으로 존재해야만 한다.

프로테아제: 적합한 프로테아제에는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것이 포 함된다. 예시적인 프로테아제에는 미생물 유래의 것이 포함된다. 화학적으로 개질되거나 단백질 가공된 돌연변이체가 포함된다. 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 메탈로프로테아제, 알칼리성 미생물 프로테아제, 또는 트립신-유사 프로테아제일 수 있다. 알칼리성 프로테아제의 예는 서브틸리신, 특히 바실러스 (Bacillus) 로부터 유래된 것들, 예를 들어, 서브틸리신 Novo, 서브틸리신 Carlsberg, 서브틸리신 309, 서브틸리신 147, 및 서브틸리신 168 (예를 들어, WO 89/06279 참조) 이다. 트립신-유사 프로테아제의 예는 트립신 (예, 돼지 또는 소 기원), 및 Fusarium 프로테아제 (예를 들어, WO 89/06270 및 WO 94/25583 참조) 이다. 유용한 프로테아제의 예에는 또한 WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, 및 WO 98/34946 에 기재된 변이체가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 시판되는 프로테아제 효소에는 하기가 포함된다: Alcalase®, Savinase®, Primase™, Duralase™, Esperase®, 및 Kannase™(Novo Nordisk A/S); Maxatase®, Maxacal™, Maxapem™, Properase®, Purafect®, Purafect OxP™, FN2™, 및 FN3™ (Genencor International, Inc.).

리파아제: 적합한 리파아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것이 포함된다. 화학적으로 개질된 또는 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 유용한 리파아제의 예에는 휴미콜라 (Humicola) (동의어 테르모마이세스 (Thermomyces)), 예를 들어, H. 라누기노사 (H. lanuginosa) (T. 라누기노수스 (T. lanuginosus)) (예를 들어, EP 258068 및 EP 305216 참조), H. 인솔렌스 (H. insolens) (예를 들어, WO 96/13580 참조) 로부터의 리파아제; 슈도모나스 (Pseudomonas) 리파아제 (예, P. 알칼리세네스 (P. alcaligenes) 또는 P. 슈도알칼리게네스 (P. pseudoalcaligenes); 예를 들어, EP 218 272 참조), P. 세파시아 (P. cepacia) (예를 들어, EP 331 376 참조), P. 스투트제리 (P. stutzeri) (예를 들어, GB 1,372,034 참조), P. 플루오레센스 (P. fluorescens), 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) 균주 SD 705 (예를 들어, WO 95/06720 및 WO 96/27002 참조), P. 위스콘시넨시스 (P. wisconsinensis) (예를 들어, WO 96/12012 참조); 바실러스 리파아제 (예, B. 서브틸리스 (B. subtilis); 예를 들어, Dartois et al. Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993) 참조), B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus) (예를 들어, JP 64/744992 참조), 또는 B. 푸밀러스 (B. pumilus) (예를 들어, WO 91/16422 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 제형에 사용하기 위해 고려되는 부가적인 리파아제 변이체에는 예를 들어: WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225, 및 EP 260105 에 기재된 것들이 포함된다. 일부 시판되는 리파아제 효소에는 Lipolase® 및 Lipolase® Ultra (Novo Nordisk A/S) 가 포함된다.

폴리에스테라아제: 적합한 폴리에스테라아제에는 국제 PCT 출원 WO 01/34899 및 WO 01/14629 에 기재된 것들이 포함되나 이에 제한되지는 않고, 본원에 논의된 기타 효소와 임의의 조합으로 포함될 수 있다.

아밀라아제: 조성물은 기타

-아밀라아제, 예컨대 비-생성 향상

-아밀라아제와 조합될 수 있다. 이들에는 시판 아밀라아제, 예컨대 Duramyl®, Termamyl®, Fungamyl® 및 BAN™ (Novo Nordisk A/S); Rapidase® 및 Purastar® (Genencor International, Inc.) 가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

셀룰라아제: 셀룰라아제가 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 셀룰라아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함된다. 화학적으로 개질되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 적합한 셀룰라아제에는 바실러스 (Bacillus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 휴미콜라 (Humicola), 푸사리움 (Fusarium), 티에라비아 (Thielavia), 아크레모니움 (Acremonium) 속으로부터의 셀룰라아제, 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,435,307 호; 제 5,648,263 호; 제 5,691,178 호; 제 5,776,757 호; 및 WO 89/09259 에 기재된 휴미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens), 마이셀리오프토라 테르모필라 (Myceliophthora thermophila) 및 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) 으로부터 생성된 진균 셀룰라아제가 포함된다. 사용하기 위해 고려되는 예시적인 셀룰라아제는 직물에 대한 색조 관리 이점을 갖는 것들이다. 이러한 셀룰라아제의 예는 예를 들어 EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, 및 WO 98/08940 에 기재된 셀룰라아제이다. 기타 예는 셀룰라아제 변이체, 예컨대 WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531315; 미국 특허 번호 5,457,046; 5,686,593; 및 5,763,254 에 기재된 것들이다. 시판되는 셀룰라아제에는 Celluzyme® 및 Carezyme® (Novo Nordisk A/S); Clazinase® 및 Puradax HA® (Genencor International, Inc.); 및 KAC-500(B)™ (Kao Corporation) 가 포함된다.

퍼옥시다아제/옥시다아제: 본 조성물에 사용하기 위해 고려되는 적합한 퍼옥시다아제/옥시다아제에는 식물, 박테리아 또는 진균 기원의 것이 포함된다. 화학적으로 개질되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 유용한 퍼옥시다아제의 예에는 코프리누스 (Coprinus), 예를 들어, C. 시네레우스 (C. cinereus) 로부터의 퍼옥시다아제, 및 이의 변이체와 WO 93/24618, WO 95/10602, 및 WO 98/15257 에 기재된 것이 포함된다. 시판되는 퍼옥시다아제에는 예를 들어 Guardzyme ™ (Novo Nordisk A/S) 가 포함된다.

세제 효소(들) 은 하나 이상의 효소를 함유하는 별도의 첨가제를 첨가하거나, 이들 효소 모두를 포함하는 조합 첨가제를 첨가하여 세제 조성물에 포함될 수 있다. 세제 첨가제, 즉, 별도의 첨가제 또는 조합 첨가제는 예를 들어 과립, 액체, 슬러리 등으로 제형화될 수 있다. 예시적인 세제 첨가제 제형에는 과립, 특히 비분진 과립, 액체, 특히 안정화된 액체 또는 슬러리이다.

비분진 과립은 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,106,991 호 및 제 4,661,452 호에 기재된 것들로서 제조될 수 있고, 당업계에 공지된 방법에 의해 임의로 코팅될 수 있다. 왁스성 코팅 물질의 예는 평균 몰 중량이 1,000 내지 20,000 인 폴리(에틸렌 옥시드) 생성물 (예, 폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50 개의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 에톡실화 노닐페놀; 에톡실화 지방 알코올 (여기서 알코올의 탄소수는 12 내지 20 이고, 15 내지 80 개의 에틸렌 옥시드 단위가 있음); 지방 알코올; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리글리세라이드이다. 유동층 기술에 의해 적용하기에 적합한 막-형성 코팅 물질의 예는 예를 들어, GB 1483591 에 제시된다. 액체 효소 제제는 예를 들어, 수립된 방법에 따라 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산 또는 붕산을 첨가하여 안정화될 수 있다. 보호된 효소는 EP 238,216 에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.

세제 조성물은 임의의 편리한 형태, 예를 들어, 바, 정제, 분말, 과립, 페이스트 또는 액체일 수 있다. 액체 세제는 전형적으로 약 70% 이하의 물 및 0% 내지 약 30% 의 유기 용매를 함유하는 수성일 수 있다. 또한 약 30% 물만을 함유하는 컴팩트 젤 유형의 형태일 수 있다. 세제 조성물은 반-극성 (semi-polar) 및/또는 음이온성 및/또는 양이온성 및/또는 양쪽이온성을 비롯한 비-이온성일 수 있는 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 전형적으로 0.1 중량% 내지 60 중량% 의 수준으로 존재한다.

포함되는 경우 세제는 전형적으로 약 1% 내지 약 40% 의 음이온성 계면활성제, 예컨대 선형 알킬벤젠술포네이트,

-올레핀술포네이트, 알킬 술페이트 (지방 알코올 술페이트), 알코올 에톡시술페이트, 2차 알칸술포네이트,

-술포 지방산 메틸 에스테르, 알킬- 또는 알케닐숙신산, 또는 비누를 함유할 것이다.

포함되는 경우 세제는 통상 약 0.2% 내지 약 40% 의 비-이온성 계면활성제, 예컨대 알코올 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민옥시드, 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드, 또는 글루코사민의 N-아실-N-알킬 유도체 ("글루카미드") 를 함유할 것이다.

세제는 0% 내지 약 65% 의 세제 강화제 또는 복합제, 예컨대 제올라이트, 디 포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTMPA), 알킬- 또는 알케닐숙신산, 가용성 실리케이트 또는 층 실리케이트 (예를 들어, SKS-6, Hoechst 사 제조) 를 함유할 수 있다.

세제는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 예는 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피리딘-N-옥시드), 폴리(비닐이미다졸), 폴리카르복실레이트, 예를 들어 폴리아크릴레이트, 말레산/아크릴산 공중합체 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체가 포함된다.

세제는 과산-형성 표백 활성화제 (예를 들어, 테트라아세틸에틸렌디아민 또는 노나노일옥시벤젠술포네이트) 와 조합될 수 있는, 퍼보레이트 또는 퍼카르보네이트와 같은 H₂O₂ 공급원을 포함할 수 있는 표백 시스템을 함유할 수 있다. 대안적으로는, 표백 시스템은 퍼옥시산 (예를 들어, 아미드, 이미드, 또는 술폰 유형의 퍼옥시산) 을 포함할 수 있다. 표백 시스템은 또한 효소 표백 시스템일 수 있다.

세제 조성물의 효소는 통상적인 안정화제, 예를 들어, 폴리올 (예, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤), 당 또는 당 알코올, 락트산, 붕산, 또는 붕산 유도체 (예, 방향족 보레이트 에스테르), 또는 페닐 붕산 유도체 (예, 4-포르밀페닐 붕산) 를 사용하여 안정화될 수 있다. 조성물은 WO 92/19709 및 WO 92/19708 에 기재된 바와 같이 제형화될 수 있다.

또한 세제는 기타 통상의 세제 성분, 예컨대 예를 들어, 점토를 비롯한 섬유 유연제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 항부식제, 오염 현탁화제, 오염 재침착방지제, 염료, 살균제, 형광 증백제, 히드로트롭, 변색 억제제, 또는 향수를 함유할 수 있다.

현재 세제 조성물, 특히 효소 변이체가 세정액 1 리터 당 효소 단백질 약 0.01 내지 약 100 mg (예를 들어, 세정액 1 리터 당 효소 단백질 약 0.05 내지 약 5.0 mg, 특히 세정액 1 리터 당 효소 단백질 0.1 내지 약 1.0 mg) 에 해당하는 양으로 첨가될 수 있다는 것이 고려된다.

5.3 세제 조성물 평가 방법

수많은

-아밀라아제 세정 검정법이 존재한다. 세정 시험의 예시적인 설명에는 하기가 포함된다.

"천조각" 은 오염물이 적용되는 섬유와 같은 물질의 조각이다. 물질은 예를 들어, 면, 폴리에스테르 또는 천연 및 합성 섬유의 혼합물로 만들어진 섬유일 수 있다. 천조각은 또한 여과지 또는 니트로셀룰로오스와 같은 종이, 또는 도자기, 금속 또는 유리와 같은 경질 물질 조각일 수 있다. 아밀라아제에 있어, 오염물은 전분 기재이지만, 혈액, 우유, 잉크, 풀, 차, 와인, 시금치, 육즙, 초콜렛, 달걀, 치즈, 점토, 안료, 오일, 또는 이들 화합물의 혼합물이 포함될 수 있다.

"소형 천조각" 은 단일 구멍 펀치 장치로 절단되거나, 주문 제작된 96 개 구멍 펀치 장치로 절단된 천조각의 한 구획으로, 여기서 다수개의 구멍 펀치의 패턴 은 표준 96 웰 마이크로역가 플레이트에 매칭되고, 그렇지 않으면 구획은 천조각으로부터 제거된다. 천조각은 직물, 종이, 금속, 또는 기타 적합한 물질일 수 있다. 소형 천조각에는 24, 48 또는 96 웰 마이크로역가 플레이트의 웰에 두기 전 또는 둔 후 오염물을 고정시킬 수 있다. "소형 천조각" 은 또한 작은 조각의 물질에 오염물을 적용시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 소형 천조각은 직경이 5/8" 미만인, 예컨대 직경이 0.25" 인 오염된 섬유 조각일 수 있다. 주문 제작된 펀치는 96 개의 천조각을 96 웰 플레이트의 모든 웰에 동시에 전달하는 방법으로 고안된다. 상기 장치는 단순히 동일한 96 웰 플레이트를 여러 번 적재하여 웰 당 1 개 초과의 천조각을 전달할 수 있다. 다수개의 구멍 펀치 장치는 천조각을 24 웰, 48 웰, 및 96 웰 플레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 포맷 플레이트에 동시에 전달할 것으로 생각될 수 있다. 또다른 고려되는 방법에서, 오염된 시험 플랫폼은 오염 성분으로 코팅되는 금속, 플라스틱, 유리 도자기 또는 기타 적합한 물질로 제조된 비드일 수 있다. 그 다음 하나 이상의 코팅된 비드를 적합한 완충액 및 효소를 함유하는 96, 48, 또는 24 웰 플레이트 또는 더 큰 포맷의 웰에 넣는다. 이 경우, 상청액을 직접 흡광도 측정에 의해 또는 2 차 색 전개 반응 후 방출된 오염물에 대해 시험할 수 있다. 방출된 오염물의 분석은 또한 질량 스펙트럼 분석에 의해 수행될 수 있을 것이다. 추가의 마이크로스크리닝 검정법은 천조각, 예를 들어 인디고 색으로 염색된 데님을 다수개의 웰 플레이트의 웰에 전달 및 확보하고, 모래와 같은 입자 또는 더 큰 입자, 예를 들어 입자 6 내지 8, 또는 9 규격을 포함하도록 체질된 가넷을 첨가하고, 플레이트 를 진탕하여 첨가된 입자에 의해 천조각을 마모시키는 것일 수 있다. 본 검정법은 예를 들어 스톤 워싱 적용에서 셀룰라아제의 평가에서의 유용성을 발견한다. 효소의 유효성은 반응 완충액으로의 색조 방출 (예, 방출된 인디고 색상을 디메틸술폭시드에 용해하고, A₆₀₀ nm 에서의 흡광도를 측정한다) 또는 침식된 천조각의 반사도 측정에 의해 평가될 수 있다.

예를 들어, 미처리된 BMI (혈액/우유/잉크: blood/milk/ink) 천조각을 표백제 없이 세제에서 세정하는 경우, 대부분의 잉크는 심지어 프로테아제의 도움 없이도 방출된다. 프로테아제를 첨가하면 잉크 방출이 조금 증가하고, 이것은 큰 배경에 비해 정량화하기는 어려울 수 있다. 본 발명은 오염물의 고정화도를 조절할 수 있게 하는 처리 프로토콜을 제공한다. 그 결과, 예를 들어, 시험되는 효소의 부재하에 세정되는 경우 오염물의 양을 달리 방출하는 천조각을 제조하는 것이 가능하다. 고정된 천조각의 사용은 세정 검정법에서 신호-대-잡음 (signal-to-noise) 비의 현저한 개선을 가져온다. 게다가, 고정화도를 다르게 함으로써, 다양한 세정 조건하에서 최적 결과를 산출하는 오염물을 발생시킬 수 있다.

다양한 유형의 물질에 대해 공지된 "강도" 의 오염물을 갖는 천조각이 시판되고/되거나 (EMPA, St. Gallen, Switzerland; wfk--Testgewebe GmbH, Krefeld Germany; 또는 Center for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands), 당업자에 의해 제조될 수 있다 (Morris and Prato, Textile Research Journal 52(4): 280 286 (1982)). 기타 시험 천조각에는 면-함유 섬유 상의 혈액/우유/잉크 (BMI) 오염물(들), 면-함유 섬유 상의 시금치 오염물, 또는 면-함유 섬유 상의 풀, 및 면-함유 섬유 상의 초콜렛/우유/그을음이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

하나의 양상에서, BMI 오염물은 면에 0.0003% 내지 0.3% 과산화수소로 고정될 수 있다. 기타 조합에는 0.001% 내지 1% 글루타르알데하이드로 고정된 풀 또는 시금치, 0.001% 내지 1% 글루타르알데하이드로 고정된 젤라틴 및 코마시 오염물, 또는 0.001% 내지 1% 글루타르알데하이드로 고정된 초콜렛, 우유 및 그을음이 포함된다.

천조각은 또한 효소 및/또는 세제 제형으로의 인큐베이션 동안 진탕될 수 있다. 세정력 데이터는 웰, 특히 96 웰 플레이트 내 천조각의 배향 (수평 대 수직) 에 따라 다르다. 이것은 혼합이 인큐베이션 기간 동안 불충분하였다는 것을 나타낼 것이다. 인큐베이션 동안 충분한 진탕을 확보하기 위해 다수의 방법이 있다 하더라도, 마이크로역가 플레이트가 2 개의 알루미늄 플레이트 사이에 샌드위치된 플레이트 홀더가 구축될 수 있다. 이것은 예를 들어, 접착 플레이트 봉합제를 웰에 둔 다음, 2 개의 알루미늄 플레이트를 임의의 유형의 적합한, 시판되는 집게로 96 웰 플레이트에 집는 정도로 간단할 수 있다. 그 다음 이것은 시판 인큐베이터 쉐이터에서 고정시킬 수 있다. 쉐이커를 약 400 rpm 로 설정하면 매우 효과적으로 혼합되면서, 이 동안 누출 또는 교차-오염이 홀더에 의해 효과적으로 방지된다.

트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 이 세정액 중의 아미노기의 농도를 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 천조각으로부터 제거되었던 단백질 양의 측정으로서 담당할 수 있다 (예를 들어, Cayot and Tainturier, Anal. Biochem. 249: 184-200 (1997) 참조). 그러나, 세제 또는 효소 샘플이 통상적이지 않게 소형 펩티드 분절을 형성하는 경우 (예를 들어, 샘플 중의 펩티다아제의 존재로부터), 더 큰 TNBS 신호, 즉, 더 큰 "잡음" 을 수득할 것이다.

혈액/우유/잉크의 세정 성능 측정을 위한 또다른 수단은 잉크 방출에 근거한다. 천조각에 대한 단백질의 단백질 가수분해는 세정액의 흡광도를 측정하여 정량될 수 있는 잉크 입자의 방출을 야기한다. 흡광도는 350 내지 800 nm 의 임의의 파장에서 측정될 수 있다. 또다른 양상에서, 흡광도는 410 nm 또는 620 nm 에서 측정된다. 세정액은 또한 풀, 시금치, 젤라틴 또는 코마시 오염물을 함유하는 오염물에 대한 세정 성능을 측정하기 위해 시험될 수 있다. 이러한 오염물에 대한 예시적 파장에는 시금치 또는 풀에 대해서는 670 nm 및 젤라틴 또는 코마시에 대해서는 620 nm 가 포함된다. 예를 들어, 세정액의 분취물 (예를 들어, 전형적으로 96 웰 마이크로플레이트로부터 100-150 μL) 을 제거하고, 큐벳 또는 다수개의 웰 마이크로플레이트에 넣는다. 그 다음 이것을 분광광도계에 넣고, 적합한 파장에서 흡광도를 판독한다.

또한 시스템은 예를 들어, 옷감, 플라스틱 또는 도자기와 같은 적합한 물질 상에 혈액/우유/잉크 오염물을 사용하는 식기 세정을 위한 효소 및/또는 세제 조성물을 측정하는데 사용될 수 있다.

하나의 양상에서, BMI/면 천조각에 30 분 동안 25℃ 에서 0.3% 과산화수소를 적용하거나 BMI/면 천조각에 30 분 동안 60℃ 에서 0.03% 과산화수소를 적용하여, 면에 BMI 오염물을 고정하였다. BMI/면 천조각으로부터 대략 0.25" 의 소형 천조각을 절단하고, 96 웰 마이크로역가 플레이트의 웰에 넣었다. 각 웰 내에, 세제 조성물과 변이체 단백질과 같은 효소의 공지된 혼합물을 넣는다. 접착 플레이트 봉합제를 마이크로역가 플레이트의 상부에 둔 후, 마이크로역가 플레이트에 알루미늄 플레이트를 집어놓고 대략 250 rpm 에서 약 10 내지 60 분 동안 오비탈 쉐이커에서 진탕한다. 마지막에, 상청액을 신규 마이크로역가 플레이트 중의 웰로 옮기고, 620 nm 에서의 잉크의 흡광도를 측정한다. 이것은 0.01% 글루타르알데하이드를 시금치/면 천조각 또는 풀/면 천조각에 30 분 동안 25℃ 에서 적용하여 면에 고정된 시금치 오염물 또는 풀 오염물로 유사하게 시험할 수 있다. 초콜렛, 우유, 및/또는 그을음 오염물로 동일한 시험을 수행할 수 있다. 혈액/우유/잉크 검정법에 대한 부가적인 변형 및 조건에 대해서는 미국 특허 번호 제 7,122,334 호 (Genencor International, Inc.) 를 참조한다.

5.4 직물 발호 조성물 및 용도

또한 고려되는 것은 하나 이상의 효소 변이체를 사용하는 섬유의 처리 조성물 및 방법 (예를 들어, 직물을 발호하기 위함) 이다. 효소 변이체는 당업계에 잘 알려진, 예를 들어 미국 특허 번호 제 6,077,316 호의 임의의 섬유-처리 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 양상에서 섬유의 촉감 및 외양은 용액에서 섬유를 효소 변이체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 향상된다. 하나의 양상에서, 섬유는 압력하에서 용액으로 처리된다.

하나의 양상에서, 효소는 직물의 방적 동안 또는 그 후, 또는 발호 단계, 또는 하나 이상의 부가적인 섬유 가공 단계 동안 적용된다. 직물의 방적 동안, 실은 고려가능한 기계적 스트레인에 노출된다. 기계 베틀에서 방적하기 전, 날실은 종종 직물의 강도를 증가시키고 파손을 방지하기 위해 사이징 (sizing) 전분 또는 전분 유도체로 코팅된다. 효소는 이러한 사이징 전분 또는 전분 유도체를 제거하기 위해 적용될 수 있다. 직물이 방적된 후, 섬유는 발호 단계를 거칠 수 있다. 이것은 하나 이상의 부가적인 직물 가공 단계가 뒤따를 수 있다. 발호는 직물로부터 사이즈를 제거하는 작용이다. 방적 후, 사이즈 코팅은 균질하고 워터-프루프 결과를 보증하기 위해 섬유의 추가 가공 전에 제거되어야만 한다. 또한 제공되는 것은 효소 변이체의 작용에 의해 사이즈의 효소적 가수분해를 포함하는 발호 방법이다.

효소 변이체는 단독으로 또는 세제 첨가제로서, 예를 들어, 수용성 조성물에 면-함유 섬유를 비롯한 섬유 발호를 위한 기타 발호 화학 시약 및/또는 발호 효소와 함께 사용될 수 있다. 효소 변이체는 또한 인디고-염색 데님 섬유 및 의류에 스톤워시 룩 (stonewashed look) 을 생성하기 위한 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 의복 제작을 위해, 섬유는 의복 또는 의류로 절단 및 재봉될 수 있고, 차후에 마감된다. 특히, 데님 청바지의 제조를 위해, 상이한 효소 마감 방법이 개발되고 있다. 데님 의류 마감은 통상적으로, 섬유에 유연성을 부여하고 연이은 효소 마감 단계에 면을 좀더 접근가능하게 하기 위해 의류를 녹말가수분해 효소의 작용에 적용시키는 동안, 효소 발호 단계로 시작된다. 효소 변이체는 데님 의 류 마감 (예를 들어, "바이오-스토닝 (bio-stoning) 공정"), 효소 발호 및 섬유에 유연성을 부여, 및/또는 마감 공정 방법에 사용될 수 있다.

5.5 전분 가공 조성물 및 용도

또다른 양상에서, 개시된

-아밀라아제 변이체를 가진 조성물은 전분 액화 또는 당화에 이용될 수 있다.

하나의 양상은 전분으로부터 감미제를 생성하기 위한 조성물 및 조성물의 용도이다. 전분을 과당 시럽으로 전환시키기 위한 "전통적인" 공정은 통상적으로 3 가지 연속 효소 공정, 즉, 액화 공정 후 당화 공정, 및 이성체화 공정으로 이루어진다. 액화 공정 동안, 전분은 약 5.5 내지 약 6.2 의 pH 값 및 약 95℃ 내지 약 160℃ 의 온도에서 대략 2 시간 동안

-아밀라아제 변이체에 의해 덱스트린으로 분해된다. 이러한 조건하에서 최적의 효소 안정성을 확보하기 위해, 1 mM 의 칼슘을 첨가한다 (40 ppm 자유 칼슘 이온). 전분 가공은 알코올 생산 (예를 들어 연료 및 알코올 음료, 알코올 양조를 위한 곡물 액화), 감미제 생산을 위한 전분 액화, 사탕수수 설탕 가공, 및 기타 전분 가공 목적과 관련된 식품에 유용하다. 기타 조건은 상이한

-아밀라아제 변이체에 대해 사용될 수 있다.

액화 공정 후, 덱스트린은 글루코아밀라아제 (예를 들어, AMG™) 및 탈분지화 효소, 예컨대 이소아밀라아제 또는 풀룰라나아제 (예를 들어, Promozyme®) 를 첨가하여 덱스트로오스로 전환된다. 한 풀라나아제 예는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 중 풀룰라나아제 균주 139raise 로 BML 780 로부터 유래된다 (Δamy 유전자; cat^R 마커를 가진 cat 유전자좌에서의 B. 데르아미피칸스 (B. deramificans) 로부터의 증폭가능 PU 유전자; Δ spo II AC; Δ apr L; 및 Δ endo-glu C, 이것은 풀룰라나아제 가수분해를 방지하기 위해 결실된 2 개의 프로테아제임). 본 단계 전, pH 는 고온 (95℃ 초과) 을 유지하면서 약 4.5 미만의 값으로 감소되고, 액화

-아밀라아제 변이체 활성은 변성된다. 온도는 60℃ 로 저하되고, 글루코아밀라아제 및 탈분지 효소가 첨가될 수 있다. 당화 공정은 전형적으로 약 24 내지 약 72 시간 동안 진행된다.

당화 공정 후, pH 는 약 6.0 내지 약 8.0 (예를 들어, pH 7.5) 의 범위의 값으로 증가되고, 칼슘이 이온 교환에 의해 제거된다. 그 다음 덱스트로오스 시럽은 예를 들어, 고정화 글루코오스 이소머라아제 (예컨대 Sweetzyme®) 을 사용하여 고 과당 시럽으로 전환된다.

상기 공정의 하나 이상의 효소적 개선이 수행될 수 있다.

-아밀라아제 변이체 액화의 칼슘 의존성 감소. 자유 칼슘의 첨가는

-아밀라아제 변이체의 고 안정성을 적절하게 확보하는데 필요하지만, 자유 칼슘은 글루코오스 이소머라아제의 활성을 강하게 억제하여, 값비싼 유닛 작업에 의해, 자유 칼슘 수준이 3 ~ 5 ppm 미만으로 감소하는 범위로 제거될 필요가 있다. 이러한 작업을 피할 수 있다면 비용 감소가 수득될 수 있고, 액화 공정은 자유 칼슘 이온의 첨가 없이 수행될 수 있을 것이다.

예를 들어, 저 농도의 유리 칼슘 (<40 ppm) 에서 안정하고 고도로 활성인 적 은 칼슘-의존성

-아밀라아제 변이체는 조성 및 절차에 이용될 수 있다. 이러한

-아밀라아제 변이체는 약 4.5 내지 약 6.5 의 범위 (예를 들어, 약 4.5 내지 약 5.5 의 범위) 의 pH 에서 최적 pH 를 가져야만 한다.

-아밀라아제 변이체는 다양한 목적을 위해 전분 또는 임의의 말토덱스트린-포함 화합물을 가수분해하기 위해 실험실 및 산업체 세팅에서 사용될 수 있다. 이들

-아밀라아제 변이체는 특이적 가수분해를 제공하기 위해 단독으로 사용될 수 있거나, 다양한 활성 스펙트럼을 가진 "칵테일" 을 제공하기 위해 기타 아밀라아제와 조합될 수 있다. 예시적인 용도에는 생물학적, 음식, 동물 사료, 약학적, 또는 산업적 샘플로부터의 전분 또는 임의의 말토덱스트린-포함 화합물의 제거 또는 부분적 또는 완전한 가수분해가 포함된다.

하나의 예시적인 용도는 발효 유기체, 예컨대 효소에 의해 발효 생성물로 전환하는데 적합한 글루코오스 및/또는 말토오스를 생성하기 위해 효소 변이체(들) 의 존재하에 전분 기질이 액화 및/또는 당화되는 발효 방법이다. 이러한 발효 방법에는 연료용 에탄올 또는 음료 에탄올 (알코올 음료) 제조 방법, 음료 제조 방법, 바람직한 유기 화합물 (예를 들어, 예컨대 시트르산, 이타콘산, 락트산, 글루콘산, 나트륨 글루코네이트, 칼슘 글루코네이트, 칼륨 글루코네이트, 글루코노 델타 락톤, 또는 나트륨 에리트로보레이트), 케톤, 아미노산 (예컨대 글루탐산, 나트륨 모노글루타미네이트), 뿐 아니라 합성으로 제조하기 어려운 더욱 복잡한 화합물 (예를 들어, 항생제, 예컨대 페니실린, 테트라사이클린), 효소, 비타민 (예를 들 어, 리보플라빈, 비타민 B12, β-카로텐), 및 호르몬의 제조 방법이 포함된다.

가공되는 전분은, 예를 들어 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99.5% 이상 순수한 고도로 정제된 전분 품질일 수 있다. 대안적으로는, 전분은 비-전분 분획, 예컨대 배 (germ) 잔류물 및 섬유질을 비롯한 제분된 전체 곡물을 포함하는 물질을 함유하는 좀더 미정제된 전분일 수 있다. 원료, 예컨대 전체 곡물을, 구조를 개방하기 위해 밀링하고 추가 공정이 가능하다. 2 가지 밀링 공정: 습식 및 건식 밀링을 사용할 수 있다. 또한, 옥수수 가루 및 밀링된 옥수수 가루가 사용될 수 있다.

건식 밀링된 곡물은 전분 외에도 유의한 양의 비-전분 탄수화물 화합물을 포함할 것이다. 이러한 이질적 물질이 제트 쿠킹에 의해 가공되는 경우 종종 오직 전분의 부분적 젤라틴화가 달성된다. 효소 변이체가 미젤라틴화된 전분에 높은 활성을 갖기 때문에, 효소 변이체는 액화 및/또는 당화 제트 쿠킹된 건식 밀링된 전분을 포함하는 공정에 유리하게 적용된다.

게다가, 효소 변이체의 우세한 가수분해 활성으로 인해, 당화 단계 동안 글루코아밀라아제에 대한 필요성이 크게 감소된다. 이것은 당화가 매우 낮은 수준의 글루코아밀라아제 활성에서도 수행되도록 하며, 글루코아밀라아제 활성은 부재하거나, 존재하는 경우, 0.5 AGU/g DS (건조 고체 (DS) 그램 당 GU 의 활성) 이하 또는 심지어 미만; 0.4 AGU/g DS 이하 또는 심지어 미만; 약 0.3 AGU/g DS 이하 또는 심지어 미만; 및 0.1 AGU 미만의 양으로 존재하고, 약 0.05 AGU/g DS 이하 또는 심지어 미만의 양의 전분 기질이 존재한다. mg 효소 단백질로 표현되는, 글 루코아밀라아제 활성을 가진 효소는 부재하거나 약 0.5 mg EP/g DS (건조 고체 그램 당 효소 단백질) 이하 또는 심지어 미만; 약 0.4 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만; 약 0.3 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만; 및 약 0.1 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만, 약 0.05 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만 또는 0.02 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만의 전분 기질의 양으로 존재한다. 글루코아밀라아제는 아스페르길루스 종 (Aspergillus sp.), 탈라로마이세스 종 (Talaromyces sp.), 파키키토스포라 종 (Pachykytospora sp.), 또는 트라메테스 종 (Trametes sp.) 중의 균주로부터 유래될 수 있고, 예시적인 예는 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 탈라로마이세스 에메르소니이 (Talaromyces emersonii), 트라메테스 신굴라타 (Trametes cingulata), 또는 파키키토스포라 파피라세아 (Pachykytospora papyracea) 이다.

mg 효소 단백질로 표현되는, 효소 변이체는 부재하거나 0.5 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만; 0.4 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만; 0.3 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만; 또는 0.1 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만, 0.05 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만 또는 0.02 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만의 전분 기질의 양으로 투여될 수 있다. 첫번째 양상의 효소 변이체는 0.05 내지 10.0 AFAU/g DS, 예컨대 0.1 내지 5.0 AFAU/g DS, 예컨대 0.25 내지 2.5 AFAU/g DS 전분의 양으로 투여될 수 있다.

공정은 a) 전분 기질을

-아밀라아제 활성을 가진 촉매 모듈 및 탄수화물-결합 모듈을 포함하는 효소 변이체, 예를 들어, 첫번째 양상의 폴리펩티드와 접촉 시키는 단계; b) 90% 이상, 또는 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% w/w 이상의 상기 전분 기질을 발효가능 당으로 전환하는데 충분한 시간 동안 및 온도에서 상기 전분 기질을 상기 효소 변이체로 인큐베이션시키는 단계; c) 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 단계; 및 d) 임의로 발효 생성물을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 공정 b) 및/또는 c) 동안, 글루코아밀라아제 활성을 갖는 효소는 부재하거나 0.001 내지 2.0 AGU/g DS, 0.01 내지 1.5 AGU/g DS, 0.05 내지 1.0 AGU/g DS, 0.01 내지 0.5 AGU/g DS 의 양으로 존재한다. 글루코아밀라아제 활성을 갖는 효소는 부재하거나 0.5 AGU/g DS 이하 또는 심지어 미만; 0.4 AGU/g DS 이하 또는 심지어 미만; 0.3 AGU/g DS 이하 또는 심지어 미만; 0.1 AGU/g DS 이하 또는 심지어 미만, 예컨대 0.05 AGU/g DS 이하 또는 심지어 미만의 전분 기질의 양으로 존재할 수 있다. mg 효소 단백질로 표현되는, 글루코아밀라아제 활성을 가진 효소는 부재하거나 0.5 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만; 0.4 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만; 0.3 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만; 0.1 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만, 예컨대 0.05 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만 또는 0.02 mg EP/g DS 이하 또는 심지어 미만의 전분 기질의 양으로 존재한다. 공정에서 단계 a), b), c), 및/또는 d) 는 별개로 또는 동시에 수행할 수 있다.

또다른 양상에서, 공정은: a) 전분 기질을

-아밀라아제 활성을 가진 촉매 모듈 및 탄수화물-결합 모듈을 포함하는 효소 변이체, 예를 들어, 첫번째 및/또는 두번째 양상의 폴리펩티드를 발현하도록 형질전환된 효모 세포와 접촉시키는 단계; b) 90% w/w 이상의 상기 전분 기질을 발효가능 당으로 전환시키는데 충분한 시간 동안 및 온도에서 상기 전분 기질을 상기 효모로 인큐베이션시키는 단계; c) 발효시켜 에탄올을 생성하는 단계; d) 임의로 에탄올을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 a), b), 및 c) 는 별개로 또는 동시에 수행할 수 있다.

또다른 양상에서, 공정은 젤라틴화 또는 과립 전분의 슬러리의 가수분해, 특히 상기 과립 전분의 초기 젤라틴화 온도 미만의 온도에서 과립 전분의 가용성 전분 가수분해물로의 가수분해를 포함한다.

-아밀라아제 활성을 가진 촉매 모듈 및 탄수화물-결합 모듈을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 첫번째 양상의 폴리펩티드와 접촉되는 것 외에도, 전분은 진균류

-아밀라아제 (EC 3.2.1.1) 및, β-아밀라아제 (EC 3.2.1.2), 및 글루코아밀라아제 (EC 3.2.1.3) 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소와 접촉될 수 있다. 구현예에서, 추가의 또다른 녹말가수분해 효소 또는 탈분지 효소, 예컨대 이소아밀라아제 (EC 3.2.1.68), 또는 풀룰라나아제 (EC 3.2.1.41) 가

-아밀라아제 변이체에 첨가될 수 있다.

구현예에서, 공정은 초기 젤라틴화 온도 미만의 온도에서 수행된다. 이러한 공정은 종종 30℃ 이상, 31℃ 이상, 32℃ 이상, 33℃ 이상, 34℃ 이상, 35℃ 이상, 36℃ 이상, 37℃ 이상, 38℃ 이상, 39℃ 이상, 40℃ 이상, 41℃ 이상, 42℃ 이상, 43℃ 이상, 44℃ 이상, 45℃ 이상, 46℃ 이상, 47℃ 이상, 48℃ 이상, 49℃ 이상, 50℃ 이상, 51℃ 이상, 52℃ 이상, 53℃ 이상, 54℃ 이상, 55℃ 이상, 56℃ 이상, 57℃ 이상, 58℃ 이상, 59℃ 이상, 또는 60℃ 이상에서 수행된다. 공정 이 수행되는 pH 는 약 3.0 내지 약 7.0, 또는 약 3.5 내지 약 6.0, 또는 약 4.0 내지 약 5.0 의 범위일 수 있다. 하나의 양상에는, 예를 들어 32℃ 근처의 온도, 예컨대 30 내지 35℃ 에서 에탄올을 생성하는 효모로의 발효를 포함하는 공정이 고려된다.

또다른 양상에서, 공정은 예컨대 30 내지 35℃ 의 온도에서, 예를 들어, 32℃ 근처에서 에탄올을 생성하는 효모, 또는 원하는 유기 화합물을 생성하는 또다른 적합한 발효 유기체로의 동시 당화 및 발효를 포함한다.

상기 발효 공정에서, 에탄올 함량은 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 11% 이상, 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 14% 이상, 약 15% 이상, 예컨대 약 16% 이상 에탄올에 달한다.

임의의 상기 양상에서 사용되는 전분 슬러리는 약 20% 내지 약 55% 건조 고체 과립 전분, 또는 약 25% 내지 약 40% 건조 고체 과립 전분, 또는 약 30% 내지 약 35% 건조 고체 과립 전분을 가질 수 있다. 효소 변이체와 접촉 후, 효소 변이체는 가용성 전분을 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 양으로 과립 전분의 가용성 전분 가수분해물로 전환시킨다.

또다른 구현예에서,

-아밀라아제 활성을 가진 촉매 모듈 및 탄수화물-결합 모듈을 포함하는 효소 변이체, 예를 들어, 첫번째 양상의 폴리펩티드는, 예를 들어 제트 쿠킹에 의한 젤라틴화에 제한되지 않는 젤라틴화 전분의 액화, 당화 공정에 사용된다. 공정은 발효 생성물, 예를 들어 에탄올을 생성하기 위한 발효를 포 함할 수 있다. 발효에 의한 전분-함유 물질로부터 에탄올을 생성하기 위한 이러한 공정은: (i) 상기 전분-함유 물질을

-아밀라아제 활성을 가진 촉매 모듈 및 탄수화물-결합 모듈을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 첫번째 양상의 폴리펩티드로 액화시키는 단계; (ii) 수득된 액화 매시 (mash) 를 당화시키는 단계; 및 (iii) 단계 (ii) 에서 수득된 물질을 발효 유기체의 존재하에서 발효시키는 단계를 포함한다. 임의로 공정은 추가로 에탄올의 회수를 포함한다. 당화 및 발효 공정은 동시 당화 및 발효 공정 (SSF 공정) 으로서 수행될 수 있다. 발효 동안, 에탄올 함량은 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 예컨대 약 11% 이상, 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 14% 이상, 약 15% 이상, 예컨대 약 16% 이상 에탄올에 달한다.

상기 양상의 공정에서 가공되는 전분은 특히 덩이줄기, 뿌리, 줄기, 콩류, 곡류 또는 전체 곡물로부터 수득될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 과립 전분은 옥수수, 옥수수속 (cobs), 밀, 보리, 귀리, 밀로, 사고, 카사바, 타피오카, 사탕수수, 쌀, 완두, 콩, 바나나, 또는 감자로부터 수득될 수 있다. 특히 고려되는 것은 왁스성과 비-왁스성 유형의 옥수수 및 보리 모두이다.

상기 기재된 조성물은 젤라틴화 또는 과립 전분, 및 부분적으로 젤라틴화된 전분의 액화 및/또는 당화에 사용될 수 있다. 부분적으로 젤라틴화된 전분은 다소 젤라틴화된 전분, 즉, 전분의 일부가 비가역적으로 팽창되고 젤라틴화되고, 전분의 일부가 과립 상태로 여전히 존재하는 전분이다.

상기 기재된 조성물은 0.01 내지 10.0 AFAU/g DS, 또는 0.1 내지 5.0 AFAU/g DS, 또는 0.5 내지 3.0 AFAU/AGU, 또는 0.3 내지 2.0 AFAU/g DS 의 양으로 존재하는 산

-아밀라아제 변이체를 포함할 수 있다. 조성물은 상기 기재된 임의의 전분 공정에 적용될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "액화" 또는 "액화하다" 는 전분이 좀더 짧은 사슬 및 덜 점성인 덱스트린으로 전환되는 공정을 의미한다. 일반적으로, 상기 공정에는

-아밀라아제 변이체의 첨가와 동시에 또는 차후에 전분의 젤라틴화가 포함된다. 부가적인 액화 유도 효소가 임의로 첨가될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "일차 액화" 는 슬러리의 온도가 젤라틴화 온도까지 또는 그 근처로 상승될 때의 액화 단계를 말한다. 온도 상승과 수반하여, 슬러리는 열 교환기 또는 200~300°F, 예를 들어, 220~235°F 의 온도까지의 제트를 통해 보내진다. 열 교환 또는 제트 온도에 대한 적용과 수반하여, 슬러리는 상기 온도에서 3~10 분 동안 유지된다. 상기 200~300°F 에서의 슬러리의 유지 단계가 일차 액화이다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "이차 액화" 는 슬러리가 대기 온도로 냉각되는, 일차 액화 (200~300°F 까지 가열) 에 수반된 액화 단계를 말한다. 상기 냉각 단계는 30 분 내지 180 분 (3 시간), 예를 들어, 90 분 내지 120 분 (2 시간) 일 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "이차 액화의 분" 은 이차 액화의 시작으로부터 경과된 시간, DE 가 측정되는 시간을 말한다.

또다른 양상에는

-아밀라아제 변이체를 포함하는 조성물에서의 β-아밀라아제의 부가적인 용도가 고려되고, β-아밀라아제 (EC 3.2.1.2) 는 외-작용 말토오즈 생성 아밀라아제로, 이것은 아밀로오스, 아밀로펙틴, 및 관련 글루코오스 중합체 중의 1,4-

-글루코시드 연결을 가수분해시켜, 말토오스를 방출시킨다. β-아밀라아제는 다양한 식물 및 미생물로부터 단리되었다 (W. M. Fogarty and C. T. Kelly, PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, vol. 15, pp. 112-115, 1979). 이러한 β-아밀라아제는 40℃ 내지 65℃ 의 범위에 최적 온도, 및 약 4.5 내지 약 7.0 의 범위에 최적 pH 를 갖는 것을 특징으로 한다. 고려되는 β-아밀라아제에는 보리 Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA (Genencor International, Inc.); 및 Novozym™ WBA (Novozymes AJS) 로부터의 β-아밀라아제가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

조성물에 사용되는 것으로 고려되는 또다른 효소는 글루코아밀라아제 (EC 3.2.1.3) 이다. 글루코아밀라아제는 미생물 또는 식물로부터 유래된다. 예시적인 글루코아밀라아제는 진균류 또는 박테리아 기원의 것이다. 예시적인 박테리아 글루코아밀라아제는 아스페르길루스 (Aspergillus) 글루코아밀라아제, 특히 A. 니게르 (A. niger) G1 또는 G2 글루코아밀라아제 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3(5): 1097-1102), 또는 이의 변이체, 예컨대 WO 92/00381; 및 WO 00/04136 에 기재됨; A. 아와모리 (A. awamori) 글루코아밀라아제 (WO 84/02921); A. 오리자에 (A. oryzae) (Agric. Biol. Chem. (1991), 55(4): 941-949), 또는 이의 변이체 또는 분절이다.

다른 고려되는 아스페르길루스 (Aspergillus) 글루코아밀라아제 변이체에는 열 안정성: G137A 및 G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9: 499-505); D257E 및 D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301: 275-281); 디술피드 결합, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35: 8698-8704); 및 위치 A435 및 S436 에 Pro 잔기를 도입 (Li et al. (1997) Protein Eng. 10: 1199-1204) 을 향상시키는 변이체가 포함된다. 다른 고려되는 글루코아밀라아제에는 탈라로마이세스 (Talaromyces) 글루코아밀라아제, 특히 탈라로마이세스 에메르소니이 (Talaromyces emersonii) (WO 99/28448), 탈라로마이세스 레이세타누스 (Talaromyces leycettanus) (미국 특허 번호 RE 32,153), 탈라로마이세스 듀폰티 (Talaromyces duponti), 탈라로마이세스 테르모필릭스 (Talaromyces thermophilics) (미국 특허 번호 4,587,215) 로부터 유래된 것이 포함된다. 고려되는 박테리아 글루코아밀라아제에는 속 클로스트리듐 (Clostridium), 특히 C. 테르모아밀로라이티쿰 (C. thermoamylolyticum) (EP 135138) 및 C. 테르모히드로술푸리쿰 (C. thermohydrosulfuricum) (WO 86/01831) 으로부터의 글루코아밀라아제가 포함된다. 예시적인 글루코아밀라아제에는 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) 유래의 글루코아밀라아제, 예컨대 WO 00/04136 의 SEQ ID NO: 2 에 제시된 아미노산 서열에 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 심지어 90% 상동성을 갖는 글루코아밀라아제가 포함된다. 또한 고려되는 것은 시판 글루코아밀라아제, 예컨대 AMG 200L; AMG 300L; SAN™ SUPER 및 AMG™ E (Novozymes); OPTIDEX® 300 (Genencor International, Inc.); AMIGASE™ 및 AMIGASE™ PLUS (DSM); G-ZYME® G900 (Enzyme Bio-Systems); G-ZYME® G990 ZR (A. 니게르 (A. niger) 글루코아밀라아제 및 저 프로테아제 함량) 이다.

글루코아밀라아제는 0.02-2.0 AGU/g DS, 예컨대 0.1-1.0 AGU/g DS, 또는 예컨대 0.2 AGU/g DS 의 양으로 첨가될 수 있다.

부가적인 효소 변이체는 또한 조성물에 포함되는 것으로 고려된다. 2 개 이상의

-아밀라아제 변이체는 단독으로 또는 본원에 논의된 기타 효소와 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 세번째 효소는 또다른

-아밀라아제 (예를 들어, 효모

-아밀라아제) 또는 또다른

-아밀라아제 변이체일 수 있다. 이들은 바실러스 (Bacillus)

-아밀라아제 또는 비-바실러스 (non-Bacillus)

-아밀라아제일 수 있다.

임의로 첨가될 수 있는 또다른 효소는 탈분지화 효소, 예컨대 이소아밀라아제 (EC 3.2.1.68) 또는 풀룰라나아제 (EC 3.2.1.41) 이다. 이소아밀라아제는 아밀로펙틴 중의

-1,6-D-글루코시드 분지 연결 및 β-제한 덱스트린을 가수분해하고, 플루란을 공격하는 이소아밀라아제의 무능에 의해, 그리고

-제한 덱스트린에 대한 제한된 작용에 의해 풀룰라나아제와 구별될 수 있다. 탈분지화 효소는 당업자에게 잘 알려진 유효량으로 첨가될 수 있다.

공정의 생성물의 정확한 조성은 적용되는 효소의 조합 뿐 아니라 가공되는 과립 전분의 유형에 따라 다르다. 가용성 가수분해물은 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95.0% 이상, 약 95.5% 이상, 약 96.0% 이상, 약 96.5% 이상, 약 97.0% 이상, 약 97.5% 이상, 약 98.0% 이상, 약 98.5% 이상, 약 99.0% 이상 또는 약 99.5% 이상의 순도를 가진 말토오스일 수 있다. 가용성 전분 가수분해물은 또한 글루코오스일 수 있고, 또는 전분 가수분해물은 94.5% 이상, 95.0% 이상, 95.5% 이상, 96.0% 이상, 96.5% 이상, 97.0% 이상, 97.5% 이상, 98.0% 이상, 98.5% 이상, 99.0% 이상 또는 99.5% 이상의 DX (총 가용화된 건조 고체의 글루코오스 %) 를 갖는다. 그러나 동등하게 고려되는 것은 생성물이 특정 시럽인, 예컨대 아이스 크림, 케이크, 캔디, 과일 통조림의 제조에 사용하기 위한 글루코오스, 말토오스, DP3 및 DPn 의 혼합물을 함유하는 특정 시럽인 공정이다.

고려되는 2 가지 밀링 공정에는 습식 및 건식 밀링이 포함된다. 건식 밀링에서, 전체 커넬 (kernel) 이 밀링되고 사용된다. 습식 밀링은 배 및 거친가루 (전분 과립 및 단백질) 를 양호하게 분리하고, 몇 가지 예외가 있지만 전분 가수분해물이 시럽 제조에 사용되는 위치에 적용된다. 건식 및 습식 밀링 모두 전분 가공 업계에 잘 알려져 있으며, 기재된 조성물 및 방법으로의 사용에 동등하게 고려된다. 공정은 잔존물 (retentate) 이 효소, 생 (raw) 전분 및 물의 존재하에서 재순환 하에서 유지되고, 투과물 (permeate) 이 가용성 전분 가수분해물인 초여과 시스템에서 수행될 수 있다. 동등하게 고려되는 것은 잔존물이 효소, 생 전분 및 물의 존재하에서 재순환 하에서 유지되고, 투과물이 가용성 전분 가수분해물인 초여과 막을 가진 연속 막 반응기에서 수행되는 공정이다. 또한 고려되는 것은 잔존물이 효소, 생 전분 및 물의 존재하에서 재순환 하에서 유지되고, 투과물 이 가용성 전분 가수분해물인 미세여과 막을 가진 연속 막 반응기에서 수행되는 공정이다.

이와 관련하여, 공정의 가용성 전분 가수분해물은 고 과당 전분계 시럽 (HFSS), 예컨대 고 과당 옥수수 시럽 (HFCS) 으로의 전환에 적용된다. 상기 전환은 글루코오스 이소머라아제, 및 예컨대 고체 지지체에 고정된 효소를 사용하여 달성될 수 있다. 고려되는 이소머라아제는 시판 제품 Sweetzyme®, IT (Novozymes A/S); G-zyme® IMGI, 및 G-zyme® G993, Ketomax®, G-zyme® G993, G-zyme® G993 액체, 및 GenSweet® IGI 를 포함한다.

또다른 양상에서, 생성된 가용성 전분 가수분해물은 연료 또는 에탄올 음료의 생성을 산출한다. 세번째 양상의 공정에서, 발효는 과립 전분 슬러리의 가수분해와 동시에 또는 별도로/연속으로 수행될 수 있다. 발효가 가수분해와 동시에 수행되는 경우, 온도는 30℃ 내지 35℃, 또는 31℃ 내지 34℃ 일 수 있다. 공정은 잔존물이 효소, 생 전분, 효모, 효모 영양분 및 물의 존재하에서 재순환 하에서 유지되고, 투과물이 에탄올 함유 액체인 초여과 시스템에서 수행될 수 있다. 동등하게 고려되는 것은 잔존물이 효소, 생 전분, 효모, 효모 영양분 및 물의 존재하에서 재순환 하에서 유지되고, 투과물이 에탄올 함유 액체인 초여과 막을 가진 연속 막 반응기에서 수행되는 공정이다.

공정의 가용성 전분 가수분해물은 또한 처리된 전분을 발효 생성물, 예컨대, 시트르산, 모노나트륨 글루타메이트, 글루콘산, 나트륨 글루코네이트, 칼슘 글루코네이트, 칼륨 글루코네이트, 글루코노 델타 락톤, 또는 나트륨 에리트로보레이트로 발효시키는 것을 포함하는 발효 생성물의 제조에 사용될 수 있다.

-아밀라아제 변이체의 녹말 가수분해 활성은 기질로서 감자 전분을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 방법은 효소에 의한 개질된 감자 전분의 분해에 기반하며, 반응에는 전분/효소 용액의 샘플을 요오드 용액과 혼합하는 것이 뒤따른다. 처음으로, 검정빛이 도는 청색 색조가 형성되나, 전분이 분해되는 동안 청색 색조는 옅어지고 점차 붉은빛이 도는 갈색으로 변하고, 이것을 착색된 유리 표준과 비교한다.

5.7 균막 제거 조성물 및 용도

조성물은 주요 효소 성분으로서 하나의

-아밀라아제 변이체, 예를 들어, 균막 제거에 사용하기 위한 1 성분 조성물을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 조성물은 균막을 제거하기 위해 다중 효소 활성, 예컨대 다중 아밀라아제, 또는 아미노펩티다아제, 아밀라아제 (β- 또는

- 또는 글루코-아밀라아제), 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글리코실트랜스페라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, 알파-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제,

-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 분해효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 분해효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 및/또는 자일라나아제를 비롯한 효소의 칵테일, 또는 이의 임의의 조합을 포함 할 수 있다. 부가적인 효소(들) 은 속 아스페르길루스 (Aspergillus), 예컨대, 아스페르길루스 아큘레아투스 (Aspergillus aculeatus), 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 또는 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae); 또는 트리코데르마 (Trichoderma); 휴미콜라 (Humicola), 예컨대 휴미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens); 또는 푸사리움 (Fusarium), 예컨대 푸사리움 박트리디오이데스 (Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스 (Fusarium cerealis), 푸사리움 크룩웰렌스 (Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸 (Fusarium culmorum), 푸사리움 그래미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸사리움 그래미눔 (Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸 (Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디 (Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼 (Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움 (Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔 (Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크루움 (Fusarium sarcochroum), 푸사리움 술푸레움 (Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로세움 (Fusarium toruloseum), 푸사리움 트리코테시오이데스 (Fusarium trichothecioides), 또는 푸사리움 베네나툼 (Fusarium venenatum) 에 속하는 미생물에 의해 생성될 수 있다.

-아밀라아제 변이체 포함 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있고, 액체 또는 건조 조성물의 형태일 수 있다. 예를 들어,

-아밀라아제 변이체 함유 조성물은 과립 또는 미세과립의 형태일 수 있다. 조성물에 포함되는 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 따라 안정화될 수 있다.

예는 폴리펩티드 조성물의 용도의 하기에 제시된다.

-아밀라아제 변이체 함유 조성물의 투여량 및 조성물이 사용되는 기타 조건은 당업계에 공지된 방법에 근거해 측정될 수 있다.

-아밀라아제 변이체는 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제 또는 이의 변이체와 함께 조성물에 사용하기 위해 추가로 고려된다.

하나의 공정은 균막의 분해 및/또는 제거이다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "분해" 는 균막 내의 각 미생물 세포와 함께 접촉 및 결합되는 균막 매트릭스 중의 다당류의 가수분해로서 이해되며, 이렇게 하여 미생물 세포는 균막으로부터 방출 및 제거될 수 있다. 균막은 표면에 존재하고, 균막의 분해는 예를 들어, 표면을

-아밀라아제 변이체 또는 균막의 분해를 담당하는 하나 이상의 기타 효소 (예컨대 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제 그러나 이에 제한되지는 않음) 를 포함하는 수성 매질에 담금, 이로 덮음 또는 이를 뿌림에 의해, 표면에 접촉시켜 달성된다. 조성물은 점액질, 예를 들어 펄프 및 제지 산업에서의 거품이 이는 물을 가수분해하는데 사용될 수 있다.

-아밀라아제 변이체는 0.0001 내지 10,000 mg/L, 또는 0.001 내지 1000 mg/L, 또는 0.01 내지 100 mg/L, 또는 심지어 0.1 내지 10 mg/L 의 양으로 존재할 수 있다. 부가적인 효소 및 효소 변이체는 최종 용액 중의 효소의 용도 및 가용성에 따라, 유사한 양으로 또는 적은 양으로 존재할 수 있다.

공정은 약 주위 온도 내지 약 70℃ 의 온도에서 적합하게는 수행될 수 있다. 예시적인 온도 범위는 약 30℃ 내지 약 60℃, 예를 들어, 약 40℃ 내지 약 50℃ 이다.

균막의 가수분해에 적합한 pH 는 약 3.5 내지 약 8.5 이다. 예시적인 범위에는 약 5.5 내지 약 8 pH, 예를 들어, 약 6.5 내지 약 7.5 이 포함된다. 효소 변이체가 균막을 효과적으로 제거하기 위한 접촉 시간 또는 반응 시간은 균막 특성 및 효소 변이체 단독 또는 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제와 같은 기타 효소와 조합으로 표면에 처리되는 빈도에 따라, 고려가능하게 다를 수 있다. 예를 들어, 적합한 반응 시간은 약 0.25 내지 약 25 시간, 예컨대 약 1 내지 약 10 시간, 예를 들어 약 2 시간이다.

-아밀라아제 변이체 및 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제와 조합될 수 있는 부가적엔 효소에는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나아제, 기타

-아밀라아제, 리파아제, 프로테아제, 및/또는 펙티나아제를 비롯한 기타 아밀라아제가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

효소는 항균제, 예컨대 효소성 또는 비 효소성-살생물제와 추가로 조합될 수 있다. 효소성 살생물제는 예를 들어, 산화환원효소, 예를 들어, 락카아제 또는 퍼옥시다아제, 특히 할로퍼옥시다아제, 및 임의로 증강제, 예컨대 특허 출원 WO 97/42825 및 DK 97/1273 에 기재된 바와 같은 알킬 실린게이트를 포함하는 조성물일 수 있다.

균막이 제거되는/거나 씻겨내어 지는 표면은 정의상 미생물에게 본질적으로 비-투과성인 임의의 표면에 관련된 경질 표면일 수 있다. 표면의 예는 임의로 예를 들어, 페인트, 에나멜, 중합체 등으로 코팅될 수 있는 금속, 예를 들어, 스테 인레스 스틸 합금, 플라스틱/합성 중합체, 고무, 보드, 유리, 목재, 종이, 직물, 콘크리트, 바위, 대리석, 석고 및 도자기 물질로부터 제조된 표면이다. 따라서, 표면은 물 공급 시스템, 음식 가공 시스템, 냉각 시스템, 화학약품 가공 시스템 또는 약제 가공 시스템과 같은 수용액을 보유, 이송, 가공 또는 이와 접촉하는 시스템의 일원일 수 있다. 조성물 및 방법은 목재 가공 산업, 예컨대 펄프 및/또는 제지 산업에서 균막을 제거하기 위한 조성물을 사용한다. 따라서, 효소 변이체 및 효소 변이체 함유 조성물은 통상의 제자리-세정 (cleaning-in-place: C-I-P) 시스템에 유용하다. 표면은 파이프, 탱크, 펌프, 막, 필터, 열 교환기, 원심분리, 증발기, 믹서, 스프레이 타워, 밸브 및 반응기와 같은 시스템 유닛의 일원일 수 있다. 또한 표면은 오염된 내시경, 보철 장치 또는 의료 이식물과 같은 의료 과학 및 산업에 사용되는 기구의 일부일 수 있거나 일부이다.

균막 제거용 조성물은 또한 금속 표면, 예를 들어, 파이프라인이 미생물 균막에 의해 공격당했을 때 발생하는 소위 생물-부식을 방지하기 위한 것, 즉 균막을 분해하여 균막의 미생물 세포가 그것이 부착하고 있는 금속 표면을 부식하는 균막 환경을 만드는 것을 방지하는 것을 위해 고려된다.

항-균막 조성물에 대한 또다른 적용은 경구 케어를 위한 것이다. 그러나 표면은 또한 생물학적 기원의 것, 예컨대 점막, 피부, 치아, 모발, 손발톱 등일 수 있다.

치태가 있는 치아는, 예를 들어, 효소 변이체를 치약에 혼입하여, 그리고 오염된 콘택트 렌즈는 표면으로서 포함된다. 따라서, 변이체 효소는 인간 또는 동물 치아에 존재하는 플라크의 분해용으로 효소 변이체를 포함하는 의약의 제조를 위한 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 추가의 용도는 점막으로부터의 균막, 예컨대 낭성 섬유증 환자의 폐 내 균막의 분해이다.

따라서, 또다른 추가의 양성에서는 본질적으로 임의의 활성 오염물이 없고 정제된, 재조합 효소 변이체를 포함하는 경구 케어 조성물에 관한 것이다. 경구 케어 조성물은 적합하게는 상당한 양의 재조합 효소 변이체를 적합하게 포함할 수 있다.

경구 케어 조성물에 사용하기 위한 기타 효소에는 경구 케어 조성물 중의 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제 활성이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 고려되는 효소 활성에는 덱스트라나아제; 뮤타나아제; 옥시다아제, 예컨대 글루코오스 옥시다아제, L-아미노산 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 예컨대 WO 95/10602 에 기재된 코프리누스 종 (Coprinus sp.) 퍼옥시다아제 (Novo Nordisk A/S) 또는 락토퍼옥시다아제, 할로퍼옥시다아제, 특히 커뷸라리아 종 (Curvularia sp.), 특히 C. 베르루큘로사 (C. verruculosa) 및 C. 이나에콸리스 (C. inaequalis) 로부터 유래가능한 할로퍼옥시다아제; 락카아제; 프로테아제, 예컨대 파파인, 산성 프로테아제 (예를 들어, WO 95/02044 에 기재된 산성 프로테아제 (Novo Nordisk A/S)), 엔도글루코시다아제, 리파아제, 아밀로글루코시다아제를 비롯한 아밀라아제, 예컨대 AMG (Novo Nordisk A/S); 항-미생물 효소, 및 이의 혼합물을 포함하는 효소 군으로부터의 활성이 포함된다.

경구 케어 조성물은 임의의 적합한 물리적 형태 (즉, 분말, 페이스트, 젤, 액체, 연고, 정제 등) 일 수 있다. "경구 케어 조성물" 에는 충치를 방지하고, 치태 및 치석의 형성을 방지하고, 치태 및 치석을 제거하고, 치과적 질환을 방지 및/또는 치료하는 등에 의해, 인간 및 동물의 구강의 경구 위생을 유지하거나 증가시키기 위해 사용될 수 있는 조성물이 포함된다. 적어도 문맥에서 경구 케어 조성물은 또한 틀니, 의치 등을 세정하기 위한 제품도 포함한다. 이러한 경구 케어 조성물의 예에는 치약, 치과용 크림, 젤 또는 가루치약, 가글액, 양치 전- 또는 후 린스 제형, 츄잉검, 마름모꼴 정제, 및 캔디가 포함된다. 치약 및 치아용 젤에는 전형적으로 연마 광택 물질, 발포제, 풍미제, 휴멕턴트 (humectant), 결합제, 증점제, 감미제, 미백/탈색/염색 제거제, 물, 및 임의로 효소가 포함된다.

플라크-제거액을 비롯한 구강청정제는 전형적으로 물/알코올 용액, 풍미, 휴멕턴트, 감미제, 발포제, 색소 및 임의로 효소를 포함한다.

연마 광택 물질은 또한 치약과 같은 경구 케어 조성물에 혼입될 것이다.

따라서, 연마 광택 물질에는 알루미나 및 그의 수화물, 예컨대 알파 알루미나 트리히드레이트; 마그네슘 트리실리케이트; 마그네슘 카르보네이트; 카올린; 알루미노실리케이트, 예컨대 하소 알루미늄 실리케이트 및 알루미늄 실리케이트; 칼슘 카르보네이트; 지르코늄 실리케이트; 및 또한 분말 플라스틱, 예컨대 폴리비닐 클로라이드; 폴리아미드; 폴리메틸 메타크릴레이트; 폴리스티렌; 페놀-포름알데하이드 수지; 멜라민-포름알데하이드 수지; 우레아-포름알데하이드 수지; 에폭시 수지; 분말 폴리에틸렌; 실리카 제로겔; 히드로겔 및 아에로겔 등이 포함될 수 있다. 또한 연마제로서 적합한 것은 칼슘 파이로포스페이트; 수-불용성 알칼리 메타포 스페이트; 2칼슘 포스페이트 및/또는 이의 디히드레이트, 2칼슘 오르토포스페이트; 2칼슘 포스페이트; 미립자 히드록시아파타이트 등이다. 또한 이러한 성분의 혼합물을 사용하는 것이 가능하다.

경구 케어 조성물에 따라, 연마 생성물은 약 0 중량% 내지 약 70 중량%, 예를 들어, 약 1 중량% 내지 약 70 중량% 로 존재할 수 있다. 치약에 있어서, 연마 물질 함량은 전형적으로 최종 치약 내에 10 중량% 내지 70 중량% 의 범위로 있다.

휴멕턴트는 예를 들어 치약으로부터 수분 손실을 방지하기 위해 사용된다. 경구 케어 조성물에 사용하기 위한 적합한 휴멕턴트에는 하기 화합물 및 이의 혼합물: 글리세롤; 폴리올; 소르비톨; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 프로필렌 글리콜; 1,3-프로판디올; 1,4-부탄디올; 수소화된 일부 가수분해된 다당류 등이 포함된다. 휴멕턴트는 일반적으로 치약 내에 0 중량% 내지 약 80 중량%, 예를 들어, 약 5 중량% 내지 약 70 중량% 로 존재할 수 있다.

실리카, 전분, 트래거캔스 검, 잔탄 검, 아이리쉬 모스(Irish moss) 추출물, 알기네이트, 펙틴, 셀룰로오스 유도체, 예컨대 히드록시에틸 셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 및 히드록시프로필 셀룰로오스, 폴리아크릴산 및 이의 염, 폴리비닐피롤리돈을, 치약 제품의 안정화를 돕는 적합한 증점제 및 결합제의 예로서 언급할 수 있다. 증점제는 치약 크림 및 젤에 최종 생성물의 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량% 의 양으로, 결합제는 최종 생성물의 약 0.01 중량% 내지 약 10 중량% 의 범위로 존재할 수 있다.

발포제로서 비누, 음이온성, 양이온성, 비이온성, 양쪽이온성 및/또는 쯔피 터성 계면활성제가 사용될 수 있다. 이들은 최종 생성물의 0 중량% 내지 약 15 중량%, 또는 약 0.1 중량% 내지 약 13 중량%, 또는 약 0.25 중량% 내지 약 10 중량% 의 수준으로 존재할 수 있다.

계면활성제는 본 효소에 비활성 영향을 주지 않는 범위로만 오직 적합하다. 계면활성제에는 지방 알코올 술페이트, 술폰화 모노-글리세라이드 또는 탄소수 10 내지 20 의 지방산의 염, 지방산-알부멘 농축 생성물, 지방산 아미드 및 타우린의 염 및/또는 이세티온산의 지방산 에스테르의 염이 포함된다.

적합한 감미제에는 제형에 사용하기 위한 사카린이 포함된다.

스피아민트와 같은 풍미는 종종 적은 양으로, 예컨대 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 특히 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량% 로 존재한다.

미백/탈색제에는 H₂O₂ 가 포함되며 최종 생성물의 중량으로 계산된 약 5% 미만, 또는 약 0.25% 내지 약 4% 의 양으로 첨가될 수 있다.

미백/탈색제는 산화환원효소와 같은 효소일 수 있다. 적합한 치아 탈색제의 예는, 예컨대 WO 97/06775 (Novo Nordisk AJS) 에 기재된 것들이다.

물은 통상 예를 들어, 치약을 유동가능한 형태로 산출하는 양으로 첨가된다.

추가의 수용성 항-박테리아제, 예컨대 클로로헥시딘 디글루코네이트, 헥세티딘, 알렉시딘, Triclosan®, 4 차 암모늄 항-박테리아 화합물 및 아연, 구리, 은 및 주석과 같은 특정 금속 이온의 수용성 공급원 (예를 들어, 아연, 구리 및 염화 주석 및 은 니트레이트) 이 또한 포함될 수 있다.

또한 고려되는 것은 불소 공급원, 염료/색소, 방부제, 비타민, pH-조절제, 항-충치제, 민감성 감소제 (desensitizing agent) 등으로 사용될 수 있는 화합물의 첨가이다.

경구 케어 조성물에 유용한 기타 성분은 상기 기재된 바와 같은 효소이다. 효소는 생명 시스템 중의 화학 반응의 생물학적 촉매이다. 효소는 이들이 작용하는 기질과 조합되어 중간체 효소-기질 복합체를 형성한다. 그 다음 상기 복합체는 반응 생성물 및 특이적인 효소 작용을 지속하는 방출된 효소로 전환된다.

효소는 구강 세정에 사용되는 경우 여러 이점을 제공한다. 프로테아제는 치아 표면에 흡착되고 생성되는 플라크의 첫번째 층인 박피를 형성하는 침 단백질을 분해한다. 프로테아제는 리파아제와 함께 박테리아 세포벽 및 막의 구조 성분을 형성하는 단백질 및 지질을 분해함으로써 박테리아를 파괴한다.

덱스트라나아제 및 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제와 같은 기타 카르보히드로라아제는 박테리아 부착을 위한 매트릭스를 형성하는 박테리아에 의해 생성된 유기 골격 구조를 분해한다. 프로테아제 및 아밀라아제는 플라크 형성을 방해할 뿐 아니라, 또한 광물화를 방해하는 칼슘을 결합하는 탄수화물-단백질 복합체를 파괴하여 치석의 발달을 방해한다.

치약은 전형적으로 하기 성분 (최종 치약 조성물의 중량% 로): 마모 물질 약 70% 까지; 휴멕턴트: 0% 내지 약 80%; 증점제: 약 0.1% 내지 약 20%; 결합제: 약 0.01% 내지 약 10%; 감미제: 약 0.1% 내지 약 5%; 발포제: 0% 내지 약 15%; 미백제: 0% 내지 약 5%; 및 효소: 약 0.0001% 내지 약 20% 를 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 치약의 pH 는 약 6.0 내지 약 8.0 이고: a) 약 10% 내지 약 70% 마모 물질; b) 0% 내지 약 80% 휴멕턴트; c) 0.1% 내지 약 20% 증점제; d) 0.01% 내지 약 10% 결합제; e) 약 0.1% 내지 약 5% 감미제; f) 0% 내지 약 15% 발포제; g) 0% 내지 약 5% 미백제; i) 약 0.0001% 내지 약 20% 효소를 포함한다.

상기 i) 에 언급되는 효소에는

-아밀라아제 변이체 단독 또는 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제와 같은 기타 효소와의 조합, 및 임의로 치약 등에 사용되는 것으로 알려진 상기 언급된 기타 유형의 효소가 포함된다.

구강청정제는 전형적으로 하기 성분 (최종 구강청정제 조성물의 중량% 로): 0% 내지 약 20% 휴멕턴트; 0% 내지 약 2% 계면활성제; 0% 내지 약 5% 효소; 0% 내지 약 20% 에탄올; 0% 내지 약 2% 기타 성분 (예를 들어, 풍미, 감미제 활성 성분, 예컨대 불소) 을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 약 0% 내지 약 70% 물을 함유할 수 있다.

구강청정제 조성물은 약 6.0 내지 약 7.5 의 pH 범위로 적합한 완충액, 예를 들어 나트륨 시트레이트 또는 포스페이트로 완충될 수 있다.

구강청정제는 비-희석 형태일 수 있다 (즉, 사용전에 희석되어야만 함).

경구 케어 조성물은 경구 케어 업계에 공지된 임의의 통상적인 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

의도된 용도의 취지 또는 범주로부터 벗어나지 않고 동일물을 사용하는 조성물 및 방법에 다양한 개질 및 변형이 이뤄질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로, 청구의 범위 및 이의 등가물의 범주 내에 있는 개질 및 변형 이 제공된다.

실시예 1

Spezyme ® FRED 의 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis )

- 아밀라아제 AlT 변이체

B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 균주 BML 612 로부터의 FRED 는 cat^R 마커가 있는 cat 유전자좌에서의 증폭가능 FRED 유전자인 Δamy 유전자 및 Δ spo II AC 이다.

발현 플라스미드 pHPLT (예를 들어, 공개 미국 출원 번호 2006/0014265 및 국제 PCT 출원 번호 WO 2005/111203 참조) 로부터 Spezyme® FRED

-아밀라아제를 발현시키기 위해, Spezyme® FRED

-아밀라아제 유전자를 프라이머 LAT(PstI)_FW & LAT(HpaI)_RV 로 PCR (Polymerase Chain Reaction: 폴리머라아제 연쇄 반응) 에 의해 증폭시켰다:

PCR 을 제조자의 지침에 따라 (어닐링 온도: 55℃) High Fidelity Platinum Taq 폴리머라아제 (Invitrogen, Carlsbad, Calif. USA) 를 사용하여 서모싸이클러 (thermocycler) 에서 수행하였다. 수득된 PCR 분절을 공급자 (Invitrogen, Carlsbad, Calif. USA) 의 지침에 따라 제한 효소 PstI 및 HpaI 으로 소화시키고 PstI 및 HpaI 소화된 pHPLT 내에 T4 DNA 리가아제로 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 미국 공개 특허 출원 US2002/0182734 (또한, 국제 공개 WO 02/14490 참조) 에 기재된 바와 같은 B 서브틸리스 (B. subtilis) 균주 SC6.1 내에 형질전환시켰다. 모든 3 개의 클론은 비교적 큰 테두리 (halo) 를 생성하였고, 이것은 높은 아밀라아제 발현에 대한 지표이다. 3 개의 클론의 삽입체를 DNA 서열분석에 의해 서열을 분석하였다. 아마도 LAT(PSTI)_FW 프라이머에서의 에러로 인해 클론 중 하나는 FRED 유전자에서 단일 돌연변이를 함유하였고, FRED(AlT) 아밀라아제를 발현한다. 본 클론에서, 알라닌 (gca) 을 코딩하는 Spezyme® FRED

-아밀라아제 (성숙 사슬 부재 신호 서열) 의 첫번째 코돈은, 트레오닌을 코딩하는 또다른 코돈 (aca) 으로 돌연변이되었다.

그 다음 FRED(AlT) 유전자를 pICatH 벡터 (예를 들어, 공개 미국 출원 2006/0014265 및 국제 PCT 출원 번호 WO 2005/111203 참조) 내로 클로닝하였다. FRED(AlT) 유전자는 상기 기재된 바와 같으나, 프라이머 EBS2XhoI_FW 및 EBS2XhoI_RV 를 사용하여 PCR 에 의해 증폭시켰다:

수득된 PCR 분절을 공급자 (Invitrogen, Carlsbad, Calif. USA) 의 지침에 따라 제한 효소 XhoI 으로 소화시키고 XhoI 소화된 pICatH 내에 T4 DNA 리가아제로 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 상기 기재된 바와 같은 B 서브틸리스 (B. subtilis) 균주 SC6.1 내에 형질전환시켰다. FRED(AlT) 유전자의 방향이 측면 catH 유전자와 동일한 클론을 선별하였다 (도 2B). 이것은 균주 SC6.1(pICatH-FRED(AlT)ori1) 를 야기하고, 이의 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.

'야생형' Spezyme® FRED

-아밀라아제 유전자 (AlT 돌연변이 없이 FRED 아밀라아제를 코딩함) 를 또한 pICatH 벡터 내에 클로닝하였다. FRED 유전자를 프라이머 PlatFREDXhoI_FW 및 FRED-Tlat_RV 로 Spezyme® FRED

-아밀라아제로부터 PCR (Polymerase Chain Reaction: 폴리머라아제 연쇄 반응) 에 의해 증폭시켰다:

PCR 을 제조자의 지침에 따라 (어닐링 온도: 55℃) Phusion High Fidelity DNA 폴리머라아제 (Finnzymes OY, Espoo, Finland) 를 사용하여 서모싸이클러 (thermocycler) 에서 수행하였다. 수득된 PCR 분절을 상기 기재된 바와 같이 제한 효소 XhoI 으로 소화시키고 XhoI 소화된 pICatH 내에 T4 DNA 리가아제로 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 상기 기재된 바와 같은 B 서브틸리스 (B. subtilis) 균주 SC6.1 내에 형질전환시켰다. FRED 유전자의 방향이 측면 catH 유전자와 동일한 클론을 선별하였다 (도 2A). 클론의 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 상기 클론은 SC6.1(pICatH-FREDori1) 으로 지정하였다.

B 서브틸리스 (B. subtilis) SC6.1(pICatH-FREDori1) 및 SC6.1(pICatH-FRED(AlT)ori1) 을 Heart Infusion (HI) 아가 플레이트로부터 0.2% 가용성 전분을 함유하는 신규 HI 플레이트 상에 3 중으로 찔러 옮겼다. 37℃ 에서 16 시간 성장 후, 플레이트에서의 전분 제거를 시각화하기 위해 플레이트를 요오드 용액으로 염색하였다 (도 3). 콜로니 주변의 테두리의 크기 (즉, 제거된 전분) 는 야생형 FRED 분자에 비해 FRED(IAT) 분자의 특이적 활성이 변경되지 않으므로 아밀라아제 생성에 대한 측정이다. FRED(AlT) 를 발현하는 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 균주에 의해 형성된 테두리 (하부, AlT 로 표기됨) 는 야생형 FRED 아밀라아제를 발현하는 동일한 숙주 균주의 것 (상부, wt 로 표기됨) 보다 더 크다. 그러므로, B. 서브틸리스 (B. subtilis) 에 의한 FRED 아밀라아제의 생성은 FRED 분자에서 AlT 돌연변이의 도입에 의해 증가된다.

실시예 2

바실러스 리케니포르미스 ( Bacillus licheniformis ) 에서의 FRED ( AlT ) 변이 체의 발현

플라스미드, plCatH-FREDori1 및 pICatH-FRED(AlT)ori1 을, 허용 온도 37℃ 에서 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 균주 BML612 (국제 PCT 출원 번호 WO 2005/111203 참조) 내에 형질전환시켰다. 각 구축물에 대해, 하나의 네오마이신 내성 (neoR) 및 하나의 클로르암페니콜 내성 (CmR) 형질전환체를 선별하고 각각 BML612(plCatH-FREDori1) 및 BML612(plCatH-FRED(AlT)ori1) 로 지정하였다. BML612(plCatH-FREDori1) 및 BML612(plCatH-FRED(AlT)ori1) 에서 플라스미드를 5 μg/mL 클로르암페니콜이 있는 배지 중 비-허용 온도 (50℃) 에서 균주를 성장시켜 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 게놈 상의 catH 영역 내에 통합시켰다. 각 구축물에 대해, 하나의 CmR 내성 클론을 선별하고 각각 BML612-plCatH-FREDori1 및 BML612-plCatH-FRED(AlT)ori1 로 지정하였다

두 균주를 루프-아웃 (loop-out) 벡터 서열까지 네오마이신 없이 여러 세대 동안 허용 온도에서 다시 성장시킨 다음, 각 구축물에 대해, 하나의 네오마이신 민감성 (neoS) 이지만, CmR 클론을 선별하였다. 상기 클론에서, 염색체 상의 plCatH 의 벡터 서열을 절단하였고 (네오마이신 내성 유전자 포함), 오직 catH-아밀라아제 카세트만이 남았다. 그 다음, 클로르암페니콜의 농도를 증가시킨 배지에서 균주를 성장시켜 염색체 상의 catH-아밀라아제 카세트를 증폭시켰다. 여러 횟수의 증폭 후, 각 구축물에 대해 전분 플레이트 상에 가장 큰 테두리를 생산한 하나의 클론 (75 μg/mL 클로르암페니콜에 대해 내성임) 을 선별하였다. 그 다음 이들 균주를 각각 BML612-FRED 및 BML612-FRED(AlT) 로 지정하였다. 14L 및 3000L 단위 모두에서 전형적인 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 발효 공정을 통해 두 균주를 주입하였다. 두 규모에서 FRED(AlT) 발효는 증가된 초기 효소 생성 속도 및 좀더 높아진 최종 적정 농도를 모두 보였다. 도 3 의 그래프는 BML612-FRED 균주에 대한 전형적인 생산 곡선 및 BML612-FRED(AlT) 균주에 대한 2 개 곡선을 포함하는 3 개의 3000L 설비 (pilot) 발효 결과를 나타낸다. 그래프는 Spezyme® FRED

-아밀라아제 발현 균주보다 최종 효소 적정 농도에서 유의한 증가를 보인다. 사용되는 성장 배지는 유기 화합물의 공급원으로서 옥수수 침지 고체 및 대두분과 함께 나트륨, 칼륨, 포스페이트, 마그네슘, 술페이트의 공급원으로서 무기 염 및 미량 원소로 이루어져 있다. 글루코오스와 같은 탄수화물 공급원은 또한, 출발 배지의 일부로서 포함되었다. 일단 배양이 성립되고 성장하기 시작하면, 배양을 유지하기 위해 탄수화물이 탱크 내에서 측정된다. 발효기 중의 배양 배지의 주기적인 샘플링을 정규적 간격으로 측정하여 색도 검정법을 사용하여 효소 적정 농도를 평가하였다. 발효는 중단된 효소 생성 속도가 증가하는 경우 종료되었다.

변이체 단백질은 하기 특이적 활성을 갖는 것으로 특징화되었다. 2 개의 FRED AlT 정제된 물질 및 4 개의 기타 FRED AlT 샘플을 분석하여 FRED AlT 의 특이적 활성을 특정하였다. FRED AlT 를 또한 분석하였고, 단백질 표준으로서 사용하였다. SDS-PAGE 젤, 질소 분석을 통한 TCA 및 총 단백질, 및 밀도측정을 수행하였다. 하기 샘플을 시험하였다:

FRED AlT

1) #1 - 정제된 물질

2) #2 - 정제된 물질

3) 20060100 - 14L PA 런 (run), "정규" 런, 정련된 공정

4)

5) 20068013, 정련됨 - 첫번째 3K PA 런, 정련된 공정

6) 20068013, 전체 세포 - 첫번째 3K PA 런, 전체 브로스

7) 20068024, 정련됨 - 두번째 3K PA 런, 정련된 공정

8) 20068024, 전체 세포 - 두번째 3K PA 런, 전체 브로스

FRED

1 ) 105-01086-002 - FRED 젤 참조

2) 107-04326-001 - FRED-L 런 1

3) 101-05330-001 - FRED-L 런 2

FRED AlT 에 대한 특이적 활성을 1317 LU/mg 활성 단백질로서 측정하였다. 상기 결과는 활성/조정 TCA 단백질 및 오직 하나의 FRED AlT 샘플이 있는 하나의 젤에 기준한 것이였고, 이것은 단백질 표준으로 사용되었다. 더욱 최근의 연구에 근거하여, FRED AlT 샘플은 상기 젤에 실제로 과적재되어 FRED AlT 결과를 거짓으로 높게 만들었다.

3 개 이상의 FRED AlT 샘플을 사용하는 여러 상이한 젤을 표준 및 대조군으로서 사용하였다. 소 혈청 알부민 (BSA) 및 LAT 는 또한 일부 젤에 대한 단백질 표준으로서 사용되었다. 특이적 활성을 2 가지 상이한 방법: 활성/조정 TCA 단백질을 사용하는 것 및 단백질 표준으로서 Spezyme® FRED, LAT 및/또는 BSA 를 사용하는 것을 사용하여 계산하였다.

활성/조정 TCA 단백질을 사용한 결과는 단백질 표준을 사용한 결과와 상이하다. 표준에 대한 결과는 Spezyme® FRED (FRED) 및 FRED AlT 샘플 모두에 대해 예상된 것과 근접하므로, 활성/조정 트리클로로아세트산 (TCA) 침전된 단백질 결과 는 최종 특이적 활성 측정에 포함되지 않았다. 상기 실험에 근거해, FRED AlT 는 1323 LU/mg 활성 단백질 또는 0.00076 mg/LU 의 특이적 활성을 가지고, 이것은 1317 LU/mg 활성 단백질 또는 0.00076 mg/LU 의 기록적으로 할당된 값보다 약 2% 높다.

실시예 3

FRED AlT 의 발효 및 정제를 향상시키는 방법

그 다음 실시예 1 에서 수득된 샘플을 SDS 폴리아크릴아미드 젤에 러닝시켰다. SDS 폴리아크릴아미드 젤에 대해, Spezyme® FRED 및 FRED AlT 샘플을 활성 단백질 값에 근거해 로딩하였다. 활성 단백질은 0.00076 mg 활성 단백질/LU 의 Spezyme® FRED 전환을 사용하여 계산하였다. 샘플을 트리클로로아세트산 (TCA) 비활성화를 사용하여 준비하였다. 통상의 코마시 (Coomassie) 를 사용하여 젤을 염색하였다. Spezyme® FRED 특이적 활성 값을 사용하여 모든 샘플을 로딩하는 경우, Spezyme® FRED 및 FRED AlT 모두는 유사한 평균 밴드 강도를 보였으며, 이는 활성 단백질/특이적 활성이 변이체 및 모 균주 사이에서 매우 유사함을 나타낸다.

2 개의 상이한 방법을 사용하여 특이적 활성을 계산하였다. 먼저, 활성 단백질을 젤로부터의 단백질의 순도에 (활성 밴드 대 총 코마시 영역 반응) TCA 침전 단백질을 곱하여 측정하였다.

두번째 방법에서, 3 개의 FRED AlT 로트 뿐 아니라 LAT 및 소 혈청 알부민 (BSA) 을 그의 활성 단백질 값을 사용하여 할당하였고, 모든 기타 샘플을 비교하고 특이적 활성 값이 결정되는 표준으로서 사용하였다; 이것은 각 샘플에 대한 주 단백질 밴드의 본래 (raw) 영역을 사용하여 수행되었다.

표 1. 조정 TCA 값을 사용하는 특이적 활성 (활성/조정 TCA 단백질)

주석: Spezyme® FRED 에 대한 5.78 g 단백질/g 질소의 전환 인자를 사용하여 단백질을 계산하였다. 5.79 g 단백질/g 질소의 전환 인자가 FRED AlT 에 대해 사용되었다. "FRED AlT 순수" 는 상기 예에서 기재된 바와 같은 정제된 효소를 의미한다. "전체 브로스는" 미정련된 것을 의미한다.

활성/조정 TCA 단백질 계산을 사용하여 3 회 런 동안 1315 LU/mg 의 평균 특이적 활성을 산출한다. FRED AlT 샘플은 1216 내지 2039 LU/mg 의 범위로, 평균 1655 LU/mg 이다. AlT 런은 상기 결과에 변화를 부여할 수 있는 발효 및 회수 공정에 많은 차이가 있었다.

표 2. 단백질 표준으로서 Spezyme ® FRED (" FRED "), LAT 및 BSA 를 사용하는 특이적 활성

"*" 는 특이적 활성이 3 개의 상이한 분석 및 5 개의 상이한 단백질 표준 (3 Spezyme® FRED 표준 뿐 아니라 BSA 및 LAT 표준) 을 사용하여 4 개의 젤로부터 수득된 평균임을 의미한다. 상이한 단백질 표준에 대한 특이적 활성은 1323 LU/mg 의 FRED 결과를 산출하고, 이것은 할당된 1299 LU/mg 값과 유사하다. FRED AlT 는 1317 LU/mg 의 특이적 활성 결과를 갖는다.

실시예 4

FRED ( AlT ) 의 B. 서브틸리스 (B. subtilis ) 생성

B. 서브틸리스 (B. subtilis) 를 AlT 및 야생형 Spezyme® FRED 에 대한 통합 플라스미드를 제작하기 위한 중간 숙주로서 사용하였다. B. 서브틸리스 (B. subtilis) FRED(AlT) 폴리펩티드가 야생형 Spezyme® FRED 에 비해 생성된 단백질 양을 증가시켰다는 결과를 얻었다.

Spezyme® FRED 아밀라아제 유전자 (위치 1, X₂ 에 알라닌을 가진 Spezyme® FRED

-아밀라아제를 코딩함) 및 돌연변이체 FRED(AlT) 유전자 (X₂ 에 알라닌 대신에 트레오닌을 갖는 FRED 돌연변이체를 코딩함) 를 pICatH 벡터 (미국 공개 번호 20060014265) 에 클로닝하고, B. 서브틸리스 (B. subtilis) 균주 SC6.1 (호주 출원 번호 20041293826) 내로 형질전환시켰다. 두 Spezyme® FRED 및 FRED AlT 구축물에 대해, Spezyme® FRED 유전자의 방향이 측면 catH 유전자와 동일한 클론을 선별하였다 (도 2A 및 2B). 이것은 균주 SC6.1(pICatH-FREDori1) 및 SC6.1(pICatH-FRED(AlT)ori1) 을 생성하였다. 두 균주를 Heart Infusion (HI) 아가 플레이트로부터 0.2% 가용성 전분을 함유하는 신규 HI 플레이트 상에 3 중으로 찔러 옮겼다. 37℃ 에서 16 시간 성장 후, 플레이트에서의 전분 제거를 시각화하기 위해 플레이트를 요오드 용액으로 염색하였다. 콜로니 주변의 테두리의 크기 (제거된 전분) 는

-아밀라아제 생성에 대한 측정이다 (야생형 Spezyme® FRED 분자에 비해 FRED(IAT) 분자의 특이적 활성이 변경되지 않음). 도 3 은 FRED (AlT) 를 발현하는 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 균주에 의해 형성된 테두리 (하부, "AlT" 로 표기됨) 가 야생형 Spezyme® FRED 를 발현하는 동일한 균주의 것 (상부, wt 로 표기됨) 보다 더 크다는 것을 보여준다.

상기 데이터로부터, B. 서브틸리스 (B. subtilis) 에 의한 Spezyme® FRED

-아밀라아제의 생성은 Spezyme® FRED 분자에서 AlT 돌연변이의 도입에 의해 증가된다는 것이 측정되었다.

실시예 5

LAT

- 아밀라아제의 개질

고려되는 또다른

-아밀라아제는 성숙 LAT

-아밀라아제이다. 성숙 형태는 LAT 와 동일하지 않거나 동일한 부모로부터 유래된 신호 폴리펩티드가 융합된 이종 단백질로서 생성될 수 있다. 첫번째 잔기를 알라닌 또는 발린 이외의 임의의 아미노산으로 치환하는 것이 포함될 것이다. 또다른 개질은 첫번째 잔기를 (밑줄친 알라닌) 알라닌에 대해 2, 3, 4, 또는 5 개의 잔기로 치환하는 것일 수 있으며, 여기서 이들 잔기의 첫번째 것은 알라닌 또는 발린 이외의 아미노산이다. 또다른 예는 밑줄친 알라닌을 트레오닌으로 치환하는 것일 수 있다. 또한 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 바와 같이 합성할 수 있을 것이다.

실시예 6

Spezyme ® FRED 의 개질

고려되는 하나의

-아밀라아제는 성숙 Spezyme® FRED 이다. 성숙 형태는 LAT 와 동일하지 않거나 바실러스 (Bacillus) 종으로부터 유래된 신호 폴리펩티드가 융합된 이종 단백질로서 생성될 수 있다. 첫번째 잔기 (즉, 알라닌) 를 알라닌 또는 발린 이외의 임의의 아미노산으로 치환하는 것이 포함될 것이다. 또다른 개질은 알라닌에 대해 2, 3, 4, 또는 5 개의 잔기로 치환하는 것일 수 있으며, 여기서 이들 잔기의 첫번째 것은 알라닌 또는 발린 이외의 아미노산이다. 또다른 예는 밑줄친 알라닌을 트레오닌으로 치환하는 것일 수 있다 (즉, AlT 은 또한 FRED AlT 로서 공지됨). 또한 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 바와 같이 합성할 수 있을 것이다.

Spezyme® FRED 는 LAT 성숙 폴리펩티드 서열와 비교해 하기 돌연변이를 갖고: M15T, H133Y, N188S, 및 A209V, 잔기는 하기 서열에서 밑줄쳐있다. 잔기 23 에서의 라이신은 또한 아르기닌일 수 있다.

실시예 7

B. 리케니포르미스 (B. licheniformis ) 야생형 테르아밀의 개질

계획되는 또다른

-아밀라아제는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 야생형 테르아밀 아밀라아제의 개질이다 (예를 들어, WO 02/10355 참조). 상기

-아밀라아제는 K23R 치환을 갖는다. 서열은 하기에 성숙 테르아밀 아밀라아제를 묘사한다.

또다른 변이체는 X₂ 에 치환을 갖는 R23K 형태 또는 R 이 성숙 형태의 잔기 23 에서 발생하는 서열일 것이다. 성숙

-아밀라아제의 첫번째 잔기 (밑줄친 알라닌) 이 알라닌 또는 발린 이외의 임의의 아미노산으로 치환되는 것이 포함될 것이다.

성숙 폴리펩티드 중의 첫번째 잔기는 실제로 전-단백질 중의 잔기 30 이다. 또다른 개질은 첫번째 잔기를 (밑줄친 알라닌) 알라닌에 대해 2, 3, 4, 또는 5 개의 잔기로 치환하는 것일 수 있으며, 여기서 이들 잔기의 첫번째 것은 알라닌 또는 발린 이외의 아미노산이다. 또다른 예는 밑줄친 알라닌을 트레오닌으로 치환하는 것일 수 있다. 또한 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 바와 같이 합성할 수 있을 것이다.

실시예 8

테르아밀 SC / Liquozyme ® Sc 서열의 개질

X₂ (성숙 서열에서 밑줄친 알라닌) 에서의 돌연변이에 대해 고려되는 또다른

-아밀라아제는 테르아밀 SC/Liquozyme® Sc 서열로, 이것은 전분 가공에 사용될 수 있다. 첫번째 잔기 (즉, 알라닌) 를 알라닌 또는 발린 이외의 임의의 아미노산으로 치환하는 것이 포함될 것이다. 또다른 개질은 알라닌에 대해 2, 3, 4, 또는 5 개의 잔기로 치환하는 것일 수 있으며, 여기서 이들 잔기의 첫번째 것은 알라닌 또는 발린 이외의 아미노산이다. 또한 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 바와 같이 합성할 수 있을 것이다.

실시예 9

Spezyme ® FRED 와 FRED AlT 를 비교하는 액화 검정

야생형

-아밀라아제, Spezyme® FRED 를 표준 액화 검정 뿐 아니라, 저 pH 하의 검정 및 저 칼슘 조건하에서의 검정으로, AlT 돌연변이체와 비교하였다.

물질 및 방법 . 4 개의 AlT 샘플을 야생형과 비교하여 평가하였다. 아밀라아제를 슈도모나스 (Pseudomonas) 에서 발효시켰다. 하기 물질을 사용하였다:

Cargill 백 전분, Lot. No. RM 228B D

Clinton Brand 106B Pearl 옥수수 전분, Lot. No. CS4 C20 076 106

TSL 06.275 blip AlT 20060100 (정련됨), 활성: 18,392, LU/g

TSL 06.276 blip AlT 20060101 (정련됨), 활성: 20,832, LU/g

TSL 06.277 blip AlT 20068013 (전체 세포), 활성: 16,969, LU/g

TSL 06.278 blip AlT 20068013 (정련됨), 활성: 22,154, LU/g

Spezyme® (실험실 표준), Lot No. 107-05190-001, 활성: 19,678 LU/g

아황산, JT Baker, Lot No. L14635

염화칼슘, Fisher, Lot No. 006902

각 세트의 액화를 위해, 4666.67 g 의 Cargill 백 전분을 7333.33 g 역삼투 (RO) 처리수에 첨가하여 옥수수 전분의 35% 건조 고체 (ds) 슬러리를 제조하였다. 상기 슬러리에, 15.385 g 의 6.5% 아황산을 사용하여 100 ppm 의 SO₂ 를 첨가하였다. 필요한 경우 칼슘을 염화칼슘 디히드레이트로서 첨가하였다. 슬러리의 pH 를 20% 나트륨 카르보네이트로 원하는 pH (5.8 또는 5.4) 로 조정하였다. 그 다음 슬러리를 100 메쉬 체를 통해 여과하고, 2000 g 부분씩 나눴다. 각 슬러리의 도스 (dose) 는 벤치 쿠커 (bench cooker) 를 통해 펌핑하기 대략 10 분 전, Spezyme® (표준 Lot No. 107-05190-001) 또는 적합한 AlT 샘플, 10 LU/g 이었다. 슬러리를 대략 43.33 mL/분의 속도로 벤치 쿠커를 통해 펌핑하여 109℃ 의 온도에서 9 분의 유지 시간을 달성하였다. 그 다음 500 mL Erlenmeyer 플라스 크에 액화물 (Liquefact) 을 수집하고, 2 차 액화를 위해 120 분 동안 95℃ 배스에 유지하였다. 샘플을 30, 60, 90, 및 120 분에 수집하였다. Schoorl 환원당 법을 사용하여 DE 를 측정하였다. 환원당 Schoorl 법은 환원당 및 공지된 과량의 구리 (II) 이온의 존재에 의해 구리 (II) 이온이 구리 (I) 로 환원되는 것에 근거한 검정법이다. 그러면 남은 구리 (II) 이온 농도는 트리요오드 이온을 형성하는 아세트 배지에서 요오드 이온을 감소시킨다. 그러면 트리요오드 이온은 표준화된 티오술페이트 용액으로 적정된다. 사용되는 구체적인 물질 및 방법은 하기와 같다: 10 mL 폭 주입 (mouth) 피펫, 250 mL Erlenmeyer 플라스크, 저장소가 있는 자동 분배 피펫 (pipettor) (10 mL 및 2 mL), 저항 가열기 (rheostat heater), 집게, 플라스크, 안전용 부젓가락, Fehlings 용액 A & B, 요오드화칼륨 용액 (30% w/v), 황산 용액 (26% w/v), 나트륨 티오술페이트 (0.1 N) 표준화된 전분 지시 용액, 글루코오스 (1.00% w/v 표준화됨). 40 mL 증류수에 150 g KI 를 용해하고, 1.5 mL 1 N NaOH 를 첨가하고, 500 mL 부피 플라스크로 정략적으로 옮기고 증류수를 표시선까지 채워 요오드화칼륨 용액 (30% w/v) 을 제조하였다. 황산 (26% w/v) 을 하기와 같이 제조하였다: 부드럽게 진탕시키면서 600 mL 비이커에서 천천히 72.f mL 농축 황산 (S. G. 1.84) 을 400 mL 증류수에 첨가한다. 실온으로 냉각시킨다. 500 mL 부피 플라스크로 정략적으로 옮기고 증류수를 표시선까지 채운다. 전분 지시 용액은 300 mL 증류수에 150 g NaCl 를 용해하고 끓을 때까지 가열하여 제조하였다. 그 다음 냉각 증류수 중의 전분 슬러리를 5 g (건조 중량) 의 가용성 전분을 함유하도록 제조하였다. 뜨거운 NaCl 용액을 진탕하면서, 전분 슬러리에 천천히 첨가한다. 조합된 혼합물을 약 5 분 동안 끓인 다음, 실온으로 냉각시킨다. 500 mL 부피 플라스크로 정략적으로 옮기고 증류수를 표시선까지 채운다. 모든 염이 용해되지는 않을 것이다. 표준화된 글루코오스, 표준화된 나트륨 티오술페이트 및 Fehlings 용액은 구입하였다.

Schrool 절차는 다음과 같다. 가열기를 전체적으로 가온시키고, 50 mL 의 물이 3 분 내에 끓도록 조절한다. 매시 (mash) 샘플을 수득하고, mL 당 47 내지 67 mg 덱스트로스의 당량을 함유하는 희석액을 제조한다. 예를 들어, 약 15 g 의 액화 매시 (DE = 10-12) 또는 4 g 의 당화 매시 (DE = 50-60) 를 100 mL 로 희석한다. 희석된 샘플의 % 고체 (%S) 를 측정한다. 250 mL Erlenmeyer 플라스크를 칭량한다. 10 mL 의 희석 샘플을 플라스크에 파이펫팅하고 (F + S) 를 칭량한다. 혼합하면서, 15 mL 증류수를 첨가한 다음, 10 mL Fehlings 용액 A, 및 10 mL Fehlings 용액 B 를 첨가한다. 혼합물을 3 분 내에 (+/- 15 초) 가열기에서 끓인다. 약 2 분 이상 동안 끓는 것을 지속한다. 흐르는 수돗물로 즉시 냉각시킨다. 혼합하면서, 10 mL 30% 칼륨 요오다이드를 첨가한 다음, 10 mL 26% 황산을 첨가한다. 2 mL 전분 지시액을 첨가하고 혼합하였다. 즉시 0.1 N 나트륨 티오술페이트로 청색 전분-요오드 복합체가 사라질 때까지 적정하였다. 청색 색조가 적어도 1 분 내에 다시 나타나지 않아야만 한다. 적정 부피 (TV) 를 기록한다. 표준을 위해 250 mL Erlenmeyer 플라스크에 5.00 mL 의 1.00% 글루코오스 및 20 mL 증류수를 파이펫팅한다. 사용된 물 블랭크는 또다른 플라스크 내의 25 mL 의 증류수였다. 15 mL 증류수를 혼합하면서 Fehlings 용액 A 및 B 각 10 mL 과 함께 첨가하는 단계에서 시작하여 단계를 반복하였다. 계산식은 다음과 같다:

결과. 4 개 샘플 각각은 유지 시간 9 분으로 109℃ 에서 벤치 쿠커를 사용하여 액화하였을 때 Spezyme® FRED 에 비해 DE 진행이 개선되었다. pH 5.4 에서 Spezyme® FRED 및 AlT FRED 변이체 모두는 그러나 5.8 보다 유의하게 DE (덱스트로오스 당량) 진행을 보였다. 전분 슬러리에 10 ppm 칼슘을 첨가하는 것은 Spezyme® FRED 또는 AlT 변이체의 액화에 유의한 영향을 끼치지 않았다. 전분의 본래 칼슘 함량이 pH 5.8 에서 각 효소를 안정화하는데 명백하게 매우 충분하다고 결론지었다.

표 3

데이터는 모든 AlT 샘플이 상기 조건에서 Spezyme® 표준보다 더 양호하게 수행하였다는 것을 보여준다. AlT 전체 세포 샘플은 정련된 반대 부분보다 양 호하게 수행하였다. Spezyme® 표준이, 효소가 120 분의 2 차 과정 동안 변성되었다는 것을 나타내는 회귀 선에서 미특징적인 굴곡을 생성한 이유는 명확하지 않았다. 도 4 는 칼슘의 첨가 없는 AlT 샘플의 DE 진행을 보여주고; 도 5 는 DE 진행이 10 ppm 첨가에서는 유의하게 영향을 받지 않았으나, AlT 가 Spezyme® 대조군보다 여전히 양호하게 수행하였다는 것을 보여준다.

pH 가 pH 5.4 로 변경되었을 때 (칼슘 첨가하지 않음), 두 효소의 안정성이 약간 감소하였다 (도 6). 그러나, AlT 샘플은 Spezyme® 대조군보다 pH 감소에 의해 평균적으로 덜 영향을 받았다.

상기 언급된 모든 참조는 모든 목적을 위해 전체가 참조로서 인용된다.

서열 목록

SEQ ID NO: 1 합성 서열 (5 개 아미노산)

여기서 X₁ 은 크기가 18 내지 35 개의 아미노산 범위인 신호 서열 내의 최종 아미노산이고;

X₂ 는 A'-B' 로, X₂ 가 알라닌인 경우, A' 는 알라닌 또는 발린 이외의 임의의 아미노산이고, B' 는 임의의 아미노산 잔기이거나 아미노산 잔기가 없고; X₂ 가 발린, 히스티딘, 또는 아스파르트산인 경우, A' 는 임의의 아미노산이고 B' 는 임의의 아미노산 잔기이거나 아미노산 잔기가 없고;

X₃ 은 아스파라긴, 알라닌, 히스티딘, 또는 글리신이고;

X₄ 는 류신, 글리신, 프롤린 또는 아스파라긴이고;

Y 는 성숙 박테리아

-아밀라아제 또는

-아밀라아제 변이체의 나머지 부분이다.

SEQ ID NO: 2 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis)

-아밀라아제 (LAT) 신호 펩티드 (29 개 아미노산)

SEQ ID NO: 3 프라이머 LAT(PSTI)_FW (47 개 뉴클레오티드)

SEQ ID NO: 4 프라이머 LAT(HPAI)_RV (46 개 뉴클레오티드)

SEQ ID NO: 5 프라이머 EBS2XHOI_FW (39 개 뉴클레오티드)

SEQ ID NO: 6 프라이머 EBS2XHOI_RV (35 개 뉴클레오티드)

SEQ ID NO: 7 프라이머 PlatFREDXhoI_FW (131 개 뉴클레오티드)

SEQ ID NO: 8 프라이머 FRED-Tlat_RV (109 개 뉴클레오티드)

SEQ ID NO: 9 LAT

-아밀라아제 (483 개 아미노산)

SEQ ID NO: 10 합성 서열 (483 개 아미노산)

SEQ ID NO: 11 합성 서열 (483 개 아미노산)

SEQ ID NO: 12 테르아밀 SC/Liquozyme® Sc 서열 (486 개 아미노산)

<110> Danisco US, Inc., Genencor Division England, George Kolkman, Marc Vroemen, Casper <120> Enhanced Amylase Production by N-Terminal Addition to Mature Amylase Protein <130> 30971WO <140> PCT/US2008/003778 <141> 2008-03-20 <150> US 60/907,174 <151> 2007-03-23 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic alpha-amylase variant motif <220> <221> SITE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid except Ala or Val <220> <221> SITE <222> (3) <223> Xaa can be Asp, Ala, His, or Gly <220> <221> SITE <222> (4) <223> Xaa can be Leu, Gly, Pro, or Asp <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 2 Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe 1 5 10 15 Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ser Ala 20 25 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 3 gaatgtctgc agcttcagca gcaaatctta atgggacgct gatgcag 47 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 4 cccggggtta actcatcttt gaacataaat tgaaaccgac ccgccg 46 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 5 atcctactcg aggcttttct tttggaagaa aatataggg 39 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 6 tggaatctcg aggttttatc ctttaccttg tctcc 35 <210> 7 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 7 acccccctcg aggcttttct tttggaagaa aatataggga aaatggtact tgttaaaaat 60 tcggaatatt tatacaatat catatgtttc acattgaaag gggaggagaa tcatgaaaca 120 acaaaaacgg c 131 <210> 8 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 8 gtcgacctcg aggttttatc ctttaccttg tctccaagct taaaataaaa aaacggattt 60 ccttcaggaa atccgtcctc tgttaactca tctttgaaca taaattg 107 <210> 9 <211> 483 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 9 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val 115 120 125 Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys 165 170 175 Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile 370 375 380 Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp 405 410 415 Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr 435 440 445 Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser 450 455 460 Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr 465 470 475 480 Val Gln Arg <210> 10 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic variant <400> 10 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val 115 120 125 Ile Ser Gly Glu Tyr Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys 165 170 175 Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Val Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile 370 375 380 Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp 405 410 415 Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr 435 440 445 Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser 450 455 460 Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr 465 470 475 480 Val Gln Arg <210> 11 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic variant <400> 11 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Arg Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro 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Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro Glu 195 200 205 Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr Thr 210 215 220 Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser 225 230 235 240 Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys Pro 245 250 255 Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu His 260 265 270 Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala Pro 275 280 285 Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe Asp 290 295 300 Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr Leu 305 310 315 320 Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala Leu 325 330 335 Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr 355 360 365 Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp Pro 370 375 380 Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr 385 390 395 400 Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly Thr Glu 405 410 415 Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe Tyr 435 440 445 Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val Pro 465 470 475 480 Arg Lys Thr Thr Val Ser 485 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic alpha-amylase variant motif <220> <221> SITE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid except Ala or Val <220> <221> SITE <222> (3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (4) <223> Xaa can be Asp, Ala, His, or Gly <220> <221> SITE <222> (5) <223> Xaa can be Leu, Gly, Pro, or Asp <400> 13 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic alpha-amylase variant motif <220> <221> SITE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid except Ala or Val <220> <221> SITE <222> (4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (5) <223> Xaa can be Asp, Ala, His, or Gly <220> <221> SITE <222> (6) <223> Xaa can be Leu, Gly, Pro, or Asp <400> 14 Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic alpha-amylase variant motif <220> <221> SITE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid except Ala or Val <220> <221> SITE <222> (4) <223> Xaa can be Asp, Ala, His, or Gly <220> <221> SITE <222> (5) <223> Xaa can be Leu, Gly, Pro, or Asp <400> 15 Xaa Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic alpha-amylase variant motif <220> <221> SITE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (2) <223> Xaa can be Val, His, or Asp <220> <221> SITE <222> (3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (5) <223> Xaa can be Asp, Ala, His, or Gly <220> <221> SITE <222> (6) <223> Xaa can be Leu, Gly, Pro, or Asp <400> 16 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic alpha-amylase variant motif <220> <221> SITE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (2) <223> Xaa can be Val, His, or Asp <220> <221> SITE <222> (3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (4) <223> Xaa can be Asp, Ala, His, or Gly <220> <221> SITE <222> (5) <223> Xaa can be Leu, Gly, Pro, or Asp <400> 17 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic junction <220> <221> SITE <222> (3) <223> Xaa can be Ala or Thr <400> 18 Ala Ser Xaa Ala 1

Claims (33)

1. SEQ ID NO: 1 또는 신호 펩티드 없는 SEQ ID NO: 1 을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 1 이 SEQ ID NO: 9 또는 10 을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 신호 펩티드 없는 SEQ ID NO: 1 이 SEQ ID NO: 9, 10, 11, 또는 12 로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 폴리펩티드.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 로 이루어진 단리된 폴리펩티드.
5. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 1 이 SEQ ID NO: 2 의 신호 펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 서열.
7. 제 6 항의 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터.
8. 제 7 항의 서열의 벡터를 포함하는 단리된 세포.
9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 서열의 핵산을 포함하는 단리된 세포.
10. 제 8 항에 있어서, 세포가 미생물인 단리된 세포.
11. 제 10 항에 있어서, 미생물이 박테리아 또는 진균인 단리된 세포.
12. 제 11 항에 있어서, 박테리아가 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), B. 리케니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필러스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 써큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 또는 S. 뮤리누스 (S. murinus) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 그람 (Gram) 양성 박테리아; 또는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 인 그람 음성 박테리아인 단리된 세포.
13. 세정 또는 식기세정용 조성물에서의 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
14. 세정 또는 식기세정용 세제 첨가제 조성물에서의 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
15. 임의로 비-분진 과립, 안정화 액체 또는 보호된 효소의 형태로, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 세제 첨가제.
16. 제 15 항에 있어서, 세제 첨가제가 셀룰라아제, 프로테아제, 및 아밀라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소를 추가로 포함하는 세제 첨가제.
17. 제 16 항에 있어서, 아밀라아제가

    

    -아밀라아제, β-아밀라아제, 또는 글루코아밀라아제인 세제 첨가제.
18. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 세제 조성물.
19. 제 15 항 또는 제 16 항의 세제 첨가제를 포함하는 세제 조성물.
20. 제 18 항에 있어서, 효소를 추가로 포함하고, 상기 효소가 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 만난나아제, 펙테이트 리아제, 또는 상기 효소의 조합인 세제 조성물.
21. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 수동 또는 자동 식기 세정 세제 조성물.
22. 제 21 항에 있어서, 효소를 추가로 포함하고, 상기 효소가 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 만난나아제, 펙테이트 리아제, 또는 상기 효소의 조합인 수동 또는 자동 식기 세정 세제 조성물.
23. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 수동 또는 자동 세탁 세정 조성물.
24. 제 23 항에 있어서, 효소를 추가로 포함하고, 상기 효소가 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 만난나아제, 펙테이트 리아제, 또는 상기 효소의 조합인 수동 또는 자동 세탁 세정 조성물.
25. 직물 발호 조성물에서의 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 용도.
26. 수용액에 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하고 임의로 효소를 포함하는 발호 조성물.
27. 수용액에 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 전분 가공 조성물.
28. 제 27 항에 있어서, 글루코아밀라아제, 이소아밀라아제, 풀라나아제, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 전분 가공 조성물.
29. 제 27 항의 조성물을 전분을 액화하기에 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는 전분 가공 방법.
30. 용액 또는 젤이고, 임의로 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 프로테아제, 펙티나아제, 항균제, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 균막 가수분해 조성물.
31. 제 30 항의 조성물을 균막을 부분적으로 또는 완전히 가수분해하기에 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는 균막 가수분해 방법.
32. 용액에 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 전분 당화용 조성물.
33. 제 32 항의 조성물을 전분을 당화시키기에 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는 전분 당화 방법.

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