MXPA01012179A - Nuevas endo-beta-1,4-glucanasas. - Google Patents

Abstract

Una enzima que exhibe la actividad de endo-?-1,4-glucanasa la cual pertenece a la familia 9 de las glicosil hidrolasas es obtenible de o endogena para una cepa que pertenece al genero Bacillus tal como Bacillus licheniformis, ATCC 14580; una molecula de polinucleotido aislado (ADN) que codifica una enzima o nucleo de enzima (el dominio cataliticamente activo de la enzima) que exhibe la actividad de endo-?-1,4-glucanasa seleccionada de (a) moleculas de polinucleotido que comprenden una secuencia de nucleotidos como se muestra en la SEC ID NO:1 del nucleotido 76 al nucleotido 1455 o del nucleotido 76 al nucleotido 1941, (b) moleculas de polinucleotidos que codifican un polipeptido que es al menos 75% identico a la secuencia de aminoacidos de la SEC ID NO:2 del residuo de un aminoacido 26 al residuo un aminoacido 485 o del residuo de un aminoacido 26 al residuo de un aminoacido 646, y (c) secuencias de nucleotidos degeneradas de (a) o (b), la enzima de endoglucanasa expresada que es util en diversas aplicaciones industriales.

Description

NUEVAS END0-BETA-1,4-GLUCANASAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una enzima que exhibe actividad de endo-ß-1, 4-glucanasa, la enzima que pertenece a la familia 9 de las glicosil hidrolasas y es al menos 75% homologa a una endo-ß-1, 4-glucanasa de la familia 9 de Bacillus licheniformis , a una molécula de polinucleótido aislada que codifica una endo-ß-1, 4-glucanasa de esta clase, y el uso de la enzima en las industrias de detergente, papel y pasta papelera, perforación de pozos petroleros, extracción de petróleo, vino y jugo, ingredientes alimenticios, alimento para animales o textiles.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La celulosa es un polímero de glucosa unido por enlaces ß-1, 4-glucosídicos. Las cadenas de celulosa forman numerosos enlaces de hidrógeno intra- e intermoleculares, lo cual da por resultado la formación de microfibrillas de celulosa insolubles. La hidrólisis microbiana de la celulosa a glucosa involucra las siguientes tres clases principales de celulasas: (i) endoglucanasas (EC 3.2.1.4) las cuales escinden las uniones 1, 4-glucosídicas aleatoriamente por todas las moléculas de celulosa: (ii) celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) las cuales digieren la celulosa del extremo no REF: 134106 reductor, liberando celobiosa; y (iii) ß-glucosidasas (EC 3.2.1.21) las cuales hidrolisan la celobiosa y las celodextrinas de bajo peso molecular para liberar la glucosa. Las celulasas son producidas por muchos microorganismos y están presentes frecuentemente en múltiples formas. El reconocimiento del significado económico de la degradación enzimática de la celulosa ha promovido una búsqueda extensiva de celulosas microbianas las cuales puedan ser utilizadas industrialmente . Como resultado, han sido investigadas las propiedades enzimáticas y las estructuras primarias de un gran número de celulasas. En base a los resultados de un análisis de conglomerados hidrófobos de la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico, estas celulasas han sido colocadas en diferentes familias de glicosil hidrolasas; las glicosil hidrolasas fúngales y bacterianas han sido agrupadas en 35 familias (Henrissat y colaboradores (1991), (1993)). La mayoría de las celulasas consisten de un dominio de enlace de celulosa (CBD) y un dominio catalítico (CAD) separados por un enlazador el cual puede ser rico en residuos de prolina y hidroxi amino. Otra clasificación de las celulasas ha sido establecida en base a la similitud de sus CBDs (Gilkes y colaboradores (1991) ) dando cinco familias de glicosil hidrolasas (I-V) . Las celulasas son sintetizadas por un gran número de microorganismos los cuales incluyen hongos, actinomicetos, mixobacterias y bacterias verdaderas pero también por plantas. Especialmente, las endo-ß-1, 4-glucanasas de una amplia variedad de especificidades han sido identificadas. Muchas endoglucanasas bacterianas ha sido descritas (Henrissat (1993); Gilbert y colaboradores, (1993)). Un uso industrial importante de las enzimas celulolíticas es el uso para el tratamiento de la pasta papelera, por ejemplo para mejorar el drenaje o para el destinte del papel reciclado. Otro uso industrial importante de las enzimas celulolíticas es el uso para el tratamiento de textiles o telas celulósicos, por ejemplo como ingredientes en composiciones de detergente o composiciones suavizantes de telas, para bio-pulimento de tela nueva (aprestado de prendas de vestir) , y para obtener una apariencia de "lavado con piedra pómez" de la tela que contiene celulosa, especialmente denim o mezclilla de algodón, y han sido sugeridos diversos métodos para tal tratamiento, por ejemplo en los documentos GB-A-1 368 599, EP-A-0 307 564 y EP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO 91/10732, WO 91/17244, PCT/DK95/00108 y PCT/DK95/00132. Hay una necesidad siempre existente por proporcionar nuevas enzimas celulasas o preparaciones enzimáticas las cuales puedan ser utilizadas para las aplicaciones donde es deseable la actividad de celulasa, preferiblemente una endo-ß-1, -glucanasa (EC 3.2.1.4).

El objetivo de la presente invención es proporcionar nuevas enzimas y composiciones enzimáticas que tengan actividad celulolítica sustancial bajo condiciones ligeramente acídicas a alcalinas y un rendimiento mejorado en el procesamiento de pasta papelera, el tratamiento textil, procesos de lavandería, procesos de extracción o en alimentos para animales; preferiblemente estas nuevas endoglucanasas de buen rendimiento son producibles o producidas al utilizar técnicas recombinantes en producciones altas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los inventores han encontrado una nueva enzima que tiene actividad celulolítica sustancial, es decir una endo-ß-1, 4-glucanasa (clasificada de acuerdo con la Nomenclatura de Enzimas como EC 3.2.1.4), la enzima que es endógena para Bacillus licheniformis y pertenece a la familia 9 de las glicosil hidrolasas, y los inventores han tenido éxito en la clonación y expresión de una secuencia de ADN que codifica tal enzima. Por consiguiente, en su primer aspecto la presente invención se refiere a una enzima que exhibe la actividad de la endo-ß-1, 4-glucanasa (EC 3.2.1.4) la cual se selecciona de uno de (a) un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de las posiciones 76 a 1455 de la SEC ID NO:l; (b) un polipéptido producido por el cultivo de una célula que comprende la secuencia de SEC ID NO:l bajo condiciones en donde la secuencia de ADN es expresada; (c) una enzima endo-ß-1, 4-glucanasa que tiene una secuencia de al menos 75% de identidad a ias posiciones 26-485 de la SEC ID NO: 2 el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de las posiciones 26-485 de la SEC ID NO: 2 cuando la identidad se determina por GAP proporcionado en el paquete de programas GCG utilizando una penalización de creación de GAP de 3.0 y una penalización de extensión de GAP de 0.1; y (d) un polipéptido codificado por la parte de la secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 12805. La enzima de la invención es identificada como que pertenece a la familia 9 de las glicosil hidrolasas definidas por Henrissat y colaboradores. En su segundo aspecto, la invención se refiere a una molécula de polinucleótido aislada, preferiblemente una molécula de ADN, que codifica el dominio catalíticamente activo de una enzima que exhibe la actividad de endo-ß-1,4-glucanasa, la molécula que se selecciona del grupo que consiste de (a) moléculas de polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID NO:l del nucleótido 76 al nucleótido 1455, (b) especies homologas de (a) ; (c) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que es al menos 75% idéntico a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 del residuo de un aminoácido 26 al residuo de un aminoácido 485, y (c) secuencias de nucleótidos degeneradas de (a) o (b) ; preferiblemente una molécula de polinucleótido capaz de hibridizar a una sonda de ADN de doble cadena, desnaturalizada bajo condiciones de severidad intermedia, en donde la sonda se selecciona del grupo que consiste de sondas de ADN que comprenden la secuencia mostrada en las posiciones 76-1455 de la SEC ID N0:1 y sondas de ADN que comprenden una sub-secuencia de las posiciones 76-1455 de la SEC ID NO:l que tiene una longitud de al menos aproximadamente 100 pares de bases. Un plásmido pSJ1678 que comprende una secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa de la invención ha sido transformado en una cepa de Escherichia coli la cual fue depositada por los inventores de acuerdo con el Tratado de Budapest de la Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos del Procedimiento de Patentes en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunscheweig, República Federal de Alemania, el 14 de Mayo de 1999 bajo el número de depósito DSM 12805. En su tercer, cuatro y quinto aspectos, la invención proporciona un vector de expresión que comprende un segmento de ADN el cual es por ejemplo una molécula de polinucleótido de la invención; una célula que comprende el segmento de ADN o el vector de expresión; y un método para producir una enzima que exhibe la actividad celulolítica, el método que comprende cultivar la célula bajo condiciones que permiten la producción de la enzima y recuperar la enzima del cultivo. En aun otro aspecto, la invención proporciona una enzima aislada que exhibe la actividad celulolítica, caracterizada en que (i) es libre de impurezas homologas y (ii) la enzima es producida por el método descrito anteriormente . Además, la presente invención se refiere al uso de tal enzima o la preparación de la enzima de la invención para aplicaciones industriales tales como para el tratamiento de pasta de madera o la degradación de biomasa. La invención también se refiere a un cultivo biológico sustancialmente puro, aislado de la cepa de Escherichia coli DSM 12805 que alberga la secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa clonada en el plásmido pSJ1678 presente en Escherichia coli DSM 12805 que se deriva de una cepa de la especie bacteriana Ba cillus licheniformis, o cualquier mutante de la cepa de E. coli . La endoglucanasa de la invención es ventajosa en un gran número de aplicaciones industriales al tener una alta actividad específica sobre la CMC (endoglucanasa) y, en contraste a la mayoría de otras endoglucanasas, la enzima de la invención es capaz de degradar la celulosa altamente cristalina. Además, esta enzima tiene su temperatura óptima a 60°C y es completamente activa entre pH 5.5 y 9.5. Por consiguiente, la enzima de la invención se puede utilizar ventajosamente para la degradación total de la biomasa, la cual necesitaría normalmente tanto la celobiohidrolasa (s) (la cual tiene muy poca actividad sobre la CMC) como la endoglucanasa (s) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "familia de la glicosil hidrolasa" utilizado en la presente ha sido descrito en Henrissat, B. "A classification of glycosyl hydrolases based of amino-acid sequence similarities" . Biochem. J. 280: 309-316 (1991); Henrissat, B., Bairoch, A. "New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781-788 (1993); Henrissat, B., Bairoch, A. "Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases" Biochem J. 316: 695-696 (1996); y Davies, G., Henrissat, B. "Structures and mechanisms of glicosyl hydrolases", Structure 3: 853-859 (1995); todos los cuales se incorporan por referencia. El término "propiedades enzimáticas funcionales" utilizado en la presente se propone para dar a entender las propiedades físicas y químicas promedio de un polipéptido que exhibe una o más actividades catalíticas. Ejemplos de propiedades enzimáticas funcionales son la actividad enzimática, actividad enzimática específica, actividad enzimática relativa a la actividad máxima (medida como una función de ya sea el pH o la temperatura) , estabilidad (degradación de la actividad enzimática a través del tiempo) , temperatura de fusión DSC, secuencia de aminoácidos N-terminal, peso molecular (usualmente medido en la SDS-PAGE) , punto isoeléctrico (pl) . En el presente contexto, el término "vector de expresión" representa una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés unido de manera operable a los segmentos tradicionales que proporcionan su transcripción. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de duplicación, uno o más marcadores seleccionables, un aumentador, una señal de poliadenilación, y similares. Los vectores de expresión se derivan generalmente del plásmido o ADN viral, o pueden contener elementos de ambos. El vector de expresión de la invención puede ser cualquier vector de expresión que se sujete convenientemente a los procedimientos de ADN recombinante, y la selección del vector dependerá frecuentemente de la célula hospedante dentro de la cual se » *j& - .*g= debe introducir el vector. De esta manera, el vector puede ser un vector de duplicación autónomo, es decir un vector el cual existe como una entidad extracromosómica, la duplicación del cual es dependiente de la duplicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en una célula hospedante, se integra en el genoma de la célula hospedante y se duplica junto con el (los) cromosoma (s) en el (los) cual (es) ha sido integrado . El término "expresión recombinante" o "expresado de manera recombinante" utilizado en la presente en conexión con la expresión de un polipéptido o proteína se define de acuerdo con la definición normal en la técnica. La expresión recombinante de una proteína se realiza generalmente al utilizar un vector de expresión como se describe inmediatamente antes. El término "aislado", cuando se aplica a una molécula de polinucleótido, representa que el polinucleótido ha sido removido de su medio ambiente genético, natural y de esta menara está libre de otras secuencias de codificación extrañas o no deseadas, y está en una forma adecuada para el uso dentro de los sistemas de producción de proteínas mediante la ingeniería genética. Tales moléculas aisladas son aquellas que se separan de su ambiente natural e incluyen ADNc y clones genómícos . Las moléculas de ADN aisladas de la ¡¿ sasi presente invención están libres de otros genes con los cuales estas están ordinariamente asociadas, pero pueden incluir las regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural tales como promotores y terminadores. La identificación de regiones asociadas será evidente para una persona de experiencia ordinaria en la técnica (ver por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78, 1985). El término "un polinucleótido aislado" puede ser denominado alternativamente "un polinucleótido clonado". Cuando se aplica a una proteína/polipéptido, el término "aislado" indica que la proteína se encuentra en una condición diferente de su ambiente nativo. En una forma preferida, la proteína aislada está sustancialmente libre de otras proteínas, particularmente otras proteínas homologas ( es decir "impurezas homologas" (ver posteriormente) ) . Se prefiere proporcionar la proteína en una forma más de 40% pura, más preferiblemente una forma más de 60% pura. Aun más preferiblemente, se prefiere proporcionar la proteína en una forma altamente purificada, es decir, más de 80% pura, más preferiblemente más de 95% pura, y aun más preferiblemente más de 99% pura, determinado mediante la SDS-PAGE. El término "proteína/polipéptido aislado" puede ser denominado alternativamente "proteína/polipéptido purificado". ? ftí & ^ i El término "impurezas homologas" significa cualquier impureza (por ejemplo otro polipéptido diferente del polipéptido de la invención) la cual se origina de la célula homologa de donde el polipéptido de la invención se obtiene originalmente. El término "obtenido de" utilizado en conexión con una fuente microbiana específica, significa el polinucleótido y/o polipéptido producido por la fuente específica, o por una célula en la cual ha sido insertado un gen de la fuente. El término "unido de manera operable", cuando se refiere a segmentos de ADN, representa que los segmentos son - ordenados de modo que éstos funcionan en armonía para sus propósitos destinados, por ejemplo la transcripción inicia en el promotor y procede a través del segmento de codificación al terminador. El término "polinucleótido" representa un polímero de cadena sencilla o doble de bases de desoxirribonucleótido o ribonucleótido leído del extremo 5' al 3' . Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados de fuentes naturales, sintetizados in vi tro, o preparados de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. El término "complementos de moléculas de polinucleótidos" representa moléculas de polinucleótido que tienen una secuencia base complementaría y una orientación inversa comparada con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria para 5' CCCGTGCAT 3' . El término "secuencia de nucleótidos degenerada" representa una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (comparado a una molécula de polinucleótido de referencia que codifica un polipéptido) . Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifica el mismo residuo de un aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC cada uno codifica a Asp) . El término "promotor" representa una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan el enlace de polimerasa de ADN y la iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras son comúnmente, pero no siempre, encontradas en las regiones no codificadoras 5' de los genes. El término "secuencia de señales secretorias" representa una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido secretorio") que, como un componente de un polipéptido más grande, dirige el polipéptido más grande a través de la vía secretoria de una célula en la cual es sintetizado. El péptido más grande es dividido comúnmente para remover el péptido secretorio durante el transito a través de la vía secretoria.

POLINUCLEÓTIDOS Dentro de las modalidades preferidas de la invención, un polinucleótido aislado de la invención hibridizará a las regiones de tamaño similar de la SEC ID NO: 1, o una secuencia complementaria para la misma, bajo condiciones de severidad al menos intermedias. En particular, los polinucleótidos de la invención hidridizarán a una sonda de ADN de cadena doble, desnaturalizada que comprende ya sea la secuencia completa que codifica el dominio catalítico de la enzima, la secuencia que se muestra en las posiciones 76-1455 de la SEC ID NO:l o cualquier sonda que comprende una sub-secuencia de la SEC ID NO:l que tiene una longitud de al menos aproximadamente 100 pares de bases bajo las condiciones de severidad al menos intermedias, pero preferiblemente en condiciones de severidad alta como se describe en detalle posteriormente. Las condiciones experimentales adecuadas para determinar la hibridización en una severidad intermedia o alta entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o ARN homologa involucra la preimpregnación del filtro que contiene los fragmentos de ADN o ARN para hibridizar en 5 x SSC (Cloruro sódico/Citrato sódico, Sambrook y colaboradores, 1989) durante 10 minutos y la prehibridización del filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt (Sambrook y colaboradores, 1989), SDS 0.5% y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado, desnaturalizado (Sambrook y colaboradores 1989) , seguido por la hibridización en la misma solución que contiene una concentración de 10 ng/ml de una sonda cebada de manera aleatoria (Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), etiquetada con 32P-dCTP (actividad específica más alta que 1 x 109 cpm/µg) durante 12 horas a aproximadamente 45°C. El filtro luego se lava dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, SDS 0.5% al menos 60°C (severidad intermedia) , aun más preferiblemente al menos 65°C (severidad intermedia/alta) , aun más preferiblemente al menos 70°C (severidad alta), y aun más preferiblemente al menos 75°C (severidad muy alta) . Las moléculas a las cuales la sonda de oligonucleótidos hibridiza bajo estas condiciones son detectadas utilizando una película de rayos x. Como se observó previamente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y ARN. Los métodos para aislar el ADN y el ARN son bien conocidos en la técnica. Los genes de codificación del ADN y ARN de interés se pueden clonar en Bancos de Genes o librerías de ADN por medio de los métodos conocidos en la técnica. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos que tienen actividad endogucanasa de la invención entonces son identificados y aislados mediante, por ejemplo, la hibridización o la PCR.

La presente invención además proporciona polipéptidos y polinucleótidos de contraparte de diferentes cepas bacterianas (ortólogos o parálogos) . Son de particular interés los polipéptidos de endoglucanasa de cepas alcalofílicas gram-positivas, que incluyen la especie Bacillus . Las especies homologas de un polipéptido con actividad de endoglucanasa de la invención se pueden clonar utilizando información y composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con las técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, una secuencia de ADN de la presente invención se puede clonar utilizando el ADN cromosómico obtenido de un tipo de célula que expresa la proteína. Las fuentes adecuadas de ADN pueden ser identificadas al examinar la técnica de inmunotransferencia Northern con sondas designadas de las secuencias descritas en la presente. Entonces se prepara una librería de ADN cromosómico de una línea de células positiva. Una secuencia de ADN de la invención que codifica un polipéptido que tiene la actividad de endoglucanasa entonces puede ser aislada por una variedad de métodos, tal como mediante el examen con las sondas designadas de las secuencias descritas en la presente especificación y las reivindicaciones o con uno o más conjuntos de sondas degeneradas en base a las secuencias descritas. Una secuencia de ADN de la invención también puede ser clonada utilizando la reacción en cadena de polimerasa, o la PCR (Mullís, patente norteamericana No. 4,683,202), utilizando los cebadores o iniciadores designados de las secuencias descritas en la presente. En un método adicional, la librería o banco de ADN se puede utilizar para transformar o transfectar las células hospedantes, y la expresión del ADN de interés se puede detectar con un anticuerpo (monoclonal o policlonal) producido contra la endoglucanasa clonada de B . licheniformis, ATCC 14580, puede ser expresada y purificada como se describe en Materiales y Métodos y los Ejemplos 1 y 3, o mediante una prueba de actividad con relación a un - polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa. La parte de codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN clonada en el plásmido pSJ1678 presente en Escherichia coli DSM 12805 y/o una secuencia de ADN análoga de la invención se puede clonar de una cepa de la especie bacteriana Bacillus licheniformis, preferiblemente la cepa ATCC 14580, que produce la enzima con la actividad de endoglucanasa, o un organismo diferente o relacionado como se describe en la presente. Alternativamente, la secuencia análoga se puede construir en base a la secuencia de ADN obtenible del plásmido presente en Escherichia coli DSM 12805 (la cual se cree que es idéntica a la SEC ID NO:l unida), por ejemplo, puede ser una sub-secuencia de la misma y/o por la introducción de las sustituciones de nucleótidos que no dan origen a otra secuencia de aminoácidos de la endoglucanasa codificada por la secuencia de ADN, pero que corresponde al uso del codon del organismo hospedante propuesto para la producción de la enzima, o por la introducción de las sustituciones de nucleótidos que pueden dar origen a una secuencia de aminoácidos diferentes ( es decir una variante de la enzima de la invención) . Alternativamente, el ADN que codifica una endoglucanasa de la invención puede ser clonado convenientemente, de acuerdo con los procedimientos bien conocidos, a partir de una fuente adecuada, tal como cualquiera de los organismos mencionados posteriormente, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos sintéticas preparadas en base a la secuencia de ADN obtenible del plásmido presente en Escherichia coli DSM 12805. Como para utilizar una secuencia de la invención para obtener otras secuencias relacionadas: La información de la secuencia descrita en la presente con relación a una secuencia de polinucleótido que codifica una endo-beta-1, 4-glucanasa de la invención se puede utilizar como una herramienta para identificar otras endoglucanasas homologas. Por ejemplo, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se puede utilizar para amplificar las secuencias que codifican otras mananasas homologas de una variedad de fuentes í aSf microbianas, en particular de diferentes especies de Bacillus .

POLIPÉPTIDOS: La secuencia de aminoácidos en la posición 26 a aproximadamente la posición 485 de la SEC ID NO: 2 es una secuencia de endoglucanasa madura del dominio activo catalítico. La enzima además comprende un dominio de enlace de celulosa (CBD) el cual es unido de manera operable al dominio activo catalítico y el cual es representado por una secuencia de aminoácidos correspondiente a aproximadamente la posición 485 a la posición 646 de la SEC ID NO: 2. El CBD de la presente endoglucanasa pertenece a la familia 3b, ver posteriormente . La presente invención también proporciona polipéptidos de endoglucanasa que son sustancialmente homólogos al polipéptido de la SEC ID NO: 2 y especies homologas (parálogos u ortólogos) de los mismos. El término "sustancialmente homólogo" se utiliza en la presente para representar los polipéptidos que tienen 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, y aun más preferiblemente al menos 90%, de identidad de secuencias con la secuencia mostrada en los aminoácidos números. 26-685 o números 26-646 de la SEC ID NO: 2 o sus ortólogos o parálogos. Estos polipéptidos serán más preferentemente al menos 95% idénticos, y más preferiblemente 98% o más idénticos a la secuencia mostrada en los aminoácidos números 26-646 de la SEC ID NO: 2 o sus ortólogos o parálogos. El porcentaje de identidad de secuencias se determina por medios convencionales, por medio de programas de computadora conocidos en la técnica tal como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, Agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711) descrito en Needleman, S. B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453, que se incorpora por este acto para referencia en su totalidad. El programa GAP se utiliza con los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de polipéptidos: penalidad por creación del GAP de 3.0 y penalidad por extensión del GAP de 0.1. La identidad de secuencias de las moléculas de polinucleótidos se determina por métodos similares utilizando el GAP con los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de ADN: penalidad por creación del GAP de 5.0 y penalidad por extensión del GAP de 0.3. Las proteínas y los polipéptidos sustancialmente homólogos se caracterizan por tener una o más sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de carácter menor, que es sustituciones de aminoácidos conservativas (ver Tabla 2) y otras sustituciones que no afectan significantemente el plegamiento o actividad de la proteína o poliproteína; supresiones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino- o carboxil-terminales pequeñas, tales como un residuo de metionina terminal, un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una extensión pequeña que facilita la purificación (una etiqueta de afinidad) , tal como un tracto de poli-histidina, proteína A (Nilsson y colaboradores, EMBO J. <4:1075, 1985; Nilsson y colaboradores, Methods Enzymol. 198 : 3, 1991. Ver, en general Ford y colaboradores, Protrein Expression and Purification 2: 95-107, 1991, la cual es incorpora en la presente por referencia. Los ADNs que codifican las etiquetas de afinidad son disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Boilabs, Berverly, MA) . Sin embargo, aunque los cambios descritos anteriormente son preferiblemente de un carácter menor, estos cambios también pueden ser de un carácter mayor tal como la fusión de polipéptidos más grandes de hasta 300 aminoácidos o más como extensiones tanto amino- o carboxilo-terminales a un polipéptido de la invención que tiene actividad de endoglucanasa . y»*?.vH»ÍÍ Tabla 1 Sustituciones de Aminoácidos Conservativas Básica: argmina lisina histidina Acídica : ácido glutámico ácido aspártico Polar: glutamina asparagina Hidrófoba: leucina isoleucina valina Aromática ; fenilalanina triptófano tirosina Pequeña: glicina alanina serina treonina metionina Además de los 20 aminoácidos estándares, los aminoácidos no estándares (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y a-metil sepna) pueden ser sustituidos por los residuos de aminoácidos de un polipéptido de acuerdo con la invención. Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no son codificados por el código genético, y aminoácidos innaturales pueden ser sustituidos por los residuos de aminoácidos. Los "aminoácidos innaturales" han sido modificados después de la síntesis de proteínas, y/o tienen una estructura química en su(s) cadena (s) colateral (es) diferente de aquellas de los aminoácidos estándar. Los aminoácidos innaturales pueden ser sintetizados químicamente, o preferiblemente, son comercialmente disponibles, e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidin carboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, y 3, 3-dimetilprolina. Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de endoglucanasa de la presente invención se pueden identificar de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham and Wells, Science 244 : 1081-1085, 1989) . En la última técnica, las mutaciones de alanina se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes, resultantes son sometidas a prueba para la actividad biológica (es decir la actividad de endoglucanasa) para identificar los residuos de un aminoácido que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton y colaboradores, J. Biol.. Chem. 271: 4699-4708, 1996. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se pueden determinar mediante el análisis físico de la estructura, determinado por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o etiquetado de fotoafinidad, en conjunción con la mutación de aminoácidos del sitio en contacto putativo. Ver, por ejemplo, de Vos y colaboradores, Science 255 : 306-312, 1992; Smith y colaboradores, J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver y colaboradores, FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden deducir a partir del análisis de homologías con los polipéptidos que están relacionados a un polipéptido de acuerdo con la invención. Las sustituciones de aminoácidos múltiples se pueden hacer y someter a prueba utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinacion y/o entremezclado seguidos por un procedimiento de selección relevante, tal como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241: 53-57, 1988), Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:2152-2156, 1989), patentes W095/17413, o WO 95/22625. En resumen, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, o la recombinación/entremezclado de diferentes mutaciones (patentes W095/17413, W095/22625) , seguido por la selección de un polipéptido funcional y luego el ordenamiento en secuencias de los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de las sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen la exhibición de fagos (por ejemplo, Lowman y colaboradores, Biochem. 30 : 10832-10837, 1991; Ladner y colaboradores, patente norteamericana No. 5,223,409; Huse, Publicación de la WIPO WO 92/06204) y la mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire y colaboradores, Gene 4_6:145, 1986; Ner y colaboradores, DNA 7:127, 1988). Los métodos de mutagénesis/entremezclado descritos anteriormente se pueden combinar con los métodos de selección automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados, clonados en las células hospedantes. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican los polipéptidos activos se pueden recuperar de las células hospedantes y ordenar en secuencias rápidamente utilizando un equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de un aminoácido individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a los polipéptidos de estructura desconocida. Utilizando los métodos discutidos anteriormente, una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede identificar y/o preparar una variedad de polipéptidos que son sustancialmente homólogos a los residuos 26 a aproximadamente 485 o los residuos 26 a 646 de la SEC ID NO: 2 y retener la actividad de endoglucanasa de la proteína de tipo no cultivado. La enzima endoglucanasa de la invención también puede comprender, además del núcleo de la enzima que comprende el dominio catalíticamente activo, un dominio de enlace de celulosa (CBD) , el dominio de enlace de celulosa y el núcleo de la enzima (el dominio catalíticamente activo) de la enzima que está unida de manera operable. El dominio de enlace de celulosa (CBD) puede existir como una parte integral de la enzima codificada como se describe anteriormente y en la SEC ID NO: 2 anexa, o un CBD de otro origen se puede introducir en la endoglucanasa para crear de esta manera un híbrido de la enzima. En este contexto, el término "dominio de enlace de celulosa" se propone para ser entendido como se define por Peter Tomme y colaboradores "Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties" en "Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler and Michael H. Penner (Eds.), ACS Symposium Series, No. 618, 1996. Esta definición clasifica más de 120 dominios de enlace de celulosa en 10 familias (I-X), y demuestra que los CBDs se encuentran en varias enzimas tales como las celulasas (endoglucanasas) , xilanasas, mananasas, arabinofuranosidasas, acetil esterasas y quitinasas. Los CBDs también han sido encontrados en algas, por ejemplo la alga roja Porphyra purpurea como una proteína de enlace de polisacáridos no hidrolítica, ver Tomme y colaboradores, op. ci t . Sin embargo, la mayoría de los CBDs son de las celulasas y xilanasas, los CBDs se encuentran en las terminaciones N y C de las proteínas o son internos. Los híbridos de la enzima son conocidos en la técnica, ver por ejemplo el documento WO 90/00609 y el documento WO 95/16782, y se pueden preparar mediante la transformación en una construcción de ADN de una célula hospedante que comprende al menos un fragmento de ADN que codifica el dominio de enlace de celulosa ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa y el crecimiento de la células hospedantes para expresar el gen fusionado. Los híbridos de enzimas pueden ser descritos por la siguiente fórmula : CBD - MR - X en donde CBD es la región N-terminal o C-terminal de una secuencia de aminoácidos que corresponde al menos el dominio de enlace de celulosa; MR es la región intermedia (el enlazador) , y puede ser un enlace, o un grupo de enlace corto preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 átomos de carbono, más preferiblemente de 2 a 40 átomos de carbono; o es preferiblemente de alrededor de 2 a alrededor 100 aminoácidos, más preferiblemente de 2 a 40 aminoácidos; y X es una región N-terminal o C-terminal de un polipéptido codificado por la primera o la segunda secuencia de ADN de la invención. En una modalidad preferida, la molécula de polinucleótido aislada de la invención comprende una secuencia de ADN parcial que codifica un dominio de enlace de celulosa (CBD) . Un ejemplo de tal secuencia de ADN parcial es la secuencia correspondiente a los nucleótidos en las posiciones de aproximadamente 485 a 1941 de la SEC ID N0:1 o la parte de codificación del CBD de la secuencia de ADN clonada dentro del plásmido pSJ1678 presente en Escherichia coli , DSM 12805. La molécula de polinucleótido aislada de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos parcial, adicional que codifica una región de unión, la región de unión que une de manera operable el dominio de enlace de celulosa (CBD) y el dominio catalíticamente activo (CAD) de la enzima codificada por la secuencia de nucleótidos comprendida por la molécula de polinucleótido aislada. Preferiblemente, la región de unión consiste de aproximadamente 2 residuos de un aminoácido a aproximadamente 120 residuos de un aminoácido, especialmente 10-80 residuos de un aminoácido.

Reactividad cruzada inmunológica Los anticuerpos policlonales, especialmente los anticuerpos policlonales monoespecíficos, que son utilizados Tn-Tir^ en la determinación de la reactividad cruzada inmunológica se pueden preparar mediante el uso de una enzima celulolítica, purificada. Más específicamente, el antisuero contra la endoglucanasa' de la invención puede ser producido al inmunizar conejos (u otros roedores) de acuerdo con el procedimiento descrito por N. Axelsen y colaboradores en: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23, o A. Johnstone y R. Torpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (más específicamente páginas 27-31) . Las inmunoglobulinas purificadas se pueden obtener de los antisueros, por ejemplo por la precipitación de sal ((NH )2 S0 ) , seguido por la diálisis y la cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo en DEAE-Sephadex. La caracterización inmunoquímica de las proteínas se puede hacer ya sea mediante el análisis de difusión doble Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed. ) , Blackwell Scientific Publications, 1967, páginas 655-706), mediante la inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen y colaboradores, supra. Capítulos 3 y 4), o mediante la inmunoelectroforesis cohética (N. Axelsen y colaboradores, Capítulo 2) .

Puentes Microbianas Para el propósito de la presente invención, el término "obtenido de" u "obtenible de" utilizado en la presente en conexión con una fuente específica, significa que la enzima se produce o se puede producir por la fuente específica, o por una célula en la cual ha sido insertado un gen de la fuente. Se contempla ahora que la celulasa de la invención se puede obtener de una bacteria gram-positiva que pertenece a una cepa del género Bacillus, en particular una cepa de Bacillus licheniformis . En una modalidad preferida, la celulasa de la invención se obtiene de la cepa Bacillus licheniformis, ATCC 14580. Ahora se contempla que una secuencia de ADN que codifica una enzima homologa a la enzima de la invención se puede obtener de otras cepas que pertenecen al género Bacillus . Un aislado de una cepa de Bacillus licheniformis de la cual se puede derivar una endo-ß-1, 4-glucanasa de la invención es disponible públicamente de American Type Culture Collection (ATCC) bajo el número de depósito ATCC 14580. Además, el plásmido pSJ1678 que comprende la secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa de la invención ha sido transformado en una cepa de la Escherichia coli y depositado bajo el número de depósito DSM 12805.

Vectores de expresión recombinantes Un vector recombinante que comprende una construcción de ADN que codifica la enzima de la invención puede ser cualquier vector, que pueda ser sujetado convenientemente a los procedimientos de ADN recombinante, y la selección del vector frecuentemente dependerá de la célula hospedante en la cual se debe introducir. De esta manera, el vector puede ser un vector de réplica autónoma, es decir, un vector, el cual existe como una entidad extracromosómica, la duplicación del cual es independiente de la duplicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en una célula hospedante, se integra en el genoma de la célula hospedante en parte o en su totalidad y se duplica junto con el (los) cromosoma (s) en el (los) cual (es) ha sido introducido. El vector es preferiblemente un vector de expresión en el cual la secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención es unida de manera operable a segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ADN. En general, el vector de expresión se deriva del plásmido o ADN viral, o puede contener elementos de ambos. El término, "unido de manera operable" indica que los segmentos son ordenados de modo que éstos funcionen en armonía para sus propósitos destinados, por ejemplo la transcripción inicia en un promotor y procede a través de la secuencia de ADN que codifica la enzima. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN, la cual muestra la actividad transcripcional en la célula hospedante de la selección y se puede derivar de los genes que codifican las proteínas ya sea homologas o heterólogas para la célula hospedante. Los ejemplos de promotores adecuados para el uso en las células hospedantes bacterianas incluyen el promotor del gen de amilasa maltogénica de Bacill us li cheniformis, el gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, el gen de alfa- - amilasa de Bacill us amyloliquefaciens, el gen de proteasa alcalina de Bacillus subtilis o el gen de xilosidasa de Bacillus pumil us, o los promotores de fagos Lambda PR o PL o los promotores de E. coli lac, trp o tac. La secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención también puede ser, si es necesario, conectada de manera operable a un terminador adecuado. El vector recombinante de la invención puede 20 comprender además una secuencia de ADN que hace posible que el vector se duplique en la célula hospedante en cuestión. El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo un gen, el producto del cual complementa un defecto en la célula hospedante, o un gen que codifica la resistencia a, por ejemplo, antibióticos ní?&tmu?A similares a la canamicina, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina, espectinomicina o similares, o la resistencia a metales pesados o herbicidas. Para dirigir una enzima de la presente invención en la vía secretoria de las células hospedantes, se puede proporcionar una secuencia de señales secretorias (también conocida como una secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) en el vector recombinante. La secuencia de señales secretorias se une a la secuencia de ADN que codifica la enzima en la estructura de lectura correcta. Las secuencias de señales secretorias se colocan comúnmente en 5' - con relación a la secuencia de ADN que codifica la enzima. La secuencia de señales secretorias puede ser aquella normalmente asociada con la enzima o puede ser de un gen que codifica otra proteína secretada. Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifican la presente enzima, el promotor y opcionalmente el terminador y/o la secuencia de señales secretorias, respectivamente, o para ensamblar o armar estas secuencias mediante los esquemas de amplificación de PCR adecuados, y para insertarlas en los vectores adecuados que contienen la información necesaria para la duplicación o integración, son bien conocidos para las personas expertas en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, op. cit . ) .

Células hospedantes La molécula de ADN clonada introducida en la célula hospedante puede ser ya sea homologa o heteróloga para el hospedante en cuestión. Si es homologa a la célula hospedante, es decir, producida por la célula hospedante del todo, típicamente será conectada de manera operable a otra secuencia promotora o, si es aplicable, otra secuencia de señales secretorias y/o secuencia terminadora que esta en su ambiente natural. El término "homólogo" se propone para incluir una secuencia de ADN que codifica una enzima nativa para el organismo hospedante en cuestión. El término "heterólogo" se propone para incluir una secuencia de ADN no expresada por la célula hospedante del todo. De esta manera, la secuencia de ADN puede ser de otro organismo, o puede ser una secuencia sintética. La célula hospedante en la cual se introduce la molécula de ADN clonada o el vector recombinante de la invención puede ser cualquier célula que sea capaz de producir la enzima deseada e incluye bacterias, levadura, hongos y células eucarióticas superiores. Ejemplos de células hospedantes bacterianas las cuales en el cultivo son capaces de producir la enzima de la invención pueden ser bacterias gram-positivas tales como una cepa de Bacillus, en particular Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus megatherium, Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis, una cepa de Lactobacillus, una cepa de Streptococcus, una cepa de Streptomyces, en particular Streptomyces lividans y Streptomyces murinus, o la célula hospedante puede ser bacterias gram-negativas tal como una cepa de Escherichia coli . La transformación de las bacterias se puede efectuar mediante la transformación de protoplastos, la electroporación, la conjugación o al utilizar células competentes de una manera conocida per se (ver, por ejemplo Sambrook y colaboradores , supra) . Cuando se expresa la enzima en una bacteria tal como Escherichia coli , la enzima puede ser retenida en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles (conocidos como cuerpos de inclusión) , o se puede dirigir al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células son lisadas y los granulos se recuperan y se desnaturalizan después de lo cual la enzima es replegada mediante la dilución del agente de desnaturalización. En el último caso, la enzima se puede recuperar del espacio periplásmico al disrrumpir las células, por ejemplo por sonicación o choque osmótico, para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la enzima. Cuando se expresa la enzima en una bacteria gram-positiva tal como una cepa de Bacillus o una cepa de Stre oiTiyces, la enzima puede ser retenida en el citoplasma, o se puede dirigir al medio extracelular por una secuencia de secreción bacteriana. Ejemplos de una célula hospedante fungal la cual en el cultivo es capaz de producir la enzima de la invención es, por ejemplo, una cepa de Aspergillus o Fusarium, en particular Aspergillus awamori , Aspergill us nidulans , Aspergillus Níger, Aspergillus oryzae, y Fusarium oxysporum, y una cepa de Trichoderma , preferiblemente Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei y Trichoderma viride . Las células fúngales pueden ser transformadas mediante un proceso que involucra la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida por la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. EL uso de una cepa de Aspergillus como una célula hospedante se describe en la patente EP 238 023 (Novo Nordisk A/S) , los contenidos de la cual se incorporan por este acto para referencia. Los ejemplos de una célula hospedante de origen de levadura la cual en el cultivo es capaz de producir la enzima de la invención es, por ejemplo una cepa de Hansenula sp., una cepa de Kluyveromyces sp . , en particular Kluyveromyces lactis y Kluyveromyces marcianus, una cepa de Pichia sp. , una cepa de Saccharomyces , en particular Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces kl uyveri y Saccharomyces uvarum, una cepa de Schizosaccharomyces sp. , en particular Schizosaccharomyces pombe y una cepa de Yarowia sp . , en particular Yarrowia lipolytica . Ejemplos de una célula hospedante de origen vegetal la cual en el cultivo es capaz de producir la enzima de la invención es por ejemplo una célula vegetal de Solanum tuberosum o Nicotiana tabacum .

Método para producir una enzima celulolítica La presente invención proporciona una método para la producción de una enzima aislada de acuerdo con la invención, en donde una célula hospedante adecuada, la cual ha sido transformada con una secuencia de ADN que codifica la enzima, es cultivada bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante se recupera del cultivo. Como se define en la presente, un polipéptido aislado (por ejemplo una enzima) es un polipéptido que está esencialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo, al menos aproximadamente 20% puro, preferiblemente al menos aproximadamente 40% puro, más preferentemente alrededor de 60% puro, aun más preferiblemente alrededor de 80% puro, mucho más preferiblemente alrededor de 80% puro, y aun mucho más preferiblemente alrededor de 95% puro, determinado mediante la SDS-PAGE. El término "polipéptido aislado" puede ser denominado alternativamente "polipéptido purificado". Cuando un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica la enzima es transformado en una célula hospedante heteróloga, es posible hacer habilitar la producción recombinante, heteróloga de la enzima de la invención. Por lo que es posible hacer una composición celulolítica altamente purificada o monocomponente, caracterizada en que está libre de impurezas heterólogas. En este contexto, impurezas homologas significa cualquier impureza (por ejemplo, polipéptidos diferentes de la enzima de la invención) que se origina de la célula homologa de donde la enzima de la invención se obtiene originalmente. En la presente invención, la célula hospedante homologa puede ser una cepa de Bacillus licheniformis . El medio utilizado para cultivar las células hospedantes transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar las células hospedantes en cuestión. La enzima celulolítica expresada puede ser secretada convenientemente en el medio de cultivo y puede ser recuperada del mismo mediante procedimientos bien conocidos que incluyen la separación de las células del medio por centrifugación o filtración, la precipitación de los componentes proteináceos del medio por una sal tal como sulfato de amonio, seguido por procedimientos cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad, o similares. 10 Composiciones enzimáticas En un aspecto aun adicional, la presente invención se refiere a una composición enzimática que comprende una enzima que exhibe la actividad de endoglucanasa descrita 15 anteriormente. La composición enzimática de la invención puede comprender, además de la endoglucanasa de la invención, uno o más de otros tipos de enzimas, por ejemplo hemicelulasa tal como xilanasa y manasa, otra celulasa o componentes de endo- 20 ß-1, 4-glucanasa, quitinasa, lipasa, esterasa, pectinasa, cutinasa, fitasa, oxidoreductasa, (peroxidasa, haloperoxidasa, oxidasa, lacasa) , proteasa, amilasa, reductasa, fenoloxidasa, ligninasa, pululanasa, pectato liasa, xiloglucanasa, pectin acetil esterasa, 25 poligalacturonasa, ramnogalacturonasa, pectin liasa, pectin r**A?í*a*mAaalt~*. -a.-». ,. . -A.' -> -A-hA ^is--, - ..-¿&teW-folte¿ metilesterasa, celobiohidrolasa, transglutaminasa; o mezclas de las mismas. La composición enzimática puede ser preparada de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica y puede estar en la forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición enzimática puede estar en la forma de un granulado o un micro-granulado. La enzima que se incluye en la composición se puede estabilizar de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Las endoglucanasas tienen usos potenciales en muchas industrias y aplicaciones diferentes. Los ejemplos de los usos preferidos de la composición enzimática de la invención son dados posteriormente. La dosificación de la composición enzimática de la invención y otras condiciones bajo las cuales se utiliza la composición se puede determinar en base a los métodos conocidos en la técnica. La composición enzimática de acuerdo con la invención puede ser útil para al menos uno de los siguientes propósitos .

La enzima En una modalidad preferida de la presente invención, la endoglucanasa exhibe la actividad en un pH en la gama de 4-11, preferiblemente 5.5-10.5.

Usos Degradación de la biomasa La enzima o la composición enzimática de acuerdo con la invención se puede aplicar ventajosamente por ejemplo como sigue: - Para descortezar, es decir, el pre-tratamiento con enzimas hidrolíticas las cuales pueden degradar parcialmente la capa de cámbium rica en pectina antes del descortezamiento en tambores mecánicos lo que da por resultado ahorros de energía ventajosos. - Para la desfibración (depuración o refinamiento) , es decir el tratamiento del material que contiene fibras celulósicas con enzimas hidrolíticas antes de la depuración o refinamiento lo cual da por resultado la reducción del consumo de energía debido al efecto de hidrolización de las enzimas en las superficies de las fibras. - Para la modificación de las fibras, es decir el mejoramiento de las propiedades de las fibras donde es necesaria la hidrólisis parcial a través de la pared de las fibras lo cual requiere la penetración más profunda de las enzimas (por ejemplo a fin de hacer más flexibles las fibras bastas) . - Para el drenaje: La capacidad de drenaje de las pastas papeleras se puede mejorar mediante el tratamiento de la pasta con las enzimas de hidrolización. El uso de la enzima o la composición enzimática de la invención puede ser más efectivo, por ejemplo, dando por resultado un grado más alto de aflojamiento de los mazos de micro-fibrillas fuertemente hidratadas en la fracción de fibras muy cortas que limita la velocidad de drenaje al bloquear los espacios huecos entre las fibras y en la malla de alambre de la máquina papelera. El tratamiento de la pasta lignocelulósica se puede realizar, por ejemplo, como se describe en las patentes WO 93/08275, WO 91/02839 y WO 92/03608.

Uso en la industria del detergente La enzima o la composición enzimática de la invención puede ser útil en una composición de detergente para la lavandería casera o industrial de textiles y prendas de vestir, y para un proceso para el tratamiento con máquina de telas que comprende tratar la tela durante un ciclo de lavado de un proceso de lavado en máquina con una solución de lavado que contiene la enzima o la preparación enzimática de la invención. Típicamente, la composición de detergente de la invención comprende ingredientes convencionales tales como surfactantes (aniónicos, no iónicos, zwiteriónicos, amfotéricos) , aditivos, y otros ingredientes, por ejemplo, como se describe en la patente WO 97/01629 la cual se incorpora por este acto para referencia.

Aplicaciones textiles En otra modalidad, la presente invención se refiere al uso de la endoglucanasa de la invención en el proceso de bio-pulimento. El bio-pulimento es un tratamiento específico de la superficie del hilo el cual mejora la calidad de la tela con respecto al tacto y apariencia sin pérdida de humectabilidad de la tela. Los efectos más importantes del bio-pulimento se pueden caracterizar por menos pelusilla y frisado, brillo/lustre incrementado, tacto de la tela mejorado, suavidad durable incrementada y absorbencia de agua alterada. El bio-pulimento toma lugar usualmente en el procesamiento húmedo de la fabricación de las telas tricotadas y tejidas. El procesamiento húmedo comprende pasos tales como por ejemplo desencolado, lavado a fondo, blanqueo, lavado, teñido/impresión y aprestado. Durante cada uno de estos pasos, la tela es sujetada más o menos a la acción mecánica. En general, después de que los textiles han sido tricotados o tejidos, la tela procede a una etapa de desencolado, seguida por una etapa lavado a fondo, etcétera. El desencolado es el acto de remover la cola de los textiles. Antes del tejido en telares mecánicos, los hilos de urdimbre son revestidos frecuentemente con almidón encolado o derivados de almidón a fin de incrementar su resistencia a la tracción. Después del tejido, el revestimiento de cola se debe remover antes del procesamiento adicional de la tela a fin de asegurar un resultado homogéneo y a prueba de lavado. Se sabe que a fin de lograr los efectos de bio-pulimento, se requiere una combinación de acción celulítica y mecánica. También se sabe que la "super-suavidad" es alcanzable cuando el tratamiento con una celulasa es combinado con un tratamiento convencional con los agentes suavizantes. Se contempla que el uso de la endoglucanasa de la invención para la bio-pulimento de telas celulósicas es ventajoso, por ejemplo, se puede lograr un pulimento más completo. El bio-pulimento se puede obtener al aplicar el método descrito por ejemplo en la patente WO 93/20278.

Lavado con piedra pómez Se conoce el proporcionar una apariencia de "lavado con piedra pómez" (abrasión localizada del color) en tela teñida, especialmente en la tela denim o tela para pantalones vaqueros, ya sea mediante el lavado del denim o los pantalones vaqueros hechos de tal tela en la presencia de piedras pómez para proporcionar el aclaramiento localizado, deseado del color de la tela o mediante el tratamiento de la tela enzimáticamente, en particular con enzimas celulíticas. El tratamiento con una endoglucanasa de la presente invención se puede llevar a cabo ya sea solo tal como se describe en la patente norteamericana No. 4,832,864, junto con una cantidad más pequeña de piedra pómez que la requerida en el proceso tradicional, o junto con perlita tal como se describe en la patente WO 95/09225.

DETERMINACIÓN DE LAS UNIDADES CMC Las unidades CMC se determinan utilizando un amortiguador Mops 0.1 M a pH 7.5 a 60 °C. La incubación durante 20 minutos y la determinación de la formación de azúcares de reducción utilizando PHAB. Una unidad CMC - corresponde a la formación de un equivalente de glucosa de 1 micromol por minuto. La concentración final de CMC (Carboxi Metil Celulosa 7L de Hercules) es 0.75%, DS 0.7.

MATERIALES Y MÉTODOS Cepas Bacillus licheniformis ATCC 14580. B. subtilis PL2306. Esta cepa es la B.subtilis DN1885 con los genes apr y npr disrrumpidos (Diderichsen y colaboradores (1990) disrrumpida en la unidad transcripcional del gen de celulasa de Bacillus subtilis conocido, lo que da por resultado las células negativas de celulasa. La disrrupción se realizó esencialmente como se describe en A.L. Sonenshein y colaboradores (1993) .

Las células componentes se prepararon y se transformaron como se describe por Yasbin y colaboradores (1975) .

Plásmidos El pSJ1678 descrito en la publicación de patente internacional WO 94/19454. pMOL944 : Este plásmido es un derivado del pUBUO que contiene esencialmente elementos que hacen al plásmido multiplicable en Bacillus subtilis, el gen de resistencia a la canamicina y que tiene un promotor fuerte y un péptido de señal clonado del gen amyL de B. licheniformis ATCC 14580. El péptido de señal contiene un sitio Sacll que lo hace conveniente para clonar el ADN que codifica la parte madura de una proteína en fusión con el péptido de señal. Esto da por resultado la expresión de una Pre-proteína, la cual se dirige hacia el exterior de la célula. El plásmido se construyó por medio de técnicas convencionales de ingeniería genética, las cuales se describen brevemente en lo siguiente. -...-. ,jy ¡ . .. -. . Ay i??&?? Construcción del pMOL944: El plásmido pUBUO (McKenzie, T. y colaboradores, 1986) se digirió con la única enzima de restricción Ncil. Un fragmento de la PCR amplificado del promotor amyL codificado en el plásmido pDN1981 (J0r-gensen P.L. y colaboradores (1990)) se digirió con Ncil y se insertó en el pUBUO digerido con Ncil para dar el plásmido pSJ2624. Los dos cebadores de la PCR utilizados tienen las siguientes secuencias: # LWN5494 5'-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCA?TTGGTAACTGTATCTCAGC-3' # LWN5495 5'-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGA? TGAGGCAGCAAGAAGAT -3' El cebador "LWN5494 inserta un sitio Notl en el plásmido. El plásmido pSJ2624 entonces se dirigió con Sacl y Notl y un nuevo fragmento de la PCR amplificado en el promotor amyL codificado en el pDN1981 se digirió con Sacl y Notl y este fragmento de ADN se insertó en el pSJ2624 digerido con Sacl-Notl para dar el plásmido pSJ2670. Esta clonación reemplaza la primera clonación del promotor amyL con el mismo promotor pero en la dirección opuesta. Los dos cebadores utilizados para la amplificación de la PCR tienen las siguientes secuencias: # LWN5938 5'-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATG AGGCAGCAAGAAGAT -3' # LWN5939 5'-GTCGGAGCTCTATCA?TTGGTA?CTGTATCTCAGC -3' El plásmido pSJ2670 se digirió con las enzimas de restricción PstI y Bcll y un fragmento de la PCR amplificado de una secuencia de ADN clonada que codifica la amilasa alcalina SP722 (descrita en la solicitud de patente internacional publicada como WO 95/26397 la cual se incorpora por este acto para referencia en su totalidad) se dirigió con PstI y Bcll y se insertó para dar el plásmido pMOL944. Los dos cebadores utilizados por la amplificación de la PCR tienen la siguiente secuencia: # LWN7864 5' - A?CAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAG-3' # LWN7901 5' - CTGCAGCCGCGGC^ATCATAATGGGACA?ATGGG -3' El cebador "LWN7901 inserta un sitio Sacll en el plásmido.

Métodos generales de biología molecular A menos que se mencione de otra manera, las manipulaciones y las transformaciones del ADN se realizaron utilizando métodos estándar de la biología molecular (Sambrook, y colaboradores (1989); Ausubel, F. M. y colaboradores (eds) (1995); Harwood, C. R. , y Cutting, S. M. (eds.) (1990)). Las enzimas para las manipulaciones de ADN se utilizaron de acuerdo con las especificaciones de los proveedores (por ejemplo, las endonucleasas de restricción, stl ligasas, etcétera, se pueden obtener de New England Biolabs, Inc. ) .

Medios TY (descrito en Ausubel y colaboradores, (1995) ) . Agar LB (descrito en Ausubel y colaboradores (1995) ) . LBP6 es agar LB complementado con glucosa 0.5% y fosfato de potasio 0.05 M, pH 7.0. medios BPX se describe en el documento EP 0 506 780 (WO 91/09129) . Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

EJEMPLO 1 Clonación y expresión de la endo-beta-1 , 4-glucanasa de Bacillus licheniformis Preparación de ADN genómico La cepa de Bacill us licheniformis ATCC 14580 se propagó en el medio líquido 3 especificado por la ATCC (American Type Culture Collection, EUA) . Después de 18 horas de incubación a 37 °C y 300 rpm, las células se recolectaron, y el ADN genómico fue aislado por el método descrito por Pitcher y colaboradores (1989) .

Construcción de Librerías o Bancos Genómicos El ADN genómico de Bacillus licheniformis ATCC 14580 fue digerido parcialmente con la enzima de restricción Sau3A y fue fraccionado en tamaño mediante la electroforesis en un gel de agarosa 0.7%. Los fragmentos de entre 2 y 7 kb de tamaño se aislaron mediante la electroforesis en papel de DEAE-celulosa (Dretzen y colaboradores (1981)). Los fragmentos de ADN aislados se ligaron al ADN del plásmido pSJl678 digerido con BamHI. El ADN ligado se utilizó en la electroporación de E.coli SJ2, las células transformadas se colocaron en placas de agar LB que contenían 10 mg/ml de cloranfenicol y CMC 0.1% (Carboxi-Metil-Celulosa Sódica, Aqualon, Francia) , las placas se incubaron 18 horas a 37°C.

Identificación de clones positivos mediante la hibridización de colonias Una librería o banco de ADN en E. coli, construida como se describe anteriormente, se seleccionó o detectó en placas de agar LB que contenían CMC 0.1% (Carboxi-Metil-Celulosa Sódica, Aqualon, Francia) y 10 µg/ml de cloranfenicol y se incubó durante la noche a 37 °C. Los transformantes se colocaron en placas de réplica subsecuentemente en el mismo tipo de placas, y estas nuevas placas se incubaron 8 horas o durante la noche a 37 °C.

Las placas originales se colorearon utilizando 25 ml de una solución acuosa que contenía 1 mg/ml de Congo red (SIGMA, EUA) . La coloración continuó durante media hora con agitación orbital moderada, después de lo cual las placas se lavaron dos veces 15 minutos utilizando NaCl 1 M. Aparecieron halos amarillentos en posiciones donde los clones positivos de celulasa estuvieron presentes, se salvaron estos clones positivos de celulosa de las placas de réplica y se volvieron a marcar en rayas en las placas de agar LB que contenían CMC 0.1% y 9 µg/ml de cloranfenicol y se incubaron durante la noche a 37 °C.

Caracterización de clones positivos De las placas de re-marcado en rayas se obtuvieron los clones positivos de endoglucanasa como colonias individuales, y los plásmidos se extrajeron. Los fenotipos se confirmaron mediante la retransformación de E. coli SJ2, y los plásmidos se caracterizaron mediante la digestión de restricción. Un clon positivo se denominó MB629-3. El gen de endoglucanasa se caracterizó al ordenar en secuencias el ADN utilizando el equipo de ordenamiento en secuencias del ciclo desoxi-terminal Taq (Perkin-Elmer, EUA) y al realizar el desplazamiento del cebador, iniciando con los cebadores únicos para el plásmido pSJ1678 y en cada lado del fragmento de ADN que codifica la endoglucanasa clonada.

El análisis de los datos de secuencia se realizó de acuerdo con Devereux y colaboradores (1984). La secuencia corresponde a la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO: 1. La secuencia de ADN de la invención que codifica la endo-beta-1, 4-glucanasa de la familia 9 representada por la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 2 (también definida Cel9) fue amplificada por la PCR utilizando el conjunto de cebadores de la PCR que consiste de estos dos oligo nucleótidos: Cel9.B. lich. superior. PstI 5' -CAT CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCT TCT GCT GAA GAA TAT CCT C-3' Cel9.B. lich. inferior. Notl 5' -GCG AGA ATA GCG GCC GCT AGT AAC CGG GCT CAT GTC CG-3' Los sitios de restricción PstI y Notl están subrayados. El ADN cromosómico aislado de B. licheniformis ATCC 14580 descrito anteriormente se utilizó como un molde o matriz en una reacción PCR utilizando la Polimerasa de ADN Amplitaq (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción PCR se estableció en el amortiguador de PCR (Tris-HCl 10 mM, pH 8.3, KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM, gelatina 0.01% (p/v)) que contenía 200 µM de cada dNTP, 2.5 unidades de polimerasa AmpliTaq (Perkin-Elmer, Cetus, EUA) y 100 pmol de cada cebador. Las reacciones PCR se realizaron utilizando un ciclador térmico de ADN (Landgraf, Alemania) . Una incubación a 94 °C durante 1 minuto seguida por treinta ciclos de PCR se realizó utilizando un perfil de los ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, destemplamiento a 60°C durante 1 minuto y la extensión a 72°C durante 2 minutos. Se analizaron alícuotas de cinco µl del producto de amplificación mediante la electroforesis en geles de agarosa 0.7% (NuSieve, FMC). La aparición de un fragmento de ADN de tamaño 2.0 kb indicó la amplificación apropiada del segmento de gen.

Subclonación del fragmento de la PCR Las alícuotas de cuarenta y cinco µl de los productos de la PCR generados como se describe anteriormente se purificaron utilizando un equipo de purificación de la PCR QIAquick (Qiagen, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN purificado se eluyó en 50 µl de Tris-HCl 10 mM, pH 8.5. Se digirieron 5 µg del pMOL944 y veinticinco µl del fragmento de la PCR purificado con PstI y Notl, se sometieron a la electroforesis en geles de agarosa de baja temperatura de gelificación 0.8% (SeaPlaque GTG, FMC), los fragmentos relevantes se retiraron de los geles, y se purificaron utilizando el Equipo de extracción de Gel QIAquick (Qiagen, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN de la PCR aislado entonces fue ligado al pMOL944 purificado y digerido con PstI-Notl. La ligadura se realizó durante la noche a 16°C utilizando 0.5 µg de cada fragmento de ADN, 1 U de ligasa de ADN T4 y amortiguador de ligasa T4 (Boehringer Mannheim, Alemania) . La mezcla de ligadura se utilizó para transformar el PL2306 de B . subtilis competente. Las células transformadas se colocaron en placas en LBPG-10 µg/ml de placas de Kanamicina. Después de 18 horas de incubación a 37 °C varios clones se re-marcaron en rayas en placas de agar nuevas y también se desarrollaron en cultivos de TY líquidos con 10 µg/ml de canamicina y se incubaron durante la noche a 37 °C. El siguiente día se utilizó 1 ml de células para aislar el plásmido de las células utilizando el Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para las preparaciones del plásmido de B. subtilis . Este ADN del plásmido se utilizó como un molde para el ordenamiento en secuencias del ADN. Un clon que contiene el gen de endo-beta-1, 4-glucanasa de la invención se mantuvo, este clon fue denominado MB905. El plásmido de MB905 se introdujo a un derivado de B . licheniformis ATCC 14580, para las pruebas de expresión.

Esta cepa se denominó MB924. La secuencia de ADN clonada se expresó en B . licheniformis mediante la fermentación de las células en los medios BP-X a 37 °C durante 5 días a 300 rpm. La proteína de endoglucanasa que apareció en el sobrenadante 5 correspondió a la proteína madura de la SEC ID NO: 2, es decir comprendió a la secuencia de proteínas correspondiente a los aminoácidos en la posición 26-646 de la SEC ID NO: 2.

EJEMPLO 2 10 Purificación y caracterización de la endo-beta-1 , 4-glucanasa de Bacillus licheniformis Purificación El MB924 obtenido como se describe en el ejemplo 1 se cultivó en medios BPX de 15 x 200 ml con 10 µg/ml de canamicina en matraces oscilantes con dos deflectores o separaciones de 500 ml durante 5 días a 37 °C a 300 rpm, por lo que se obtuvieron 2500 ml del caldo de cultivo. El fluido de cultivo se diluyó con un volumen de agua ionizada y el pH se ajustó a 7.5, utilizando ácido acético. Luego se adicionaron 112.5 ml del agente catiónico (C521 10%) y 225 ml del agente aniónico (A130 0.1%) durante la agitación para la floculación. El material floculado se separó mediante la centrifugación utilizando una centrífuga Sorval RC 3B a 10000 rpm durante 30 minutos a 6°C. El sobrenadante resultante y ^j^ ^-^^ ^-s^* contuvo 120 unidades CMC por ml en un volumen total de 5000 ml. El sobrenadante se clarificó utilizando filtros de vidrio Whatman GF/D y C y finalmente se concentró en una membrana UF filtron con un corte de 10 kDa. El volumen total de 1750 ml se ajustó a pH 8.0. Para obtener una endoglucanasa altamente purificada, se llevó a cabo un paso final utilizando la cromatografía de intercambio aniónico de Q-Sepharose. Se aplicaron 1750 ml de la solución a una columna de 800 ml que contenía Q-Sepharose (Pharmacia) equilibrado con un - amortiguador de 50 mmoles de Tris pH 8.0. La endoglucanasa se unió y se eluyó utilizando un gradiente de NaCl 0.5 M. Más de 95% de la endoglucanasa se concentró.

Caracterización La enzima pura dio una banda individual en SDS-PAGE de 67 kDa y un punto isoeléctrico de alrededor de 5.6. La concentración de la proteína se determinó utilizando un coeficiente de extinción molar de 171640 (en base a la composición de aminoácidos deducida de la secuencia) . Los perfiles de la actividad de pH mostraron más de 50% de actividad relativa entre pH 6.0 y 9.2, a 60°C. La temperatura óptima fue 65°C a pH 7.5. La DSC mostró un punto de fusión a 77°C a pH 6.2.

Determinación N-terminal de la endoglucanasa pura: EYPHNYALLQK. La endoglucanasa pura comprende un dominio catalítico que pertenece a la familia 9 de las glicosil hidrolasas, el dominio que corresponde a la secuencia de aminoácidos de aproximadamente la posición 26 a aproximadamente la posición 485 de la SEC ID NO: 2, y un dominio de enlace de celulasa (CBD) el cual se une al dominio catalítico y es representado por la secuencia de aminoácidos de aproximadamente la posición 486 a la posición 644 de la SEC ID NO: 2. El CBD pertenece a la familia 3b. Propiedades inmunológicas: en la compañía Danesa DAKO, se produjo suero monoespecífico policlonal de conejo contra la endo-beta-1, 4-glucanasa altamente purificada utilizando técnicas convencionales. El suero formó un precipitado individual fino en geles de agarosa con la endoglucanasa de la invención.

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LISTADO DE SECUENCIAS <110> NOVO NOKDIS A/S <120> NUEVAS ENDO-BETA-l,4-GLUCANASAS <130> seg <140> <141> <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1941 <212> ADN <213> Bacillus lichenifor is <400> 1 atgaaagcgc tttgtttggc cttttagtg atcttctcta tgagcatagc gtcgttttca 60 gaaaagaccc gtgcagct c tgc gaagaa tatcctcata attatgctga actgctgcaa 120 aagtctttgt tattttatga agcacagcgc tcgggaagac ttccggaaaa cagccggctg 180 aattggagag gagactccgg gcttgaggac ggaaaagacg ttggcctcga tttaacggga 240 gggtgg a g atgccggcga ccacgtgaag ttcggtctgc cgatggctta ttctgccgca 300 atcctgtcat ggtcggtcta tgagtaccga gatgcctaca aagaatcggg tcagcttgat 360 gcggcgctgg acaatattaa atgggcgaca gactactttc ttaaagccca tacggctcct 420 tatgaattgt ggggccaagt cggaaatggc gctctagacc acgcatggtg ggggccggcc 480 gaagtaatgc cgatgaagcg ccctgcctat aagatcgatg ccggctgtcc ggggtcagac 540 ct gc ggtg gtacagccgc agcgctagca tcagcatcaa ttattttcaa gccgacagat 600 tcttcttact ctgaaaaatt actggctcat gccaagcaat tgtatgattt tgccgaccgc 660 taccgcggca aatattcaga ctgcattaca gacgcacagc aatattataa ttcgtggagc 720 gggtataaag atgaactgac atggggagct gcctggctct acttggcaac agaagaacaa 780 caatatttgg ataaagccct tgcttcggtc tcagattggg gcgatcccgc aaactggcct 840 taccgctgga cgctttcctg ggatgacgtc acttacggag cacagctgct gctcgctcgt 900 ctgacaaacg attcccgttt tgtcaaatct gtcgaacgca atcttgatta ttggtcgaca 960 ggctacagtc ataatggaag catagaacgg atcacgtata cgccgggcgg tttggcctgg 1020 cttgagcagt ggggatcatt gcgatacgct tcgaatgccg cttttctcgc tttcgtttat 1080 tccgattggg tggatacaga aaaagcgaaa agatatcggg attttgctgt tcggcaaacg 1140 gagtatatgc taggagataa tccgcagcag cgaagc ttg tcgttggata cggtaaaaat 1200 ccgccgaaac atccgcatca ccgtacagca cacggttcat gggccaatca gatgaatgtg 1260 cctgaaaacc atcgccatac cctatacggc gcattagtcg gcggtccggg aagggacgat 1320 tcgtaccgag atgacataac agattatgcg tcaaacgaag ttgcgatcga ttataatgcc 1380 gcttttaccg gcaacgtagc gaaaatgttt cagctgttcg ggaaaggcca tgttccgctg 1440 cctgattttc cggagaagga aacacctgag gacgaatatt ttgcagaggc atcaatcaac 1500 agc ccggaa acagctatac tgaaatccgg 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Arg Phe Val Lys Ser Val Glu Arg Asn Leu Asp Tyr Trp Ser Thr 305 310 315 320 Gly Tyr Ser His Asn Gly Ser lie Glu Arg lie Thr Tyr Thr Pro Gly 325 330 335 Gly Leu Ala Trp Leu Glu Gln Trp Gly Ser Leu Arg Tyr Ala Ser Asn 340 345 350 Ala Ala Phe Leu Ala Phe Val Tyr Ser Asp Trp Val Asp Thr Glu Lys 355 360 365 Ala Lys Arg Tyr Arg Asp Phe Ala Val Arg Gln Thr Glu Tyr Met Leu 370 375 380 10 Gly Asp Asn Pro Gln Gln Arg Ser Phe Val Val Gly Tyr Gly Lys Asn 385 390 395 400 Pro Pro Lys His Pro His His Arg Thr Ala His Gly Ser Trp Ala A=n 405 410 415 Gln Met Asn Val Pro Glu Asn His Arg His Thr Leu Tyr Gly Ala Leu 420 425 430 Val Gly Gly Pro Gly Arg Asp Asp Ser Tyr Arg Asp Asp lie Thr Asp 435 440 445 15 Tyr Ala Ser Asn Glu Val Ala He Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Thr Gly 450 455 460 Asn Val Ala Lys Met Phe Gln Leu Phe Gly Lys Gly His Val Pro Leu 465 470 475 480 Pro Asp Phe Pro Glu Lys Glu Thr Pro Glu Asp Glu Tyr Phe Ala Glu 485 490 495 Ala Ser lie Asn Ser Ser Gly Asn Ser Tyr Thr Glu He Arg Ala Gln 500 505 510 Leu Asn Asn Arg Ser Gly Trp Pro Ala Lys Lys Thr Asp Gln Leu Ser 515 520 525 Phe Arg Tyr Tyr Val Asp Leu Thr Glu Ala Val Glu Ala Gly Tyr Ser 530 535 540 Ala Glu Asp He Lys Val Thr Ala Gly Tyr Asn Glu Gly Ala Ser Val 545 550 555 560 Ser Glu Leu Lys Pro His Asp Ala Ser Lys His He Tyr Tyr Thr Glu 25 565 570 575 ids&íií^i^ Val Ser Phe Ser Gly Val Leu He Tyr Pro Gly Gly Gln Ser Ala His 580 585 590 Lys Lys Glu Val Gln Phe Arg Leu Ser Ala Pro Asp Gly Thr Ser Phe 595 600 605 Trp Asn Pro Glu Asn Asp His Ser Tyr Gln Gly Leu Ser His Ala Leu 610 615 620 Leu Lys Thr Arg Tyr He Pro Val Tyr Asp Asp Gly Arg Leu Val Phe 625 630 635 640 Gly His Glu Pro Gly Tyr Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una enzima que exhibe la actividad de endo-ß- 1, 4-glucanasa (EC 3.2.1.4), caracterizada porque se selecciona de uno de (a) un polipéptido codificado por una secuencia de ADN de las posiciones 76 a 1455 de la SEC ID NO:l; (b) un polipéptido producido mediante el cultivo de una célula que comprende la secuencia de SEC ID NO:l bajo condiciones en donde se expresa la secuencia de ADN; (c) una enzima endo-ß-1, 4-glucanasa que tiene una secuencia de al menos 75% de identidad en las posiciones 26-485 del polipéptido de la SEC ID NO: 2 que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de las posiciones 26-485 de la SEC ID NO: 2 cuando la identidad se determina por el programa GAP proporcionada en el paquete de programas GCG utilizando una penalización por creación del GAP de 3.0 y una penalización por extensión del GAP de 0.1; y (d) un polipéptido codificado por la parte de -la secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa obtenible del plásmido en Escherj ch í a e l i DSM 12805.
2. 2. La enzima de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque pertenece a la familia 9 de las glicosil hidrolasas.
3. 3. La enzima de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque comprende un polipéptido endógeno para Bacillus licheniformis, ATCC 14580.
4. 4. La enzima de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque es activa a un pH en la gama de 4-11, preferiblemente 5.5-10.5.
5. 5. La enzima de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en las posiciones 26-646 de la SEC ID NO: 2, o (b) un análogo del polipéptido el cual es al menos 75% homólogo con el polipéptido.
6. 6. Una molécula de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido que tiene la actividad de endo-beta-1, 4-endoglucanasa, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) moléculas de polinucleótido que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID N0:1 del nucleótido 76 al nucleótido 1455; (b) especies homologas de (a) ; (c) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que es al menos 75% idéntico a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 del residuo de un aminoácido 26 al residuo de un aminoácido 485; (d) moléculas complementarias para (a) , (b) o (c) ; y (c) secuencias de nucleótidos degeneradas de (a) o (b) .
7. 7. La molécula de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) moléculas de polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en la S?C ID NO:l del nucleótido 76 al nucleótido 1941; (b) especies homologas de (a) ; (c) moléculas de polinucelótidos que codifican un polipéptido que es al menos 75% idéntico a la secuencia de aminoácidos de l a SEC ID NO: 2 del residuo de un aminoácido 26 al residuo de un aminoácido 646; (d) moléculas complementarias para (a) , (b) o (c) ; y (e) secuencias de nucleótidos degeneradas de (a) o (b) . , *^y^^^g&S
8. 8. La molécula de polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 6 o 7, caracterizada porque el polinucleótido es ADN.
9. 9. Una molécula de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido que tiene la actividad de endo-beta- 1, 4-glucanasa, caracterizada porque la molécula de polinucleótido hibridiza a una sonda de ADN de doble cadena, desnaturalizada bajo condiciones de severidad intermedia, en donde la sonda se selecciona del grupo que consiste de sondas de ADN que comprenden la secuencia mostrada en las posiciones 76-1455 de la SEC ID NO:l y sondas de ADN que comprenden una sub-secuencia de las posiciones 76-1455 de la SEC ID NO:l que tiene una longitud de al menos aproximadamente 100 pares de bases .
10. 10. La molécula de polinucleótido aislada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque es aislada de o producida en base a una librería o banco de ADN de una célula procariótica, preferiblemente de una bacteria, más preferiblemente de una bacteria gram-positiva.
11. 11. La molécula de polinucleótido aislada de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque es aislada de o producida en base a una librería o banco de ADN de una cepa que pertenece al género Bacill us, en particular una cepa de Bacillus licheniformis , especialmente Bacillus licheniformis, ATCC 14580. ^^
12. 12. La molécula de polinucleótido aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-11, caracterizada porque es aislada de Escherichia coli , DSM 12805.
13. 13. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende los siguientes elementos unidos de manera operable: un promotor de transcripción; un segmento de ADN seleccionado del grupo que consiste de (a) moléculas de polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene la actividad de endo- beta-1, 4-glucanasa que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID NO:l del nucleótido - 76 al nucleótido 1455, (b) moléculas de polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene la actividad de endo-beta- 1, 4-glucanasa que es al menos 75% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 del residuo de un aminoácido 26 al residuo de un aminoácido 485, y (c) secuencias de nucleótidos degeneradas de (a) o (b) ; y un terminador de transcripción.
14. 14. Una célula cultivada dentro de la cual se ha introducido un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN.
15. 15. La célula de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque es una célula procariótica, en particular una célula bacteriana, o una célula endógena de la eiy??. cual se origina el segmento de ADN que codifica el polipéptido que exhibe la actividad de endo-beta-1, 4-glucanasa .
16. 16. La célula de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la célula pertenece a una cepa de Bacillus, preferiblemente una cepa de Bacillus subtilis o Bacillus lentus .
17. 17. Una célula de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la célula pertenece a una cepa de Bacillus licheniformis, preferiblemente Bacillus licheniformis, ATCC 14580.
18. 18. La célula de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la célula pertenece a una cepa de Pseudomonas , preferiblemente una cepa de Pseudomonas flurescens o Pseudomonas mendocina .
19. 19. La célula de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la célula pertenece a una cepa de Streptomyces.
20. 20. Una célula de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la célula pertenece a una cepa de Saccharomyces, preferiblemente una cepa de Saccharomyces cerevisiae . .
21. 21. Un método para producir un polipéptido que tiene la actividad de endo-beta-1, 4-glucanasa, caracterizado porque comprende cultivar una célula en la cual ha sido introducido un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 13, por lo que la célula expresa un polipéptido codificado por el segmento de ADN; y recuperar el polipéptido.
22. 22. Una composición enzimática, caracterizada porque comprende la enzima de conformidad con la reivindicación 1.
23. 23. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque además comprende una o más enzimas seleccionas del grupo que consiste de las proteasas, celulasas (endoglucanasas), ß-glucanasas, hemicelulasas, lipasas, peroxidasas, lacasas, a-amilasas, glucoamilasas, cutinasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, pectato liasas, xiloglucanasas, xilanasas, pectin acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, pectin liasas, otras mananasas, pectin metilesterasas, celobiohidrolasas, transglutaminasas; o mezclas de las mismas.
24. 24. Una enzima aislada que tiene la actividad de endo-beta-1, 4-glucanasa, caracterizada porque la enzima (i) está libre de impurezas homologas y (ii) es producida por el método de conformidad con la reivindicación 21.
25. 25. Un cultivo biológico sustancialmente puro, aislado de la cepa Escherichia coli , DSM 12805.
26. 26. Un método para la degradación de la biomasa que contiene celulosa, caracterizado porque la biomasa se trata con una cantidad efectiva de la enzima de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 24 o de la composición enzimática de conformidad con la reivindicación 22 o 23.