WO2023200284A1 - 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법 - Google Patents

생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법 Download PDF

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정현진
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장재명
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Definitions

  • the present invention relates to a method for separating, purifying, concentrating, and performing mass spectrometry on proteins associated with or bound to lipids, such as those present in lipid membranes in biological samples.
  • lipids and proteins are distributed asymmetrically and biased by lipid membrane microdomains such as lipid rafts composed of cholesterol and sphingolipids.
  • amyloid precursor protein exists in cell membranes and is closely associated with lipid rafts. Because beta amyloid is surrounded by lipids derived from lipid rafts, the extraction and quantification process is complicated. In particular, during the process of removing lipids, most of the lipid membrane proteins were lost, and only pure proteins were separated, making it impossible to perform quantitative mass spectrometry on the proteins present in the lipid membrane.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for purifying and concentrating lipid-related proteins for mass spectrometry of lipid-related proteins in biological samples.
  • the present invention provides a composition for purifying and concentrating lipid-related proteins for mass spectrometry of lipid-related proteins in biological samples containing lipase as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for purifying and concentrating lipid-related proteins for mass spectrometry of lipid-related proteins in a biological sample, comprising the step of removing lipids by treating the biological sample with lipase.
  • the present invention includes the steps of 1) treating a biological sample with lipase to remove lipids; 2) dissolving the biological sample from which the lipids have been removed by adding a surfactant and urea mixed solution; 3) ultrasonically pulverizing the solution; 4) removing surfactant from the ultrasonic pulverized solution; 5) removing impurity proteins from the solution from which the surfactant has been removed; and 6) subjecting the solution from which the impurity proteins have been removed to in-solution digestion. It provides a method for purifying and concentrating lipid-related proteins for mass spectrometry of lipid-related proteins in biological samples.
  • the present invention includes the steps of 1) adding a surfactant and urea mixed solution to a biological sample and dissolving it; 2) treating the solution with lipase to remove lipids; 3) ultrasonically pulverizing the lipid-free solution; 4) removing surfactant from the ultrasonic pulverized solution; 5) removing impurity proteins from the solution from which the surfactant has been removed; and 6) subjecting the solution from which the impurity proteins have been removed to in-solution digestion. It provides a method for purifying and concentrating lipid-related proteins for mass spectrometry of lipid-related proteins in biological samples.
  • the present invention includes the steps of 1) treating a biological sample with lipase to remove lipids; 2) removing impurity proteins from the lipid-free solution; and 3) subjecting the solution from which the impurity proteins have been removed to in-solution digestion. It provides a method for purifying and concentrating lipid-related proteins for mass spectrometry of lipid-related proteins in biological samples.
  • the present invention relates to a method for purifying and concentrating lipid-related proteins for mass spectrometry of lipid-related proteins in biological samples. More specifically, the present invention relates to a method for purifying and concentrating lipid-related proteins in biological samples. This is a simple and efficient method of extracting and purifying specific proteins that exist in lipid rafts and cannot be separated. According to the present invention, membrane proteins that cannot generally be purified, such as beta amyloid, can be easily purified, and proteins that could not be analyzed due to mixed lipids can be easily concentrated and purified.
  • Figure 2 shows the results of confirming the expression levels of proteins isolated through Western blotting when synaptosomes extracted from the brains of general laboratory animals and Alzheimer's disease model laboratory animals were treated with and without lyapase.
  • Figure 3 shows the results of confirming the expression levels of proteins isolated through Western blotting when plasma extracted from the blood of general laboratory animals and Alzheimer's disease model laboratory animals was treated with and without lipase.
  • Figure 5 shows the expression levels of proteins separated according to the time of lyapase and the surfactant treated after treatment of cell lysate of cortical tissue of general laboratory animals and Alzheimer's disease model laboratory animals by Western blotting. This is a result confirmed through
  • Figure 6 shows the results of Western blotting for four types of lipase to confirm whether there was a change in protein expression due to lyapase when treated with lyapase alone without protein.
  • Figure 7 shows the number and location of proteins identified through mass spectrometry using liquid chromatography when synaptosomes extracted from the brains of general laboratory animals and Alzheimer's disease model laboratory animals were treated with and without lyapase. This is information about
  • Figure 8 shows the number and location of proteins identified through mass spectrometry using liquid chromatography when plasma extracted from the blood of general laboratory animals and Alzheimer's disease model laboratory animals was treated with and without lyapase. It's information.
  • Figure 9 shows the separation of CD9 protein when plasma extracted from the blood of general laboratory animals and Alzheimer's disease model laboratory animals was treated with lyapase without treatment with other treatment solutions used in existing proteome analysis. This is the Western blotting result including information about and enrichment.
  • Figure 10 shows the cells when extracellular vesicles of plasma extracted from the blood of genetically modified experimental animals were treated with lyapase and not treated with other treatment solutions used in conventional proteomic analysis. This is the result of Western blotting, including information on the separation and enrichment of Alix and CD63 proteins, known as markers of the external endoplasmic reticulum.
  • the composition may further include a surfactant and urea mixed solution, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for purifying and concentrating lipid-related proteins for mass spectrometry of lipid-related proteins in a biological sample, comprising the step of removing lipids by treating the biological sample with lipase.
  • the present invention includes the steps of 1) treating a biological sample with lipase to remove lipids; 2) dissolving the biological sample from which the lipids have been removed by adding a surfactant and urea mixed solution; 3) ultrasonically pulverizing the solution; 4) removing surfactant from the ultrasonic pulverized solution; 5) removing impurity proteins from the solution from which the surfactant has been removed; and 6) subjecting the solution from which the impurity proteins have been removed to in-solution digestion. It provides a method for purifying and concentrating lipid-related proteins for mass spectrometry of lipid-related proteins in biological samples.
  • the present invention includes the steps of 1) adding a surfactant and urea mixed solution to a biological sample and dissolving it; 2) treating the solution with lipase to remove lipids; 3) ultrasonically pulverizing the lipid-free solution; 4) removing surfactant from the ultrasonic pulverized solution; 5) removing impurity proteins from the solution from which the surfactant has been removed; and 6) subjecting the solution from which the impurity proteins have been removed to in-solution digestion. It provides a method for purifying and concentrating lipid-related proteins for mass spectrometry of lipid-related proteins in biological samples.
  • the present invention includes the steps of 1) treating a biological sample with lipase to remove lipids; 2) removing impurity proteins from the lipid-free solution; and 3) subjecting the solution from which the impurity proteins have been removed to in-solution digestion. It provides a method for purifying and concentrating lipid-related proteins for mass spectrometry of lipid-related proteins in biological samples.
  • 'biological sample' refers to any sample containing protein and includes viruses, microorganisms, cells, animal or plant tissues, animal or plant organs, and their body fluids.
  • samples include the brain. It can be a variety of samples such as organs and other brain fluid components, tissues, etc., and samples such as specific disease brain tissue, brain tissue with biomarkers, blood, spinal fluid, tears, or urine related to brain tissue, and the samples. It may include all endoplasmic reticulum, cell rajitates, samples grown through cell culture, or samples from the natural world.
  • the sample can be obtained using methods known in the art. In the present invention, it is preferable to use brain tissue or blood as a biological sample.
  • biological samples can be used as is or subjected to heat treatment, but are not limited thereto.
  • a buffer solution containing surfactant and urea as main ingredients can be used.
  • Surfactants used at this time include sodium dodecyl sulfate (SDS), dodecyl maltoside (DDM), Triton-X, Tween20, CHAPS, and NP-40, which are commonly used in the industry to facilitate protein separation.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • DDM dodecyl maltoside
  • Triton-X Triton-X
  • Tween20 CHAPS
  • NP-40 NP-40
  • the type of surfactant used to cleanse or remove impurities is not particularly limited, but for example, sodium dodecyl sulfate can be used.
  • SDS use 1 to 4% SDS can be used, but it cannot be used alone.
  • the mixed buffer solution requires chemicals such as urea, thiourea, and Amicon Ultra Tube that can break the bond between the surfactant and the protein.
  • the type of drug is not limited to a specific one, and as an example of the present invention, urea (UREA) can be used.
  • Urea is generally a chaotrpoic agent that plays a role in breaking non-covalent bonds, and is used in proteins and surfactants. It separates the protein and surfactant by breaking the non-covalent bonds of the complex.
  • the urea can be used in a mixed buffer solution containing 4 to 8 M of urea and a surfactant at 37 to 70°C for 1 hour, but is not limited to this.
  • a protease control agent or EDTA can be added to the mixed buffer solution for the purpose of inhibiting the action of protease contained in the sample.
  • the present invention may include a process of homogenizing a biological sample, which includes the step of decomposing lipids with a buffer solution containing lipase as a main component or dissolving the sample with a surfactant/urea mixed solution and separating the surfactant from the protein.
  • a process of homogenizing a biological sample which includes the step of decomposing lipids with a buffer solution containing lipase as a main component or dissolving the sample with a surfactant/urea mixed solution and separating the surfactant from the protein.
  • the technology for homogenizing biological samples is not particularly limited, but it is preferable to use a method of pulverizing them using an ultrasonic generator.
  • a method of passing the solution through a surfactant removal spin column can be used to remove components of the surfactant used to dissolve the sample.
  • a surfactant-removing spin column was used, but for samples with high concentration, it is preferable to use a plate based on a surfactant-removing resin.
  • the solution passes through a surfactant spin column, it can be effectively used by centrifugation or filtration.
  • the present invention may include the step of removing a large amount of proteins unnecessary for analysis and concentrating only proteins bound or associated with lipids, which may include decomposing lipids with a buffer solution containing lipase as a main component or surfactant/urea.
  • the mixed solution can be used after dissolving the sample and separating the surfactant from the protein.
  • the method for removing a large amount of protein is not particularly limited, but it is preferable to use a method using an antibody, resin, or bead that binds to a specific protein, a methanol/chloroform protein precipitation method, or a heat treatment method. do.
  • the above method of using an antibody, resin, or bead that binds to a specific protein involves treating and removing antibodies, resin, or beads that can bind to a large amount of protein present in the sample - serum, album in plasma, or IgG. It's a method. This is a technology that removes a large amount of protein, leaving only an appropriate amount or a small amount of protein, thereby reducing the range of protein in the sample to a range where an appropriate amount or small amount of protein can be measured.
  • the methanol/chloroform protein precipitation method is a method of precipitating only proteins among various components in a sample. It is preferable to use the precipitated protein by dissolving it in 50mM triethylammonium solution.
  • an experiment is performed to denature plasma proteins by heat treatment in the solution and separate and purify them. After heat treatment at a temperature of 60 to 70°C for 30 to 120 minutes, preferably 30 to 60 minutes, cooled on ice and separated through centrifugation or filtration, the supernatant is separated to remove a large amount of high molecular weight plasma protein impurities. Remove. Alternatively, heat treatment may be performed at 70 to 100°C for 1 to 10 minutes.
  • the mass of the peptide obtained by decomposing the protein bound to or associated with the lipid collected through the above process with protease can be measured using a mass measuring device. It is preferable to use a mass spectrometer as the mass measurement device.
  • This mass spectrometry method uses a liquid chromatography-based mass spectrometry method, but is not limited thereto.
  • proteins are decomposed into peptides using protease. This step uses the commonly known, in-solution digestion process.
  • Protease is an enzyme that recognizes amino acid sequences and cleaves specific sites.
  • the sequence of the peptide that can be obtained is estimated, and the mass of this peptide can be secured by calculating it with reference to the mass of the amino acid since the mass of the amino acid is known. From the mass of the peptide derived from a known specific protein obtained in this way, select the peptide with a mass that matches or is most similar to the mass of the measured peptide and confirm which cell, tissue, organism, etc. protein the peptide with that mass is derived from. I can identify my protein.
  • the present invention simplifies the separation and detection method of lipid-related proteins in biological samples by adjusting the lipase treatment time, concentration, and reaction conditions (temperature, pH, etc.) and can be applied to methods such as analysis and diagnosis.
  • biological samples including plasma, tissue, cells, cerebrospinal fluid, tears, urine, etc., including samples stored after pretreatment and real-time biopsy samples
  • lipase By directly treating biological samples (including plasma, tissue, cells, cerebrospinal fluid, tears, urine, etc., including samples stored after pretreatment and real-time biopsy samples) with lipase, differences in lipid-related substances in the samples can be distinguished. Therefore, it can be used for quantitative and qualitative analysis of lipid-related targeting proteins, transcripts, and lipids in biological samples, and can be used for diagnosis and reagents. Examples include Western blot, qPCR, Simoa, Lateral flow kit, etc.
  • the lipid-related protein may be beta-amyloid (A ⁇ ), Lamp1, LC3, Shank2, Neurogranin, CD9, CD63, or Alix, but is not limited thereto.
  • the hippocampal tissue of the animal was removed and immersed in HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) at 1 ⁇ 4°C.
  • the hippocampal tissue was transferred to a 300 ⁇ l solution of EDTA-free protease (HaltTM Protease Inhibitor Cocktail (100X), 87786, Thermo) mixed with Syn-PERTM Synaptic Protein Extraction Reagent (87793, Thermo Scientific) just before the experiment.
  • the solution was homogenized on ice using an ultrasonic homogenizer, and then centrifuged at 1,200 g for 20 minutes at 4°C using a centrifuge (5430R, Eppendorf), and only the supernatant was used. The supernatant was transferred to a separate 1.5 mL e-tube and centrifuged at 15,000 g for 20 minutes at 4°C, and the supernatant was discarded. 200 ⁇ l Syn-PERTM Synaptic Protein Extraction Reagent was dissolved in the remaining sediment.
  • methanol 400 ⁇ l of methanol (Methanol, S452-4, Fisher) was added to 100 ⁇ l of the treated sample solution and mixed well using a vortex. Again, 100 ⁇ l of chloroform (Chloroform, 319988, Sigma Aldrich) was added and mixed using a vortex. Next, 300 ⁇ l of ultrapure water solution was added and mixed in the same manner as before. The supernatant was removed by centrifuging at 14,000g for 5 minutes using a centrifuge. 400 ⁇ l methanol was added to the remaining solution and mixed using votex. After centrifugation at 14,000g for 5 minutes to remove as much methanol in the supernatant as possible, 50mM triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB; 90114, Thermo) was added to dissolve it.
  • TEAB triethylammonium bicarbonate buffer
  • the amount of protein in the solution containing the extracted sample was measured using the Pierce BCA Protein Assay Kit (23225, Thermo ScientificTM).
  • BSA was prepared in a volume of 0.1 mL at a concentration of 25 ⁇ g/mL using a stepwise dilution method.
  • the solution to be measured was also appropriately diluted or used as is to prepare 0.1 mL.
  • 200 ⁇ l of reagent was added to 20 ⁇ l of the standard or measurement target solution and mixed well.
  • the mixed solutions were reacted at 37°C for 30 minutes and cooled to room temperature. Measurements were made on a spectrometer (FlexStation3, Molecular Devices) set to 562 nm. After subtracting the measured value of the blank standard solution from the measured value, an expected concentration curve was drawn.
  • the amount of protein in the sample was estimated by comparing the curve and the measured value of the sample.
  • mM sodium chloride NaCl, S3014, Sigma-Aldrich
  • 1mM EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid, 15575-038, Invitrogen
  • 1mM PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride, 93482, Sigma-Aldrich
  • EDTA-free protease HaltTM Protease Inhibitor Cocktail (100X)
  • 87786 Thermo
  • the solution was briefly mixed using a vortex, and then ultrasonic pulverized in an ultrasonic generator (Bioruptor® Pico, Diagenode) using the settings below.
  • Pierce Detergent Removal Spin Columns (87777, Thermo ScientificTM) were used to remove the surfactant from the solution.
  • 0.5 mL spin columns were placed in a centrifuge tube and centrifuged at 1,500 g for 1 minute to remove the storage buffer solution in the column.
  • 0.4 mL of wash/equilibration buffer (40mM ammonium bicarbonate; A6141, Sigma-Aldrich) was added, centrifuged at 1,500g for 1 minute, and the solution collected in the tube was discarded. This process was performed a total of 3 times. 100 ⁇ l of the solution was added to the column and left at room temperature for 2 minutes. Then, the solution was centrifuged at 1,500g for 2 minutes in a centrifuge to remove the surfactant collected in the centrifuge tube.
  • the prepared gel was placed in an electrophoresis device, and electrophoresis buffer solution (Tris/Tricine/SDS Running Buffer 1610744, Bio-Rad) was poured through the buffer solution.
  • electrophoresis buffer solution Tris/Tricine/SDS Running Buffer 1610744, Bio-Rad
  • the sample was placed in the groove of the gel, and the same amount of gel loading buffer solution as the sample was added to the unused groove.
  • the electric field of the gel was applied to 80 V/m for 10 minutes, and when bromophenol blue reached the resolving gel, the voltage was raised to 100 V/m and electrophoresis was performed until bromophenol blue reached the end of the resolving gel (approximately 1 hour).
  • PVDF Polyvinylidene difluoride transfer membrane (IPVH00010, Millipore) cut to an appropriate size was soaked in methanol for about 5 minutes and equilibrated with the transfer buffer solution. Then, the cassette for Western blot was placed into the solution containing the transfer buffer solution and the equilibrated membrane was placed on the gel. It was placed together with filter paper and sponge. After attaching the fixation device to the cassette, it was transferred to the blotting chamber, the transcription buffer solution was added, the electrode was installed so that the membrane side was the anode and the gel side was the cathode, and transcription was performed at 300 mA for 80 minutes.
  • IPVH00010 Polyvinylidene difluoride transfer membrane
  • the membrane onto which the antigen (protein) has been transcribed is soaked in phosphorylated wash buffer solution (PBST, Phosphated-buffered saline with Tween-20) containing 5% skim milk, shaken, and left at room temperature for 1 hour. The portion of the membrane to which no protein was bound was blocked. After blocking treatment, it was washed three times with washing buffer (PBST).
  • PBST phosphorylated wash buffer solution
  • washing buffer removes antigen-specific primary antibodies diluted 1:1,000 in washing buffer (PBST) containing 5% BSA at an appropriate concentration, enough to fully submerge the transfer membrane, and process for more than 8 hours at 37°C. did.
  • PBST washing buffer solution
  • the transfer membrane was washed three times for 10 minutes each with the washing buffer solution.
  • Enzyme-labeled secondary antibodies diluted 1:5,000 in wash buffer (PBST) were reacted at room temperature for 1 hour. After removing the secondary antibody dilution buffer, the transfer membrane was washed three times with washing buffer (PBST) solution.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • blood was drawn from the heart and transferred to a vacuum blood collection tube coated with EDTA.
  • the collected blood was centrifuged at 400g, 18-20°C for 10 minutes using a centrifuge, and the supernatant was used. It was placed in a centrifuge again and centrifuged at 2000g, 18-20°C for 10 minutes, and the supernatant was removed and used for analysis.
  • Cerebral cortex tissue from general laboratory animals was removed and analyzed.
  • the analysis process is the same as Examples 1 to 8.
  • the concentration of lipase was treated at 0.2, 0.4, and 2 unit / ⁇ g.
  • Cerebral cortex tissue from general laboratory animals was removed and analyzed.
  • the analysis process is the same as Examples 1 to 8.
  • the concentration of lipase was 2 units/ ⁇ g, and the treatments were performed for 10 minutes, 30 minutes, and 60 minutes.
  • Lipase (Lipase from porcine pancreas type VI-S, L0382) was dissolved in buffer solution at a concentration of 5 units/ ⁇ l. 10 ⁇ l of the dissolved lipase, 5 ⁇ l of 4X Laemmli sample buffer (1610747, Bio-rad), and 2 ⁇ l of ultrapure water were added and boiled at 100°C.
  • the already prepared gel was placed in an electrophoresis device and electrophoresis buffer solution was poured into it.
  • the sample was placed in the groove of the gel, and the same volume of gel loading buffer solution as the sample was added to the unused groove.
  • the electric field of the gel was applied to 80 V/m for 10 minutes, and when bromophenol blue reached the resolving gel, the voltage was raised to 100 V/m and electrophoresis was performed until bromophenol blue reached the end of the resolving gel (approximately 1 hour).
  • the gel was taken out, placed on a tray, an appropriate amount of Comassie blue staining solution (LC6060, Invitrogen) was poured into it, and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction was completed, the stained protein was confirmed after being washed several times with ultrapure water.
  • Comassie blue staining solution LC6060, Invitrogen
  • mice After euthanizing general laboratory animals (mice, C57BL/6, Korea Brain Research Institute, 33-35 weeks of age) or Alzheimer's disease model laboratory animals (mice, C57BL/6;Tg6799, Korea Brain Research Institute, 33-35 weeks of age), the experiment was performed. The animal's cerebral cortex tissue was removed.
  • Trypsin Protease (90058, Pierce, USA) was added to each sample at 2 ⁇ l and reacted at 37°C for one day. After pretreatment was completed, the sample was evaporated using a high-speed vacuum concentrator (SpeedVac; SPD1010, Thermo, USA), and then the protein/peptide present in the sample was desalted using C18 Spin Tips (87784, Pierce, USA). desalting) was performed.
  • the re-extracted sample was evaporated using a high-speed vacuum concentrator and then re-dissolved in 0.1% formic acid.
  • the tryptic digest of each sample was analyzed using a liquid chromatography mass spectrometer (Ulimate 300 / Q Exactive plus, Thermo, USA) coupled with a nano-electrospray ion source. Peptides were loaded from the RS auto-sampler through a Trap column (Acclaim TM PepMap TM 100 C18 HPLC column, 164535, Thermo) onto an analytical column (EASY-Spray TM HPLC column, ES903, Thermo), and 0.1% formic acid and 0.1% formic acid were added.
  • Separation was performed using an aqueous acetonitrile solution containing a linear gradient at a flow rate of 300 nl/min.
  • the LC eluent was electrosprayed from the analytical column and a voltage of 2.0 kV was applied through the liquid contact of the nanospray source.
  • the peptide mixture was separated using acetonitrile with a concentration gradient of 10% to 50% over 80 minutes.
  • the method consisted of a full MS scan ranging from 350 to 2000 m/z, and data-dependent MS/MS (MS2) on the 10 most intense ions from the full MS scan.
  • MS2 data-dependent MS/MS
  • the mass spectrometer was programmed to capture in data dependent mode. Basic calibration of the mass spectrometer instrument was performed with the suggested calibration solution according to the manufacturer's instructions.
  • the generated data were analyzed with Proteome Discoverer v2.4 (Thermo, USA).
  • the spectral data was searched against the mouse Uniprot database (release 2021_03).
  • the analysis flow used at this time consists of four nodes: Spectrum Files (data input), Spectrum Selector (spectrum and feature retrieval), Sequest HT (sequence database search), and Percolator (peptide spectral match or PSM Validation and FDR analysis). ) was included. All identified proteins had a false discovery rate (FDR) of ⁇ 1% calculated at the peptide level. Evaluation was based on q-value.
  • Search parameters included methionine oxidation as dynamic modification and methylthio-modification of cysteine as fixed modification, as well as tryptic specificity up to a maximum value of 2 for the number of missed cleavages. .
  • Mass search parameters for +1, +2, and +3 ions included mass error tolerances of 10 ppm for precursor ions and 0.2 Da for fragment ions.
  • Example of extracting plasma from general laboratory animals mice, C57BL/6, Korea Brain Research Institute, 33-35 weeks of age
  • Alzheimer's disease model laboratory animals mice, C57BL/6;Tg6799, Korea Brain Research Institute, 33-35 weeks of age
  • the extracted plasma was treated with lipase, and liquid chromatography mass spectrometry and data analysis were the same as in Example 6.
  • the method for quantifying protein in the extracted sample is the same as step 3 (protein quantification) in Example 1.
  • the method of treating extracted plasma proteins with lipase was the same as in Example 5, but lipase was dissolved in a buffer solution at a concentration of 1 and 3 units/ ⁇ l.
  • step 1 sample extraction
  • step 3 protein quantification
  • the extracted plasma protein was quantified to be 80 ⁇ g
  • extracellular vesicles (EV) were extracted from the quantified plasma using ExoQuick (EXOQ20A-1, System Biosciences, LLC, USA).
  • EXOQ20A-1 Extracellular vesicles
  • the method of treating the extracted EV with lipase was the same as in Example 5, but the lipase concentration was 1 and 3 units / ⁇ g, and the treatment was performed for 1 hour and 30 minutes, respectively.
  • Subsequent Western blotting for Alix and CD9 was the same as Example 5.
  • Example 5 To compare different lipases, 50mM TEAB was used as a control group, and 3 types of lipase were used as a comparison group (Lipase from porcine pancreas type II, L3126, Sigma-aldrich/ Lipase from Aspergillus oryzae, L0777, Sigma-aldrich/ Lipase from Candida sp., L3170, Sigma-aldrich) was used in the same volume.
  • 3 types of lipase Lipase from porcine pancreas type II, L3126, Sigma-aldrich/ Lipase from Aspergillus oryzae, L0777, Sigma-aldrich/ Lipase from Candida sp., L3170, Sigma-aldrich
  • Example 8 The same process as in Example 8 was performed on the same animal model as in Example 8. For comparison of experiments, the same experiment was performed for each animal model without lipase.
  • Example 9 The same process as in Example 9 was performed on the same animal model as in Example 9. For comparison of experiments, the same experiment was performed for each animal model without lipase.
  • Example 1 The primary antibodies used in Western blotting to analyze the results of Example 1 and Comparative Example 1 are as follows.
  • a ⁇ is generally in an aggregated form, and it is known that some of it is bound to lipids such as cholesterol.
  • Lamp1 is a lysosome biomarker and exists in lipid accumulation form.
  • LC3 a marker of autophagosomes, also exists in a lipid-bound form.
  • Shank2 is a protein that plays a scaffolding role in post-sypnaptic neurons, and is known to exist together with ⁇ PKC in tight junctions, so it was predicted to be closely related to lipids.
  • Example 2 The primary antibodies used in Example 2 and Comparative Example 2 are as follows.
  • a ⁇ (D54D2) ( ⁇ -Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb, 8243s, Cell Signaling)
  • the secondary antibody commonly used was Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP (31460, Invitrogen).
  • Neurogranin and A ⁇ are known as biomarkers for Alzheimer's disease and early cognitive impairment in cerebrospinal fluid and blood exosomes.
  • Neurogranin is a post-synaptic protein, a calmodulin-binding protein, and is mainly located in the dendritic spine in the brain. In particular, it is a protein that binds to phosphatidic acid and is associated with cell membranes.
  • the ⁇ -Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb used in Example 1 and Comparative Example 1 is an antibody that binds mainly to human-derived A ⁇ -42, A ⁇ -40, A ⁇ -39, A ⁇ -38, and A ⁇ -37 peptides. am. These A ⁇ peptides are aggregated to have a ⁇ sheet structure, and some of them are known to be bound to cholestreol and various lipids.
  • Example 3 The experiment of Example 3 was conducted to confirm the concentration of lipase that can effectively separate and concentrate proteins associated with lipids through lipase.
  • the primary antibodies used in Example 3 and Comparative Example 3 are as follows.
  • the secondary antibody used was Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP (31460, Invitrogen).
  • Example 4 The experiment of Example 4 was conducted to confirm the appropriate lipase treatment time to effectively separate and concentrate proteins associated with lipids through lipase (FIG. 5).
  • Example 3 The primary and secondary antibodies used in Example 3 and Comparative Example 3 were the same as those in Experimental Example 3.
  • Lipase is an enzyme made up of proteins. Therefore, when performing mass analysis using methods such as mass spectrometry, lipase itself can create peaks with arifacts, which becomes a factor that interferes with the analysis.
  • Example 5 in order to check whether the lipase presented in the present invention produces proteins that may interfere with the analysis, the lipase was treated as in Example 5 without a sample. After protein electrophoresis, residual protein was detected through Comassie blue staining. The results of Example 5 assert that the lipase presented in our invention does not retain protein derived from the lipase during analysis. However, the Comassie blue staining results for the three lipases in Comparative Example 5 confirmed that they remained in the protein during lipase treatment.
  • Example 7 The method of analyzing data from Example 7 is the same as Experimental Example 6.
  • plasma extracted from general laboratory animals was not treated with lipase, there were 478 species, and when lipase was treated, there were 340 species.
  • 108 (14%) proteins were newly discovered in plasma through lipase.
  • plasma extracted from Alzheimer's disease animals when not treated with lipase, there were 512 types of proteins, and when treated with lipase, there were 342 types of proteins identified.
  • 102 (14%) proteins were newly discovered in plasma through lipase.
  • Example 8 To confirm whether it is possible to separate and concentrate lipid-related proteins in biological samples by directly treating the sample with lipase without adding other treatment solutions such as methanol/chloroform or urea/surfactant used in protein analysis methods, Example 8 and was analyzed as in Comparative Example 6.
  • CD9 protein an extracellular endoplasmic reticulum marker and known as a diagnostic marker for Alzheimer's disease, is generally known to be significantly increased in endoplasmic reticulum derived from Alzheimer's disease brains. Our results also showed that it was increased in the plasma of animal models of Alzheimer's disease.
  • Alix and CD63 proteins which are one of the representative lipid-related proteins and known as extracellular endoplasmic reticulum marker proteins, can be separated and concentrated by directly treating the sample with lipase without treating other samples.
  • Extracellular vesicles were isolated from plasma derived from genetically modified mice, and the amounts of proteins in the isolated vesicles were compared.
  • Alix protein when lipase was directly treated with 1 unit / ⁇ g of lipase for 1 hour without the addition of other treatment solutions previously used for proteomic analysis, it was significantly separated and concentrated compared to when lipase was not treated ( Figure 10).
  • CD63 protein when 3 units/ ⁇ g of lipase was directly treated with the sample for 1 hour, it was separated and concentrated more significantly than when lipase was not treated.
  • lipase treatment is an effective method for separating and identifying new proteins associated with or associated with lipids.
  • the separation and detection method of lipid-related proteins in biological samples can be simplified by adjusting lipase treatment time, concentration, and reaction conditions (temperature, pH, etc.) and applied to methods such as analysis and diagnosis.
  • these results mean that it can be used for quantitative and qualitative analysis of lipid-related targeting proteins, transcripts, and lipids in biological samples.
  • diagnosis, reagents, etc. Examples include Western blot, qPCR, Simoa, Lateral flow kit, etc.

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Abstract

본 발명은 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 뇌조직, 혈액과 같은 검체로부터 추출한 생체 시료에 지질분해효소와 계면활성제를 처리하여, 지질 라프트에 존재하여 분리되지 않는 특정 단백질을 간단하고 효율적으로 추출하고 정제하는 방법이다. 본 발명에 따르면, 베타 아밀로이드와 같이 일반적으로 정제할 수 없었던 막단백질을 간단하게 정제할 수 있고, 지질이 혼재되어 있어서 분석하지 못했던 단백질을 손쉽게 농축 및 정제할 수 있다.

Description

생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법
본 발명은 생체 시료 내 지질막에 존재하는 등 지질과 연관되거나 지질에 결합되어 있는 단백질을 분리 정제하여 농축하여 질량 분석을 할 수 있는 방법에 관한 것이다.
지질막은 콜레스테롤과 스핑고리피드로 구성된 지질 라프트와 같은 지질막 마이크로 도메인에 의해 지질과 단백질이 비대칭적으로 편향되게 분포되어 있다. 특히, 아밀로이드 전구체 단백질은 세포막에 존재하며, 지질 라프트와 밀접하게 연관되어 있다. 베타 아밀로이드는 지질 라프트로부터 유래한 지질에 둘러쌓여 있기 때문에, 추출 및 정량 과정이 복잡하다. 특히, 지질을 제거하는 과정에서 지질막 단백질은 대부분 손실되고, 순수 단백질만 분리되어 지질막에 존재하는 단백질에 대한 정량적 질량 분석을 할 수 없었다. 마찬가지로 지질막 마이크로 도메인에 조직되어 있는 대부분의 단백질 또한, 계명활성제 처리 과정에서 사라지거나, 그 상호작용 성질을 잃어서 분석될 수 있는 단백질의 양이 부족하였다. 또한, 계면활성제를 사용하여 지질을 분리하는 경우, 지질-지질 상호작용 또는 지질-단백질 상호작용이 파괴된 채로 분리가 되기 때문에 손쉽게 분석할 수 없다. 그래서 이온 강도가 낮은 계면활성제를 사용하지만, 계면활성제를 제거하는 과정이 필요하다. 계면활성제를 시료에서 제거하지 않으면, 단백질 분석에 활용할 수 없기 때문이다. 뿐만 아니라, 수크로스(sucrose)를 이용해 원심 분리할 경우, 160,000g 이상에서 4℃, 18시간 동안 수행하기 때문에 고성능 장비와 시간이 필요하다. 이에, 상기와 같은 단점을 극복하면서도, 생체 시료에서 지질 연관 단백질을 효율적으로 정제하고 농축할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리파아제를 유효성분으로 포함하는 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계를 포함하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계; 2) 상기 지질이 제거된 생체 시료에 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 첨가하여 용해하는 단계; 3) 상기 용해액을 초음파 분쇄하는 단계; 4) 상기 초음파 분쇄된 용액에서 계면활성제를 제거하는 단계; 5) 상기 계면활성제가 제거된 용액에서 불순물 단백질을 제거하는 단계; 및 6) 상기 불순물 단백질이 제거된 용액을 용액 내 절단(In-solution digestion) 처리하는 단계를 포함하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 생체 시료에 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 첨가하여 용해하는 단계; 2) 상기 용해액에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계; 3) 상기 지질이 제거된 용해액을 초음파 분쇄하는 단계; 4) 상기 초음파 분쇄된 용액에서 계면활성제를 제거하는 단계; 5) 상기 계면활성제가 제거된 용액에서 불순물 단백질을 제거하는 단계; 및 6) 상기 불순물 단백질이 제거된 용액을 용액 내 절단(In-solution digestion) 처리하는 단계를 포함하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계; 2) 상기 지질이 제거된 용액에서 불순물 단백질을 제거하는 단계; 및 3) 상기 불순물 단백질이 제거된 용액을 용액 내 절단(In-solution digestion) 처리하는 단계를 포함하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법을 제공한다.
본 발명은 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 뇌조직, 혈액과 같은 검체로부터 추출한 생체 시료에 지질분해효소와 계면활성제를 처리하여, 지질 라프트에 존재하여 분리되지 않는 특정 단백질을 간단하고 효율적으로 추출하고 정제하는 방법이다. 본 발명에 따르면, 베타 아밀로이드와 같이 일반적으로 정제할 수 없었던 막단백질을 간단하게 정제할 수 있고, 지질이 혼재되어 있어서 분석하지 못했던 단백질을 손쉽게 농축 및 정제할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 제시하는 방법의 개념도이다.
도 2는 일반 실험동물과 알츠하이머 질환 모델 실험동물의 뇌에서 추출한 시냅토좀에 대해서 리아파제를 처리했을 경우와 처리하지 않았을 경우, 웨스턴 블로팅을 통해 분리된 단백질의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 일반 실험동물과 알츠하이머 질환 모델 실험동물의 혈액에서 추출한 혈장에 대해서 리파아제를 처리했을 경우와 처리하지 않았을 경우, 웨스턴 블로팅을 통해 분리된 단백질의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 4는 일반 실험동물과 알츠하이머 질환 모델 실험동물의 피질조직의 세포 lysate에 대해서 리아파제를 처리할 때, 리아파제의 농도와 이후 처리한 계면활성제에 따라 분리된 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블로팅을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 일반 실험동물과 알츠하이머 질환 모델 실험동물의 피질조직의 세포 lysate에 대해서 리아파제를 처리할 때, 리아파제의 시간과 이후 처리한 계면활성제에 따라 분리된 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블로팅을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 단백질이 없이 리아파제만 처리했을 때, 리아파제로 인한 단백질 발현 변화가 있는지 확인하기 위해서 리파아제 4종에 대해서 웨스턴 블로팅을 한 결과이다.
도 7은 일반 실험동물과 알츠하이머 질환 모델 실험동물의 뇌에서 추출한 시냅토좀에 대해서 리아파제를 처리했을 경우와 처리하지 않았을 경우, 액체 크로마토그래피를 통한 질량 분석을 통해 동정되는 단백질의 개수와 그 위치에 대한 정보이다.
도 8은 일반 실험동물과 알츠하이머 질환 모델 실험동물의 혈액에서 추출한 혈장에 대해서 리아파제를 처리했을 경우와 처리하지 않았을 경우, 액체 크로마토그래피를 통한 질량 분석을 통해 동정되는 단백질의 개수와 그 위치에 대한 정보이다.
도 9는 일반 실험동물과 알츠하이머 질환 모델 실험동물의 혈액에서 추출한 혈장에 대해서 기존의 단백체 분석에 사용되었었던 다른 처리용액을 처리하지 않고, 리아파제를 처리했을 경우와 처리하지 않았을 경우 CD9 단백질의 분리와 농축에 대해 정보를 포함한 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 10은 유전자 변형 실험동물의 혈액에서 추출한 혈장의 세포외 소포체(Extracellular vesicle)에 대해서 기존의 단백체 분석에 사용되었었던 다른 처리용액을 처리하지 않고, 리아파제를 처리했을 경우와 처리하지 않았을 경우 세포외 소포체의 표지자로 알려진 Alix와 CD63 단백질의 분리와 농축에 대해 정보를 포함한 웨스턴 블로팅 결과이다.
본 발명은 리파아제를 유효성분으로 포함하는 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계를 포함하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계; 2) 상기 지질이 제거된 생체 시료에 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 첨가하여 용해하는 단계; 3) 상기 용해액을 초음파 분쇄하는 단계; 4) 상기 초음파 분쇄된 용액에서 계면활성제를 제거하는 단계; 5) 상기 계면활성제가 제거된 용액에서 불순물 단백질을 제거하는 단계; 및 6) 상기 불순물 단백질이 제거된 용액을 용액 내 절단(In-solution digestion) 처리하는 단계를 포함하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 생체 시료에 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 첨가하여 용해하는 단계; 2) 상기 용해액에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계; 3) 상기 지질이 제거된 용해액을 초음파 분쇄하는 단계; 4) 상기 초음파 분쇄된 용액에서 계면활성제를 제거하는 단계; 5) 상기 계면활성제가 제거된 용액에서 불순물 단백질을 제거하는 단계; 및 6) 상기 불순물 단백질이 제거된 용액을 용액 내 절단(In-solution digestion) 처리하는 단계를 포함하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계; 2) 상기 지질이 제거된 용액에서 불순물 단백질을 제거하는 단계; 및 3) 상기 불순물 단백질이 제거된 용액을 용액 내 절단(In-solution digestion) 처리하는 단계를 포함하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법을 제공한다.
본 발명에서 ‘생체 시료’는 단백질이 함유된 모든 시료를 말하는 것으로 바이러스, 미생물, 세포, 동물 또는 식물의 조직, 동물 또는 식물의 기관, 이들의 체액 등이 포함되며, 이러한 시료의 일례로, 뇌와 같은 기관과 그 외 뇌의 체액성분, 조직 등과 같이 다양한 샘플이 될 수 있으며, 특정 질병 뇌조직, 바이오마커를 지닌 뇌조직, 뇌조직과 연관된 혈액, 척수액, 눈물 또는 소변 등의 시료와 그 시료로부터 나오는 소포체, 세포 라지에트, 세포배양을 통해 증식된 시료 또는 자연계의 시료를 모두 포함하는 것일 수 있다. 상기 시료는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 본 발명에서는 생체 시료로 뇌조직 또는 혈액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 생체 시료 내 지질과 결합 또는 연관되어 있는 단백질에서 지질만을 제거하기 위해 지질의 분해를 돕는 리파아제가 주요 성분으로 포함된 용액을 사용한다. 리파아제는 여러 종류의 리파아제를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 췌장 유래 고순도 리파아제를 사용한다. 리파아제의 농도는 0.1 ~ 5 U/μg 이고, 처리 온도가 10 ~ 50℃, 처리시키는 시간이 60분 이내인 게 바람직하나, 이에 한정되는 것이 아니다. 리아파제를 처리한 이후에는 72℃에서 30분 이상 실시하여 리파아제의 활성을 중지시킨다.
본 발명에서 생체 시료는 그대로 사용할 수 있고, 열처리를 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 생체 시료를 용해시키기 위해, 계면활성제와 우레아가 주요성분으로 혼합된 완충용액을 사용할 수 있다. 이때 사용하는 계면활성제로 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS), 도데실말토사이드(dodecyl maltoside, DDM), Triton-X, Tween20, CHAPS, NP-40 등 당업계에서 통상적으로 단백질 분리를 용이하게 하거나 불순물을 제거하기 위해 사용되는 것으로 계면활성제의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니나, 일례로, 도데실 황산 나트륨을 사용할 수 있다. SDS 사용의 일례로, 1 ~ 4% SDS를 사용할 수 있으나, 단독으로 사용할 수 없다. 상기 혼합 완충 용액에 계면활성제와 단백질의 결합을 끊어줄 수 있는 우레아, thiourea, 아미콘 울트라 튜브와 같은 약품이 필요하다. 약품의 종류는 특정한 것으로 한정된 것은 아니며, 본 발명의 일례로, 우레아 (UREA)를 사용할 수 있으며, 우레아는 일반적으로 비공유 결합을 끊어주는 역할을 하는 키오트록픽제(Chaotrpoic agent)로 단백질과 계면활성제의 복합체의 비공유 결합을 끊어주어 단백질과 계면활성제를 분리한다. 상기 우레아는, 보다 바람직하게, 4 ~ 8M의 우레아와 계면활성제가 포함된 혼합 완충용액을 37 ~ 70℃에서 1시간 동안 사용할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 혼합 완충용액에는 시료에 포함되어 있는 프로테아제의 작용을 억제시키는 목적으로 프로테아제 제어제 혹은 EDTA를 첨가할 수 있다.
본 발명에서는 생체 시료를 균질화 하는 과정을 포함할 수 있으며, 이는 리파아제를 주요성분으로 하는 완충 용액으로 지질을 분해하는 단계 또는 계면활성제/우레아 혼합 용액으로 시료를 용해하고 단백질로부터 계면활성제를 분리하는 단계 전 또는 후에 사용할 수 있다. 본 발명에서 생체 시료를 균질화하는 기술은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 초음파 발생기를 이용해 분쇄하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 상기 시료의 용해에 사용된 계면활성제의 성분을 제거하기 위해 상기 용액을 계면활성제 제거 스핀 컬럼에 통과시키는 방법을 사용할 수 있다. 일례로, 계면활성제 제거 스핀 컬럼을 사용하였으나, 농도가 높은 시료의 경우, 계면활성제 제거 레진을 기반으로 하는 플레이트를 사용하는 것이 바람직하다. 계면활성제 스핀 컬럼을 상기 용액이 통과할 때, 원심 분리 또는 여과를 실시하여 효과적으로 사용할 수 있다.
본 발명에서는 분석에 불필요한 다량의 단백질을 제거하고 지질과 결합되거나 연관되어 있는 단백질만을 농축시키는 단계를 포함할 수 있으며, 이는 리파아제를 주요성분으로 하는 완충 용액으로 지질을 분해하는 단계 또는 계면활성제/우레아 혼합 용액으로 시료를 용해하고 단백질로부터 계면활성제를 분리하는 단계 후에 사용할 수 있다.
본 발명에서, 다량의 단백질을 제거하는 방법으로 특별히 제한되는 것은 아니지만, 특정 단백질과 결합하는 항체, 레진 또는, 비드를 이용하는 방법과 메탄올/클로로포름 단백질 침전법, 가열처리를 이용한 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
상기, 특정 단백질과 결합하는 항체, 레진 또는, 비드를 이용하는 방법은 시료 내에 다량으로 존재하는 다량의 단백질 - serum, 혈장내의 album, IgG에 항체 결합할 수 있는 항체, 레진, 또는 비드를 처리해 제거하는 방법이다. 다량의 단백질을 제거하여 적당량 또는 소량의 단백질만 남게하여 시료내 단백질 범위가 적당량 또는 소량의 단백질이 측정 가능한 범위로 줄이게 하는 기술이다.
상기, 메탄올/클로로포름 단백질 침전법은 시료 내 다양한 구성 성분 중에서 단백질만 침전시키는 방법이다. 침전된 단백질은 50mM 트리에틸암모늄 용액으로 용해시켜 사용하는 것이 바람직하다.
추가로 혈장과 같은 시료를 분석하는 경우 상기 용액에 가열처리를 통하여 혈장단백질을 변성시켜 분리정제하는 실험을 수행한다. 온도는 60 ~ 70℃ 정도에서 30 ~ 120분, 바람하게는 30 ~ 60분간 가열처리를 한 후, ice 냉각하여 원심분리법 또는 여과법을 통해 분리하고 상층액을 분리하여 다량의 고분자량 혈장 단백질 불순물을 제거한다. 또는, 70 ~ 100℃에서 1 ~ 10분 동안 가열처리할 수도 있다.
본 발명은 상기 과정을 처리해 수집한 지질과 결합하거나 연관된 단백질을 프로테아제로 분해하여 수득한 펩타이드에 대한 질량을 질량 측정 장치로 측정할 수 있다. 상기 질량 측정 장치로는 질량 분석기를 사용하는 것이 바람직하다. 본 질량의 질량 분석 방식으로 액체 크로마토그래피 기반 질량 분석 방식을 사용하나, 이에 제한하지 않는다. 상기 질량 분석기를 이용하기 위해서 프로테아제를 사용하여 단백질을 펩타이드로 분해한다. 이 단계에서는 일반적으로 알려진, In-solution digestion 과정을 사용한다. 프로테아제는 아미노산 서열을 인식하여 특정 부위를 절단하는 효소이다. 따라서 특정한 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 지정된 프로테아제로 처리할 경우 수득할 수 있는 펩타이드의 서열이 추정되고, 이 펩타이드의 질량은 아미노산의 질량이 공지되어 있으므로 이를 참조로 하여 계산함으로써 확보할 수 있다. 이렇게 확보한 공지된 특정 단백질 유래 펩타이드 질량으로부터 측정된 펩타이드의 질량과 일치하거나 가장 유사한 질량을 갖는 펩타이드를 선별하여 그 질량을 갖는 펩타이드가 어떤 세포, 조직, 생물 등의 단백질로부터 유래된 것인지 확인함으로써 시료 내 단백질을 동정할 수 있다.
본 발명은 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 분리 및 검출 방법을 리파아제 처리 시간, 농도, 반응 조건 (온도, pH 등)을 조절함으로써 간소화하고 분석, 진단 등의 방법에 응용할 수 있다. 생체시료 (플라즈마, 조직, 세포, 뇌척수액, 눈물, 소변 등을 포함하며 전처리 후 보관된 시료와 실시간 생검 시료를 포함함)에 직접 리파아제를 처리하여 시료내 지질 연관 물질의 차이를 구분할 수 있다. 따라서, 생체 시료 내 지질 연관 표적하는 단백질 및 전사체, 지질체의 정량 및 정성 분석에 사용하여 진단, 시약 등에 사용할 수 있고 그 예는 Western blot, qPCR, Simoa, Lateral flow kit 등을 포함한다.
본 발명에서, 상기 지질 연관 단백질은 베타 아밀로이드(beta-amyloid; Aβ), Lamp1, LC3, Shank2, Neurogranin, CD9, CD63, 또는 Alix일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
본 명세서 내에서 모든 동물 실험 과정은 한국뇌연구원 실험동물 위원회의 지침서에 따라 수행하였다. 실험용 생쥐는 12시간 명/암 주기 조건에서 자유롭게 물을 섭취할 수 있도록 하였다.
<실시예 1>
1. 시료의 추출
일반 실험동물 (생쥐, C57BL/6, 한국뇌연구원, 33~35주령) 또는 알츠하이머 질환 모델 실험 동물 (생쥐, C57BL/6;Tg6799, 한국뇌연구원, 33~35주령)을 안락사를 시킨 후, 실험 동물의 해마 조직을 떼어내어 1~4℃ HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)에 담궈두었다. 상기 해마 조직을 실험직전 Syn-PER™ Synaptic Protein Extraction Reagent(87793, Thermo Scientific)에 EDTA-free protease(Halt™ Protease Inhibitor Cocktail (100X), 87786, Thermo)를 혼합한 300 ㎕ 용액에 옮겨 담았다. 상기 용액을 ice 위에서 초음파 발생기(ultrasonic homogenizer)로 균질화 작업을 한 후 원심분리기(5430R, Eppendorf)를 이용해 1,200g, 4℃에서 20분동안 원심분리를 하여 상층액만 사용하였다. 상층액을 별도의 1.5mL e-tube에 옮기고 원심분리를 이용해 15,000g, 4℃에서 20분동안 원심 분리를 하여 상층액은 버렸다. 남은 침전물에 200 ㎕ Syn-PER™ Synaptic Protein Extraction Reagent를 녹였다.
2. 메탄올/클로로포름 단백질 침전법
상기 처리된 시료용액 100 ㎕에 400 ㎕ 메탄올(Methanol, S452-4, Fisher)의 넣고 vortex을 이용해 잘 섞어주었다. 다시 100 ㎕의 클로로포름(Chloroform, 319988, Sigma Aldrich)을 넣고 vortex를 이용해 섞어주었다. 다음으로 300 ㎕의 초순수 용액을 넣고 앞서 동일한 방법으로 섞어주었다. 원심 분리기를 이용해 14,000g에서 5분 동안 원심분리를 하여 상층액을 제거하였다. 남은 용액에 400 ㎕ 메탄올을 넣고 votex를 이용해 섞어주었다. 14,000g에서 5분 동안 원심분리를 하여 상층액에 있는 메탄올을 최대한 제거한 후 50mM 트리에틸 암모늄 (Triethylammonium bicarbonate buffer, TEAB; 90114, Thermo)을 넣어 용해하였다.
3. 단백질 정량
상기 추출한 시료가 담긴 용액은 Pierce BCA Protein Assay Kit(23225, Thermo Scientific™)를 이용해 용액안의 단백질의 양을 측정하였다. BSA를 계단 희석법을 통해 25μg/mL 단위의 농도로 0.1 mL 씩 만들었다. 측정하고자 하는 용액 또한 적절히 희석 또는 그대로 사용하여 0.1 mL를 준비하였다. 준비된 용액에서 20 ㎕ 의 표준 또는 측정대상이 담긴 용액에 200 ㎕ 의 시약을 넣고 잘 섞어주었다. 섞어준 용액들은 37℃에서 30분간 반응을 시키고, 상온에서 냉각시켰다. 562nm 로 세팅된 spectrometer (FlexStation3, Molecular Devices)에서 측정하였다. 측정된 값에서 Blank 표준 용액의 측정값을 빼준 다음에 농도 예상 곡선을 그렸다. 곡선과 시료의 측정값을 비교해서 시료의 단백질의 양을 추정하였다.
4. 지질 분해 및 제거
1.5mL의 e-tube로 시료를 옮기고, 계산된 단백질의 양에 맞추어 3 unit / μg으로 녹인 리파아제(L0382, Sigma Aldrich)를 100 μL e-tube에 넣어 37℃로 맞추어진 히팅 블록 (ThermoMixer® C, Eppendorf)에 놓아두어 1시간 반응시켰다. 이후, 히팅 블록에서 70℃ 30분간 놓아두어, 리파아제 효소의 활동을 중지시켰다.
5. 우레아/계면활성제 처리
상기 용액에 1.5mL e-tube에 넣은 다음, 8M 우레아 (Urea; U5378, Sigma Aldrich), 2% 도데실 황산 나트륨 (SDS; L3771, Sigma-Aldrich), 50mM Tris-HCl(M1352, Mentos), 150 mM 염화나트륨(NaCl, S3014, Sigma-Aldrich), 1mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid, 15575-038, Invitrogen), 1mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride, 93482, Sigma-Aldrich), EDTA-free protease(Halt™ Protease Inhibitor Cocktail (100X), 87786, Thermo)로 이루어진 혼합용액을 상기용액의 부피 동일한 양만큼 넣었다. 히팅 블록에서 72도에서 1시간 반응을 시켰다.
6. 초음파 분쇄
상기 용액을 vortex를 이용해 간단히 섞은 다음에 아래의 세팅값을 이용해 초음파 발생 장치 (Bioruptor® Pico, Diagenode)에서 초음파 분쇄를 하였다.
- Sonication cycle: 15 sec ON/30 sec OFF
- Total sonication time: 3 - 5 cycles
- Temperature: 4℃
7. 계면활성제 제거
상기 용액의 계면 활성제를 제거하기 위해 Pierce Detergent Removal Spin Columns (87777, Thermo Scientific™)을 사용하였다. 상기 용액을 처리하기 이전에 0.5mL spin columns을 원심분리기용 tube에 넣어 1,500g 로 1분 동안 원심분리해서 column안에 있는 저장 완충용액을 제거하였다. 여기가 0.4 mL의 wash/equilibration buffer (40mM 중탄산암모늄, ammonium bicarbonate; A6141, Sigma-Aldrich)를 넣어 1,500g 로 1분 동안 원심분리를 하고 tube에 모아진 용액은 버렸다. 이 과정을 총 3번 하였다. 상기 용액 100㎕를 column에 넣고 2분 동안 상온에서 놓아 두었다. 그리고 원심분리기에서 1,500g 로 2분 동안 원심 분리를 하여 원심분리용 tube안에 모인 계면활성제가 제거된 용액을 사용하였다.
8. 웨스턴 블로팅
전기 영동 장치에 이미 만들어놓은 겔을 장치하고 완충용액 통해 전기영동 완충용액(Tris/Tricine/SDS Running Buffer 1610744, Bio-Rad)을 부었다. 겔의 홈에 시료를 넣고, 사용하지 않는 홈에도 시료와 같은 용양의 겔 loading 완충 용액을 넣었다. 겔의 전기장을 80 V/m 되도록 10분간 가하고, bromophenol blue가 resolving gel에 도달하면 100 V/m로 전압을 올리고 bromophenol blue가 resolving겔의 끝까지 갈 때까지 (대략 1시간) 전기 영동을 실시하였다.
적당한 크기로 자른 PVDF(Polyvinylidene difluoride) Transfer membrane (IPVH00010, Millipore)을 약 5분간 Methanol에 담궈둔 후 전사 완충용액으로 평형시킨 다음 웨스턴 블롯용 카세트를 전사 완충용액이 담긴 용액에 넣고 겔 위에 평형시킨 막을 여과지와 스폰지와 함께 올려놓았다. 카세트에 고정 장치를 한 후, blotting chamber로 옮긴 후 전사 완충 용액을 넣고 막 쪽이 양극, 겔 쪽이 음극이 되도록 전극을 장치한 다음 300 mA에서 80분 동안 전사하였다.
항원(단백질)이 전사된 막은 5% skim milk가 포함된 트윈20이 포함된 인산화된 세척 완충 용액 (PBST, Phosphated-buffered saline with Tween-20) 용액에 담가 흔들어주면서, 1시간 동안 실온에서 놓아두어 단백질이 결합하지 않은 막의 부분을 차단시켰다. 블러킹 처리를 한 후, 세척 완충용액 (PBST)으로 세 번 세척하였다.
세척 완충용액을 제거하고, 적당한 농도로 5% BSA가 첨가한 세척 완충용액 (PBST)에 각각 1:1,000으로 희석된 항원 특이적인 일차 항체를 전사막이 충분히 잠길 만큼 가하여 37℃에서 8시간 이상 처리하였다. 일차 항체 희석한 세척 완충용액 (PBST)을 제거한 후 세척 완충용액으로 전사막을 3회에 걸쳐 10분씩 세척하였다. 세척 완충용액 (PBST)에 1:5,000으로 희석시킨 효소가 표지된 이차항체를 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이차항체 희석 완충요액을 제거한 후, 전사막을 3회에 걸쳐 세척완충용액(PBST) 용액으로 세척하였다. 전사막이 잠길 만큼의 적당한 양의 luminescent 기질 용액(SuperSignal™ West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate, 34580, Thermo)을 첨가한 후 서서히 흔들면서 반응시켰다. Enhanced chemiluminescence (ECL, ImageQuantTM LAS 4000, GE Healthcare) 측정기를 이용해 원하는 단백질을 검출하였다.
<실시예 2>
1. 시료의 추출
일반 실험동물 (생쥐, C57BL/6, 한국뇌연구원, 33~35주령) 또는 알츠하이머 질환 모델 실험 동물 (생쥐, C57BL/6;Tg6799, 한국뇌연구원, 33~35주령)를 흡입 마취 시킨 후, EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)가 코팅된 주사기를 이용해서, 심장에서 혈액을 뽑아, EDTA가 코팅되어 있는 진공채혈관 (blood collection tube)에 옮겼다. 원심분리기를 이용해서 400g, 18 ~ 20℃에서 10분 동안 수집된 혈액을 원심분리를 한 후, 상층액을 사용하였다. 다시 원심분리기에 넣어 2000g, 18 ~ 20℃에서 10분동안 원심분리를 한 후, 상층액을 덜어내서 분석에 사용하였다.
이후 분석의 과정은 실시예 1의 2~8과 동일하다.
<실시예 3>
일반 실험동물 (생쥐, C57BL/6, 한국뇌연구원, 33~35주령)의 대뇌피질 조직을 떼어내어 분석하였다. 분석의 과정은 실시예의 1~8과 동일하다. 단, 4단계에서 리파아제의 농도를 0.2, 0.4, 2 unit / μg으로 처리하였다.
<실시예 4>
일반 실험동물 (생쥐, C57BL/6, 한국뇌연구원, 33~35주령)의 대뇌피질 조직을 떼어내어 분석하였다. 분석의 과정은 실시예의 1~8과 동일하다. 단, 4단계에서 리파아제의 농도를 2 unit / μg으로 처리하였고, 10분, 30분, 60분을 처리하였다.
<실시예 5>
리파아제 (Lipase from porcine pancreas type Ⅵ-S, L0382)에 대해서 5 unit / ㎕의 농도로 완충용액에 녹였다. 이렇게 녹인 리파아제 10 ㎕ 와 4X Laemmli sample buffer (1610747, Bio-rad) 5 ㎕, 그리고 초순수를 2uL로 넣고 100℃에 끓였다.
전기 영동 장치에 이미 만들어놓은 겔을 장치하고 전기영동 완충용액을 부었다. 겔의 홈에 시료를 넣고, 사용하지 않는 홈에도 시료와 같은 용량의 겔 loading 완충 용액을 넣었다. 겔의 전기장을 80 V/m 되도록 10분간 가하고, bromophenol blue가 resolving gel에 도달하면 100 V/m로 전압을 올리고 bromophenol blue가 resolving겔의 끝까지 갈 때까지 (대략 1시간) 전기 영동을 실시하였다. 전기 영동이 끝난 겔을 꺼내어 트레이에 놓고 Comassie blue staning 용액 (LC6060, Invitrogen)을 적당량 부어준 후 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 초순수로 여러 번 씻어낸 후 염색된 단백질을 확인하였다.
<실시예 6>
1. 시료의 추출
일반 실험동물 (생쥐, C57BL/6, 한국뇌연구원, 33~35주령) 또는 알츠하이머 질환 모델 실험 동물 (생쥐, C57BL/6;Tg6799, 한국뇌연구원, 33~35주령)을 안락사를 시킨 후, 실험 동물의 대뇌 피질 (cortex) 조직을 떼어냈다.
이후의 과정은 실시예 1의 1~7단계까지 동일하다.
8. In-solution digestion
플로우-쓰루(flow-through) 처리과정을 통해 얻은 시료 용액에 40 mM 중탄산 암모늄을 100 ㎕가 되도록 넣어준 후 500 mM DL-디티오트레이톨 (DL-Dithiothreitol; D0632, Sigma, USA)를 4 ㎕ 넣고 56℃에서 30분간 반응시켰다. 500mM 요오드아세트아미드(Iodoacetamide; I1149, Sigma)를 8 ㎕ 넣고 실온에서 차광시켜 20분간 둔 후 한 번 더 500 mM DL-디티오트레이톨 4 ㎕를 넣어주었다. 그리고 0.5 ㎍/㎕ Trypsin Protease (90058, Pierce, USA)을 2 ㎕씩 시료에 넣어주고 37℃에서 하루동안 반응시켰다. 전처리가 완료된 시료는 고속진공농축기 (SpeedVac; SPD1010, Thermo, USA)을 사용하여 증발시킨 후, C18 Spin Tips (87784, Pierce, USA)를 사용하여 시료 내에 존재하는 단백질/펩타이드의 탈염(protein/peptide desalting)을 하였다.
다시 추출된 시료는 고속진공농축기를 사용하여 증발시킨 후 0.1% 포름산(formic acid)에 재용해 하였다. 각 시료의 트립신 분해물을 나노엘릭트로스프레이 이온소스 (nano-electrospray ion source)가 결합된 액체크로마토그래피 질량분석기 (Ulimate 300 / Q Exactive plus, Thermo, USA)로 분석하였다. 펩타이드를 RS auto-sampler로부터 Trap column (AcclaimTM PepMapTM 100 C18 HPLC column, 164535, Thermo)을 통해 분석 컬럼 (EASY-SprayTM HPLC column, ES903, Thermo)으로 로딩하였고, 0.1% 포름산과 0.1% 포름산을 함유하는 아세토니트릴(acetonitrile) 수용액을 사용하여 유속 300 nl/min의 선형구배로 분리하였다. LC 용리제를 분석 컬럼으로부터 전자분무하고, 2.0 kV의 전압이 나노스프레이 소스의 액체 접촉부를 통해 인가되도록 하였다. 펩타이드 혼합물을 80분 동안 10%에서 50% 농도 구배를 갖도록 한 아세토니트릴을 사용하여 분리하였다. 상기 분석법은 350 ~ 2000 m/z 범위의 전체 MS 스캔 (full MS scan), 및 상기 전체 MS 스캔으로부터 10개의 가장 강한 이온 상에 데이터-의존적인 MS/MS (MS2)로 구성하였다. 상기 질량분석기는 데이터 의존적 모드로 포착하도록 프로그래밍 하였다. 질량분석기의 장비에 대한 기본적인 교정은 제조자의 지시에 따라 제안된 교정 솔루션으로 수행되었다. 생성된 데이터는 Proteome Discoverer v2.4 (Thermo, USA)로 분석하였다. 상기 스펙트럼 데이터를 마우스 Uniprot database (release 2021_03)에 대해 검색하였다. 이때 사용된 분석 플로우는 4개의 노드 (node) 즉, Spectrum Files (data input), Spectrum Selector(spectrum and feature retrieval), Sequest HT (sequence database search), 및 Percolator (peptide spectral match or PSM Validation and FDR analysis)를 포함하였다. 모든 동정된 단백질은 펩타이드 수준에서 계산하여 ≤ 1%의 FDR (false discovery rate)를 가졌다. 평가는 q-value에 기초하였다. 검색 파라미터는 가변수식화 (dynamic modification)로서 메티오닌 산화 및 고정수식화 (fixed modification)로서 시스테인의 메틸티오-수식화 함께 미절단 (missed cleavage) 개수 최대값 2까지의 트립신분해 특이도 (tryptic specificity)를 허용하였다. +1, +2, 및 +3 이온에 대한 질량검색 파라미터는, 전구이온 (precursor ions)에 대해 10 ppm 및 조각이온 (fragment ions)에 대해 0.2 Da의 질량에러 허용 오차를 포함하였다.
Proteome Discoverer
Database UniProt Fasta file (Mus musculus)
Mass tolerance Precursor (10 ppm), Fragment (0.2 Da)
<실시예 7>
일반 실험동물 (생쥐, C57BL/6, 한국뇌연구원, 33~35주령) 또는 알츠하이머 질환 모델 실험 동물 (생쥐, C57BL/6;Tg6799, 한국뇌연구원, 33~35주령)에서 혈장을 추출하는 실시예 2와 동일하다. 추출한 혈장에 대해 리파아제를 처리하고, 액체크로마토그래피 질량 분석과 데이터 분석은 실시예 6과 동일하다.
<실시예 8>
일반 실험동물 (생쥐, C57BL/6, 한국뇌연구원, 5개월령) 또는 알츠하이머 질환 모델 실험 동물 (생쥐, C57BL/6;Tg6799, 한국뇌연구원, 5개월령)에서 혈장을 추출하는 실시예 2의 1단계(시료의 추출)와 동일하다. 추출한 시료 내 단백질 정량 방법은 실시예 1의 3단계 (단백질 정량)과 동일하다. 추출한 혈장의 단백질에 리파아제를 처리하는 방법은 실시예 5와 동일하나, 리파아제에 대해서 1, 3 unit / ㎕의 농도로 완충용액에 녹였다. 이렇게 녹인 리파아제 10 ㎕ 와 4X Laemmli sample buffer(1610747, Bio-rad) 5 ㎕, 그리고 초순수를 2uL로 넣고 37℃에서 30분을 처리한 후, 100℃에 끓였다. 이후의 CD9에 대한 웨스턴 블로팅은 실시예 5와 동일하다.
<실시예 9>
유전자 변형 실험동물 (생쥐, 한국뇌연구원, 5개월령) 에서 혈장을 추출하는 실시예 2의 1단계(시료의 추출과)와 동일하다. 추출한 시료 내 단백질 정량 방법은 실시예 1의 3단계 (단백질 정량)과 동일하다. 추출한 혈장의 단백질이 80 μg 되도록 정량화하고, ExoQuick (EXOQ20A-1, System Biosciences,LLC, USA)를 사용하여 질량이 정량화된 혈장으로부터 Extracellular vesicle(EV)을 추출하였다. 추출한 EV에 대해 리파아제를 처리하는 방법은 실시예 5와 동일하나, 리파아제의 농도를 1, 3 unit / μg으로 처리하였고, 각각 1시간, 30분을 처리하였다. 이후 Alix와 CD9에 대한 웨스턴 블로팅은 실시예 5와 동일하다.
<비교예 1>
실시예 1의 동일한 동물 모델에 대해서 실시예 1의 1단계부터 8단계까지 동일한 과정으로 진행하였다. 실험의 비교를 위해서 각각의 동물 모델에 대해서, 4단계에서 리파아제를 넣지 않고 동일하게 실험을 진행하였다.
<비교예 2>
실시예 2의 동일한 동물 모델에 대해서 실시예 2의 1단계부터 8단계까지 동일한 과정으로 진행하였다. 실험의 비교를 위해서 각각의 동물 모델에 대해서, 4단계에서 리파아제를 넣지 않고 동일하게 실험을 진행하였다.
<비교예 3>
실시예 3의 동일한 동물 모델에 대해서 실시예 2의 1단계부터 8단계까지 동일한 과정으로 진행하였다. 계면활성제 간의 차이를 비교하기 위해 리파아제 대신에, 2% SDS 또는 8M UREA를 넣어 실험을 진행하였다.
<비교예 4>
실시예 4의 동일한 동물 모델에 대해서 실시예 2의 1단계부터 8단계까지 동일한 과정으로 진행하였다. 계면활성제 간의 차이를 비교하기 위해 리파아제 대신에, 2% SDS 또는 8M UREA를 넣어 실험을 진행하였다.
<비교예 5>
실시예 5와 동일하게 진행하였다. 서로 다른 리파아제 비교하기 위해서 대조군으로 50mM TEAB을, 비교군으로 리아파제 3종(Lipase from porcine pancreas type Ⅱ, L3126, Sigma-aldrich/ Lipase from Aspergillus oryzae, L0777, Sigma-aldrich/ Lipase from Candida sp., L3170, Sigma-aldrich)을 동일한 부피로 사용하였다.
<비교예 6>
실시예 8의 동일한 동물 모델에 대해서 실시예 8과 동일한 과정으로 진행하였다. 실험의 비교를 위해서 각각의 동물 모델에 대해서, 리파아제를 넣지 않고 동일하게 실험을 진행하였다.
<비교예 7>
실시예 9의 동일한 동물 모델에 대해서 실시예 9와 동일한 과정으로 진행하였다. 실험의 비교를 위해서 각각의 동물 모델에 대해서, 리파아제를 넣지 않고 동일하게 실험을 진행하였다.
<실험예 1>
실시예 1과 비교예 1의 결과를 분석하기 위해서 웨스턴 블로팅에 사용된 일차 항체는 다음과 같다.
- Cyclophilin B (Anti-Cyclophilin B antibody, ab16045, abcam)
- GAPDH (HRP-Conjugated GAPDH Antibody, HRP-60004, Proteintech)
- Synaptophysin (anti-synaptophysin (YE269), ab32127, abcam)
- α-tubulin (HRP-Conjugated Alpha Tubulin Antibody, HRP-66031, Proteintech)
- Aβ (6E10) (beta-amyloid (1-16) (6E10), 803001, Biolegend)
- Lamp1 (LAMP1 (C54H11) Rabbit mAb, 3243, Cell Signaling)
- Shank2 (rat Shank2 antibody, 75-088, Neuromab)
- LC3a (LC3A (D50G8) XP® Rabbit mAb, 4599S, Cell Signaling)
Cyclophilin B, GAPDH, Synaptophysin, Lamp1, LC3a 에는 2차 항체 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP (31460, Invitrogen)를 사용하였다. Aβ (6E10) 는 2차 항체로 Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP (31430, Invitrogen)를, Shank2 는 Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP (31470, Invitrogen)을 사용하였다. 각 도표의 Fold Change 값은 모든 sample에서 공통적으로 나오는 Cyclosphilin B의 값을 분모로 사용하였다. 일반적으로 GAPDH의 단백질을 사용하나, Synaptophisin 이나 α-tublin과 같이 지질과 연관성이 적은 단백질의 경우, 본 발명이 제시한 방법으로 발견의 양이 큰 차이로 줄어들기 때문이었다.
지질과 관련되어 있는 단백질 중 Aβ의 경우, 일반적으로 응집된 형태로 있으며, 일부가 콜레스테롤과 같은 지질과 결합하고 있음이 알려져 있다. Lamp1은 lysosome의 생체 표지자로 lipid accumulation 있는 형태로 존재한다. Autophagosome의 표지자인, LC3의 경우도, 지질이 결합된 형태로 존재한다. Shank2의 경우 post-sypnaptic neuron에서 scaffolding 역할을 하는 단백질로, αPKC와 tight junction에서 결합해 같이 존재해 있음이 알려져 있어서, 지질과 밀접할 것으로 예측되었다.
알츠하이머 질환 동물 모델의 시냅토좀에서는 리파아제가 있을 경우, Aβ-42, Aβ-40 peptide가 시냅토좀으로부터 분리되어 농축됨을 알 수 있었다(도 2). 비슷한 경우로, Lamp1이나 Shank2 단백질은, 일반적인 생쥐의 뇌로부터 유래한 시냅토좀과 알츠하이머 질환 동물 모델의 뇌로부터 유래한 시냅토좀 모두 리아파제가 있을 경우, 발견되는 양이 증가함을 확인하였다.
<실험예 2>
실시예 2과 비교예 2에서 사용한 일차 항체는 다음과 같다.
Neurogranin (Anti-Neurogranin antibody [EPR21152], ab217672, abcam)
Aβ (D54D2) (β-Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb, 8243s, Cell Signaling)
2차 항체는 공통적으로 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP (31460, Invitrogen)를 사용하였다.
Neurogranin 과 Aβ는 뇌척수액과 혈액 엑소좀에서 알츠하이머 질환과 초기 인지 장애를 나타내는 생체 표지자로 알려져 있다. Neurogranin 은 post-synaptic protein으로, calmodulin-binding protein으로 뇌에서는 주로 dendritic spine에 위치하고 있다. 특히, phosphatidic acid 와 결합하여 세포막에 연관되어 있는 단백질이다.
실시예 1과 비교예 1에서 사용한 β-Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb는 주로 인간에서 유래한 Aβ-42, Aβ-40, Aβ-39, Aβ-38, and Aβ-37 peptides와 결합하는 항체이다. 이런 Aβ peptides는 응집되어 β sheet 의 구조를 갖고 있으며, 이중 일부는 cholestreol 과 여러 지질과 결합되어 있는 것으로 알려져 있다.
상기 두 종류의 지질과 연관된 단백질을 일반 동물 모델의 혈장과 알츠하이머 질환 동물 모델의 혈장에 확인하기 위해 추출한 혈장에 리파아제를 처리하였다(도 3). 리파아제를 처리하지 않았을 때, 두 가지 동물 모델의 혈장에서 Neurogranin 과 Aβ는 발견되지 않았다. 하지만, 리파아제를 처리했을 경우, 상기 두 종류의 항원 모두 발견됨을 확인하였다. 특히 알츠하이머 질환 동물 모델의 혈장에 대한 결과에서 리파아제를 처리할 경우, 명확한 밴드를 보여주었다(도 3).
<실험예 3>
리파아제를 통해서 지질에 연관되어 있는 단백질을 효과적으로 분리하고 농축할 수 있는 리파아제의 농도를 확인하기 위해서 실시예3의 실험을 진행하였다.
실시예 3과 비교예 3에서 사용한 일차 항체는 다음과 같다.
- Lamp1 (LAMP1 (C54H11) Rabbit mAb, 3243, Cell Signaling)
- LC3a (LC3A (D50G8) XP® Rabbit mAb, 4599S, Cell Signaling)
이차 항체는 2차 항체 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP (31460, Invitrogen)를 사용하였다.
추가적으로 리파아제를 처리한 이후, 우레아와 계면활성제를 처리할 때, 계면활성제의 종류에 따른 차이에 대해서도 실시예 3과 비교예 3과 같이 분석하였다(도 4).
<실험예 4>
리파아제를 통해서 지질에 연관되어 있는 단백질을 효과적으로 분리하고 농축할 수 적절한 리파아제의 처리 시간을 확인하기 위해서 실시예 4의 실험을 진행하였다(도 5).
실시예 3과 비교예 3에서 사용한 일차 항체와 이차 항체는 실험예 3과 동일하다.
실험예 3과 동일하게, 시간에 따라서 리파아제를 처리한 후, 우레아와 계면활성제를 처리할 때, 계면활성제의 종류에 따른 차이에 대해서도 실시예 4와 비교예 4와 같이 분석하였다(도 6).
<실험예 5>
리파아제는 단백질로 구성된 효소이다. 그래서, 질량 분석 등과 같은 방법을 이용해 질량 분석을 할 때 리파아제 그 자체만으로 arifact를 가진 peak을 만들 수 있어서, 분석을 방해하는 요인이 된다.
그래서 본 발명에서 제시하는 리파아제가 분석에 방해할 수 있는 단백질을 만드는지 확인하기 위해서 리파아제를 시료없이 실시예 5와 같이 처리하였다. 단백질 전기영동을 한 후, Comassie blue staning을 통해서 잔여하는 단백질을 검출하였다. 실시예 5의 결과는 우리 발명에서 제시한 리파아제는 분석간 리파아제로부터 유래한 단백질이 남아있지 않음을 주장한다. 하지만, 비교예 5의 리파아제 3종에 대한 Comassie blue staning 결과는 리파아제 처리 과정에서 단백질에 잔여함을 확인시켜 주었다.
<실험예 6>
리파아제를 이용해서 지질을 제거한 생체 시료가 실제 질량 분석에서 활용될 수 있는지 확인할 수 있게, 실험예 1과 동일한 방법으로 생쥐의 피질에서부터 추출한 시냅토좀에 대해 액체 크로마토그래피 질량-분석을 하였다. 실시예 6으로부터 얻는 데이터는 R의 DEP package(Zhang X et al. (2018). “Proteome-wide identification of ubiquitin interactions using UbIA-MS.” Nature Protocols, 13, 530-550.)를 기반으로 분석하였다.
분석 결과, 일반 실험동물에서 유래한 시냅토좀에서는 리파아제를 처리하지 않고, 3,511 종의 단백질을 동정했고, 리파아제를 처리했을 경우, 2,985 종의 단백질은 동정했다. 이 중, 리파아제를 처리했을 경우, 515종(13%)의 새로운 단백질을 발견할 수 있었다. 알츠하이머 질환 동물 모델에 유래한 시냅토좀을 분석했을 때는, 리파아제 없이 3,731 종의 단백질이, 리파아제를 처리했을 경우 3,127 종의 단백질이 동정되었다. 526종(11%)의 단백질이 리파아제를 통해 확인되었다. 새롭게 확인된 단백질이 어떤 위치에 있는지 확인하기 위해서 R의 UniprotR (Soudy, Mohamed et al. (2020) “UniprotR: Retrieving and Visualizing Protein Sequence and Functional Information from Universal Protein Resource (UniProt Knowledgebase).” Journal of Proteomics 213 (February).)을 사용하여 Gene Ontology Cellular Component를 탐색하였다. 그 결과, 일반 실험동물에서 유래한 시냅토좀을 리파아제를 처리했을 때 발견한 단백질 515종 중 Integral component of membrane에 위치하는 단백질이 105종 (17.07%), plasma membrane에 위치하는 단백질이 67종 (10.41%), membrane에 위치하는 단백질이 28종 (5.04%), Integral component of membrane에 위치하는 단백질이 24종 (3.90%), ER membrane 19종 (3.09%), Golgi membrane 17종 (2.76%), mitochondrial inner membrane 16종 (2.60%), apical plama membrane 11종 (1.79%) 였다. 알츠하이머 질환 모델 동물에서 유래한 시냅토좀의 경우에도, 새롭게 발견된 단백질 526종 중 Integral component of membrane에 위치하는 단백질이 92종(17.49%), plasma membrane에 위치하는 단백질이 57종(10.84%), membrane에 위치하는 단백질이 29종(5.51%), Integral component of membrane에 위치하는 단백질이 20종 (3.80%), ER membrane 12종 (2.28%), mitochondrial inner membrane 10종 (1.90%)였다. 상기 두 가지의 생체 시료 모두 리파아제를 처리해서 새롭게 발견한 단백질의 40%가 지질과 연관되어 있었다(도 7).
<실험예 7>
실시예 7로부터 데이터를 분석하는 방법은 실험예 6과 동일하다. 분석 결과, 일반 실험 동물에서 추출한 혈장에 리파아제를 처리하지 않았을 때, 478 종이었고, 리파아제를 처리했을 경우, 340종이었다. 이 중 리파아제를 통해 혈장에서 새로 발견된 단백질은 108종 (14%) 이었다. 알츠하이머 질환 동물에서 추출한 혈장도 마찬가지로 리파아제를 처리하지 않았을 때, 512종이었고, 리파아제를 처리할 경우 동정된 단백질은 342 종이었다. 이 중 리파아제를 통해 혈장에서 새로 발견된 단백질은 102종 (14%) 이었다.
새롭게 확인된 단백질의 위치를 확인했을 때, 일반 실험동물에서 추출한 혈장의 경우, Integral component of membrane 10종 (9.26%), plasma membrane이 7종 (6.46%), external side of plama membrane 6종 (5.56%), cell surface와 basement membrane이 각각 4종 (3.7%), mitochondrial matrix, mitochondrial inner membrane, membrane raft가 모두 3종 (2.78%)로 지질과 연관되었거나 결합되었을 것으로 추정되는 단백질이 40종 (37.02%) 이었다. 알츠하이머 질환 동물 유래 혈장에 대해 리파아제를 처리했을 경우, Integral component of membrane 12종 (11.76%), plasma membrane과 membrane에 위치하는 단백질이 각각 9종 (8.82%), basement membrane이 5종 (4.9%), mitochondrial inner membrane, membrane raft, external side of plasma membrane가 모두 3종 (2.94%)로 지질과 연관되었거나 결합되었을 것으로 추정되는 단백질이 47종 (43.12%) 이었다(도 8).
<실험예 8>
단백질 분석 방법에 사용되는 메탄올/클로로포름이나 우레아/계면활성제 등의 다른 처리 용액을 가하지 않고, 리파아제를 시료에 직접 처리하여 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 분리 및 농축을 할 수 있는지 확인하기 위하여 실시예 8와 비교예 6과 같이 분석하였다. 세포외 소포체 표지자이면서, 알츠하이머병 진단 마커로 알려진 CD9 단백질은 일반적으로 알츠하이머병 뇌 유래 소포체에서 유의미하게 증가됨이 알려져 있다. 우리의 결과에서도 알츠하이머병 질환 동물 모델 혈장에서도 증가하였다. 하지만, 리파아제를 1 unit / ㎍ 농도로 혈장에 처리하고 혈장에 있는 CD9 단백질은 분리하여 농축했을 때, 알츠하이머병 질병 동물 모델의 혈장에서 유의미하게 증가하였다(도 9). 리파아제를 아예 처리하지 않았거나 리파아제 농도가 3 unit/ ㎍ 일 때, 증가하는 CD9 단백질의 양이 일정하지 않고 변화되어 통계적으로 유의미하지 않는 불안정한 결과를 보여주었다.
<실험예 9>
대표적인 지질연관 단백질 중의 하나이면서 세포외 소포체 표지자 단백질로 알려진 Alix와 CD63 단백질에 대해 다른 시료를 처리하지 않고, 리파아제를 시료에 직접 처리하여 분리 및 농축을 할 수 있는지 확인하기 위해, 실시예 9과 비교예 7과 같이 분석하였다. 유전자 변형 마우스에서 유래한 혈장으로부터 세포외 소포체를 분리하였고, 분리된 소포체 내에 있는 단백질의 양을 비교하였다. Alix 단백질의 경우 이전에 알려진 단백체 분석에 사용된 다른 처리 용액의 첨가 없이 리파아제를 1 unit / ㎍을 1시간 동안 시료에 직접 처리하였을 때, 리파아제를 처리하지 않았을 때보다 유의미하게 분리 및 농축되었다(도 10). CD63 단백질의 경우, 리파아제를 3 unit / ㎍을 1시간 동안 시료에 직접 처리하였을 때, 리파아제를 처리하지 않았을 때 보다 유의미하게 분리 및 농축되었다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 지질과 연관되었거나 지질과 관련되어 있는 새로운 단백질을 분리 분출하고 동정하기 위해서 리파아제의 처리가 효과적 방법이라고 할 수 있다. 또한, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 분리 및 검출 방법을 리파아제 처리 시간, 농도, 반응 조건 (온도, pH 등)을 조절함으로써 간소화하고 분석, 진단 등의 방법에 응용할 수 있다. 뿐만아니라, 이러한 결과는 생체 시료 내 지질 연관 표적하는 단백질 및 전사체, 지질체의 정량 및 정성 분석에 사용됨을 의미한다. 나아가서 진단, 시약 등에 사용할 수 있고 그 예는 Western blot, qPCR, Simoa, Lateral flow kit 등이 포함된다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (15)

  1. 리파아제를 유효성분으로 포함하는 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축용 조성물.
  3. 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계를 포함하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법.
  4. 1) 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계;
    2) 상기 지질이 제거된 생체 시료에 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 첨가하여 용해하는 단계;
    3) 상기 용해액을 초음파 분쇄하는 단계;
    4) 상기 초음파 분쇄된 용액에서 계면활성제를 제거하는 단계;
    5) 상기 계면활성제가 제거된 용액에서 불순물 단백질을 제거하는 단계; 및
    6) 상기 불순물 단백질이 제거된 용액을 용액 내 절단(In-solution digestion) 처리하는 단계를 포함하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법.
  5. 1) 생체 시료에 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 첨가하여 용해하는 단계;
    2) 상기 용해액에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계;
    3) 상기 지질이 제거된 용해액을 초음파 분쇄하는 단계;
    4) 상기 초음파 분쇄된 용액에서 계면활성제를 제거하는 단계;
    5) 상기 계면활성제가 제거된 용액에서 불순물 단백질을 제거하는 단계; 및
    6) 상기 불순물 단백질이 제거된 용액을 용액 내 절단(In-solution digestion) 처리하는 단계를 포함하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법.
  6. 1) 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계;
    2) 상기 지질이 제거된 용액에서 불순물 단백질을 제거하는 단계; 및
    3) 상기 불순물 단백질이 제거된 용액을 용액 내 절단(In-solution digestion) 처리하는 단계를 포함하는, 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리파아제 처리는 0.1 ~ 5 unit/μg 리파아제를 10 ~ 50℃에서 10 ~ 60분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 계면활성제 및 우레아 혼합 용액은 1 ~ 4% 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) 및 4 ~ 8M 우레아가 혼합된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 4) 단계는 계면활성제 제거 스핀 컬럼에 통과시켜, 원심분리 또는 여과를 통해 계면활성제를 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 5) 단계의 불순물 단백질을 제거하는 단계는 불순물 단백질에 결합할 수 있는 항체, 레진, 또는 비드를 처리하여 불순물 단백질을 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 5) 단계의 불순물 단백질을 제거하는 단계는 메탄올 및 클로로포름을 첨가하여, 분석에 필요한 단백질을 침전시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 5) 단계의 불순물 단백질을 제거하는 단계는 60 ~ 70℃에서 30 ~ 120분 동안 가열처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제6항에 있어서, 상기 2) 단계의 불순물 단백질을 제거하는 단계는 70 ~ 100℃에서 1 ~ 10분 동안 가열처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 시료는 혈액, 혈장, 조직, 세포, 뇌척수액, 눈물 또는 소변인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 연관 단백질은 베타 아밀로이드(beta-amyloid; Aβ), Lamp1, LC3, Shank2, Neurogranin, CD9, CD63, 또는 Alix인 것을 특징으로 하는 방법.
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