JP4327187B2 - 生物試料からＰｒＰｒｅｓを精製する方法とその応用 - Google Patents

Description

本発明は、生物試料に含まれるＰｒＰｒｅｓの定性的及び／又は定量的検出に使用するために、その試料からＰｒＰｒｅｓを精製する新規な方法に関する。

伝播性亜急性海綿状脳症（transmissible subacute spongiform encephalopathies：ＴＳＳＥ）は、その詳細な性質が今日なお未解明のままである、非通常伝播性エージェント( non-conventional transmissible agents ：ＮＣＴＡ) −所謂プリオン−によって惹き起こされる。ＴＳＳＥには、主として、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ヒツジやヤギにおけるスクレーピ、ウシにおけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）が含まれ、他の脳症が、ミンクや、アカシカ、エラジカ等の一定の種類の野生動物において確認されている。
これらの疾病の結果は常に死であり、現在、有効な治療法はない。

伝播性亜急性海綿状脳症においては、主として中枢神経系において、宿主タンパク質：ＰｒＰ（ Prion protein：プリオンタンパク質）の異常な形態（ＰｒＰｒｅｓ）における蓄積が見られる。ＰｒＰｒｅｓは精製によっても感染性を失うことはなく、その蓄積は、組織学的な病変に先行して現れる。インビトロにおいて、ＰｒＰｒｅｓは、神経細胞カルチャーに対して毒性を示す。

ＰｒＰｒｅｓと正常ＰｒＰとは、通常、２つの生化学的特徴によって区別される。ＰｒＰｒｅｓは、プロテアーゼに対して部分的な耐性を有し、また陰イオン性界面活性剤に不溶性を示す。
ある試料中に存在するＰｒＰｒｅｓを検出可能とするためには、その試料から正常ＰｒＰを除く一方、ＰｒＰｒｅｓを豊富に含むものとするために、その試料に対して複数の操作を行なうことが必要であり、そのようにして、初めて、
・正常ＰｒＰ又は他の不純物の存在によって、擬陽性（ false positives）を示すこと や、
・最終的な生物試料に含まれるＰｒＰｒｅｓの濃度が不充分であるために、擬陰性（ f alse nagatives）を示すこと
を惹起することなく、何れの適当な特異的方法によっても検出され得るようになる。

上記の目的のために、ＰｒＰｒｅｓを分離及び／又は精製するための多くの方法が提案されている。それらの方法は、本質的に、ヒルマート（Hilmert ）とディリンジャー（Diringer）（ Nature 、１９８３、３０６、４７６‐４７８）によって開発された方法に基づいており、一般に、洗浄剤による抽出と、分画超遠心分離と、タンパク質分解酵素による処理とを含む［マルトープ（ Multhaup G. ）ら、EMBO J.、１９８５、４、６、１４９５−１５０１；タカハシ（ Takahashi K. ）ら、Microbiol. Immunol. 、１９８６、３０、２、１２３−１３１；ホープ（ Hope J.）ら、EMBO J. 、１９８６、５、１０、２５９１−２５９７；グラスボール（ Grathwohl K.U.D. ）ら、Arch. Virol.、１９９６、１４１、１８６３−１８７４；カスチャク（ Kascsak R.J. ）ら、Immunol. Investig.、１９９７、２６、２５９−２６８；レイス（ R.E. Race）ら、J. Gen. Virol.、１９９２、７３、３３１９−３３２３；ドイ（ Doi）ら、J. Gen. Virol.、１９８８、６９、９５５−９６０；ムラモト（ T. Muramoto）ら、Am. J. Pathol.、１９９３、１４３、５、１４７０−１４７９；ファルクハル（ Farquhar C.F.）ら、 Gen. Virol.、１９９４、７５、４９５−５０４及び J. Gen. Virol.、１９９６、７７、１９４１−１９４６］。それらの方法は、複数回の超遠心分離を含む多数の工程からなり、そのために、実施することが面倒であって、なお且つＰｒＰｒｅｓの累積的な損失につながるという問題点を有する。その結果、感度が不充分となって、ＰｒＰｒｅｓの高い精度での検出閾値や定量を得ることが困難となる。

上記の諸々の方法は、研究実験設備と相当な実施時間を必要とすることから、堵殺場等の現場で使用することが困難である。
このように、動物の堵殺に際して伝播性亜急性海綿状脳症の存在／不存在を迅速に証明する必要性が存在する。

Nature 、１９８３、３０６、４７６‐４７８ EMBO J.、１９８５、４、６、１４９５−１５０１ Microbiol. Immunol. 、１９８６、３０、２、１２３−１３１ EMBO J. 、１９８６、５、１０、２５９１−２５９７ Arch. Virol.、１９９６、１４１、１８６３−１８７４ Immunol. Investig.、１９９７、２６、２５９−２６８ J. Gen. Virol.、１９９２、７３、３３１９−３３２３ J. Gen. Virol.、１９８８、６９、９５５−９６０ Am. J. Pathol.、１９９３、１４３、５、１４７０−１４７９ Gen. Virol.、１９９４、７５、４９５−５０４ J. Gen. Virol.、１９９６、７７、１９４１−１９４６

そこで、本発明者は、生物試料を精製して、それをＰｒＰｒｅｓの迅速且つ信頼性の高い検出のために使用する方法を提供することを企図した。この方法は、実施が容易で、堵殺場等の現場においても使用することが可能であり、そのために、従来の方法よりも実際上の必要性をより良く満足させるものである。

事実、本発明に係る方法は、
−実施が容易であり、
−信頼性が高く、
−解釈が容易である。即ち、擬陽性（正常ＰｒＰ及び他の不純物）をなくすことによって、ＰｒＰｒｅｓの検出感度閾値を高め、また、大量の生物試料を、８０％を超える精製歩留まりで処理することが出来るので、絶対的な意味での実質的な量のＰｒＰｒｅｓの取得を可能とすることによって、擬陰性をなくことが出来る。このことは、堵殺場において特に価値あることであり、簡易な診断テストで、ＰｒＰｒｅｓが容易に検出され得る試料を提供する。

本発明は、生物試料からＰｒＰｒｅｓを精製する方法であって、
（１）前記生物試料を、３０秒から２時間の間、好ましくは３０秒から１０分の間、８０℃よりも低い温度において、その生物試料の重量の１／４〜４倍の間の量の、好ましくは１／４倍〜１．５倍の間の量の少なくとも１種類の界面活性剤を含むバッファ（ buffer ）Ａを用いてインキュベーションし、また場合により、それに先立ち、その後に、またはそれと同時に、プロテアーゼを用いてインキュベーションすることによって、オパール様乃至は濁った状態のミセル状又は層状（ラメラ）の懸濁液Ｓ１を得る工程と；上記の温度及び量的条件の下では、如何なる界面活性剤又は界面活性剤混合物であっても、それは殆どＰｒＰｒｅｓを可溶化せず、ＰｒＰｒｅｓは懸濁液中に留まるが、他方、正常ＰｒＰは可溶化され、プロテアーゼが添加されれば、破壊されさえする；本インキュベーションは、前記生物試料の重量の１／４倍と１．５倍との間の量の界面活性剤の存在下では、５０℃より低い温度で行なわれる；本発明によれば、前記プロテアーゼは、前記界面活性剤よりも前、若しくは後、またはそれと同時に添加される、
（２）上記の（１）で得られたミセル状又は層状の懸濁液Ｓ１に、その懸濁液Ｓ１を清澄化させる［例えば、マイクロエマルジョン（ microemulsion）又はマイクロサスペンション（ microsuspension）とすることによって］ために適当な量の、前記ＰｒＰｒｅｓを可溶化せず且つ誘電率が１０〜２５の溶媒又は溶媒混合物からなるバッファＢを加える工程と；これにより、肉眼には透明な懸濁液Ｓ２が得られる、
（３）かかる（２) の工程で得られた懸濁液Ｓ２を遠心分離する工程と；この遠心分離は、例えば２分間〜１０分間、２０，０００ｇより低い速度、好ましくは３，５００ｇと１７，５００ｇの間の速度で行なわれる；その結果得られる遠心分離残渣に含まれるＰｒＰｒｅｓの精製歩留まりは、驚くべきことに、８０〜１００％に達する；この遠心分離の時間と速度は、同じ結果、即ち、精製歩留まり８０〜１００％のＰｒＰｒｅｓを得ることが出来るように、調整され得る、
（４）得られた残渣を、０．１％と５％との間の濃度、好ましくは０．２５％と１％との間の濃度［バッファＣの体積に基づく（ｗ／ｖ）］の、前記（１) で定義された少なくとも１種類の界面活性剤、及び／又は０．１Ｍと８Ｍの間の濃度の少なくとも１種類のカオトロピック剤（ chaotropic agent ）を含むバッファＣに、室温と１００℃の間の温度、好ましくは８０℃以上の温度において、可溶化させる工程と；それらの温度条件下においては、前記界面活性剤、好ましくはイオン性界面活性剤及び／又は前記カオトロピック剤がＰｒＰｒｅｓを可溶化する、
を必須的に含むことを特徴とする方法に関する。
上記の工程（１）と工程（２）は、同時に行なってもよく、あるいは、連続的に行なってもよいが、連続的に行なうほうが好ましい。

上記方法を実施するための好ましい態様においては、前記生物試料が組織又は器官である場合に、その試料が、水等の中性バッファと５％グルコース等の等張性バッファからなる群から選択された均質化バッファ中において、工程（１）の前に、例えば機械的なすり潰しによって、均質化される。

上記方法を実施するための好ましい態様においては、工程（１）で採用される温度が、室温と５０℃の間の温度であり、好ましくは３７℃である。

前記バッファＡは、好ましくは、
−ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、サルコシル（ラウロイルサルコシン）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤と、
−ＳＢ３−１０（デシルスルホベタイン）、ＳＢ３−１２（ドデシルスルホベタイン）、ＳＢ３−１４、ＳＢ３−１６（ヘキサデシルスルホベタイン）、ＣＨＡＰＳ、デオキシ（deoxy ）ＣＨＡＰＳ等の両性界面活性剤Ａ、
−Ｃ１２Ｅ８（ドデシルオクタエチレングリコール）、トリトン（Triton）Ｘ１００、トリトンＸ１１４、トイーン（Tween ）２０、トイーン８０、ＭＥＧＡ９（ノナノイルメチルグルカミン）、オクチルグリコシド、ＬＤＡＯ（酸化ドデシルジメチルアミン）、ＮＰ４０等の非イオン性界面活性剤と、
−ＳＤＳ／トイーン８０混合物、サルコシル／トリトンＸ１００混合物等のイオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤との混合物、ＳＤＳ／デオキシコール酸塩混合物等の２種類のイオン性界面活性剤の混合物、イオン性界面活性剤と両性（ zwitterionic ）界面活性剤との混合物等の界面活性剤混合物と、
からなる群から選択された界面活性剤を含む。

上記方法を実施するための好ましい態様においては、前記バッファＢが、好ましくは、Ｃ₃ −Ｃ₆ アルコールと平均理論誘電率が１０と２５の間であるアルコール混合物とからなる群から選択される。前記アルコール又はアルコール混合物としては、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチルプロパン−１−オール、イソプロパノール、（イソプロパノール＋ペンタノール）、（エタノール＋ヘキサノール）、（ブタノール＋ペンタノール）が、特に好ましい。

本発明の用語において、誘電率とは、静的な乃至比較的低周波数の場において測定される静的誘電率εを意味するものと理解され、この誘電率は、電界が２９３．１５Ｋと２９８．１５Ｋの間の温度において溶液に適用される時の、電気移動（ electric displacement）Ｄの電界強度（ electric field strength）Ｅに対する比率に相当する。
このように定義された液体の誘電率は、『化学と物理学のＣＲＣハンドブック』（ David R. Lide 著、７５版、１９９４、ＣＲＣ出版）に詳細に記述されている。
溶媒混合物の場合、平均理論誘電率とは、複数の溶媒のそれぞれの誘電率を混合物中のそれぞれの割合で重み付けして得られる平均値を意味する。

驚くべきことに、工程（２）においてバッファＢを添加することによって、低速遠心分離条件下において、９０％を超える精製歩留まりを得ることが出来る。即ち、バッファＢは、高い精製歩留まりを維持しつつ、最終残渣の量を有意に減少させる。有利なことに、最終残渣の量は、生物試料の最初の重量の１０％を超えない量とすることが出来、それにより、その残渣を免疫検定に有効に使用することが出来る。バッファＡのみが添加される場合に得られる条件は、従来技術の条件であり、ＰｒＰｒｅｓの検出のために充分な精製度を得るためには、超遠心分離を行なう必要がある。

８０％を超える精製歩留まりは、遠心分離の時間と速度を変更しても得られることが、留意されてよい。即ち、２０，０００ｇより低い速度での２分間から１０分間の遠心分離でもよいし、『ｇ』の数値の増加に比例して、『時間』を減少させてもよい。
有利なことに、前記懸濁液Ｓ２の遠心分離の後に回収される残渣の量に対する、その固体相に含まれるＰｒＰｒｅｓの精製歩留まりの比率は、最初の試料が１００ｍｇの脳に相当する場合に、１０より大きくすることが出来る。

他の有利な態様においては、工程（４）において使用される前記バッファＣが、尿素及びグアニジン又はその混合物からなる群の中から選択されたカオトロピック剤（ chaotropic agent ）を含む。尤も、他の何れのカオトロピック剤を使用してもよい。
尿素の濃度は、好ましくは、０．２５Ｍと８Ｍの間であり、グアニジンの濃度は、好ましくは、０．１Ｍと６Ｍの間である。

バッファＣが少なくとも１種類の界面活性剤と少なくとも１種類のカオトロピック剤との混合物である場合は、バッファＣは、好ましくは、ＳＤＳと尿素の混合物、サルコシルと尿素の混合物、デオキシコール酸塩（ deoxycholate ）と尿素の混合物、サルコシルとグアニジンの混合物、サルコシルとグアニジンと尿素の混合物からなる群から選択される。ＳＤＳと尿素の混合物が選択される場合に、ＳＤＳの濃度は、好ましくは、０．２５〜１％であり、尿素の濃度は、好ましくは、０．２５〜６Ｍである。サルコシルと尿素の混合物が選択される場合に、サルコシルの濃度は、好ましくは、０．２５％と１％の間であり、尿素の濃度は、好ましくは、０．２５Ｍと８Ｍの間である。サルコシルとグアニジンの混合物が選択される場合に、サルコシルの濃度は、好ましくは、０．２５％と１％の間であり、グアニジンの濃度は、好ましくは、０．５Ｍと３Ｍの間である。サルコシルとグアニジンと尿素の混合物が選択される場合に、サルコシルの濃度は、好ましくは、０．２５％と１％の間であり、グアニジンの濃度は、好ましくは、０．５Ｍと３Ｍの間であり、尿素の濃度は、好ましくは、０．２５Ｍと６Ｍの間である。

特に、ウェスタン・ブロッティング法のためには、レムリ（ Laemmli）・バッファ［４％ＳＤＳ、０．１Ｍトリス（Tris）−ＨＣｌｐＨ８、５％ショ糖、及び２％β−メルカプトエタノール］を使用することが出来る。

本発明は、また、生物試料においてＰｒＰｒｅｓを検出する方法であって、
−上記のように定義された前記試料を処理する工程と、
−得られた試料を、必要に応じて、希釈する工程と、
−前記ＰｒＰｒｅｓを、特異的な信号を発生させる、免疫検定法（ＥＬＩＳＡ法、ウェ スタン・ブロッティング法等）等の何れかの適当な分析法を用いて検出する工程と
を含むことを特徴とする方法に関する。
上記の希釈工程は、ＥＬＩＳＡ法によるＰｒＰｒｅｓの検出を可能にするためのバッファＣの中和を可能にする。この希釈は、例えば、最終アルブミン濃度が２％と１０％（ｗ／ｖ）の間の値となるようなアルブミンを含むバッファ、または、１％デオキシコール酸等に基づくバッファを用いて、実施される。

このように処理された生物試料は、有効な濃度のＰｒＰｒｅｓを含むので、そのＰｒＰｒｅｓは、免疫学的方法等の何れの分析法によっても、その試料中において直接検出され得る。

派生例として、本発明は、また、生物試料からＰｒＰｒｅｓを精製する方法であって、
（１）前記生物試料を、３０秒から２時間の間、好ましくは３０秒から１０分の間、８０℃よりも低い温度において、その生物試料の重量の１／４倍と４倍との間の量の、好ましくは１／４倍と１．５倍の間の量の、少なくとも１種類の界面活性剤を含むバッファＡを用いてインキュベーションし、また場合により、それに先立ち、その後に、またはそれと同時に、プロテアーゼを用いてインキュベーションすることによって、オパール様乃至は濁った状態のミセル状又は層状の懸濁液Ｓ１を得る工程と；本発明によれば、前記プロテアーゼは、実際には、前記界面活性剤よりも前、若しくは後、またはそれと同時に添加される、
（２）かかる（１）の工程で得られたミセル状又は層状の懸濁液Ｓ１に、相分離を生じさせるために適当な量の、前記ＰｒＰｒｅｓを可溶化せず且つ誘電率が１０〜２５の溶媒又は溶媒混合物からなるバッファＢを加える工程と、
（３）この（２) の工程で得られた懸濁液を遠心分離する工程と；この遠心分離は、例えば２分間〜１０分間、２０，０００ｇより低い速度、好ましくは３，５００ｇと１７，５００ｇの間の速度で行なわれる；前記ＰｒＰｒｅｓは、最終的に界面に現れる、
（４）その界面に存在する薄膜を回収する工程と、
（５）プロテアーゼを加えないバッファＡで、前記薄膜を再可溶化させる工程と、
（６）該工程（５) で得られた懸濁液を遠心分離する工程と；この遠心分離は、例えば２分間〜１０分間、２０，０００ｇより低い速度、好ましくは３，５００ｇと１７，５００ｇの間の速度で行なわれる；その結果、得られる遠心分離残渣に含まれるＰｒＰｒｅｓの精製歩留まりは、驚くべきことに、７０〜１００％となる；この遠心分離の時間と速度は、同じ結果、即ち、精製歩留まり７０〜１００％のＰｒＰｒｅｓを得ることが出来るように、調整され得る、
（７）得られた残渣を、０．１％と５％の間の濃度、好ましくは０．２５％と１％の間の濃度［バッファＣの体積に基づく（ｗ／ｖ）］の、前記（１) で定義された少なくとも１種類の界面活性剤及び／又は０．１Ｍと８Ｍの間の濃度の少なくとも１種類のカオトロピック剤を含むバッファＣに、室温と１００℃の間の温度、好ましくは８０℃以上の温度において、可溶化させる工程と；それらの温度条件下においては、前記界面活性剤、好ましくはイオン性界面活性剤及び／又は前記カオトロピック剤がＰｒＰｒｅｓを可溶化する、
を必須的に含むことを特徴とする方法に関する。

マイクロエマルジョン、マイクロサスペンション、または、相分離を形成するために加えられるべきバッファＢの量は、図１にブタン−１−オールについて示されたバッファＢの範囲に基づいて確定される。それらの量は、バッファＡとバッファＢのために選択された成分との関数として変化し得る。

派生例として、前記バッファＣ中における前記可溶化工程［前記第１方法の工程（４）又は前記第２方法の工程（７）］は、５分間〜１０分間、８０℃以上の温度で加熱し、その後、例えば、２分間〜１０分間、２０，０００ｇより低い速度、好ましくは３，５００ｇと１７，５００ｇの間の速度での遠心分離を行なうものである。この場合には、ＰｒＰｒｅｓは再可溶化され、最終的に上澄み中に現れる。この条件下で得られた試料は、特に、ＥＬＩＳＡ法によるＰｒＰｒｅｓの検定に適している。

本発明は、更に、生物試料を処理するためのキットであって、その試料を均質化するためのバッファに加えて、上記のように定義された、それぞれ適当な量のバッファＡ、バッファＢ、及びバッファＣを含むことを特徴とするキットに関する。

本発明は、更に、ＰｒＰｒｅｓを検出するためのキットであって、ＰｒＰｒｅｓが検出されるべき生物試料を均質化するための適当な量のバッファと、上記のように定義された、それぞれ適当な量のバッファＡ、バッファＢ、及びバッファＣと、少なくとも１種類の抗ＰｒＰｒｅｓ抗体（ anti-PrPres antibody ）とを含むことを特徴とするキットに関する。

以上に記載された態様に加え、本発明は、その主題を構成する方法の実施に関する具体例及び添付の図面についての以下の記載から明らかとなる他の態様をも含むものである。

以下、本発明の具体例を図面を参照しながら説明するが、それらの具体例は、本発明の主題を説明するための例示に過ぎず、本発明が、以下の記載に何ら限定されるものではないことが、理解されるべきである。

実施例１：現場においてＰｒＰｒｅｓを検定するためのウシの脳の試料の処理： バッファＢの適当な量の選択
−ウシの脳５００ｍｇの試料をすり潰し、５％グルコース溶液中の濃度が２５％（ｗ／ｖ）となるように均質化する。
この均質化を行なうために、先ず、脳試料（５００ｍｇ）とグルコース１ｍｌとをセラミック・ビーズを入れた試験管に投入して、攪拌する。その上澄み（約１．５ｍｌ）を回収した後、ビーズを５００μｌのグルコースに懸濁させて濯ぎ、攪拌する。この得られた上澄みを回収し、先に得られた上澄みと混合する（２ｍｌ）。

−こうして得られたホモジネートの４００μｌ（脳１００ｍｇに対応する）を、２５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと２５％（ｖ／ｖ）トイーン８０とをそれぞれ等部づつ１対１の比率（ｖ／ｖ）で含む混合物と、プロテアーゼＫ（０．１ｍｇ／ｍｌバッファＡ、即ち、０．４ｍｇ／ｇ組織）とを含むバッファＡの４００μｌを用いて、１０分間（５分間を２回）、３７℃の温度で、インキュベートする［工程（１）］。ある変更例においては、バッファＡとして、１０％サルコシルと１０％トリトンＸ１００とを含むものが、有利に使用される。後者のバッファＡは、ＳＤＳを含まないものであり、ＥＬＩＳＡ型の方法を使用し、特異的な抗体によってＰｒＰｒｅｓを検出する場合に動揺を起こさないので、より有利である。
−０〜１０００μｌのブタノール（バッファＢ）を添加せしめる［工程（２）］。

図１は、ウェスタン・ブロッティング法によって定量化されたＰｒＰｒｅｓの精製歩留まり（％）と、添加されたバッファＢの量の関数としての残渣の量（ｍｇ）とを示す。
この図によれば、ブタノールが１０％と５３％の間では、ＰｒＰｒｅｓは懸濁状態に維持され、３０％と５０％の間では、１００％に近い精製歩留まりと１０ｍｇより少ない残渣が得られる。

−３，８００ｇ（４，０００ｒｐｍ、JOUAN 遠心分離機）での遠心分離を１０分間行なった後［工程（３）］、上澄みを捨て、ＰｒＰｒｅｓを含む残渣を回収し、その残渣を、
・０．５％ＳＤＳと０．５Ｍ尿素、若しくは、
・レムリ・バッファ、若しくは、
・０．５％サルコシルと６Ｍ尿素
を含むバッファＣの８０〜１００μｌに、５分間、１００℃において、溶解させる［工程（４）］。

ＰｒＰｒｅｓは、この処理によって、溶解される。この試料は、ＥＬＩＳＡ法やウェスタン・ブロッティング法等の免疫学的検定法にすぐに使用することが出来る。

ＥＬＩＳＡ法を行なうためには、先ず、残渣を、サルコシル（０．２５〜１％）と尿素（０．２５〜８Ｍ）、若しくは、ＳＤＳ（０．２５〜１％）と尿素（０．２５〜１Ｍ）を含むバッファＣに溶解させる。加熱の後、得られた試料を、最終的なアルブミン濃度が２％と１０％の間（ｗ／ｖ）となる量のアルブミンを含むバッファ、または、１％のデオキシコール酸塩を含むバッファで希釈する（４分の１又は２分の１に）。

ある変更例において、希釈された試料は、１００℃において、５〜１０分間の間、加熱され、その後、２０，０００ｇより低い速度、好ましくは３，５００ｇと１７，５００ｇの間の速度で、２〜１０分間、遠心分離される。得られた上澄みを、ＥＬＩＳＡバッファを用いて、４分の１〜２分の１に希釈する。

本例では、ＰｒＰｒｅｓは、ウェスタン・ブロッティング法によって定量される。そこでは、先ず、同体積のレムリ・バッファと混合される。その後、希釈試料を、ウェスタン・ブロッティング法による検出のためにゲル上に置く。検出されたＰｒＰｒｅｓの量が、ＢＳＥに冒されて疾病の最終段階にあるウシの脳から得た一つのホモジネートから、上記の条件と同一の条件下で精製されたＰｒＰｒｅｓの希釈物の線形範囲（正のコントロール）と比較される。

本発明に従う方法によって処理された試料は、バックグランドの影響を受けず、ＰｒＰｒｅｓの、信頼性に富み、特異性の高い、定量的な検定を可能にする。

本発明に従う方法は、ＰｒＰｒｅｓの精製歩留まりの有意の増加を可能にする：
・実際に、バッファＡのみが加えられた場合には、ＰｒＰｒｅｓの歩留まりは４０％程度に過ぎず、固体相と液体相との分離等の理由によって、ＰｒＰｒｅｓの６０％程度の損失が観察される。また、実質的な量の残渣が観察される。このことは、従来技術に記載されたプロトコールがサルコシルを使用する理由となっている。サルコシルは、残渣の量を減少させるが、充分な歩留まりを得るためには、面倒な超遠心分離を必要とする。
・工程（２）によって、固体相中のＰｒＰｒｅｓの歩留まりが増加する。上記の如く、懸濁液Ｓ２の固体相において、８０〜１００％程度の歩留まりが得られると同時に、残渣の量が減少する。

実施例２：現場においてＰｒＰｒｅｓを検定するためのウシの脳の試料の処理： 工程（１）と工程（２）の変更例
−均質化工程は、実施例１で記載された工程と同じである。
−その後、５００ｍｇのウシの脳から得られたホモジネートの２ｍｌを、実施例１で記載された条件と同一の条件下で、バッファＡの２ｍｌを用いてインキュベートする［工程（１）］。
−さらに、実施例１で記載された条件と同一の条件下でバッファＢの３ｍｌを添加する［工程（２）］。
−残りの工程は、実施例１と同じである。

実施例３：現場においてＰｒＰｒｅｓを検定するためのウシの脳の試料の処理： 均質化工程の変更例
−ウシの脳の２５０ｍｇの試料をすり潰し、５％グルコース溶液中の濃度が２５％（ｗ／ｖ）となるように均質化する。

この均質化を行なうために、先ず、脳試料（２５０ｍｇ）と７５０μｌのグルコースとをセラミック・ビーズを入れた試験管に投入し、４０秒間、攪拌する（ＲＩＢＯＬＹＳＥＲ−ＨＹＢＡＩＤ装置）。４００μｌの上澄み（約１．５ｍｌ）を回収する。残りの工程は、実施例１と同じである。

実施例４：ＰｒＰｒｅｓの精製歩留まりと残渣の量との比率に対する異なるバッファＢの 影響の比較：
試料は、バッファＢの量が６００μｌであることを除いて、実施例１で記載された条件と同一の条件下で処理される。

図２は、異なるバッファＢを用いて、ウェスタン・ブロッティング法によって得られた比率を示す。異なるバッファＢは、ペンタノール、ブタノール、イソプロパノール／ペンタノール混合物、エタノール／ヘキサノール混合物、イソプロパノール、及びエタノールであり、混合物は体積に基づいて調製されている。

実施例５：異なる混合物のそれぞれの誘電率の比較とそれらのＰｒＰｒｅｓの精製歩留ま りと残渣の量とに対する影響：
本方法は、実施例４に記載された条件下で行なわれる。

図３は、得られた結果を示す。バッファＢが複数のアルコールの混合物の場合、各アルコールの体積は、その誘電率と混合物に要求される理論的誘電率（例えば、１７）の関数として、アルコールの全体の体積である６００μｌに基づいて計算される。例えば、ヘキサノール／エタノール混合物の場合には、以下の式が得られる。
１３ｙ＋２５（１−ｙ）＝１７
但し、ｙはヘキサノールの百分率であり、１３はヘキサノールの誘電率であり、２５はエタノールの誘電率である。

平均理論誘電率が１５以下の場合は、相分離が観察される。

実施例６：ウェスタン・ブロッティング法によるＰｒＰｒｅｓの検出：
＊プロトコル：
１）ウシの脳の２５％（重量／体積）ホモジネートの４００ｍｇを、２５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと２５％（ｖ／ｖ）トイーン８０の等部（５０／５０）づつ（ｖ／ｖ）の混合物の４００μｌと、プロテアーゼＫ（ＰＫ：濃度−０．１ｍｇ／ｍｌバッファＡ）とを含むバッファＡの４００μｌを用いて、５分間を２回、３７℃で、インキュベートする。
２）ブタノール−１−オールからなるバッファＢの６００μｌ（レーン７と８の試料についてのみバッファＢの１、０００μｌ）を、添加する。
３）この混合物を、１５，０００ｒｐｍ（約１７，０００ｇ）で、５分間、遠心分離する。
４）遠心分離によって得られる残渣を、４％のＳＤＳを含むレムリ・バッファの１００μｌに取り、１００℃で、５分間、加熱する。

＊ウェスタン・ブロッティング法：
得られた試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なうために使用され、トービン（Towbin）ら（ Proc. Natl. Acad. Sci. 、ＵＳＡ、１９７９，７６，４３５０−４３５４）又は C.I. ラスメサス（ Lasmeszas）ら（J. Gen. Virol.、１９９６、前掲）によって記載された条件下で、ニトロセルロース膜に移される。

健康なウシのホモジネートから、実施例１で記載された条件と同じ条件下で得られた負のコントロールにおいて、試料は、信号の強度の理由から、電気泳動ゲル上に置かれる前に、２０分の１に希釈される［９．５ｍｇの健康なウシの脳と０．５ｍｇの感染したウシの脳に対応する１０ｍｇ（１０μｌ）の脳の等価物で負荷された１２％ポリアクリルアミド］。

ＰｒＰｒｅｓの免疫検出を、抗血清ＪＢ００７［Ｒ．デマイメイ（ Demaimay）ら、J. Virol.、１９９７、７１、１２、９６８５−９６８９] （１／５０００）とペルオキシダーゼに結合させた抗ウサギヤギＩｇ（１／２５００）で行なった。免疫活性は、図４に示されるように、ケミルミネッセンス［ＥＣＬ，アマーシャム（Amersham）］によって検出され、定量化され、オートラジオグラフ・フィルム上に視覚化される。

図４は、得られた結果を示し、図３Ａのプロパノール／ヘキサノール曲線に対応する。
図４において、レーン１〜６は、バッファＢとして異なるプロパノール／ヘキサノール混合物を使用して処理された試料に対応し、異なる平均理論誘電率に対応する。レーン８と９は、バッファＢとして１０００μｌのブタノールを使用する方法に従った生物試料に対応する（図１の横軸上の５３％）。この場合には、すべてのＰｒＰｒｅｓが最終的に界面に現れることが、観察される。レーン９と１０は、バッファＢとして６００μｌのブタノールを使用する方法に従った生物試料に対応する（図１の横軸上の４３％）。この場合には、すべてのＰｒＰｒｅｓが最終的に残渣に現れることが、観察される（レーン１０）が、他方、同じ条件下で処理された負のコントロールでは、如何なる信号も検出されなかった（レーン９）。

実施例７：本発明に従って得られた試料からのＰｒＰｒｅｓのＥＬＩＳＡ法：
以下の条件下で、試料が調製される：
−実施例１に記載された条件と同じ条件下において、ウシの脳４００ｍｇの試料をすり潰し、５％グルコース溶液（１．６ｍｌ）中の濃度が２０％となるように均質化する。
−こうして得られたホモジネートの５００μｌを、１０％のサルコシルと１０％のトリトンＸ１００及びプロテナーゼＫ（８０μｇ／ｍｌ）を含むバッファＡの５００μｌを用いて、３７℃で、１０分間（５分間を２回行ない、その中間に攪拌を行なう）、インキュベートする。
−５００μｌのバッファＢ（ブタノール）を添加する。
−この混合物を、１７，６０８ｇを適用することが可能なロータを用いて、１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離する。２０，６２７ｇで、４分間遠心分離することによっても、同じ結果が得られる。
−上澄みを捨て、ＰｒＰｒｅｓを含む残渣を回収し、その残渣を、６Ｍ尿素と０．５％サルコシルを含むバッファＣの１００μｌに、５分間、１００℃において、溶解させる。
−この混合物を、１７，６０８ｇを適用することが可能なロータを用いて、１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離する。２０，６２７ｇで４分間遠心分離することによっても、同じ結果が得られる。この上澄みを、ＥＩＡバッファ（０．５％デオキシコール酸塩を含む燐酸塩バッファ）を用いて、３分の１に希釈する。

ＥＬＩＳＡ法を行なうために、得られた試料は、１ウェルあたり１００μｌの割合で、２ウェルずつ、第１抗ＰｒＰ抗体［８Ｇ８、クレースマン（Kraseman）ら、Molecular Medicine、１９９６、参照］で覆われたプレート上に置かれる。インキュベーションと洗浄の後、アセチルコリンエステラーゼ［グラッシ（Grassi）ら、J. Immunol. Methods 、１９８９、参照］に結合させた第２抗ＰｒＰ抗体（１２Ｆ１０、クレースマンら、１９９６、参照）に反応させる。アセチルコリンエステラーゼのための基質を用いてインキュベーションし、基質［エルマン（Ellmann ）の試薬］の添加後、１５分又は３０分の時点で、４１５ｎｍで、その結果を読む。

図５に示された結果は、ＢＳＥに臨床的に冒されたウシの脳の２０％（重量／体積）ホモジネートであって、健康なウシの脳の２０％（重量／体積）ホモジネート中に、１０分の１、１００分の１、１，０００分の１、及び１０，０００分の１に希釈されたものに関する。

その後、試料は、前記の条件下で処理され、補足抗体としての８Ｇ８と検出抗体としての１２Ｆ１０とを用いたＥＩＡ法によって、検査される。
検査される試料は、ＥＩＡデポー（depot ）バッファ中に希釈される（３分の１の希釈であり、因数３である）。

図５は、得られた結果を示す（ホモジネートの最終希釈度、即ち、負のホモジネートによる希釈度ｘＥＩＡバッファによる希釈度の関数としての信号の吸光度）。半対数曲線は、ＥＩＡ法のすべての検定において従来観察されてきたシグモイド型を有する。また、１０分の１、１００分の１、１，０００分の１に希釈されたホモジネートから得られた曲線に良好な重なり合いがあることが注目される。最後に、本試験の感度のレベルは、１０，０００分の１に希釈された陽性の脳の検出を可能にするものである。

図６においては、１００分の１に希釈された他のホモジネートが、４００ｎｇ／ｍｇの濃度のＰＫによる前記の処理の後に、又は、異なる濃度のＰＫによるホモジネートの直接的な処理の後に、ＥＩＡ法によって試験された。その結果、精製されていないホモジネートのＰＫによる直接的な処理では、低いＰＫ濃度（PrPcの不完全な破壊）の負のコントロールについては高い信号を示すか、または、高いＰＫ濃度では陽性のウシについて低い信号を示すことが見出される。従って、本例は、ＰｒＰｒｅｓを正しく検出しようとすれば、前記の方法でホモジネートを処理することが、必須の要件であることを示している。

実施例８：異なるバッファＣの比較：
採用された試料処理プロトコルは、実施例７のものと同じである。
図７は、得られた結果を示す。

グアニジンが有効のように思われ、また、（尿素がＥＬＩＳＡ法についてより寛容であることから）尿素／グアニジンの組合わせが最も価値が高いように思われる。

上記の記載から明らかなように、本発明は、本明細書中で明示的に記載された実施の態様、具体例、適用の態様に何ら限定されず、本発明の枠組み又は範囲を逸脱しない限りにおいて、当業者に自明なすべての変更を包含するものである。

バッファＢ（ブタノール）の量の、ＰｒＰｒｅｓの精製歩留まり（％）と遠心分離後に得られる残渣の量に対する影響を示す図である。 異なるバッファＢの、ＰｒＰｒｅｓの精製歩留まり（％）と遠心分離後に得られる残渣の量に対する影響を示すグラフである。 バッファＢとして使用される異なるアルコール混合物の比較による、上記記載において定義された平均理論誘電率の役割を示す図である。 ウェスタン・ブロッティング法によってＰｒＰｒｅｓを検出する具体例を示す図である。 本発明に従う処理試料の異なる希釈物に関する、ＥＬＩＳＡ法の感度と精製歩留まりを示す図である。 ホモジネート上で直接行なわれるＥＬＩＳＡ法を示す図である。 異なるバッファＣの比較を示す図である。

Claims (15)

1. 生物試料から異常な形態のプリオンタンパク質（ＰｒＰｒｅｓ）を精製する方法であって、
   （１）前記生物試料を、３０秒から２時間の間、８０℃よりも低い温度において、該生物 試料の重量の１／４〜４倍の量で少なくとも１種類の界面活性剤を含むバッファＡ を用いてインキュベーションし、更にそれに先立ち、その後に、またはそれと同時 に、プロテアーゼを用いてインキュベーションすることによって、懸濁液Ｓ１を得 る工程と、
   （２）かかる（１）の工程で得られた懸濁液Ｓ１に対して、相分離を生じさせるに適した 量において、前記ＰｒＰｒｅｓを可溶化することなく、相分離を形成し得る、（i) ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチルプロパン−１−オール、イ ソプロパノール、及びペンタノールからなる群より選択されたＣ₃ 〜Ｃ₆ アルコー ル、又は（ii）（ａ）イソプロパノールとペンタノール、（ｂ）エタノールとヘキ サノール、（ｃ）ブタノールとペンタノール、（ｄ）プロパノールとヘキサノール 、及び（ｅ）プロパノールとペンタノールの各組合せからなる群より選択されたア ルコール混合物からなるバッファＢを、加える工程と、
   （３）相分離を生じるように、該（２) の工程で得られた懸濁液Ｓ２を遠心分離する工程
   と、
   （４）その界面に存在する薄膜を回収する工程と、
   （５）懸濁液を形成するために、プロテアーゼを加えることなくバッファＡで前記薄膜を 再可溶化させる工程と、
   （６）残渣を形成するために、かかる工程（５）で得られた懸濁液を遠心分離する工程と
   、
   （７）得られた残渣を、（i)０．１％〜５％の間の濃度［バッファＣの体積に基づく（ｗ ／ｖ）］の、前記（１）で定義された界面活性剤、（ii）０．１Ｍ〜８Ｍの間の濃 度のカオトロピック剤、及び（iii）該（i）で定められる化合物と該（ii）で定め られる化合物との混合物からなる群より選択される少なくとも１種類の化合物を含 むバッファＣに、室温〜１００℃の間の温度において、可溶化させる工程と、
   を必須的に含むことを特徴とする方法。
2. 生物試料から異常な形態のプリオンタンパク質（ＰｒＰｒｅｓ）を精製する方法であって、
   （１）前記生物試料を、３０秒から２時間の間、８０℃よりも低い温度において、少なく とも１種類の界面活性剤を含むバッファＡを用いてインキュベーションし、そして それに先立ち、その後に、またはそれと同時に、プロテアーゼを用いてインキュベ ーションすることによって、懸濁液Ｓ１を得る工程と、
   （２）かかる（１）の工程で得られた懸濁液Ｓ１に対して、相分離を生じさせるに適した 量において、前記ＰｒＰｒｅｓを可溶化することなく、相分離を形成し得る、（i) ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチルプロパン−１−オール、イ ソプロパノール、及びペンタノールからなる群より選択されたＣ₃ 〜Ｃ₆ アルコー ル、又は（ii）（ａ）イソプロパノールとペンタノール、（ｂ）エタノールとヘキ サノール、（ｃ）ブタノールとペンタノール、（ｄ）プロパノールとヘキサノール 、及び（ｅ）プロパノールとペンタノールの各組合せからなる群より選択されたア ルコール混合物からなるバッファＢを加える工程と
   （３）相分離を生じるように、該（２) の工程で得られた懸濁液を遠心分離する工程と、
   （４）その界面に存在する薄膜を回収する工程と、
   （５）懸濁液を形成するために、プロテアーゼを加えることなく、バッファＡを用いて前 記薄膜を再可溶化させる工程と、
   （６）残渣を形成するために、かかる工程（５）で得られた懸濁液を遠心分離する工程と
   、
   （７）得られた残渣を、（i)０．１％〜５％の間の濃度［バッファＣの体積に基づく（ｗ ／ｖ）］の、前記（１）で定義された界面活性剤、（ii）０．１Ｍ〜８Ｍの間の濃 度のカオトロピック剤、及び（iii）該（i）で定められる化合物と該（ii）で定め られる化合物との混合物からなる群より選択される少なくとも１種類の化合物を含 むバッファＣに、室温〜１００℃の間の温度において、可溶化させる工程と、
   を必須的に含むことを特徴とする方法。
3. 前記生物試料が組織又は器官である場合に、かかる試料が、中性バッファと等張性バッファからなる群から選択された均質化バッファ中において、前記工程（１）の前に、均質化されることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記工程（１）のインキュベーションの時間が、３０秒〜１０分の間であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１つに記載の方法。
5. 前記バッファＡ及び／又は前記バッファＣが、
   −ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、サルコシル（ラウロイルサルコシン）、コール 酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム等の陰イオ ン性界面活性剤と、
   −ＳＢ３−１０（デシルスルホベタイン）、ＳＢ３−１２（ドデシルスルホベタイン） 、ＳＢ３−１４、ＳＢ３−１６（ヘキサデシルスルホベタイン）、ＣＨＡＰＳ、デオ キシＣＨＡＰＳ等の両性界面活性剤と、
   −Ｃ１２Ｅ８（ドデシルオクタエチレングリコール）、トリトンＸ１００、トリトンＸ １１４、トイーン２０、トイーン８０、ＭＥＧＡ９（ノナノイルメチルグルカミン） 、オクチルグリコシド、ＬＤＡＯ（ドデシルジメチルアミンオキシド）、ＮＰ４０等 の非イオン性界面活性剤と、
   −イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤の混合物、２種類のイオン性界面活性剤 の混合物、イオン性界面活性剤と両性界面活性剤の混合物等の界面活性剤混合物と、からなる群から選択された少なくとも１種の界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１つに記載の方法。
6. 前記工程（１）で採用される温度が、室温〜５０℃の間の温度であることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１つに記載の方法。
7. 前記工程（１）で採用される温度が、３７℃であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 前記工程（１）において、バッファＡ中に存在する界面活性剤の量が、前記生物試料の重量の１／４〜１．５倍の間であることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１つに記載の方法。
9. 前記工程（７）の可溶化において、バッファＣにおける前記界面活性剤の濃度が、０．２５％〜１％の間の濃度［バッファＣの体積を基準にして（ｗ／ｖ）］であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
10. 前記工程（７）の可溶化が、８０℃或いはそれ以上の温度で行なわれることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
11. 前記工程（３）と前記工程（６）の遠心分離が、２分間〜１０分間、２０，０００ｇ以下の速度で行なわれることを特徴とする請求項１乃至１０の何れか１つに記載の方法。
12. 前記工程（３）及び工程（６）の遠心分離が、３，５００ｇ〜１７，５００ｇの間の速度で行なわれることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 前記バッファＣが、尿素及びグアニジン又はそれらの混合物からなる群の中から選択されたカオトロピック剤を含むことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
14. 前記バッファＣにおける前記工程（７）の可溶化が、５分間〜１０分間、８０℃或いはそれ以上の温度で加熱し、その後、遠心分離を行なうことを特徴とする請求項１乃至１３の何れか１つに記載の方法。
15. 生物試料中のＰｒＰｒｅｓを検出する方法であって、
    −前記請求項１乃至１４の何れか１つに従って前記試料を処理する工程と、
    −得られた試料を、必要に応じて、希釈する工程と、
    −前記ＰｒＰｒｅｓを所定の分析法を用いて検出する工程と
    を含むことを特徴とする方法。

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