BG64291B1 - М...'од и ки' за ...к''рахиран... на прион про'...ин - Google Patents

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до метод за екстрахиране на прион протеин от биологичен материал, като например животинска тъкан или биологична течност. Процесът на екстрахиране позволява тестване за наличие на анормален прион протеин, например за диагностика на трансмисивни спонгиформни енцефалопатии.

Предшестващо състояние на техниката

Прион заболяванията или трансмисивни спонгиформни енцефалопатии (TSEs) причиняват прогресивни дегенеративни нарушения на централната нервна система, водещи до смърт (Prusiner, Med. Res. Rev. 16: 487, 1996; Weissman, FEBS Letters 289:3, 1996). Скрапия, TSE при овцете, е описана найнапред преди 200 години (Pattisson, Vet. Rec. 123: 661, 1988) и е прототип на тези заболявания. Няма известни лечения на тези заболявания и няма известни антемортем (след умъртвяването) тестове за наличие на заболяването в дадено животно. Прион заболяванията се причиняват от конформационно изменение на нормалния гостоприемников прион протеин в анормална структура, която формира агрегати. Поради избухналата наскоро спонгиформна енцефалопатия по говедата в Англия и връзката между това TSE и новия вариант, Creutzfeld-Jakob (Bruce et al., Nature 389: 498, 1997), човешки TSE, налице е необходимост от нови методи, които са едновременно чувствителни и точни за диагностициране на TSEs. В идеалния случай тази диагноза може да бъде използвана за тестване на животни, преди те да покажат клинични симптоми и преди да влязат в хранителната верига на човека или във фармацевтични препарати за приложение върху хора.

Повечето от методите, използвани за получаване и пречистване на причинителите на TSEs, включват комплексна последователност от обработка с ензим и повърхностно активно вещество и центрофугиране (Bolton et al., J. Virol. 53: 596, 1985). Анор малният прион протеин е напълно разтворим в обичайните биологични буфери. Един метод за получаване на пречистен анормален прион протеин е хроматографиране с хидрофилно взаимодействие (HILIC) (Alpert, J., Chromatogr. 499: 177, 1990), която е инверсията на обратнофазова хроматография. Обикновено се започва със 70-85% органичен разтворител и се пуска низходящ органичен градиент. Елуацията е в посока от най-малка към най-голяма полярност. Наймобилните органични фази на HILIC са конкурентни с протеини, които обикновено не се срещат свободни във воден разтвор, като мембранни протеини (Jeno et al., Anal. Biochem. 215: 292, 1993), β-амилоиден пептид (1-43) (Alpert et al., Eighth Symposium of the Protein Society, July 1994, San Diego, CA) и хистони (Lindner et al., J. Chromatogr. A. 782: 55, 1997). Повърхностно активни вещества и други денатуранти елуират във или близко до празен обем, докато протеините и пептидите са най-общо добре съхранени.

След HILIC пречистване, прион протеинът може да бъде установен с помощта на капилярно електрофоретично имунологично изпитване (Schmerr and Jenny, Electrophoresis 19: 409, 1998) или чрез капилярно изоелектрично фокусиране (Schmerr et al., J. Chromatogr. A. 802: 135, 1998).

Както бе отбелязано по-горе, настоящите аналитични методи за откриване на анормален прион протеин се използват обикновено след умъртвяването (post mortem) .така че е необходимо изпитване преди умъртвяването за анормален прион протеин. В допълнение, необходим е метод за изолиране на анормален прион протеин без етапи на ултрацентрофугиране, които изискват оборудване, което не винаги е достъпно за ветеринарните диагностични лаборатории. Наличието на анормален прион протеин като агрегати, чийто голям размер улеснява формирането на утайка в центрофужните епруветки, изисква центрофугиране. Такива агрегати е трудно да бъдат разтворени и открити в последващи етапи. Използването на центрофугиране също подлага на опасност възможността за откриване на мономерен анормален прион протеин, потенциално понижаващ чувствителността на която и да е проба. Налице е дори по-голяма необходи мост за бързо изпитване, като качествено имунологично изследване, за тестване на стадото за инфекция с TSE. Така, в областта е налице необходимост от ефективен, прост метод за екстрахиране на анормален прион протеин.

В допълнение, антителата, които са продуцирани, откриват анормалния прион протеин в тяхната мономерна форма, с изключение на антителата, продуцирани срещу нативния анормален прион протеин (Korth et al., Nature 390: 74, 1997). Като резултат, анормалният прион протеин следва да бъде деагрегиран със силни повърхностно активни вещества или денатуриращи средства; последните трябва след това да бъдат отстранени преди провеждането на повечето имунологични изследвания. Така, налице е необходимост в областта от бърз, прост метод за екстракция на прион протеин, свободен на детергенти или денатуриращи средства за имунологични анализи.

Настоящото изобретение предлага нов метод за екстрахиране на всички размери от анормалния прион протеин, независимо дали е в агрегирана или в мономерна форма. Изобретението дава възможност за тестване за анормален прион протеин в проби от живо животно, например използвайки имунологични изследвания. Например, диагнозата може да се основава на кръвни проби, които ще позволят тестването на живи животни и ще улеснят отстраняването на инфектираните животни от ятата или стадата и ще предотвратят възможното замърсяване на продуктите за консумация.

Техническа същност на изобретението

Изобретението предлага метод за екстрахиране на анормален прион протеин от биологичен материал, за който се предполага, че съдържа анормален прион протеин. Методът включва инкубиране на смес от екстракционния разтворител и изотоничен или хипотоничен воден препарат на биологичния материал в условия, ефективни за екстрахиране на анормален прион протеин от биологичния материал в екстракционния разтворител. Екстракционният разтворител е полярен органичен разтворител, в който анормалният прион протеин може да бъде разтворен, и може да се смеси с хипотоничен или изотоничен воден разтвор, но не може да се смеси с лиотропен воден разтвор. Лиотропната активност на сместа се повишава така, че посоченият екстракционен разтворител се отделя като отчетлива фаза от водния препарат на биологичния материал за добиване на екстракционен разтворител, съдържащ който и да е анормален прион протеин от биологичния материал.

Изобретението по-нататък предлага метод за откриване наличието на анормален прион протеин в дадено животно, включващ изпитване на отделен екстракционен разтворител, получен както е описано по-горе за анормален прион протеин.

Предложен е също кит за изолиране на анормален прион протеин от биологична проба. Китът съдържа екстракционен разтворител, които има характеристиките, изложени по-горе, и лиотропна сол или воден разтвор на лиотропна сол за добавяне към воден препарат на биологична проба, така че органичният разтворител става несмесваем с водния препарат. В друг вариант на изобретението китът включва проба за изпитване на прион протеин, за предпочитане проба за анормален прион протеин.

Така, цел на изобретението е да предложи бърз метод за изолиране на анормален прион протеин от биологична проба.

Друга цел на изобретението е да предложи метод за ранно откриване на организми, инфектирани с анормален прион протеин.

Следваща цел на изобретението е да предложи екстракционна техника за изолиране на анормален прион протеин за биологична проба.

Още една цел на изобретението е да опрости аналитичното тестване на биологичен материал от животно или човек за наличие на анормален прион протеин.

Още една цел на изобретението е да предостави екстракт, съдържащ анормален прион протеин за следващо тестване или пречистване.

Тези или други цели на изобретението са представени по-детайлно в съпътстващите фигури и подробното описание на изобретението.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 - хроматограма от HILIC на ¹²⁵1-прион протеин, както е установен чрез радиоактивност (отворени кръгове) и чрез абсорбция при 280 пт (плътна линия);

фигура 2 - антитяло свързване на HILIC фракции на ¹²⁵1-прион протеин.

Описание на изобретението

Изобретението предлага метод за екстракция на анормален прион протеин от биологичен материал. Екстрахираният продукт може да бъде тестван с имуноизпитване за анормален прион протеин. Тази екстракция на анормален прион протеин, в съчетание с имунологично изпитване, може да бъде използвана за диагностика на живи организми за инфекция с TSE, и ще бъде широко използвана за тестване на TSE инфектирани животни и хора. Така, настоящото изобретение преимуществено позволява тестване за прион протеин в клинични и ветеринарни лаборатории, където липсват скъпи центрофуги и позволява тестване в полеви условия.

Воден препарат на биологичния материал се комбинира с екстракционен разтворител за формиране на смес. Екстракционният разтворител е полярен органичен разтворител, в който анормалният прион протеин е разтворим и може да се смеси с нелиотропен изотоничен воден разтвор, но е несмесваем с лиотропен воден разтвор. В специфично предпочитан вариант на изпълнение екстракционният разтворител е хексафлуоро-2-пропанол (също наречен хексафлуороизопропанол или HFIP). Макар и в примерите по-долу обемите на екстракционния буфер и воден препарат на биологичен материал да са почти еднакви, може да бъде използвано което и да е съотношение, което дава две ясно отчетливи фази, както е описано по-горе.

В предпочитан вариант на изпълнение, сместа се инкубира при температура в границите около 20°С до около 100°С. Независимо от това, може да бъде използвана която и да е температура, при която както екстракционният разтворител, така и водният препарат на биологичния материал са в течна фаза, т.е., между точката на замръзване и точката на кипене.

Сместа от екстракционен разтворител - биологичен материал се инкубира при условия, ефективни за екстрахиране на анормален прион протеин от биологичния материал в екстракционния разтворител. След инкубация, лиофилната активност на сместа се повишава така, че екстракционният разтворител се разделя от водния препарат. Екстракционният разтвор, съдържащ прион протеин, се отстранява от водния препарат на биологичния материал.

Съгласно изобретението, лиотропната активност на сместа екстракционен разтворител-воден препарат, може да бъде повишена чрез добавяне на лиотропна сол. Солта може да бъде добавена в твърда форма директно към сместа или като концентриран воден разтвор. Предпочитани примери на лиотропни соли включват натриев и амониев сулфат. В специфичен вариант на изпълнение, дадени по-долу, йонната сила се повишава чрез добавяне към сместа на 0.5 М натриев сулфат в съотношение около 1:1 (об./об.).

Изобретението притежава изключително предимство, тъй като не изисква получаване на материал от аутопсия или некропсия. Съгласно изобретението биологичният материал може да бъде проба от живо животно. Методът от изобретението предлага екстракция на анормален прион протеин от биологична течност или органична биопсия за аналитично тестване. Обратно, биологичният материал може да бъде получен от аутопсия или некропсия, например на животински продукти за използване за храна, фармацевтични, козметични или други продукти за използване от хора или с други животни. В друг вариант на изпълнение методът от изобретението може да бъде използван за отстраняване на прион протеин от такива материали за осигуряване на факта, че инфекциозни приони не са трансмитирани.

Екстракционният метод от изобретението може да бъде използван за екстракция както на нормален прион протеин, така и на анормален такъв. Чрез предварителна обработка на биологична проба с протеиназа-К, нормалният прион протеин може да бъде разграден. Така, там, където се желае само анормален прион протеин, водният препарат на биологичния материал може да бъде предварително обработен с протеиназа-К преди смесването му с екстракционния разтворител.

Екстракционният разтвор, съдържащ който и да е прион протеин, може да бъде изсушен за добиване на екстракционна утайка. Прион протеинът в разтвора или екстракционната утайка може да бъде пречистен понататък, например чрез хроматография с хидрофилно взаимодействие.

Анормалният прион протеин в едно животно може да бъде установен чрез изпитване на материала в отделената екстракционна утайка за неговото наличие. За предпочитане, методът за изпитване е имунологично изпитване за анормален прион протеин. Пробата може да бъде обработена с протеиназа-К преди изолирането на прион протеина, така че не се изолира нормален прион протеин.

В друг аспект изобретението предлага китове за изолиране на анормален прион протеин от биологична проба. В един вариант китът съдържа екстракционен разтворител, например хексафлуоро-2-пропанол. Китът понататък включва лиотропна сол или воден разтвор на лиотропна сол за прибавяне към водния препарат на биологична проба, така че екстракционният разтворител става смесваем с водния препарат.

Изобретението по-нататък предлага кит за откриване наличието на анормален прион протеин от биологична проба. В допълнение към компонентите на кита, описан по-горе, настоящият кит включва проба за установяване на анормален прион протеин. Предпочитаната проба за откриване наличието на анормален прион протеин е имунопроба.

Макар този метод за екстракция и китът да са били създадени най-напред за диагностика на скрапия (TSE в овце), те са приложими за диагностика на други TSE в други гръбначни, по-специално при бозайници и птици, като хора, говеда, свине, лос, сърна, домашни птици и гризачи. Анормален прион протеин може да бъде установен в тъкани на животни и хора най- рано две седмици след инфекцията. Важно приложение на метода от това изобретение е установяване на анормален прион протеин в човешка кръв. Тази техника може да бъде из ползвана също за екстрахиране на анормален прион протеин от обработен материал, използван за продуциране на фармацевтични средства за хора или други продукти, предназначени за приложение при хора, включително заместители на храна.

Както е използван тук, терминът “около” или “приблизително”, означава в рамките на 20%, за предпочитане в рамките на 10%, и по-предпочитано в рамките на 5% от дадена степен или интервал.

Биологични материали

Настоящото изобретение позволява екстрахирането на прион протеин от биологичен материал. Най-общо прион протеините се намират в гръбначни, както е дискутирано по-горе. Поради това, при повечето обстоятелства биологичният материал ще бъде от животно или човек. Прион протеинът може да бъде продуциран също по време на ферментационни процеси с еукариотни клетки. Той може да бъде експресиран като рекомбинантен прион протеин. От по-голям интерес е възможността за инцидентна експресия на ендогенен прион протеин от клетки, които са били рекомбинантно модифицирани да експресират друг протеин. Тази възможност е по-вероятна, ако клетките са с неврален произход, като например PC 12 клетки. В този случай, биологичният материал може да бъде ферментационен продукт, например рекомбинантен протеин.

Примери на биологични материали от животни включват, но без да се ограничават до тъкани, като мозък, мускули (включително сърце), черен дроб, апендикс, панкреас, органи на гастроинтестиналния тракт, кожа и лимфоидни тъкани, като тимус, слезка, сливици, лимфни възли и др. Обратно, биологичният материал може да бъде биологична течност. Терминът биологична течност се отнася до цереброспинална течност, кръв, серум, плазма, мляко, урина, слюнка, сълзи, мукозни секреции, пот, семенна течност и телесни течности, съдържащи тези компоненти. Той може също да се отнася до културална течност (или културална среда), използвана за продуциране на рекомбинантни протеини или съдържаща клетки в суспенсия преди трансплантация. От термина “биологичен материал” са обхванати продуктите, направени от животински органи или тъ кани, включително серумни протеини (като албумин и имуноглобулин), хормони, храна и обработени хранителни продукти, заместители на храни, костно месо, храна за животни, екстрацелуларни матриксни протеини, желатин и други животински странични продукти, използвани за производство или крайни продукти.

Когато биологичният материал е тъкан или твърд продукт, той трябва най-напред да бъде разтворен или суспендиран във воден разтвор, така че да бъде подходящ за екстракционния процес. Например, мозъчна тъкан може да бъде суспендирана в захарен разтвор (напр. 0.32 М захароза) при 10% тегл. за обем. Други хипотонични или изотонични разтвори включват 5% декстроза, фосфатно буферен разтвор, три-буферен разтвор, HEPES-буферен разтвор или който и да е от горните буфери. Биологичният материал може да бъде хомогенизиран, грундиран, или разрушен по друг начин за максимализиране контакта между екстракционния разтворител и биологичния материал. Обаче, ако биологичната течност е биологичният материал, добавянето на течност най-вероятно не е необходимо, освен за разреждане йонната сила на биологичната течност, което да позволи смесваемостта на екстракционния разтворител.

Прион протеин

Терминът “прион протеин”, както е използван тук, се отнася до нативен протеин, експресиран в неутрална тъкан, по-специално мозъка и при по-ниски нива в лимфоидни тъкани и всички други тъкани. При някои обстоятелства, прион протеинът възприема патогенна конформация, която тук се нарича анормален прион протеин. Определени мутации на прион гена в някои индивиди явно предразполагат прион протеинът да възприеме патогенната конформация. Излагането на един организъм на трансмисивно инфекциозно средство, приона, може да индуцира също конформационно изменение, водещо до патологията.

Анормалният прион протеин е по-малко податлив на протеолиза в сравнение с нормалния прион протеин. Третиране на биологичен материал с протеиназа, по-специално протеиназа-К, разгражда нормалния протеин, но не и анормалния прион протеин.

В специфични примери по-долу, по метода от изобретението се екстрахира овчи анормален прион протеин (PrP^sc). Обаче, с помощта на метода от изобретението могат да бъдат екстрахирани също и други прион протеини от други видове, по-специално тези, отбелязани по-горе.

В категорията на анормалния прион протеин са включени също човешки прион протеини, установени в невродегенеративните заболявания Kuru, Creutzfeld-Jakob Disease (CJD), Gerstmann-Straussler Syndrom (GSS), и фатално семейно безсъние. Някои случаи на CJD и GSS са свързани с известни мутации на прион гена. CJD също е свързан с излагане на TSEs. Например, както е отбелязано по-горе, CJD се свързва с говежда спонгиформна енцефалопатия. Настоящото изобретение позволява, за първи път, екстракция на анормален прион протеин от пациенти преди аутопсия. Установяването на екстрахиран анормален прион протеин може да бъде използвано за диагностициране на което и да е от тези заболявания.

Скрапия (овце, кози) и говежда спонгиформна енцефалопатия (крави) са заболявания на животните от анормален прион протеин. Прион протеините са изолирани също при пилета, норки, прасета, мишки, хамстер и морски свинчета. Нещо повече, мишка, хамстер и морско свинче могат да развият спонгиформна енцефалопатия чрез излагане на въздействието на приони от човек или други животински източници. По метода от изобретението може да бъде установен или екстрахиран прион протеин от който и да е от тези източници.

Екстракционен разтворител и условия Екстракционният разтворител за приложение в настоящото изобретение следва да бъде способен на разделяне като отчетлива фаза от вода или воден разтвор при лиотропни условия. Същевременно, прион протеинът следва да бъде разтворим в екстракционния разтворител. Някои полярни органични разтворители отговарят на тези критерии. Предпочитаният полярен органичен разтворител е хексафлуоро-2-пропанол. Други разтворители, които могат да бъдат използвани, включват изопропанол; 1,1,1трифлуоро-2-пропанол (TFIP); 2,2,3,3-тет рафлуоро-1-пропанол (тетНР); перфлуороt-бутилов алкохол (PFtBA); 1,1,1,3,3,3-хексафлуороацетон (HFA); трифлуорооцетна киселина (TFA); 2,2,2-трифлуоро-1-етанол (TFE); 2,2,3,3,4,4,4-хептафлуоро-2-пропанол (HFB); 1,1,1,3,3,4,4,4-октафлуоро-2-бутанол (OFIB); 1-метил-2-пиролидинон (NMR); виж Wille et al., J. Mol. Biol., 259: 608, 1996. Други възможни разтворители, които могат да бъдат оценени, включват DMSO; тетрахидрофуран; и други подобни. Обратно, може да бъде използван разтворител, който е несмесваем с вода, но в който прион протеинът е разтворим.

В специфичен вариант на изпълнение разтворителят се смесва с вода, например при физологична йонна сила (изотоничен воден разтвор) или по-нисък от физиологична йонна сила (хипотоничен воден разтвор). Обаче, когато буферът съдържа лиотропни соли, намиращи се в концентрации (или йонна сила) над праговата стойност, екстракционният разтворител е неразтворим във водния разтвор: двете фази разделят на слой на екстракционния разтворител и слой на воден разтвор. Те са отнесени тук като “лиотропни състояния”. Стойността за йонна сила на лиотропна сол на водния разтвор, която достига лиотропни състояния, може да варира в зависимост от избрания екстракционен разтворител и използваната сол(и). Тя може да бъде лесно определена чрез титрационна или друга систематична вариация на концентрацията на лиотропната сол, с тестване смесваемостта или несмесваемостта на екстракционния разтворител с водния разтвор. Както е използвано тук, воден разтвор с йонна сила на лиотропна сол, при която екстракционният разтворител се разделя от вода, се отнася като лиотропен воден разтвор. Водни разтвори, съдържащи по-ниски концентрации на лиотропни или физиологични соли, като изотонични буфери, се считат за нелиотропни разтвори.

Най-общо, в процеса на разтворима екстракция се използват почти еднакви обеми от екстракционния разтворител и водния препарат на биологичния материал. Обаче, съотношението на екстракционния разтворител спрямо водния препарат може да граничи от около 5:1 до около 1:5, за предпочитане от около 3:1 до около 1:3.

След смесване на екстракционния разтворител с водния препарат сместа може да бъде инкубирана за същия период от време и при определена температура за повишаване екстракцията на прион протеина в екстракционния буфер. Инкубационното време може да варира от 1 min до 1 h, и може да бъде определено чрез анализиране на екстрахирания материал за наличие на прион протеин. След като количеството на прион протеина в ектракционния материал спрямо времето достигне платото, което може да бъде тествано с помощта на хроматографски или имунологични техники, или и двете, както е описано в примерите, допълнителна инкубация няма да има влияние върху добива на прион протеина. В специфичен вариант на изпълнение, инкубационното време е 5 min.

В допълнение, температурата на инкубация може да бъде доведена до повишаване ефективността на екстракция, при условие, че екстракционният разтворител и водният разтвор са и двата течности при избраната температура. По-високи температури, т.е., над стайна температура, се предпочитат, доколкото те повишават разтворимостта на прион протеина в екстракционния разтворител. Специално приложими са температури в рамките на интервала от около 50 С60 С. Колкото до други вариации, като йонната сила на водния препарат и времето на инкубация, оптималната температура може да бъде определена чрез рутинно експериментиране и тестване.

Разделяне на фазите

За повишаване на йонната сила на водния разтвор може да бъдат използвани различни лиотропни соли, индуцирайки по този начин разделянето на фазите. Сред предпочитаните соли са натриев сулфат и амониев сулфат, които са лиотропни. И двата се използват при концентрация, под която преципитират протеините. Например, в специфичен вариант към еднакъв обем от сместа екстракционен разтворител/воден препарат, се добавя 0.5 М разтвор на натриев сулфат, което води до крайна концентрация от 0.25 М натриев сулфат. Тази концентрация е достатъчна да индуцира разделянето на фазите на HFIP и вода. Други соли също могат да се използват при условие, че те достигат необходимата лиотропна активност при кон центрация, при която те са разтворими. Терминът “лиотропна активност” се използва тук за структуро-формиращите свойства на разтвор на лиотропна сол. Лиотропната активност се достига чрез достигане на достатъчна концентрация от лиотропната сол за индуциране на разделянето на фазите на органична и водна фази. Избегнати са протеин преципитиращите концентрации на лиотропната сол.

“Лиотропни” или “структуро-формиращи” соли, също известни като космотропи, съдействат за порядъка на водния разтвор, като по този начин изключват разтворените органични вещества. Ако органичното разтворено вещество е екстракционния разтвор, става разделяне на фазите. Ако това е протеин, той е свързан със солта извън разтвора. Добри структурообразуващи соли включват натриев или амониев сулфат, фосфати, цитрати и други (Washabaugh and Collins, J. Biol. Chem., 261: 12477, 1986). (Разрушаващите структурата соли, или хаотропи, включват гуанидин хидрохлорид, натриев перхлорат, натриев бромид и др. Те имат противоположен ефект, насочват органичните разтворени вещества във воден разтвор). Йонната сила на водния разтвор е функция на тоталния брой йони в разтвора, що се отнася до това дали те са структуроформиращи или структуроразрушаващи йони. Терминът “йонна сила” се отнася до концентрацията на една сол.

Както е дискутирано по-горе, лиотропната сол може да бъде добавена като твърдо вещество или концентрирана течност, при условие, че концентрацията на крайната лиотропна сол е ефективна да индуцира разделянето на фазите. За предпочитане, крайното съотношение на екстракционния разтворител спрямо водната фаза (което включва водния препарат на биологичен материал и разтвор на която и да е сол) след повишаване на лиотропната активност на сместа е около 1:10 до около 10:1, за предпочитане (и както е изложено по-долу в примерите) около 1:3 до около 3:1 при условие, че при по-ниско съотношение на екстракционния разтворител спрямо водната фаза, крайната концентрация на сол е все още достатъчно висока, за да индуцира разделянето на фазите.

След повишаване на лиотропната ак тивност, екстракционният разтворител, който сега съдържа който и да е прион протеин, намиращ се в биологичния материал, се разделя от водния препарат. Процесът на разделяне отнема няколко минути и завършва когато двете фази са ясни и се наблюдава дискретно разделяне между тях. След като двете фази се разделят напълно, екстракционният разтворител, сега съдържащ който и да е прион протеин, може да бъде отстранен или изтеглен, например чрез изтегляне с пипета или фуния, или със сепарационна колба.

Екстракционният разтворител, съдържащ който и да е прион протеин (наречен тук “екстракт”), може да бъде изсушен, например чрез изпаряване, чрез лиофилизация или вакуумно центрофугиране за добиване на високо концентриран или сух екстракт. Екстрактът може да съдържа други компоненти, включително клетъчни липиди, липидни мембраносвързващи протеини и други повече хидрофобни клетъчни компоненти. По желание, прион протеинът може да бъде изолиран или пречистен от тези компоненти, например чрез хроматография с хидрофилно взаимодействие, както е посочено в примерите по-долу, или други хроматографски техники (катионообменна хроматография, гел-проникваща хроматография, обратнофазова хроматография и афинитетна хроматография, например върху антитяло колона).

Обратно, концентрираният или изсушен екстрактен материал може да бъде анализиран директно, както е описано по-долу, за установяване на анормалния прион протеин.

Детектор на прион протеин; имунопроби

В областта са известни различни начини за изпитване на прион протеин, включително изпитване за селективно откриване на анормален прион протеин. Капилярната гел електрофореза е доказано, че е ефективно аналитично средство за анормален прион протеин (Schmerr and Jenny, Electrophoresis, 19:409, 1998). Предпочитан метод е имунологичният, например както е описано от Schmerr and Jenny, по-горе. Антисерумът, описан в този източник, е специфичен за анормалния прион протеин, тъй като е установено, че реагира в оцветяване по Western с инфектиран със скрапия мозък, но не и в нормален мозък. Друг антисерум, реактивен с прион протеин, е добре известен в областта. Предпочитана имунопроба е ELISA (например, Grathwohl et al., J. Virol. Methods, 64:205, 1997).

Така, в някои случаи, откриване присъствието на прион протеин, и по-специално анормален прион протеин, се основава на биофизичните и химични характеристики на прион протеина. Те включват устойчивост на протеиназа (по-специално на протеиназа К) и профилно разграждане (независимо дали с протеолитични ензими, гликолитични ензими, химикали, нагряване, денатуранти и др.). Могат да бъдат оценени ефектите на такива обработки върху действителното молекулно тегло и изоелектрична точка и различни проби на свързване. Протеиназната устойчивост и профилът на разграждане може да бъдат установени чрез хроматография, гел електрофореза и други чувствителни към молекулното тегло техники. Изоелектричната точка може да бъде измерена с помощта на капилярно изоелектрично фокусиране (IEF) или гелно изоелектрично фокусиране, макар капилярна IEF е способна да измери прион pl от 3 по-ефективно в сравнение с повечето гелове. Нещо повече, качественото определяне на общия заряд (киселинност или основност) може да бъде определено чрез йонообменна хроматография. За идентифициране на прион протеина могат да бъдат използвани също и други биофизични техники, известни в областта.

Примерите за изследвания за откриване на прион протеин включват действителното молекулно тегло и изоелектрична точка на протеина, включително след нагряване, разцепване с цианоген бромид, третиране с невраминидаза, и др. (Bolton et al., J. Virol. 53:596, 1985); обработка c гликозидаза и свързване с лектин (Sommerville and Ritchie, J. Gen. Virol., 71: 883, 1990); устойчивост на протеиназа-К (Race et al., Am. J. Vet. Res., 53:883, 1992); и имунологично изпитване (Farquhar et al., J. Virol. Methods, 24: 215,1989).

Алтернативно, секвениране или микросеквениране на екстрахиран, и за предпо читане пречистен прион протеин, позволява недвусмисленото потвърждаване на неговата идентичност.

Имунологичните изпитвания за прион протеин могат да бъдат осъществени чрез техники, известни в областта, например радиоимунологична, ELISA (ензимно-свързано имуносорбентно изпитване), “сандвич” имунопроби, имунорадиометрични проби, реакции на гел дифузионно утаяване, имунодифузионни проби, in situ имунологични изпитвания (с използване на колоидно злато, ензимни или радиоизотопни маркери, например), оцветявания по Western, реакции на преципитиране, аглутационни реакции (например гел аглутационни изпитвания), хемаглутационни изпитвания, изпитвания за фиксиране на комплемента, имунофлуоресцентни проби, проби с протеин А и протеин G, имуноелектрофоретични изпитвания, измерване на техните нива в подходящи физиологични проби, и др. В един вариант на изпълнение свързването на антитела се установява чрез откриване на маркер на първично антитяло. В друг вариант на изпълнение първичното антитяло се открива чрез установяване свързването на вторично антитяло или реагент към първичното антитяло.

Екстракционният метод от изобретението предлага един нескъп източник на прион протеин, който може да бъде използван за генериране на допълнителни антитела. Нещо повече, тъй като условията на екстрахиране от изобретението силно се отличават от обичайните условия на екстракция, прион протеинът, екстрахиран в съответствие с изобретението, може да има различна конформация и показва различна популация на антитела, ако бъде използван за имунизация.

Този метод съкращава екстракционното време до 1 до 2 h. Нещо повече, поради това че е опростен, той може да бъде автоматизиран. Методът екстрахира прион протеин с различни молекулни тегла, така че не е ограничен. Той също разтваря анормалния прион протеин, така че повечето имунопроби да могат да бъдат използвани за откриването му. Нещо повече, и не незначително, той редуцира неефективността на абнормения прион протеин, правейки процеса по-безопасен.

Китове

Компонентите за практикуване на настоящото изобретение може да бъдат предложени в удобна форма на кит. В неговия найпрост вариант на изпълнение китът от изобретението предлага екстракционен разтворител, за предпочитане HFIP, и лиотропна сол (или концентриран разтвор на лиотропна сол) за повишаване лиотропната активност на сместа екстракционен разтворител-воден препарат. Количеството на всяка компонента може да бъде предварително измерено, за да осигури специфичен брой изпитвания. В друг вариант на изпълнение китът ще включи контейнер на пробата, за предпочитане от пластмаса или материал, обработен така, че да се избегне неспецифичното свързване на прион протеина.

Както е използвано тук, терминът контейнер има по-широко значение, т.е., който и да е приемник за поместване на материал или реагент. Той може да бъде фабрично произведен от стъкло, пластмаса, керамика, метал или който и да е друг материал, обикновено използван за съдържане на реагенти. Обаче, приемливият материал не бива да бъде реактивен със съдържанието, което се предполага че ще има.

Китът може да включва също протеиназа-К за разграждане на нормален прион протеин в биологична проба.

В следващ вариант на изпълнение китът включва контейнер за пробата с индикатор за обема за водния препарат на биологичната проба. В този вариант на изпълнение полярният органичен разтворител и лиофилната сол са оптимално предложени в предварително измерени единици, свързани с контейнера на пробата. Препаратът на биологичната проба може да бъде поместен в контейнера на пробата. Предварително измерената единица от екстракционния разтворител може да бъде добавена, последвано от смесване. След това, предварително измерената единица от лиотропната сол може да бъде добавена, за да индуцира разделянето на фазите от екстракционния разтвор и водата. В още един друг вариант в кита се предлага протеиназа-К за обработка на водния препарат от биологичната проба, за предпочитане в предварително измерена единица.

Кит за екстрахиране на прион протеин от тъканна проба може да включва буфер за разреждане, като 0.32 М захарен разтвор или фосфатно буферен разтвор, за хомогенизиране на тъканта за водния препарат на биологичния материал.

В следващ вариант, в който китът е кит за откриване наличието на анормален прион протеин в биологичен материал или проба, китът предлага детектор за анормален прион протеин или изпитване, както е описано по-горе. Имунологични изпитвания, както е описано по-горе, са предпочитани за откриване на анормален прион протеин, екстрахиран в съответствие с изобретението.

В още един следващ вариант китът включва имунохроматографска мембрана или повърхност. Екстракционният разтворител, съдържащ който и да е прион протеин, може да бъде приложен към повърхността директно, или да бъде приложен изсушен екстракт, например след обратно разтваряне. При подходящи условия прион протеинът може да проникне през повърхността. Той може да бъде уловен, например чрез имобилизирано анти-прион антитяло и имобилизираният прион протеин да бъде установен. В изобретението могат да бъдат използвани множество методи и съоръжения, известни в областта за имунохроматографско изпитване. Имунохроматографските изпитвания са специално приложими в полеви условия, където лабораторно оборудване не е достъпно. Примери за такива изпитвания са предложени в US патенти 5,248,619, 5,451,504, 5,500,375, 5,624,809 и 5,658,801.

Кит от изобретението за предпочитане включва опаковане и инструкции за използването му, например на опаковката или във вложката на пакета.

Примери за изпълнение на изобретението

Настоящото изобретение може по-добре да бъде разбрано чрез препратка към следващите неограничителни примери, които са предложени в изобретението.

Пример 1. Анализ на анормален прион протеин, екстрахиран от инфектиран овчи мозък и лимфни възли

Тъкан от мозък или лимфни възли от всяка втора инфектирана със скрапия овца се хомогенизира в 10% саркозил и се обработва с протеиназа К за разграждане на нормалния гостоприемников прион протеин, но не и изменената анормална форма на прион протеин. Еднакви обеми (0.5 тМ) от хомогената и HFIP се смесват и инкубират за 5 min при 56°С. Към тази смес се добавят 0.5 тМ 0.5 М Na₂SO₄ и сместа се инкубира за допълнителни 5 min. При тези условия слоят HFIP се разделя от водния слой. HFIP слоят се отделя и изсушава на центрофуга. Изсушените проби се ресуспендират и смесват в 25 μΐ дестилирана вода. 10 μΐ от пробата се смесва с 5μ1 от 20% SDS буфер и се вари за 5 min при 100°С.

Провежда се Western blot анализ върху 10% до 15% градиентен полиакриламиден гел. Протеинът се прехвърля от полиакриламидния гел върху нитроцелулоза при стандартни условия. Нитроцелулозата се блокира чрез инкубиране с разтвор на 5% рибен желатин и се промива с Tris-Tween буфер. Нитроцелулозата се инкубира за една нощ със заешки антиприон протеин (антитяло, създадено срещу пълен прион протеин, разреден 1 до 2500; (Kascak et al., Immunol. Invest., 26: 259, 1997; виж също Miller et al., J. Vet. Diagn. Invest. 5: 309; Kascak et al., J. Virol., 59: 676, 1986). След инкубация c антиприон антитяло, нитроцелулозата се промива с Tris-Tween и след това взаимодейства с антизаешки IgG - HRP (пероксидаза от дрян) конюгат и се инкубира за 1 h. Нитроцелулозата след това се промива екстензивно и се проявява с хемилуминесцентен реагент (Pierce UltraSuperSignal^R). Пероксидазната активност се установява с помощта на хемилуминесцентен преобразовател (Chemi-Imager-4000; Alpha, Innotech).

Екстрактите от двете заразени със скрапия овце, съдържащи 2.75 μΐ, продуцират материал, показателен за анормален прион протеин и за двете тъкани - от мозък и от лимфни възли. Екстракт от мозъчна тъкан, съдържащ 1.5 μΐ материал от една от заразените със скрапия овце продуцира ивица, показателна за анормален прион протеин. Оцветяване по Western на сходни екстракти от нормални (неинфектирани) овце не продуцират никакви ивици, показателни за анормален прион протеин.

Пример 2. Анализ на анормален прион протеин, екстрахиран и пречистен от инфектирани овчи мозък и лимфни възли

Този пример показва по-нататъшно пречистване и анализ на анормален (скрапия) прион протеин (PrPSC) с помощта на хроматография на хидрофилно взаимодействие (HILIC). Тъканни проби, включващи овчи мозък и лимфни възли, се получават с повърхностно активно вещество и протеиназа К, както е описано по-рано. Получените в резултат екстракти се прилагат на колона HILIC и елуират с низходящ градиент на ацетонитрил в 0.1% трифлуороцетна киселина и 50 тМ хексафлуоро-2-пропанол. Извличането от колоната е приблизително 75%, както е определено с обработен с радиоактивен йод прион протеин. След изсушаване събраните пикове се ресуспендират във вода и изпитват с антитела, специфични за прион протеина. Методът позволява ефективно пречистване на прион протеина, както и тестване чрез имунопроба, тъй като интерфериращите повърхностно активни вещества са отстранени.

Пример 3. Анализ на анормален прион протеин, екстрахиран от инфектиран овчи мозък

Получаване на материал от овчи мозък

Инфектирани със скрапия овчи мозъци са получени от полеви случаи, които са позитивни за анормалния прион протеин по Western blot (Race et al., Am. J. Vet. Res. 53: 883, 1992). Извадката е направена от 3 позитивни мозъка. Същата извадка е използвана за всички експерименти, представени тук. Нормални мозъци идват от овце от стада без скрапия и са негативни за анормален прион протеин по Western blot. Мозъчният материал за хроматография се получава чрез модификация на метода на Bolton et al. (J. Virol. 53: 596, 1985). Накратко, мозъчните стволове се дисецират, претеглят и поставят в 0.32 М захароза (10% т./об.). Материалът след това се хомогенизира за 60 s с Brinkman Polytron (Kinematica AG, Lucerne Switzerland) c помощта на 0.7 cm генератор от стомана при най-висока скорост. Хомогенатът се центрофугира при 10,000 g за 20 min за отстраняване на частиците и получената супернатанта се центрофугира при 230 000 g за 1 h. Тази утайка след това се подлага на серия от промивания и ултрацентрофугирания както по-горе. Пробата се обработва с 10 mM Tris pH 7.4, съдържащ 10% натриев лаурил сулфат и протеиназа-К (50 pg/ml). След крайното центрофугиране пробата се ресуспендира в 10 mM Tris pH 7.4 (200 μΐ/g от изходната мозъчна проба).

Хроматография на хидрофилно взаимодействие (HILIC)

Пробата се разтваря в 0.01 М Tris НС1, pH 8.00, съдържаща 2 mM EDTA, 5% SDS и 10% хексафлуоро-2-пропанол при 100°С за 10 min. След обработка със SDS пробата се поставя в разтворител, състоящ се от 100% ацетонитрил, съдържащ 0.1% TFA киселина и 50 mM хексафлуоро-2-пропанол (буфер А) и се прилага на колона за хидрофилно взаимодействие. Всички колони, които са използвани, са от PolyLC, Inc. (Columbia, MD, USA) c дименсии 200 x 4.6-mm; 5 pm; 300-A. Изследват се три натоварвания, PolyWAX LP™ (йонообменен материал), PolyHYDROXYETHYLA™ (неутрален материал), и PolySULFOETHYL А™ (силно катионообменен материал) (всичките три търговски марки са собственост на PolyLC, Inc.). Скоростта на потока е 0.5 ml/min. Условията за елуиране Prp^sc са: 100% А за 8 min и след това линеен градиент до 100% вода, съдържаща 0.1% трифлуорооцетна киселина и 50 шМ хексафлуоро2-пропанол (буфер В) в 15 min, след това 100% В за 10 min. Пиковете фракции се събират и изсушават във вакуумна центрофуга (Savant Instruments, Inc., Farmingdale, NY, USA). Фракциите се ресуспендират в 10 μΐ дейонизирана Н₂О и фракцията, тествана позитивно чрез имунооцветяване за РгР^с, се използва в проба за капилярна електрофореза.

Маркиране на прион протеин с ^|251.

PrP^sc се маркира с ^12ίΙ с помощта на IODOGEN™ (Pierce, Rockford, IL, USA). Белязаният протеин се разделя от свободния ¹²⁵1 чрез пропускането му през твърдофазова екстракционна касета, съдържаща PolyWAX LP™ (PolyLC, Inc.), която е уравновесена с буфер А. Белязаната PrP^sc се елуира от касетата с помощта на буфер В. Несвързаният ¹²⁵1 се получава върху касетата, като би могъл да бъде отстранен като твърд радиоактивен отпадък. Фракциите, съдържащи беляза ния PrP^sc, се изсушават във вакуумна центрофуга, разтварят се във вода, разреждат се 1/10 в буфер А и се натоварват върху HPLC колоната.

Капкови оцветявания

Равни части от по един Ιμΐ от пиковите фракции от HILIC хроматография се прилагат върху нитроцелулозна хартия, изсушават се и след това се инкубират в 20 mM Tris, pH 7.5, съдържащ 500 mM NaCl, 0.05% Tween 20 (TTBS) и 5% рибен желатин за 1 h. Оцветяването се промива 2х с TTBS и след това се инкубира с антитела с разреждане 1/500, създадени срещу пептиди на прион протеина за 3 h при 25°С (заешки антитела срещу пептид 142-154). След инкубация оцветяването се промива 2х с TTBS и след това се инкубира с биотинилиран протеин G (Bio-Rad Laboratories, Hercules, СА, USA) за 1 h. Отново оцветяването се промива както по-горе. Пероксидаза от хрян, свързана към NeutrAvidin™ (Pierce, Rockford, IL, USA) се добавя към накапването и се инкубира за 1 h при 25°С. След инкубиране оцветяването се промива 6х с TTBS. След промиване накапването се инкубира в система SupersignaF Substrate (Pierce) за 10 min и след това се експонира на ултравиолетов филм Kodak XОМАТ AR (Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA) за 15 s.

Проба за свързване за ¹²⁵IprP^sC

Фракции, съдържащи ^|251 от колоната PolyWAX LP, се изпитват за активност на свързване към антитяло, което е продуцирано срещу пептида, съответстващ на остатъци 142-154 от прион протеина. Епруветките, съдържащи радиоактивност, се изсушават във вакуумна центрофуга Savant при 42°С и се ресуспендира в 10 μΐ Н₂О и след това се разреждат със съдържащи буфер соли в 0.1% BSA. PVC блюдо се покрива с антитялото в 0.1 М Na₂CO₃, pH 9.0. След промиване с горния буфер, 100 μΐ от ¹²⁵1PrP^sc се инкубират върху блюдата при 37°С за 2 h и след това една нощ при 4°С. Блюдото се промива и се нарязва на отделни ямки и се преброяват. Фоновото срт се изважда от срт в ямките.

Условия на капилярна електрофореза

Свободна зона на капилярна електрофореза (Schmerr and Jenny, Electrophoresis 19: 409, 1998) е представена на Beckman Р/АСЕ

5500 (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA). Лазерно индуцирано флуоресцентно (LIF) откриване c използването на въздушно-охладен аргонов лазер (Beckman Instruments) с възбудимост при 488 nm и емисия при 520 nm. Немодифицирани капиляри са получени от Beckman Instruments. Използван е капиляр 20 cm (дължина до детектора) х 201 pm I.D. с 200 тМ трисин, pH 8.0. Този буфер съдържа 0.1% N-октилглюкозид (Boehringer Mannheim GmbH, Indianopolis, IN, USA) и 0,1% BSA (Sygma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). В препарата за разделянето капилярът се промива 1 min с 0,25 М NaOH, промива се 2 min с Н_гО, и след това се промива 2 min с буфер. Условията за разделяне са 30 KV за 3 min при 20°С. Токът е около 20 μΑ. Пробата се инжектира за 15 s, последвано от 5 s инжектиране на пропускания буфер. Обемът на пробата е около 0.95 nl. Промиванията се провеждат при високо налягане и инжектирането на пробата се осъществява при ниско налягане.

Имунокомплекс и проби на свързване на приона μΐ белязан с флуоресцеин пептид, съдържащ около 2 pmole от флуоресцентно белязания пептид, се смесват с афинитетно-пречистен заешки IgG за демонстриране свързването на антитялото към белязания с флуоресцеин пептид. Към пробата се добавят фракции от по един μΐ от HILIC хроматография. След смесване на компонентите пробите се инкубират при 25°С за 10 min.

Резултати

На фиг. 1 е показана хроматограмата на PrP^sc след пречистване и йодиране. Радиоактивност (срш) от белязания с ^|251 прион протеин съвпада с абсорбция при 280 nm, с изключение на последния пик, установен с абсорбция. Добивът на анормален протеин, основан на възстановяване на ^Ш1 срт, натоварен върху колоната, е около 76%. Пиковете на срт и А280 абсорбция съвпадат с пиковете, показващи антитяло активност в изпитването за свързване (фиг. 2). Главният пик в това изпитване при около 25 min съвпада с пикове за ^1М1-РгР и А280 абсорбция при 25 min на фиг. 1. Сходни резултати са получени за хроматограма (не са показани) от екстракция (непречистена) на инфектирани със скрапия овчи мозъци.

В литературата са докладвани широк интервал от pl стойности (Schmerr and Jenny, supra; Safar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6373, 1990; Somerville et al., J. Gen. Virol. 70: 25, 1989) за анормален прион протеин, pl на този протеин би повлиял свързването на този протеин към пълнителите на колоната. Няма голяма разлика между времето за ретенция върху позитивно заредена PolyWAX LP колона и неутралната PloyHYDROXYETHYL А колона. Това предполага, че протеинът може да е кисел. Проби от анормален прион протеин, съдържащи SDS, се елуират от негативно заредена PolySULFOETHYL А колона в широк обхват. Съответно, анормалният прион протеин, пречистен на колона PolyWAX LP, се пропуска отново на колона PolySULFOETHYL А. Елуирането му в или в близост до празния обем показва, че е наистина кисел. Това е потвърдено както чрез изоелектрично фокусиране, така и с капилярно електрично фокусиране (Schmerr etal., Chromatogr. A. 802: 135, 1998). pl стойностите граничат от 3 до 6, при повечето видове при 3.00. Тези резултати предполагат, че при хроматография на хидрофилно взаимодействие е необходимо използването на неутрален или анионообменен материал.

При капилярна имуноелектрофореза с използването на пречистени с HILIC проби, получените в резултат електрофореграми (не са показани) означават, че проби от инфектирани овце реагират, докато проби от нормални (неинфектирани) овце не реагират. Тъй като SDS инхибират типичните имунопроби, включително капилярни електрофоретични проби, необходимо е отстраняването на SDS с оглед провеждането на такива изпитвания. Конкурентна проба с използването на капилярна електрофореза би могла да бъде проведена след хроматография HILIC, тъй като SDS елуира в или в близост до празния обем (Jeno et al., Anal. Biochem., 215: 292,1993).

Пример 4. Анализ на анормален прион протеин, екстрахиран от инфектирана кръв на овце

Центрофужни фракции от инфектирани с TSE кръвни проби от овце се разреждат с буфериран с Tris физиологичен разтвор (10% тъкан; 90% буфер). Пробите след това се обработват с протеиназа К за разгражда не на нормалния гостоприемников прион протеин, но не и променената анормална форма на прион протеин. След разграждане обработената проба се смесва с еднакъв обем хексафлуоро-2-пропанол (HFIP) и се инкубира при 56 С за 5 min. Добавя се равен обем от 0.5 М натриев сулфат и фазите се оставят да се разделят. Слоят, съдържащ HFIP, се отстранява и пробата се изсушава във вакуумна центрофуга.

Утайката се ресуспендира във вода и суспенсията се поставя в една органична хроматографски мобилна фаза, съдържаща 95% ацетонитрил, 5% вода, 0.1% трифлуороцетна киселина и 50 mM HFIP. Мобилната фаза се прилага на твърдофазова екстракционна касета от PolyHYDROXYETHYL Aspartamide™ (PolyLC, Inc.). Анормален прион протеин се елуира от тази повърхност със 100% вода, 0.1 % трифлуороцетна киселина и 50 тМ HFIP, и след това се изсушава и ресуспендира във вода.

Наличието на анормален прион протеин се установява чрез капилярна имуноелектрофореза. Анормалният прион протеин не се установява в електроферограми за контрол на проби на кръв, които не са инфектирани с TSE.

Пример 5. Анализ на анормален прион протеин, екстрахиран от инфектирана кръв на черноопашат елен

Процедурата от пример 4 се повтаря с кръвни проби от инфектиран с TSE черноопашат елен. Наличието на анормален прион протеин е установено чрез капилярна имуноелектрофореза. Анормален прион протеин не е установен в електрофореграми за контролни проби на кръв, които не са инфектирани с TSE.

Пример 6. Анализ на анормален прион протеин, екстрахиран от инфектирана кръв на лос

Процедурата от пример 4 се повтаря с кръвни проби от инфектиран с TSE лос. Наличието на анормален прион протеин е установено с капилярна имуноелектрофореза. Анормален прион протеин не е установен в електроферограми за контролни проби на кръв, които не са инфектирани с TSE.

Всички патенти, патентни описания, тест протоколи и публикации, цитирани тук, са включени в справката в тяхната цялост.

Настоящото изобретение не следва да бъде ограничавано по обхват до специфичните варианти на изпълнение, описани тук. Наистина, различни модификации на изобретението в допълнение към описаните тук, стават очевидни за специалиста в областта от предшестващото описание и съпътстващите фигури. Такива модификации се предполага, че влизат в обхвата на приложените претенции.

Claims (5)

1. Метод за екстрахиране на анормален прион протеин от биологичен материал, за който се предполагаме съдържа анормален прион протеин, характеризиращ се с това, че включва:

a) инкубиране на смес от екстракционен разтворител и изотоничен или хипотоничен препарат на биологичен материал в условия, ефективни за екстрахиране на анормален прион протеин от посочения биологичен материал в посочения екстракционен разтворител, където посоченият екстракционен разтворител е:

i) полярен органичен разтворител, в който посоченият анормален прион протеин е разтворим, и

й) смесваем с нелиотропен воден разтвор, но несмесваем с лиотропен воден разтвор; и

b) повишаване лиотропната активност на сместа за разделяне на посочения екстракционен разтворител от посочения воден препарат на посочения биологичен материал за добиване на екстракционен разтворител, съдържащ който и да е анормален прион протеин от посочения биологичен материал.

2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият екстракционен разтворител е хексафлуоро-2-пропанол.

3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият биологичен материал е тъкан или биологична течност от гръбначно.

4. Метод съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че посочената тъкан е мозъчна тъкан.

5. Метод съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че посочената биоло-