HUT77340A - Eljárás szivacsszerű agybetegség kimutatására - Google Patents

Description

ELJÁRÁS SZIVACSSZERŰ AGYBETEGSÉG KIMUTATÁSÁRA

A találmány tárgya eljárás állatok szivacsszerű agybetegsége, főként szarvasmarha szivacsszerű agybetegsége (BSE) kimutatására.

A szivacsszerű agybetegségek egy betegségcsoportot alkotnak, ide tartozik a juhok neurotróp vírusos megbetegedése (scrapie) és az emberek Creutzfeldt-Jakob betegsége (CJD). A BSE kötelező bejelentés alá eső végzetes neurodegeneratív megbetegedés, amelyet a szarvasmarháknál találtak. A BSE az angol állattenyésztésben nagyon nagyjelentőségű.

Jelenleg a BSE eseteket az állatok klinikai megnyilvánulásai alapján azonosítják. Az eseteket halál után igazolják az agyszövet analízisével. Például szövetkórtani vizsgálatokkal, a scrapie-re jellemző kis rostok kimutatásával, vagy a proteináz K-nak ellenálló fehérje kimutatásával.

Ezeknek az eljárásoknak az a hátránya, hogy ezekhez a potenciálisan fertőzött állatok levágása szükséges, és később kiderülhet, hogy az állatok nem voltak betegek. Az is előfordulhat, hogy a klinikai tünetek hiányoznak vagy nem kimutathatók, és így fertőzött állatok maradnak a gulyában.

Harrington és munkatársai (lásd New England Journal of Medicine (1986) vol 315. 5, 279-283) nagyfelbontású kétdimenziós poliakril-amid gél elektroforézist (DPAGE) alkalmaztak négy abnormális fehérje jelenlétének kimutatására CJD-ben szenvedő humán betegek agy-gerincvelő folyadékában. A fehérjék pontos azonosítását azonban nem sikerült elvégezni.

85700-3793 BÉ/Pk • Β* · « ·· V · • · * ·

-2·· ··· ··

Nagy szükség van tehát a BSE halál előtti kimutatására, amely felhasználható a potenciálisan fertőzött állatok diagnosztizálására.

A találmány tárgya eljárás szivacsszerű agybetegség kimutatására állatoknál, amelynek segítségével az említett problémák közül néhány, előnyös esetben valamennyi megoldható.

A találmány tárgya tehát egyrészt eljárás szivacsszerű agybetegség kimutatására állatoknál, amely abból áll, hogy meghatározzuk egy olyan anyag jelenlétét és/vagy mennyiségét az állat valamely testfolyadékában, amely keresztbe reagál az apoliprotein E-vel szemben kibocsátott antitesttel, majd a meghatározás eredményét az állat fertőzési státuszával összefüggésbe hozzuk.

A meghatározás eredményét előnyösen összehasonlító értékhez viszonyítjuk és a kettő közötti viszonyt rendeljük az állat fertőzési státuszához.

Az eljárást előnyösen a BSE kimutatására alkalmazzuk.

Az apoliprotein E egy koleszterinszállító fehérje, amely a perifériás és központi idegrendszerben képződik. Akár többszörös, akár egyszeres formában történő jelenlétét az agy-gerincvelő folyadékban (cerebrospinális fluidum, rövidítve CSF) és a szérumban kategorizáltuk.

A találmányt tehát azon a felismerésen alapul, hogy egy állat szivacsszerű agybetegséggel történő fertőzése hozzárendelhető az állat testfolyadékában lévő egy vagy több anyag jelenlétéhez vagy annak koncentráció-növekedéséhez.

Az egy vagy több anyag kölcsönösen reagál az antiapoliprotein E-vel, molekulatömege kb. 34-38 kDa, és pl értéke kb. 5,4 és 5,7 közötti. Ez megfelel az apoliprotein E-ként történő azonosításával is, és az Apó E anyag kifejezésen a leírásban minden olyan anyagot értünk, amely az említett tulajdonságokkal rendelkezik • · · * ·<.·? <·'· Μ*»· * · · · * * « · ·»«··· ·· ····« * ·«,·»··*· ♦•f (beleértve az apoliprotein E-t, valamint izoformjait vagy többszörös formáit is).

Meg kell jegyezni, hogy nem szükséges az Apó E mennyiségét pontosan meghatározni, mivel az állat szivacsszerű agybetegség fertőzési státusza kimutatható egy összehasonlító mintával való egybevetéskor is.

Az összehasonlító érték származhat egy különböző állatban az Apó E koncentrációjából (amely állat fertőzési státusza ismert), és amelyet a vizsgált állattal párhuzamosan analizálunk. Úgy is eljárhatunk, hogy az összehasonlító értéket ugyanabból az állatból vesszük, vagy ez lehet egy ismert standard is.

Az összehasonlító értéket meg lehet határozni úgy, hogy ugyanazt az eljárást alkalmazzuk a vizsgált állatra, de alkalmazhatunk egy eltérő analitikai eljárást is.

Az összehasonlító állatból származó eredmények felhasználhatók egy standard pozitív vagy negatív összehasonlító érték kialakításához vagy a vizsgált állatnál kapott érték kalibrálásához.

A eljárásnál analizált testfolyadék előnyösen a CSF, mivel az autentikus apoliprotein E a fő apoliprotein, amely ebben ebben a folyadékban található. Ezen kívül a CSF közelsége az agyhoz azt eredményezi, hogy azok az idegrendszeri rendellenességek, amelyek az agy fehérje-összetételének elváltozásait okozzák, megnyilvánulnak a CSF-ben. A CSF minták vételére szolgáló eljárások szakember számára jól ismertek.

A találmány minden olyan eljárást felölel, amely egy állat testfolyadékában az Apó E anyag koncentrációjának meghatározására szolgál, amely jelenleg a szakirodalomból ismert, felöleli továbbá azokat az eljárásokat is, amelyek a későbbiekben válhatnak ismertté.

«»«« «· · · * · _V «·« ·· ···*» · «* ·>4 4· * ···

-4Előnyösen az testfolyadékában az Apó E jelenlétének és/vagy mennyiségének meghatározása poliakril-amid gél elektroforézis (PAGE) alkalmazásával történik, amellyel a testfolyadékban lévő egyéb anyagoktól elválasztható az Apó E. A gélt ezután megfestjük és denzitométeres méréseket végzünk azon géltartományban, amely az adott anyagot tartalmazza, és így meghatározzuk az Apó E jelenlétét és/vagy mennyiségét.

Az Apó E anyag azonosítását immunogén anyaggal, például az Apó E-vel vagy annak valamely szekvenciáján alapuló szintetikus peptiddel szembeni antitestet alkalmazunk. A kölcsönös reakció mérésére szolgáló immunogén alapú eljárások szakember számára jól ismertek (lásd például ELISA vagy Western Blotting).

A találmány szerint úgy is eljárhatunk, hogy az említett immunogén eljárásokat felhasználjuk mind az Apó E azonosítására, mind a koncentrációjának meghatározására.

A találmány tehát lehetővé teszi a vizsgált állatban a szivacsszerű agybetegség jelenlétének kimutatását úgy, hogy az addig ismert problémákat előnyös esetben teljesen megoldja. A vizsgálati bizonyosság és az alkalmazás nehézsége közötti egyensúly függ a találmány szerinti eljárásban történő alkalmazásra kiválasztott konkrét Apó E analízistől. Azonban a lehetőség, hogy a BSE-t szarvasmarhában halála előtt lehet diagnosztizálni, megnyitja az utat a gulyák tömeges ellenőrzésére, ezáltal csökkenti annak a valószínűségét, hogy nem fertőzött állatokat levágnak, vagy hogy valamely állatnál nem veszik észre a fertőzést.

Találmányunkat a továbbiakban példával is illusztráljuk, de nem kívánjuk arra korlátozni. A példa alapján a szakember számára egyéb, a találmány oltalmi körébe eső megvalósítások is nyilvánvalóvá válnak.

-5Példa

BSE azonosítása szarvasmarhában

A mintát a következőképpen készítjük el: CSF mintákat veszünk BSE-pozitív szarvasmarhától és BSE-negatív szarvasmarhától. Valamennyi esetben a diagnózist halál utáni kórszövettani vizsgálattal és elektronmikroszkópos vizsgálattal igazoljuk. A CSF mintákat halál után cisternamagna punkcióval vesszük és 10-15szőrösre koncentráljuk. A 40 pg összes fehérjét tartalmazó CSF mintákat 4:1 arányban denaturáló oldattal keverjük (1 g nátrium-dodecil-szulfát (SDS), és 0,232 g ditiotreit 10 ml vízben), majd az elegyet 5 percre 95 °C-ra melegítjük. A mintákat azután impulzuscentrifugálásnak vetjük alá.

Az elektroforézist a következőképpen végezzük: Az elkészített mintákat 2D elektroforézisnek vetjük alá Millipore Investigator 2D elektroforézis rendszer alkalmazásával a használati utasításban ismertetett módon. Az első dimenziós izoelektromos fokuszálást 26 cm-es csavarmenetes üvegcsőben végeztük, amelynek belső átmérője 1 mm, pH gradienst alkalmazunk 3-10 között, 18000 V-nál, miután a gélt egy órán keresztül 1500 V-nál előfókuszáltuk. A második dimenziós SDS-PAGE-t 1 mm vastag nagyméretű gélek (23 cm x 23 cm) alkalmazásával végezzük, amely gél 12,5 % akril-amidot tartalmaz, és nem tartalmaz halmozott gélt.

Festés és képanalízis: A 2D géleket ezüsttel megfestjük a Millipore kézikönyv szerint. A géleket Omnimedia scanner XRS típusú készülékkel szkenneljük, és a Bioimage software, valamint az Investigator Database program (Millipore) alkalmazásával sunSPARC számítógép felhasználásával analizáljuk.

-6Αζ Αρο Ε azonosságának igazolását a következőképpen végezzük: A 2D géleket elektromos úton felszívatjuk Immobilon-P membránokra, éjszakán át 30 V-on, Bio-Rad Trans-Blot cella alkalmazásával. A nyomatokat Tween 80-nal egy órán keresztül rögzítjük, majd 90 percig inkubáljuk birka antiszérummal, amely autentikus az apoliprotein E-vel szemben kifejlesztett poliklonális antitestet tartalmazza. A megkötött birka antitesteket nyúl anti-birka IgG alkalmazásával és torma peroxidáz detektálási rendszerrel detektáljuk. Azt találtuk, hogy számos az érdekes tartományban lévő (molekulatömeg kb. 34-38 kDa és pl kb. 5,4-5,7) anyag kölcsönös reakcióba lép az anti-apoliprotein E antitesttel.

BSE negatív és BSE pozitív szarvasmarha összehasonlítása: A tipikus BSE pozitív és negatív mintákból vett festett gélek összehasonlítását az 1(a) és 1(b) ábrán mutatjuk be. Amint az látható, az ezüsttel festett foltok száma és intenzitása a 34-38 kDa körüli molekulatömegű anyagnak megfelelő tartományban és a kb. 5,4-5,7 körüli pl tartományban (amelyet Apó E-nek jelölünk) nagyobb a BSE pozitív mintában.

Összehasonlítottuk azoknak az ezüsttel testeknek foltoknak a géleken az optikai sűrűségét, amelyekről azt találtuk, hogy antiapoliprotein E antitesttel kölcsönös reakcióba lépnek. Az összehasonlítást a következő táblázatban adjuk meg:

• · · ·

Az anyag száma	BSE-negatív	BSE-pozitív
1.	0,13	0,47
2.	0,42	0,84
3.	0,45	0,64
4.	0,45	0,64
5.	0,46	1,02
6.	0,41	0,69
7.	0,87	1,12

A két sorozat optikai sűrűség összehasonlításából látható, hogy az anyag jellemzően nagyobb mennyiségben található a BSE pozitív állatokban (n=31), mint a BSE-negatív állatokban (n=27). Ezt azt jelzi, hogy ezeknek az anyagoknak a jelenlétét és/vagy mennyiségét felhasználhatjuk arra, hogy a potenciálisan fertőzött állatokban a BSE jelenlétét valószínűsítsük.

Claims (8)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás egy állat szivacsszerű agybetegsége meglétének meghatározására, azzal jellemezve, hogy

   a) meghatározzuk az állat agy-gerincvelő folyadékában az apoliprotein E mennyiségét,

   b) a meghatározás eredményét összehasonlító értékkel vetjük össze,

   c) az apoliprotein E megnövekedett koncentrációját az állat pozitív betegségi állapotával korrelációba hozzuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szivacsszerű agybetegség szarvasmarha szivacsszerű agybetegség.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az állat agy-gerincvelő folyadékában az apoliprotein E mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy meghatározzuk azon anyag menynyiségét az állat agy-gerincvelő folyadékában, amely kölcsönösen reagál az apoliprotein E-vel szemben kifejlesztett antitesttel.
4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az állat agy-gerincvelő folyadékában az apoliprotein E mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy poliakril-amin gél elektroforézis alkalmazásával elválasztjuk az apoliprotein E-t a folyadékban lévő többi anyagtól, majd a gélt megfestjük, az apoliprotein E-t azonosítjuk és a festési sűrűségből megbecsüljük az apoliprotein E mennyiségét.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az apoliprotein E mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy felbecsüljük azon anyag mennyiségét az agy-gerincvelő folyadékban, amelynek molekulatömege 34 és 38 kDa közötti, és pl értéke 5,4 és 5,7 közötti.

   -96. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az apoliprotein E azonosítását a gélen az apoliprotein E-vel szemben kifejlesztett antitest alkalmazásával igazoljuk.
6. 7. A 4-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a poliakril-amid gél elektroforézis kétdimenziós poliakril-amid gél elektroforézis.
7. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az összehasonlító értéket ugyanolyan eljárással határozzuk meg, mint amelyet az állatnál alkalmazunk, de egy további állatot is felhasználunk, amelyről ismert, hogy szivacsszerű agybetegsége van vagy nincs.
8. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás lényegében ahogy a példában le van írva.