WO2003040729A2 - Verfahren zum nachweis von pathogenen partikeln im organismus - Google Patents

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WO2003040729A2
WO2003040729A2 PCT/EP2002/012432 EP0212432W WO03040729A2 WO 2003040729 A2 WO2003040729 A2 WO 2003040729A2 EP 0212432 W EP0212432 W EP 0212432W WO 03040729 A2 WO03040729 A2 WO 03040729A2
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Florian Schweigert
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection and / or differentiation of apathogenic particles and their pathogenic and / or pathognostic variants, in particular for the diagnosis of encephalopathies in an organism, and also for the diagnosis of neurological disorders, inflammatory processes, tumor diseases, kidney diseases and / or changes , especially disorders of reproduction or metabolism.
  • Encephalopathy is a collective term for non-inflammatory diseases or damage to the brain of different etiology.
  • the subacute spongiform encephalopathies (nowadays often referred to as transmissible spongiform encephalopathies) are a group of sporadic, hereditary or communicable diseases of the CNS, which are caused by spongy (spongiform) degenerations of the brain (extensive nerve cell loss), proliferation of neurons. and slowly progressive, always fatal and characterized as prion diseases.
  • To the Encephalopathy is also considered Alzheimer's disease, a dementia, ie a progressive degenerative change in the brain with loss of previously acquired cognitive skills. This progressive brain atrophy occurs especially in women over the age of 40.
  • the so-called Alzheimer's degeneration fibrils elongated or curly-shaped, thick fibrils made of two helically connected filaments in the cytoplasm of nerve cells, and possibly amyloid deposits, can be detected pathologically.
  • encephalopathies particularly subacute spongiform encephalopathies, in sheep or goats (scrapie), cattle (BSE; bovine spongiform encephalopathy), mink (TME; transmissible mink encephalopathy), cats (FSE; feline spongiform encephalopathy) cheetah or paw SE; spongiform encephalopathy), deer, roe deer or moose (CWS; chronic wasting syndrome) and other mammals.
  • Creutzfeld-Jakob disease Kuru, Gerstmann-St Hurssler-Scheinker syndrome and fatal familial insomnia (FFI; fatal familial insomnia) are attributed to these diseases.
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • mad cow disease is a form of subacute spongiform encephalopathy that occurs in cattle and has occurred epidemiologically, especially in Great Britain, since 1985. Since it first became known, an initially local problem has developed into a Europe-wide crisis that has a serious impact on various aspects of personal and social life. In addition to hormone and drug scandals, BSE has had a lasting negative impact on trust in the quality and safety of food. The direct and indirect costs for the nation states and the EU resulting from the BSE crisis are considerable. In contrast to previously known causal forms, the transmissible spongiform encephalopathy and other degenerative brain diseases are a transmission that is probably caused solely by proteins, without the involvement of genetic information (s).
  • spongiform encephalopathies are transmitted solely by certain proteins, the so-called prions.
  • these prions are regular components of the membranes of nerve cells.
  • healthy prions are changed in their conformation, so that infectious prions accumulate in certain areas of the central nervous system. This accumulation is associated with the death of the affected neurons. In humans and animals, this change then leads to sometimes serious neurological disorders (Agrimi, U., Di Guardo, G. and Pocchiari, M. (1992).
  • Bovine spongiform encephalopathy an overview. Ann Ist Super Sanita 28, 497-505 ; Bennett, RM and Hallam, D. (1998). Implications of BSE policy for livestock production and veterinary Services in the United Kingdom. Vet Rec 742, 155-159; Bosch, X. (2001). European concern over BSE transmission. Jama 285, 397-398; Bradley, R. (1991).
  • Bovine spongiform encephalopathy (BSE): the current situation and research. Eur J Epidemiol 1 ', 532-544; Davies, G. (1996). Origin of BSE. Vet Rec 138, 23, Done, J. (1996). The BSE crisis. Vet Rec 138, 599; Fatzer, R., Graber, HU, Meyer, RK, Cardozo, C, Vandevelde, M. and Zurbriggen, A. (1996). Neuronal degeneration in brain stem nuclei in bovine spongiform encephalopathy. Primabl Veterinarmed A43, 23-29; Heim, D. and Wilesmith, JW (2000). Surveillance of BSE.
  • BSE is believed to be caused by the inadequate sterilization of animal meal made from carcasses of scrapie-infected sheep.
  • a transmission to humans through the consumption of, in particular, cattle slaughter products (especially the brain, offal) cannot be ruled out, and the transmission of BSE is being discussed, particularly in connection with the "new" form of Creutzfeld-Jakob disease.
  • the prions are infectious protein particles (MG approx. 28-35 kDa) that can be distinguished from viruses, viroids and plasmids, which may correspond to small nucleotides together with a polypeptide, and a host gene (PrP -Gen) can be encoded.
  • MG approx. 28-35 kDa infectious protein particles
  • PrP -Gen a host gene
  • the primarily apathogenic gene product is normally found on the membrane surface of the nerve cell surface. Its function is still unknown. Gene loss in mice does not lead to defects and prevents susceptibility to infection.
  • a specific prion is formed under disease conditions, which, in contrast to the normal variant, is protease-resistant.
  • PrP Sc This infectious or pathogenic isoform
  • PrP Sc This infectious or pathogenic isoform is from the same gene encodes and is identical in its amino acid sequence with the non-pathogenic gene product.
  • the change in protease sensitivity is based neither on differences in the amino acid sequence nor on post-translational modifications. Studies indicate that a change in conformation is probably responsible for the differences. This change in conformation may be accelerated by chaperones.
  • the difference between PrP and PrP Sc lies in the content of ⁇ -helix or ⁇ -leaflets, whereby the ⁇ -leaflets are responsible for the infectiousness.
  • the accumulated form of the infectious particles ie the pathogenic particles, has been detected in the CNS of animals and humans with subacute spongiform encephalopathies in the form of rod-shaped or fibril-shaped particles (so-called prion rods, scrapie-associated fibrilles).
  • prion diseases are characterized primarily by the fact that they occur sporadically or in families, and that they can be transmitted by tissue inoculation or protein injection. Common features of prion disease are specific mutations of the PrP gene in familial occurrence, the long latency period (usually several years), the inexorably progressive, always fatal course and pathologically-anatomically the lack of classic signs of inflammation with spongy degeneration of the brain tissue. Overcoming species barriers by prions has been proven within the animal kingdom (e.g.
  • Bioassav Is based on causing infections in mice by feeding brain material. Serves as proof of infectivity, which cannot be demonstrated by immunological methods. A sensitive test, which, however, involves a lot of work (Grassi, J.,
  • Immunohistochemical detection takes place in modified brain sections after appropriate pretreatment (Schulz-Schaeffer, W. J., Fatzer, R., Vandevelde, M. and Kretzschmar, H.
  • the paraffin-embedded tissue blot detects PrP (Sc) early in the incubation time in prion diseases.
  • ELISA Different ELISA methods for the detection of modified and unchanged prions are used. A distinction is made between the changed and unchanged prions either extracted sequentially or the unchanged prions are digested (Barnard, G., Heimick, B.,
  • a test method would therefore be desirable in which a marker particle could be detected in an infected organism.
  • no product has been developed that is suitable for this verification. This is due in particular to the fact that many questions regarding prion diseases and dementia of the Alzheimer type have not yet been clarified. So z. B. with prion diseases not even known exactly how the transmission path is. It is believed that prions are taken up in the digestive tract and from there the transmission - possibly via immune cells - to the nerve cells.
  • the sensitivity of conventional detection methods is nowadays too low to detect an infection at an early stage and thus e.g. B. to enable monitoring of animal populations and possible containment of epidemics, since the infected animals have already entered the food chain with the specificity, selectivity and sensitivity of the existing detection methods.
  • the earliest possible detection of encephalopathy is desirable in humans. B. to start with early therapy.
  • pathognostic variants are to be understood as those particles that are characteristic of a certain disease or disorder, so-called biomarkers.
  • Typical substances that occur in different variants are, for example, glycoproteins and peptides.
  • examples include HCG, FSH, LH, prolactin, transferrin and Tamm-Horsfall protein. Glycosylations can be found in eucariots as well as procariots and viruses (Kumar, RS and Tränt, JM (2001). Piscine glycoprotein hormone (gonadotropin and thyrotropin) receptors: a review of recent developments. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 129, 347 -355; Schaffer, C, Graninger, M. and Messner, P. (2001). Prokaryotic glycosylation. Proteomics 1, 248-261).
  • transthyretin and LH (Lamminen, T. and Huhtaniemi, I. (2001).
  • LH Huhtaniemi
  • Eur J Pharmacol 414, 1-7 Saraiva, MJ (2001).
  • Hum Mutat 17, 493-503 but receptors can also be affected (de Roux, N. and Milgrom, E. (2001). Inherited disorders of GnRH and gonadotropin receptors. Mol Gell Endocrinol 179, 83-87).
  • Post-translational modifications such as changes in the carbohydrate content of peptides and proteins as ligands and / or receptors, can also be responsible for the occurrence of different variants (isoforms).
  • glycoproteins are:
  • HCG HCG
  • FSH Choappel, SC (1995). Heterogeneity of follicle stimulating hormone: control and physiological function.
  • Hum Reprod Update 1, 479-487 LH, prolactin, glycodelin (Mueller, MD, Vigne, JL, Vaisse, C. and Taylor, RN (2000).
  • Glycodelin a pane in the implantation window.
  • the megalin receptor as a member of the low-density lipoprotein receptor family, which is also glycosylated (Li, Y., Cam, J. and Bu, G. (2001). Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mole Neurobiol 23, 53-67; Verroust, PJ and Kozyraki, R. (2001). The roles of cubilin and megalin, two multiligand receptors, in proximal tubule function: possible implication in the progression of renal disease. Curr Opin Nephrol
  • Degradation processes are the isoforms of retinol binding protein (RBP) in plasma and urine, which is shortened by one or two amino acids (Jaconi, S., Rose, K., Hughes, G.J., Saurat, J.H. and
  • trace protein in human cerebrospinal fluid a diagnostic marker for N-glycosylation defects in brain.Biochim Biophys Acta 1455, 54-60; Hiraoka, A., Seiki, K.,
  • kidney diseases and - as a result of smoking or eating certain
  • Hyperglycosylation of HCG can be observed in pregnancy, for example, in connection with Down syndrome (Cole, LA, Omrani, A., Cermik, D., Singh, RO and Mahoney, MJ (1998). Hyperglycosylated hCG, a potential alternative to hCG in Down syndrome screening. Prenat Diagn 18, 926-933). Certain forms can also indicate the success of pregnancy (Kovalevskaya, G., Birken, S., Kakuma, T., Ozaki, N., Sauer, M., Lindheim, S., Cohen, M., Kelly, A., Schlatterer, J. and O'Connor, JF (2002).
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • a correspondingly suitable detection and / or differentiation system is a prerequisite for utilizing the diagnostic potential of isoforms or micro-heterogeneities.
  • the aim of the invention is therefore to provide a method for the detection and / or differentiation of apathogenic particles and their pathogenic and / or pathognostic variants, which is so specific, selective and sensitive that in the case of encephalopathies already in a very early phase of Infection with comparatively little preparative effort these diseases can be detected. Furthermore, with the help of the new method, micro-heterogeneities are to be detected and / or diagnosed in order to be able to use their diagnostic potential in the case of a large number of diseases, disorders and changes.
  • the invention thus relates to a method for the detection and / or differentiation of apathogenic particles and their pathogenic and / or pathognostic variants, in particular for the diagnosis of encephalopathies, neurological disorders, inflammatory processes, tumor diseases, kidney diseases and / or changes, in particular reproductive disorders or of metabolism.
  • the apathogenic particles and their pathogenic and / or pathognostic variants present in or taken from the body's own material, in particular from the body's own material taken from a human or animal organism, are enriched on or on a carrier material. These particles are then detected and / or differentiated using their different masses.
  • apathogenic particles and in particular their pathogenic and / or pathognostic variants can be modified, in particular fractionated and / or marked.
  • the selective digestion or the chemical modification of the apathogenic, pathogenic and / or pathognostic particles can be used.
  • the particles bound on a carrier material can be treated enzymatically or chemically before the mass determination. So it is z. B. possible that treatment with protease K unchanged and pathologically modified particles, for. B. prions can be differentiated.
  • a further modification can be achieved, for example, by guanidine thiocyanant (Meyer, RK , Oesch, B., Fatzer, R., Zurbriggen, A. and Vandevelde, M. (1999) Detection of bovine spongiform encephalopathy-specific PrP (Sc) by treatment with heat and guanidine thiocyanate. J Virol 73, 9386-9392 ).
  • glycosylations or phosphorylations can also be detected by the enzymatic pretreatment of the (enriched and purified) proteins or peptides such as growth hormone and erythropoietin variants with, for example, glycosidases or phosphorylases on the support material.
  • the sample specifically enriched on the carrier material is mixed according to customary methods with specific enzymes which allow complete or selective elimination of sugar or phosphate residues.
  • Suitable enzymes are, for example, the PNGase-F glycosidases or phosphorylases such as the alkaline phosphatase and others.
  • Different glycosidases can be used to differentiate between N and O linkages of the sugar residues.
  • Hydrazine is used, for example.
  • the volume, time and temperature of the analytical steps are adapted to the surface of the carrier material, in accordance with known methods (Savage, A. (1997). translational modification. In Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production, (ed. H. Hauser and R. Wagner), pp. 231-276, Berlin, New York: Walter de Gruyter).
  • the apathogenic particles and their pathogenic and / or pathognostic variants are peptides, polypeptides, proteins, proteohormones and / or prions.
  • the prions in particular the prions are included in the invention, which are involved in the manifestation of scrapie, BSE, TME, CWS, FSE, SE, Kuru, Creutzfeld-Jakob disease, Gerstmann-St Hurssler-Scheinker syndrome and / or FFI ,
  • all other particles, in particular prions, which can be detected using the method according to the invention are also suitable.
  • the proteins claimed in accordance with the invention which are involved in the manifestation of dementia of the Alzheimer type, such as, for. B. the amyloids.
  • the proteins, peptides, polypeptides and proteohormones are preferably transferrin, alpha-fetoprotein, lactoferrin, transthyretin, thyrotropin, erythropoeitin, gonadotropins (FSH, LH, hCG), lipocalins, especially retinol binding protein, ß-2coprotein Tamm-Horsfall protein, renin, natriuretic peptide, transforming growth factor-ß (TGF-ß), granulocytes / macrophages colony stimulating factor (GM-CSF), platelet-derived growth factor (PDGF) and / or prolactin.
  • TGF-ß transforming growth factor-ß
  • GM-CSF granulocytes / macrophages colony stimulating factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • the body's own material is preferably material that has been removed from a living organism, but ex mortem removal is also provided according to the invention.
  • the body's own materials are body fluids, tissues and / or organs.
  • the body fluids can be blood, serum, plasma, urine, milk, Sweat, saliva and / or cerebrospinal fluid as well as all other body fluids.
  • Blood can e.g. B. by puncturing blood vessels (venipuncture). Because of the very small volume required for the analysis, blood can also be obtained by puncturing blood capillaries (for example the fingertip). Blood sampling or plasma / serum extraction as well as the extraction of other body fluids takes place according to established procedures.
  • Tissues and organs are removed by established biopsy procedures or post mortem and stored according to established procedures. Before the analysis, the organs and tissues must first be homogenized, for example according to established procedures in appropriate buffers. So z. B. the homogenization of a suitable tissue - e.g. B brain - done in 320 mM sucrose solution. The homogenate is then clarified by centrifugation (7,000 g / 5 min.) Using the method of Meyer et al.
  • Dilution steps and sample volume depend on the particle concentration in the respective matrix.
  • a selective enrichment on the carrier material can take place, for example, by selective fractionation.
  • Methods for tissue homogenates and urine are known (Maissen, M., Roeckl, C, Glatzel, M., Goldmann, W. and Aguzzi, A. (2001).
  • Plasminogen binds to disease-associated prion protein of multiple species. Lancet 357, 2026-2028; Shaked, GM , Fridlander, G., Meiner, Z., Taraboulos, A. and Gabizon, R. (1999)
  • Protease-resistant and detergent-insoluble prion protein is not necessarily associated with prion infectivity. No increase in mortality found among occupations exposed to BSE. J Bio! Chem 27'4, 17981-17986).
  • the support material is a chromatographic support material.
  • This chromatographic support material can be a hydrophobic, hydrophilic, cation-exchanging, anion-exchanging and / or metal ion-binding support material, but also all other chromatographic support materials are claimed by the methods according to the invention.
  • These chromatographic carrier materials can be used for the selective enrichment of apathogenic and pathogenic particles. So z. B.
  • a further step the selective removal of as many constituents of the body's own material (eg proteins and peptides) from the carrier material that are not of interest can then be carried out.
  • as differentiation criteria between apathogenic and pathogenic and / or pathognostic particles for example, special bonds to certain chromatographic surfaces, differences in the binding intensity to these surfaces in Depending on the stringing of the washing buffer etc. serve.
  • an immobilized carrier material can also be used as carrier material, which is claimed in a further embodiment of the method.
  • this immobilized carrier material has been immobilized with antibodies, aptamers, binding proteins and / or receptors and other functional groups which allow selective enrichment of the substance to be analyzed.
  • the carrier material or the surface of the carrier material can be activated before immobilization.
  • an antibody monoclonal / polyclonal
  • aptamer aptamer
  • binding proteins and / or receptors are immobilized on these activated / inactivated carrier materials, which are able to bind apathogenic and pathogenic and / or pathognostic particles and thus together with fragments or Variants from complex matrices, e.g. B. solutions to fish.
  • the antibody, aptamer, binding protein and / or receptor can be coupled either directly or via a spacer.
  • the orientation of the antibody, binding protein and / or receptor can be controlled by using a spacer.
  • Antibodies, binding proteins and / or receptors are coupled in the usual way during an incubation period, the parameters (duration, temperature, etc.) of which are determined by the matrix and the concentration of the pathogenic and / or pathognostic and apathogenic particles to be examined (species specificity or variant) (Kuczius, T. and Groschup, MH (1999). Differences in proteinase K resistance and neuronal deposition of abnormal prion proteins characterize bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie strains. Mol Med 5, 406-418).
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • the carrier material can be e.g. B. a chip, preferably a protein chip. Enrichment, detection and, if necessary, necessary modification can take place on or on this chip.
  • the apathogenic particles and their pathogenic and / or pathognostic variants are separated from one another before they are detected.
  • This separation of the apathogenic and pathogenic and / or pathognostic particles can take place before or after the enrichment on a suitable carrier material.
  • the separation can be carried out after modification, in particular fractionation and / or marking.
  • suitable modifications of the particles such as glycosylation or phosphorylation by the enzymatic pretreatment of the apathogenic and pathogenic and / or pathognostic particles cleaned (possibly previously enriched) with, for example, glycosidases or phosphorylases (Kuczius, T.
  • MH Differences in proteinase K resistance and neuronal deposition of abnormal prion proteins characterize bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie strains. Mol Med 5, 406-418).
  • specific enzymes are added to the sample (enriched) specifically on the carrier material in accordance with customary methods, which enzymes allow complete or selective elimination of sugar or phosphate residues.
  • Suitable enzymes are, for example, the glycosidases PNGase-F or phosphorylases such as the alkaline phosphatase and the like. By using different glycosidases, a distinction can be made between N and O linkages of the sugar residues. Another possibility is the chemical splitting off of sugar residues.
  • Hydrazine is used here.
  • the analytical steps take place in Volume, time and temperature adapted to the carrier materials according to known methods (Kuczius, T. and Groschup, MH (1999). Differences in proteinase K resistance and neuronal deposition of abnormal prion proteins characterize bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie strains. Mol Med 5, 406-418; Savage, A. (1997) Glycosylation: A post-translational modification: In Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production, (ed. H. Hauser and R. Wagner), pp. 231-276. Berlin, New York: Walter de Gryter).
  • particle modification which can improve the distinction between pathogenic and / or pathognostic and apathogenic particles under the described enrichment and measurement conditions, represent various known and future possibilities for the selective labeling of amino acids or covalent modifications which lead to mass changes and can thus be detected by mass spectroscopy or, after modification, can lead to the separation of the apathogenic from the pathogenic and / or pathognostic particles. This separation can then be carried out using known separation processes.
  • the apathogenic particles and their pathogenic and / or pathognostic variants are detected via their different molecular weights.
  • SELDI surface enhanced laser desorption / ionization
  • SELDI surface enhanced laser desorption / ionization
  • MS mass spectrometry
  • the particles are after adding a Energy-absorbing matrix ionized with the help of a laser beam and then accelerated in an electrical field.
  • the firing frequency of the laser beam averages 50 to 100 shots.
  • the molecular mass of the bound particles and any fragments that may be present is determined from the flight time of the particles from the sample carrier to the detector at the end of the flight tunnel.
  • the differentiation between apathogenic and pathogenic and / or pathognostic particles is usually made on the basis of the difference in the molecular weight of the particles and / or their fragments which may be present after cleavage.
  • the accuracy of the system in relation to the information about the molecular weight is approximately 0.1 to 0.01 percent.
  • the apathogenic particles and their pathogenic and / or pathognostic variants are quantified. This quantification can be done using standards of apathogenic particles and their pathogenic and / or pathognostic variants.
  • the method according to the invention is initially characterized in that it can be used to diagnose pathological changes.
  • disorders in the area of reproduction, especially diseases in pregnancy are recorded. Alcoholism, diabetes and glycosylation disorders can also be diagnosed.
  • the method according to the invention can also be used to assess physiological functional states.
  • the physiological functional states can be the definition of sexual maturity in male and female organisms, the characterization of the cycle and / or the course of menopause in female organisms.
  • the invention comprises a method for examining the importance of micro-heterogeneity-related differences on the interactions or binding capabilities of the substances in question with, for example, antibodies, binding proteins, transport proteins and / or receptors. In this way, the influence of peptide or protein modifications on the binding ability to, for example, transport proteins or receptors can be assessed. Furthermore, the specificity of polyclonal and / or monoclonal antibodies can be tested with the aid of the method according to the invention.
  • Antibody testing plays an important role, for example, in the development of immunological detection methods such as ELISA or various methods of immunohistochemistry.
  • Specific monoclonal or polyclonal antibodies against the particles to be examined and an IgG control in a concentration between 0.01 and 0.09 mg / ml are applied in a volume of 20 ⁇ l to the preactivated surfaces of a carrier material.
  • the incubation then takes place in a water vapor-saturated chamber (incubation chamber) for 1 to 2 hours at room temperature or at 4 ° C. overnight (14-16 hours). During this incubation period, the antibodies are covalently bound to the activated substrate surfaces. The remaining free areas of the carrier material are blocked by the subsequent addition of 20 ⁇ l glycerol solution (0.1 M, pH 7.8). There is a further incubation for 20 minutes at room temperature in the incubation chamber.
  • the antibody solution is then removed by washing several times.
  • the punctiform surfaces are washed with 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) solution (50-100 ⁇ l).
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) solution 50-100 ⁇ l.
  • 300 ⁇ l PBS solution containing 0.5% (v / v) Triton X-100 The incubation period at room temperature is 20 minutes in the incubation chamber.
  • two further washing steps each with 300 ⁇ l PBS (without Triton X-100) for 10 minutes at room temperature in the incubation chamber.
  • sample material is either applied directly to the pre-activated and immobilized carrier material at a low level
  • the carrier material is then dried.
  • alpha-cyano-4- is used as an energy absorbing substance.
  • the analysis of the apathogenic particles and their pathogenic and / or pathognostic variants is then carried out using a time-of-flight mass spectrometer.
  • This invention makes it possible to enrich and detect very similar (micro-heterogeneous) variants of particles from a complex mixture of substances.
  • the subject of the invention combines, inter alia, the selectivity of antibodies or other affinity steps with a high degree of accuracy in determining the molecular weight of the enriched molecules.
  • An analysis run is generally completed within 4 hours. The sample throughput depends on the degree of automation.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von apathogenen Partikeln und deren pathogenen und/oder pathognostischen Varianten (Isoformen), insbesondere zur Diagnose von Enzephalopathien in einem Organismus, bei dem die in entnommenem körpereigenen Material, insbesondere von einem menschlichen oder tierischen Organismus entnommene körpereigene Material, vorhandenen apathogenen Partikel und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten auf oder an einem Trägermaterial angereichert werden, und anschliessend diese Partikel über ihre unterschiedlichen Massen nachgewiesen und/oder differenziert werden.

Description

Beschreibung
Verfahren zum Nachweis von apathogenen Partikeln und deren pathogenen und/oder pathognostischen Varianten im Organismus
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von apathogenen Partikeln und deren pathogenen und/oder pathognostischen Varianten, insbesondere zur Diagnose von Enzephalopathien in einem Organismus, sowie auch zur Diagnose von neurologischen Störungen, Entzündungsprozessen, Tumorerkrankungen, Nierenerkrankungen und/oder Veränderungen, insbesondere Störungen der Reproduktion oder des Stoffwechsels.
Bei den Enzephalopathien handelt es sich um eine Sammelbezeichnung für nicht-entzündliche Erkrankungen oder Schädigungen des Gehirns unterschiedlicher Atiologie. Bei den subakuten spongiformen Enzephalopathien (heutzutage häufig als transmissible [übertragbare] spongiforme Enzephalopathien bezeichnet), handelt es sich um eine Gruppe sporadischer, erblicher oder übertragbarer Erkrankungen des ZNS, die durch schwammige (spongiforme) Degenerationen des Gehirns (ausgedehnter Nervenzellverlust, Wucherung der Neuroglia) und langsam progredienten, immer tödlichen Verlauf gekennzeichnet sind und den Prionenkrankheiten zugerechnet werden. Zu den Enzephalopathien wird auch die Alzheimer-Krankheit gerechnet, eine Demenz, d. h. eine progrediente degenerative Veränderung des Gehirns mit Verlust von früher erworbenen kognitiven Fähigkeiten. Diese progrediente Hirnatrophie tritt vor allem ab dem 40. Lebensjahr bei Frauen auf. Pathologisch sind die sogenannten Alzheimer- Degenerationsfibrillen, längliche oder lockenförmige, dicke Fibrillen aus zwei helixartig verbundenen Filamenten im Zytoplasma von Nervenzellen, und eventuell Amyloidablagerungen, nachzuweisen.
Im Tierreich kommen Enzephalopathien, insbesondere die subakuten spongiformen Enzephalopathien, bei Schaf oder Ziege (Scrapie), Rind (BSE; bovine spongiform encephalopathy), Nerz (TME; transmissible mink encephalopathy), Katze (FSE; feline spongiform encephalopathy) Gepard bzw. Puma (SE; spongiform encephalopathy), Hirsch, Reh oder Elch (CWS; chronic wasting syndrome) und andere Säugetierarten vor. Beim Menschen wird die Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Kuru, Gerstmann- Sträussler-Scheinker-Syndrom und die tödliche familiäre Schlaflosigkeit (FFI; fatal familial insomnia) diesen Erkrankungen zugerechnet. BSE (bovine spongiform encephalopathy; sogenannter Rinderwahnsinn) ist eine bei Rindern vorkommende Form der subakuten spongiformen Enzephalopathien, die seit 1985 vor allem in Großbritannien epidemiologisch auftreten. Seit deren ersten Bekanntwerden hat sich aus einem zunächst lokalen Problem eine europaweite Krise entwickelt, die einen gravierenden Einfluß auf vielfältige Aspekte des persönlichen und gesellschaftlichen Lebens hat. Neben Hormon- und Arzneimittelskandalen hat BSE das Vertrauen in Qualität und Sicherheit von Lebensmitteln nachhaltig negativ beeinflußt. Die aus der BSE-Krise resultierenden direkten und indirekten Kosten für die Nationalstaaten und die EU sind erheblich. Im Gegensatz zu bisher bekannten Verursachungsformen handelt es sich bei der übertragbaren spongiformen Enzephalopathie und anderen degenerativen Hirnerkrankungen um eine Übertragung, die wohl alleine durch Proteine, ohne Beteiligung von Erbinformation(en), verursacht wird. Nach der von Prusier formulierten sogenannten Prionentheorie werden spongiforme Enzephalopathien alleine durch bestimmte Proteine, den sogenannten Prionen, übertragen. In gesunden Individuen stellen diese Prione reguläre Bestandteile der Membranen von Nervenzellen dar. In einer Kettenreaktion werden gesunde Prionen in ihrer Konformation verändert, so daß es zu einer Anhäufung von infektiösen Prionen in bestimmten Bereichen des zentralen Nervensystems kommt. Diese Anhäufung ist mit einem Absterben der betroffenen Neuronen verbunden. Bei Mensch und Tier führt diese Veränderung dann zu zum Teil schwerwiegenden neurologischen Störungen (Agrimi, U., Di Guardo, G. and Pocchiari, M. (1992). Bovine spongiform encephalopathy: an overview. Ann Ist Super Sanita 28, 497-505; Bennett, R. M. and Hallam, D. (1998). Implications of BSE policy for livestock production and veterinary Services in the United Kingdom. Vet Rec 742, 155-159; Bosch, X. (2001 ). European concern over BSE transmission. Jama 285, 397-398; Bradley, R. (1991 ).
Bovine spongiform encephalopathy (BSE): the current Situation and research. Eur J Epidemiol 1 ', 532-544; Davies, G. (1996). Origin of BSE. Vet Rec 138, 23, Done, J. (1996). The BSE crisis. Vet Rec 138, 599; Fatzer, R., Graber, H. U., Meyer, R. K., Cardozo, C, Vandevelde, M. and Zurbriggen, A. (1996). Neuronal degeneration in brain stem nuclei in bovine spongiform encephalopathy. Zentralbl Veterinarmed A43, 23-29; Heim, D. and Wilesmith, J. W. (2000). Surveillance of BSE. Arch Virol Suppl, 127-133; Holm, L. and Mohl, M. (2000). The role of meat in everyday food culture: an analysis of an interview study in Copenhagen. Appetite 34, 277-283; Josephson, J. (1998). Cows for fear: is BSE a threat to human health? Bovine spongiform encephalopathy. Environ Health Perspect 106, A134-138; Kaaden, O. R. and Truyen, U. (1999). Recent developments in the epidemiology of virus diseases and BSE. Infection 27, S39-41 ; Kaaden, O. R., Truyen, U., Groschup, M. H., Uysal, A., Kaiser, E., Kretzschmar, H., Bogumil, T., Pohlenz, J., Diringer, H., Steinhagen, P. et al. (1994). Bovine spongiform encephalopathy in Germany. Zentralbl Veterinarmed [B\ 41 , 294-304; Kretzschmar, H. A. (1999). Molecular pathogenesis of prion diseases. Eur Arch Psychiatry Cfin Neurosci 249, 56-63; Love, J., Galloway, J. and Mclntosh, N. (1996). The BSE crisis. Vet Rec 138, 422; Simmons, M. M., Ryder, S. J., Chaplin, M. C, Spencer, Y. I., Webb, C. R., Hoinville, L. J., Ryan, J., Stack, M. J., Wells, G. A. and Wilesmith, J. W. (2000). Scrapie surveillance in Great Britain: results of an abattoir survey, 1997/98. Vet Rec 146, 391 -395.; Stekel, D. J., Nowak, M. A. and Southwood, T. R. (1996). Prediction of future BSE spread. Nature 381 , 1 19; Wadsworth, J. D., Jackson, G. S., Hill, A. F. and Collinge, J. (1999). Molecular biology of prion propagation. Curr Opin Genet Dev 9, 338-345).
Ursache für BSE ist vermutlich die Verfütterung unzureichend sterilisierten Tiermehls, das aus Kadavern von Scrapie-infizierten Schafen hergestellt wurde. Eine Übertragung auf den Menschen durch den Verzehr insbesondere von Rinderschlachtprodukten (vor allem Gehirn, Innereien) ist nicht auszuschließen, und insbesondere im Zusammenhang mit der „neuen" Form von Creutzfeld-Jakob-Krankheit wird die Übertragung von BSE diskutiert.
Bei den Prionen (proteinatious infectious particles; eigentlich Proinen) handelt es sich um von Viren, Viroiden und Plasmiden unterscheidbare infektiöse Eiweißpartikel (MG ca. 28-35 kDa), die eventuell kleinen Nukleotiden zusammen mit einem Polypeptid entsprechen, und von einem Wirtsgen (PrP-Gen) kodiert werden. Das primär apathogene Genprodukt ist, wie weiter oben schon beschrieben, normalerweise membrangebunden an der Zelloberfläche von Nervenzellen anzutreffen. Seine Funktion ist bis heute unbekannt. Ein Genverlust bei Mäusen führt zu keinen Defekten und verhindert die Infektionsanfälligkeit. Unter Krankheitsbedingungen wird ein spezifisches Prion gebildet, das im Gegensatz zur normalen Variante Protease-resistent ist. Diese infektiöse bzw. pathogene Isoform (PrPSc) wird vom gleichen Gen kodiert und ist identisch in seiner Aminosäuresequenz mit dem apathogenen Genprodukt. Die Veränderung in Bezug auf die Proteaseempfindlichkeit beruht weder auf Unterschieden in der Aminosäuresequenz noch auf postranslationalen Modifikationen. Untersuchungen weisen darauf hin, daß wahrscheinlich eine Konformationsänderung für die Unterschiede verantwortlich ist. Diese Konformationsänderung wird eventuell durch Chaperone beschleunigt. Der Unterschied zwischen PrP und PrPSc liegt im Gehalt an α-Helix bzw. ß-Faltblättem, wobei die ß-Faltblätter für die Infektiösität verantwortlich sind. Die infektiösen Partikel, d. h. die pathogenen Teilchen, sind in ihrer akkumulierten Form als stab- oder fibrillenförmige Partikel (sogenannte Prionstäbe, Scrapie-associated fibrilles) im ZNS von Tieren und Menschen mit subakuten spongiformen Enzephalopathien nachgewiesen worden.
Erstaunlicherweise konnte bis jetzt kein Hinweis auf Antigene oder eine Immunantwort des Wirtes auf die pathogenen Partikel nachgewiesen werden, und die Prionen zeigen eine ungewöhnliche Resistenz gegenüber Proteasen, Nukleasen, Temperatur, UV- und Röntgenstrahlung sowie chemischen Einflüssen. Die Prionenkrankheiten zeichnen sich vor allem dadurch aus, daß sie sporadisch oder familiär gehäuft auftreten und durch Gewebeinokulation bzw. Eiweißinjektion übertragbar sind. Gemeinsame Merkmale der Prionenerkrankung sind spezifische Mutationen des PrP-Gens bei familiärem Vorkommen, die lange Latenzzeit (meist mehrere Jahre), der unaufhaltsam progrediente, stets tödlich endende Verlauf und pathologisch-anatomisch das Fehlen klassischer Entzündungszeichen bei schwammiger Degeneration des Hirngewebes. Die Überwindung von Artenbarrieren durch Prionen ist innerhalb des Tierreiches erwiesen (z. B. zwischen Schaf und Rind), und eine Übertragbarkeit von Tieren auf den Menschen ist nicht auszuschließen und sehr wahrscheinlich. Neben der Gefahr für die Volksgesundheit sind es vor allem die finanziellen Schäden, die durch BSE entstanden sind und sich mittlerweile zu Milliardenbeträgen summieren, die die Suche nach geeigneten Tests und Nachweisverfahren vorantreiben. Die Nachweismöglichkeiten wurden in mehreren Übersichtarbeiten dargestellt (Butler, D. (1998). Brüssels seeks BSE diagnostic test to screen European cattle. Nature 395, 205-206; Moynagh, J. and Schimmel, H. (1999). Test for BSE evaluated. Bovine spongiform encephalopathy. Nature 400, 105; Schiermeier, Q. (2001 ). Testing times for BSE. Nature 409, 658-659; van Keulen, L. J., Langeveld, J. P., Garssen, G. J., Jacobs, J. G., Schreuder, B. E. and Smits, M. A. (2000). Diagnosis of bovine spongiform encephalopathy: a review. Vet Q 22, 197-200). Dabei kann zwischen folgenden Verfahren unterschieden werden :
1. Bioassav: Beruht auf der Verursachung von Infektionen bei Mäusen durch die Verfütterung von Gehirnmaterial. Dient als Nachweis der Infektiösität, die durch immunologische Methoden nicht nachgewiesen werden kann. Ein empfindlicher Test, der jedoch mit einem hohen Arbeitsaufwand verbunden ist (Grassi, J.,
Creminon, C, Frobert, Y., Fretier, P., Turbica, I., Rezaei, H., Hunsmann, G., Comoy, E. and Deslys, J. P. (2000). Specific determination of the proteinase K-resistant form of the prion protein using two-site immunometric assays. Application to the post-mortem diagnosis of BSE. Arch Virol Suppl, 197-205).
2. Immunhistochemische Nachweismethoden: Der immunhistochemische Nachweis erfolgt in veränderten Gehirnschnitten nach entsprechender Vorbehandlung (Schulz- Schaeffer, W. J., Fatzer, R., Vandevelde, M. and Kretzschmar, H.
A. (2000a). Detection of PrP(Sc) in subclinical BSE with the paraffin-embedded tissue (PET) blot. Arch Virol Suppl, 173-180). Western-Blottinq: Westem-Blot-Techniken machen sich die Besonderheit zunutze, daß das veränderte Prion nicht durch Proteasen vollständig verdaut werden kann (Beekes, M., Baldauf, E., Cassens, S., Diringer, H., Keyes, P., Scott, A. C, Wells, G. A., Brown, P., Gibbs, C. J., Jr. and Gajdusek, D. C. (1995). Western blot mapping of disease-specific amyloid in various animal species and humans with transmissible spongiform encephalopathies using a high-yield purification method. J Gen Virol 76, 2567-2576; Cooley, W. A., Clark, J. K., Ryder, S. J., Davis, L. A., Farrelly, S. S. and Stack, M. J. (2001 ). Evaluation of a rapid western immunoblotting procedure for the diagnosis of bovine spongiform encephalopathy (bse) in the uk. J Comp Pathol 125, 64-70; Katz, J. B., Pedersen, J. C, Jenny, A. L. and Taylor, W. D. (1992). Assessment of western immunoblotting for the confirmatory diagnosis of ovine scrapie and bovine spongiform encephalopathy
(BSE). J Vet Diagn Invest 4, 447-449; Madec, J. Y., Belli, P., Calavas, D. and Baron, T. (2000). Efficiency of Western blotting for the specific immunodetection of proteinase K-resistant prion protein in BSE diagnosis in France, Vet Rec 146- 74-76; Oesch, B. (1994). Characterization of PrP binding proteins. Philos Trans R
Soc Lond B Biol Sei 343, 443-445; Oesch, B., Doherr, M., Heim, D., Fischer, K., Egli, S., Bolliger, S., Biffiger, K., Schaller, O., Vandevelde, M. and Moser, M. (2000). Application of Prionics Western blotting procedure to screen for BSE in cattle regularly slaughtered at Swiss abattoirs. Arch Virol Suppl, 189-195; Oesch,
B., Jensen, M., Nilsson, P. And Fogh, J. (1994). Properties of the scrapie prion protein: quantitative analysis of protease resistance. Biochemistry 33, 5926-5931 ; Paraf, A, (1998). An immunological approach to prion diseases. Med Hypotheses 50, 85-90; Schaller, O., Fatzer, R., Stack, M., Clark, J., Cooley, W., Biffiger, K., Egli,
S., Doherr, M., Vandevelde, M., Heim, D. et al. (1999). Validation of a western immunoblotting procedure for bovine PrP(Sc) detection and its use as a rapid surveillance method for the diagnosis of bovine spongiform encephalopathy (BSE). Acta Neuropathol (Berl) 98, 437-443; Schulz-Schaeffer, W. J., Tschoke, S., Kranefuss, N., Drose, W., Hause-Reitner, D., Giese, A., Groschup, M. H. and Kretzschmar, H. A. (2000b). The paraffin- embedded tissue blot detects PrP(Sc) early in the incubation time in prion diseases. Am J Pathol 156, 51-56; Yokoyama, T. (1999). The immunodetection of the abnormal isoform of prion protein. Histochem J 31 , 209-212).
4. ELISA: Verschiedene ELISA-Methoden zum Nachweis von veränderten und unveränderten Prionen werden verwendet. Dabei erfolgt eine Unterscheidung zwischen den veränderten und unveränderten Prionen entweder sequenziell extrahiert oder die unveränderten Prionen werden verdaut (Barnard, G., Heimick, B.,
Madden, S., Gilbourne, C. and Patel, R. (2000). The measurement of prion protein in bovine brain tissue using differential extraction and DELFIA as a diagnostic test for BSE. Luminescence 15, 357- 362). Eine selektive Prionenform (PrPSc) bindet . (Barnard, G., Heimick, B., Madden, S., Gilbourne, C. and Patel, R. (2000). The measurement of prion protein in bovine brain tissue using differential extraction and DELFIA as a diagnostic test for BSE. Luminescence 15, 357-362).
Alle bisher vorhandenen Nachweisverfahren für Enzephalopathien haben aber neben den schon genannten weitere Nachteile. So erreichen z. B. die PrPBSE-Konzentrationen in dem Gewebe von Rindern erst ca. 6 Monate vor Ausbruch der Erkrankung einen Wert, der nachgewiesen werden kann. Die Inkubationszeit beim Rind liegt zwischen 24 Monaten und 6 Jahren, durchschnittlich bei 5 Jahren. Da in Deutschland ca. 60 % der Rinder, die geschlachtet werden, nicht älter als 2 Jahre sind, ist der Hauptteil des Rindfleisches, das in Deutschland in die Nahrungskette gelangt, von Tieren abstämmig, die, auch wenn sie BSE hätten, mit den vorhandenen Testverfahren nicht erkannt werden können. Desweiteren werden zum Teil bei den vorhandenen Nachweisverfahren nicht direkt die Prionen, sondern ZNS-Gewebe nachgewiesen. Die Verfütterung von Gehirnmaterial an Mäusen (Bioassay) ist mit einem hohen präparativen und finanziellen Aufwand verbunden, die anderen Nachweisverfahren (immunhistochemische Nachweismethoden, Western-Blotting) können meist erst am toten Organismus die Prionen nachweisen.
Erwünscht wäre daher ein Testverfahren, in dem bei einem infizierten Organismus ein Markerpartikel nachgewiesen werden könnte. Jedoch ist bis heute kein Produkt entwickelt worden, das für diesen Nachweis geeignet ist. Dies liegt insbesondere daran, daß viele Fragen bezüglich der Prionenkrankheiten sowie auch der Demenz vom Alzheimer-Typ noch nicht geklärt worden sind. So ist z. B. bei den Prionenerkrankungen noch nicht einmal bekannt, wie genau der Übertragungsweg ist. Es wird vermutet, daß Prionen im Verdauungstrakt aufgenommen werden und von dort die Übertragung - eventuell über Immunzellen - auf die Nervenzellen erfolgt. Die Sensitivität üblicher Nachweisverfahren ist heutzutage zu gering, um eine Infektion in einem frühen Stadium festzustellen und somit z. B. eine Überwachung der Tierbestände und eventuelle Eindämmung von Epidemien zu ermöglichen, da die infizierten Tiere bei der heutigen Spezifität, Selektivität und Sensitivität der vorhandenen Nachweisverfahren schon in die Nahrungskette gelangt sind. Ferner ist auch beim Menschen ein möglichst früher Nachweis einer Enzephalopathie erwünscht, um so z. B. mit einer frühzeitigen Therapie beginnen zu können.
Neben einem Testverfahren für derartige pathogene Partikel ist in vielen Fällen auch ein Nachweis von pathognostischen Varianten bestimmter apathogener Partikel von Interesse. Unter pathognostischen Varianten sind solche Partikel zu verstehen, die für eine bestimmte Krankheit oder Störung kennzeichnend sind, also sogenannte Biomarker.
In vielen Fällen wurde beobachtet, dass körpereigene Substanzen, wie Peptide und Proteine in sich sehr heterogen sind. Diese körpereigenen Substanzen liegen in mehreren Varianten vor, die als Isoformen bezeichnet werden. Man spricht hier auch von Mikroheterogenitäten, die sich durch Veränderungen im Aminosäuregerüst, durch posttranslationale Modifikationen im Zusammenhang mit der Synthese, der Sekretion und/oder des Abbaus der Peptide oder Proteine äußern können. Diese Mikroheterogenitäten sind in vielen Fällen von pathogener Bedeutung. Der Nachweis des Auftretens dieser Varianten ist damit nicht nur von pathogenetischer sondern auch von pathognostischer bzw. pathognomischer Bedeutung. Die veränderten Varianten einer körpereigenen Substanz können damit als Biomarker physiologischer, pathophysiologischer oder pathologischer
Zustandsveränderungen eingesetzt werden und besitzen damit ein hohes diagnostisches Potential. Diese Veränderungen können Ausdruck physiologischer Veränderungen sein, können als Folge von Erkrankungen entstehen oder Folgen exogener Ursachen sein (Beitins, I. Z. and Padmanabhan, V. (1991 ). Bioactivity of gonadotropins. Endocrinol Metab Clin North Am. 20, 85-120; Chappel, S.C. (1995). Heterogeneity of follicle stimulating hormone: control and physiological function. Hum Reprod Update 1 , 479-487; Seregni, E., Botti, C. and Bombardieri, E. (1995). Biochemical characteristics and clinical applications of alpha-fetoprotein isoforms. Anticancer Res 15, 1491 - 1499; Wilson, C. A., Leigh, A. J. and Chapman, A. J. (1990). Gonadotrophin glycosylation and function. J Endocrinol 125, 3-14.).
Typische Substanzen, die in verschiedenen Varianten vorkommen, sind beispielsweise Glykoproteine und -peptide. Beispiele dafür sind HCG, FSH, LH, Prolaktin, Transferrin und Tamm-Horsfall-Protein. Glykosylierungen sind sowohl bei Eukarioten als auch Prokarioten und Viren zu finden (Kumar, R. S. and Tränt, J. M. (2001 ). Piscine glycoprotein hormone (gonadotropin and thyrotropin) receptors: a review of recent developments. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 129, 347-355; Schaffer, C, Graninger, M. and Messner, P. (2001 ). Prokaryotic glycosylation. Proteomics 1 , 248-261 ). Auch beispielsweise membranständige, zytoplasmatische und nukleare Rezeptoren und Bindungsproteine können von diesen Veränderungen betroffen sein (Abumrad, N. A., Sfeir, Z., Connelly, M. A. and Coburn, C. (2000). Lipid transporters: membrane transport Systems for cholesterol and fatty acids. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 3, 255-262).
Beispiele für das Auftreten verschiedener Varianten ein und der selben Substanz durch Veränderungen im Peptidgerüst (z.B. Punktmutationen) sind beispielsweise Transthyretin und LH (Lamminen, T. and Huhtaniemi, I. (2001 ). A common genetic variant of luteinizing hormone; relation to normal and aberrant pituitary-gonadal function. Eur J Pharmacol 414, 1 -7; Saraiva, M. J. (2001 ). Transthyretin mutations in hyperthyroxinemia and amyloid diseases. Hum Mutat 17, 493-503); aber auch Rezeptoren können betroffen sein (de Roux, N. and Milgrom, E. (2001 ). Inherited disorders of GnRH and gonadotropin receptors. Mol Gell Endocrinol 179, 83-87).
Auch postranslationale Modifikationen, wie beispielsweise die Veränderungen des Kohlenhydratanteils bei Peptiden und Proteinen als Liganden und/oder Rezeptoren, können für das Auftreten unterschiedlicher Varianten (Isoformen) verantwortlich sein. Beispiele für derartige Glykoproteine sind:
- HCG, FSH (Chappel, S. C. (1995). Heterogeneity of follicle stimulating hormone: control and physiological function. Hum Reprod Update 1 , 479-487); - LH, Prolaktin, Glycodelin (Mueller, M. D., Vigne, J. L., Vaisse, C. and Taylor, R. N. (2000). Glycodelin: a pane in the implantation window. Semin Reprod Med 18, 289-298);
- Haptoglobulin (Andersson, M., Stenstrom, M., Vatne, M., Sevelius, E. and Jonsson, L. (1998). Disease-related variations of the glycosylation of haptoglobin in the dog. J Comp Pathol 119, 227- 238);
- Alpha-Fetoprotein (Breborowicz, J. (1988). Microheterogeneity of human alphafetoprotein. Tumour Biol 9, 3-14; Gillespie, J. R. and Uversky, V. N. (2000). Structure and function of alpha-fetoprotein: a biophysical overview. Biochim Biophys Acta 1480, 41 -56.; Seregni, E., Botti, C. and Bombardiere, E. (1995). Biochemical characteristics and clinical applications of alpha-fetoprotein isoforms. Anticancer Res 15, 1491 -1499); - Transferrin (Sillanaukee, P., Strid, N., Allen, J. P. and Litten, R. Z.
(2001 ). Possible reasons why heavy drinking increases carbohydrate-deficient transferrin. Alcohol Clin Exp Res 25, 34-40; van Rensburg, S. J., Berman, P. A., Potocnik, F. C. and Taljaard, J. J. (2000). Glycosylation of transferrin in Alzheimer's disease and alcohol-induced dementia. Metab Brain Dis 15, 243-247);
- Erythropoetin (Kendall, R. G. (2001 ). Erythropoietin. Clin Lab Haematol 23, 71 -80);
- Muzine (Corfield, A. P., Carroll, D., Myerscough, N. and Probert, C. S. (2001 ). Mucins in the gastrointestinal tract in health and disease. Front Biosci 6, D1321 -1357).
Eine Mikroheterogenität von Peptiden und Proteinen kann auch beobachtet werden bei:
- Proteinen der Milchfettkügelchenmembran (Mather, I. H. (2000). A review and proposed nomenclature for major proteins of the milk- fat globule membrane. J Dairy Sei 83, 203-247); - Proteinen der Tränenflüssigkeit (Bjerrum, K. B. (1999). Tear fluid analysis in patients with primary Sjogren's syndrome using lectin probes. A comparative study of patients with primary Sjogren's syndrome, patients with other immune inflammatory connective tissue diseases and controls. Acta Ophthalmol Scand 77, 1 -8);
- Proteinen des Speichels (Carpenter, G. H. and Proctor, G. B. (1999). O-Iinked glycosylation oecurs on basic parotid salivary proline-rich proteins. Oral Microbiol Immunol 14, 309-315);
- Proteinen des Ovidukts und des Uterus (Abe, H. and Abe, M. (1993). Immunological detection of an oviductal glycoprotein in the rat. J Exp Zool 266, 328-335; Buhi, W. C, Alvarez, I. M. and Kouba, A. J. (2000). Secreted proteins of the oviduet. Cells Tissues Organs 166, 165-179; Chu, S. T., Huang, H. L, Chen, J. M. and Chen, Y. H. (1996). Demonstration of a glycoprotein derived from the 24p3 gene in mouse uterine luminal fluid.
Biochem. J 316, 545-550; Seppala, M., Koistinen, H. and Koistinen, R. (2001 ). Glycodelins. Trends Endocrinol Metab 12, 111 -117);
- Proteinen des Harns als Filtrate von Serumproteinen oder bei harnspezifischen Proteinen (Kovalevskaya, G., Birken, S.,
Kakuma, T., Ozaki, N., Sauer, M., Lindheim, S., Cohen, M., Kelly, A., Schlauerer, J. and O'Connor, J. F. (2002). Differential expression of human chorionic gonadotropin (hCG) glycosylation isoforms in failing and continuing pregnancies: preliminary characterization of the hyperglycosylated hCG epitope. J
Endorinol 172, 497-506; van Rooijen, J. J., Voskamp, A. F., Kamerling, J. P. and Vliegenthart, J. F. (1999). Glycosylation sites and site-speeifie glycosylation in human Tamm-Horsfall glycoprotein. Glycobiology 9, 21 -30); - verschiedene Rezeptoren für diese Proteine und
- dem Megalinrezeptor als Mitglied der ebenfalls glykosylierten Low- Density-Lipoprotein-Rezeptor-Familie (Li, Y., Cam, J. and Bu, G. (2001 ). Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and Signal transduction. Mol Neurobiol 23, 53-67; Verroust, P. J. and Kozyraki, R. (2001 ). The roles of cubilin and megalin, two multiligand receptors, in proximal tubule function: possible implication in the progression of renal disease. Curr Opin Nephrol
Hypertens 10, 33-38).
Ein Beispiel für das Auftreten unterschiedlicher Varianten in Folge von
Abbauvorgängen sind die Isoformen von Retinolbindungsprotein (RBP) im Plasma und Harn, das um eine bzw. zwei Aminosäuren verkürzt vorliegt (Jaconi, S., Rose, K., Hughes, G. J., Saurat, J. H. and
Siegenthaler, G. (1995). Characterization of two post-translationally processed forms of human serum retinol-binding protein; altered ratios in chronic renal failure. J Lipid Res 36, 1247-1253). RBP kann aber auch beispielsweise durch Sulfatierungen oder Glykosylierungen verändert sein (Bellovino, D., Morimoto, T., Mengheri, E., Perozzi, G., Garaguso,
I., Nobili, F. and Gaetani, S. (2001). Unique biochemical nature of carp retinol-binding protein. N-Iinked glycosylation and uncleavable NH2- terminal Signal peptide. J Biol Chem 276, 13949-13956).
Das Auftreten von Varianten ein und der selben körpereigenen Komponenten, beispielsweise im Glycosylierungsmuster als Ursache oder Konsequenz von Erkrankungen, können u.a. bei folgenden Zuständen beobachtet werden.
- neurologischen Störungen (Grunewald, S., Huyben, K., de Jong, J. G., Smeitink, J. A., Rubio, E., Boers, G. H., Conradt, H. S., Wendel, U. and Wevers, R. A. (1999). Beta-trace protein in human cerebrospinal fluid: a diagnostic marker for N-glycosylation defects in brain. Biochim Biophys Acta 1455, 54-60; Hiraoka, A., Seiki, K.,
Oda, H., Eguchi, N., Urade, Y., Tominaga, I. and Baba, K. (2001 ). Charge microheterogeneity of the beta-trace proteins (lipocalin- type prostaglandin D synthase) in the cerebrospinal fluid of patients with neurological disorders analyzed by capillary isoelectrofocusing, Electrophoresis 22, 3433-3437);
- Rheumatoide Erkrankungen (Dwek, R. A. (1998). Biological importance of glycosylation. Dev Biol Stand 96, 43-47);
- Lebererkrankungen (Matei, L. (1997). Plasma proteins glycosylation and its alteration in disease. Rom J Intern Med 35, 3-
11 );
- Krebs (Andersson, M., Stenstrom, M., Vatne, M., Sevelius, E. and Jonsson, L. (1998). Disease-related variations of the glycosylation of haptoglobin in the dog. J Comp Pathol 119, 227-238; Johnson, P. J., Poon, T. C, Hjelm, N. M., Ho, C. S., Blake, C. and Ho, S. K. (2000). Structures of disease-specific serum alpha-fetoprotein isoforms. Br J Cancer 83, 1330-1337); - diversen Erkrankungen der Fortpflanzung;
- bei Alkoholikern;
- bei angeborenen Glykosylierungsstörungen (Pearl, P. L. and Krasnewich, D. (2001 ). Neurologic course of congenital disorders of glycosylation. J Child Neurol 16, 409-413; Sillanaukee, P., Strid, N., Allen, J. P. and Litten, R. Z. (2001 ). Possible reasons why heavy drinking increases carbohydrate-deficient transferrin. Alcohol Clin Exp Res 25, 34-40);
- bei Diabetes;
- bei Nierenerkrankungen und - in Folge des Rauchens oder des Verzehrs bestimmter
Nahrungsmittel (Singh, R., Barden, A., Mori, T. and Bellin, L. (2001 ). Advanced glycation end-products: a review. Diabetologia 44, 129-146; Ulrich, P. and Cerami, A. (2001 ). Protein glycation, diabetes, and aging. Recent Prog Horm Res 56, 1 -21.; Yamagishi, S., Takeuchi, M. and Makita, Z. (2001 ). Advanced glycation end products and the pathogenesis of diabetic nephropathy. Contrib Nephrol 30-35). Im Bereich des Reproduktionsgeschehens können Veränderungen in den Isoformen von einzelnen Peptiden und Proteinen auch Hinweis auf physiologische Veränderungen sein (Ulloa-Aguirre, A., Timossi, C. and Mendez, J. P. (2001 ). Is there any physiological role for gonadotrophin oligosaccaride heterogeneity in humans? Gonadatrophins are synthesized and released in multiple molecular forms. A matter of fact. Hum Reprod 16, 599-604), wie beispielsweise der Eintritt der Schwangerschaft, die Ovulation, ein fertiler Zyklus (Baird, D. D. (1999). Characteristics of fertile menstrual cycles. Scand J Work Environ Health 25, 20-22; discussion 26-28), der Beginn der Menopause (Fitzgerald, C, Zimon, A. E. and Jones, E. E. (1998). Aging and reproductive potential in women. Yale J Biol Med 71 , 367-381 ) oder der Verlauf der Pubertät. Letzteres könnte als zusätzliche Methode der Definition von Strafmündigkeit bei jugendlichen Straftätern genutzt werden. Die Änderung der Mikroheterogenität kann auch Hinweise auf physiologische und pathologische Veränderung beim männlichen Geschlecht liefern (Hermann, M., Untergasser, G., Rumpold, H. and Berger P. (2000). Aging of the male reproductive System. Exp Gerontol 35, 1267-1279).
Eine Hyperglykosylierung von HCG ist in der Schwangerschaft beispielsweise im Zusammenhang mit dem Down-Syndrom zu beobachten (Cole, L. A., Omrani, A., Cermik, D., Singh, R. O. and Mahoney, M. J. (1998). Hyperglycosylated hCG, a potential alternative to hCG in Down syndrome screening. Prenat Diagn 18, 926-933). Gewisse Formen können aber auch Hinweis auf den Erfolg der Schwangerschaft sein (Kovalevskaya, G., Birken, S., Kakuma, T., Ozaki, N., Sauer, M., Lindheim, S., Cohen, M., Kelly, A., Schlatterer, J. and O'Connor, J. F. (2002). Differential expression of human chorionic gonadotropin (hCG) glycosylation isoforms in failing and continuing pregnancies: preliminary characterization of the hyperglycosylated hCG epitope. J Endocrinol 172, 497-506) oder möglicherweise einen Hinweis auf das Geschlecht des Embryos geben.
Die Möglichkeit des Nachweises derartiger Mikroheterogenitäten ist auch von besonderer Bedeutung für die künstliche Befruchtung (Lambert, A., Talbot, J. A., Anobile, C. J. and Robertson, W. R. (1998). Gonadotrophin heterogeneity and biopotency: implications for assisted reproduction. Mol Hum Reprod 4, 619-629).
Voraussetzung für die Ausnutzung des diagnostischen Potentials von Isoformen bzw. Mikroheterogenitäten ist ein entsprechend geeignetes Nachweis- und/oder Differenzierungssystem.
Ziel der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von apathogenen Partikeln und deren pathogenen und/oder pathognostischen Varianten bereitzustellen, was so spezifisch, selektiv und sensitiv ist, dass im Fall von Enzephalopathien bereits in einer sehr frühen Phase der Infektion mit vergleichsweise geringem präparativen Aufwand diese Erkrankungen nachzuweisen sind. Weiterhin sollen mit Hilfe des neuen Verfahrens Mikroheterogenitäten nachgewiesen und/oder diagnostiziert werden, um deren diagnostisches Potential bei einer Vielzahl von Erkrankungen, Störungen und Veränderungen ausnutzen zu können.
Dieses Ziel wird gelöst durch das Verfahren, wie es in Anspruch 1 definiert ist. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 14 sowie im Anspruch 15 dargelegt. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß apathogene Partikel und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten nach selektiver Anreicherung mit Hilfe eines hoch sensitiven Nachweisverfahrens über ihre unterschiedlichen Massen nachgewiesen werden können.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von apathogenen Partikeln und deren pathogenen und/oder pathognostischen Varianten, insbesondere zur Diagnose von Enzephalopathien, neurologischen Störungen, Entzündungsprozessen, Tumorerkrankungen, Nierenerkrankungen und/oder Veränderungen, insbesondere Störungen der Reproduktion oder des Stoffwechsels. Hierbei werden die in entnommenem körpereigenem Material, insbesondere von einem menschlichen oder tierischen Organismus entnommenem körpereigenem Material, vorhandenen apathogenen Partikel und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten auf oder an einem Trägermaterial angereichert. Anschließend werden diese Partikel über ihre unterschiedlichen Massen nachgewiesen und/oder differenziert.
Vor der Anreicherung und/oder dem Nachweis der apathogenen Partikel und insbesondere deren pathogener und/oder pathognostischer Varianten können diese modifiziert, insbesondere fraktioniert und/oder markiert, werden. So kann z. B. zur Differenzierung zwischen apathogenen und pathogenen und/oder pathognostischen Partikeln die selektive Verdauung oder die chemische Modifikation der apathogenen, pathogenen und/oder pathognostischen Partikel genutzt werden. Dazu können die auf einem Trägermaterial gebundenen Partikel vor der Massenbestimmung enzymatisch oder chemisch behandelt werden. So ist es z. B. möglich, daß durch Behandlung mit Protease K unveränderte und krankhaft veränderte Partikel, z. B. Prionen, differenziert werden. Während unveränderte Partikel durch Protease K-Behandlung enzymatisch verdaut werden, sind die krankhaft veränderten Partikel weitestgehend Protease K-resistent. Bei den Prionen kommt es zur unterschiedlichen Spaltung der verschiedenen Prionenstämme, welches Hinweise auf Varianten geben kann (Kuczius, T. and Groschup, M. H. (1999). Differences in proteinase K resistance and neuronal deposition of abnormal prion proteins characterize bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie strains. Mol Med 5, 406-418). Als Ergebnis entsteht ein für die jeweilige Prionenvariante charakteristischer „Fingerabdruck". Die analytischen Schritte erfolgen bezüglich Volumen, Zeit und Temperatur durch an die jeweiligen Trägermaterialien angepaßte, dem Fachmann bekannte Verfahren. Eine weitere Modifikation kann beispielsweise durch Guanidin-Thiocyanant erreicht werden (Meyer, R. K., Oesch, B., Fatzer, R., Zurbriggen, A. and Vandevelde, M. (1999). Detection of bovine spongiform encephalopathy- specific PrP(Sc) by treatment with heat and guanidine thiocyanate. J Virol 73, 9386-9392).
Es lassen sich auch andere kovalente Proteinmodifikationen wie beispielsweise Glykosylierungen oder Phosphorylierungen durch die enzymatische Vorbehandlung der auf dem Trägermaterial befindlichen (angereicherten und gereinigten) Proteine oder Peptide wie beispielsweise Wachstumshormon- und Erythropoetin-Varianten mit beispielsweise Glykosidasen oder Phosphorylasen nachweisen. Hierbei wird die spezifisch auf dem Trägermaterial angereicherte Probe entsprechend üblicher Methoden mit spezifischen Enzymen versetzt, die eine vollständige oder selektive Abspaltung von Zucker- oder Phosphatresten erlauben. Als Enzyme eignen sich beispielsweise die Glykosidasen PNGase-F oder Phosphorylasen wie die Alkalische Phosphatase und andere. Durch den Einsatz von verschiedenen Glykosidasen kann zwischen N- bzw. O-Verknüpfungen der Zuckerreste unterschieden werden. Eine weitere Möglichkeit stellt die chemische Abspaltung von Zuckerresten dar. Dabei findet z.B. Hydrazin Anwendung. Die analytischen Schritte erfolgen in Volumen, Zeit und Temperatur an die Trägermaterialoberfläche angepasst, entsprechend bekannter Verfahren (Savage, A. (1997). Glycosylation: A post- translational modification. In Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production, (ed. H. Hauser and R. Wagner), pp. 231 -276, Berlin, New York: Walter de Gruyter).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den apathogenen Partikeln und deren pathogenen und/oder pathognostischen Varianten um Peptide, Polypeptide, Proteine, Proteohormone und/oder Prionen. Bei den Prionen werden insbesondere die Prionen von der Erfindung umfaßt, die bei der Manifestation von Scrapie, BSE, TME, CWS, FSE, SE, Kuru, Creutzfeld- Jakob-Krankheit, Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom und/oder FFI beteiligt sind. Es kommen aber auch alle anderen Partikel, insbesondere Prionen, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen werden können, in Frage. Sofern es sich um ein Nachweisverfahren für Proteine handelt, sind insbesondere die Proteine erfindungsgemäß beansprucht, die bei der Manifestation einer Demenz vom Alzheimer-Typ beteiligt sind, wie z. B. die Amyloide. Weiterhin handelt es sich bei den Proteinen, Peptiden, Polypeptiden und Proteohormonen vorzugsweise um Transferrin, Alfa-Fetoprotein, Laktoferrin, Transthyretin, Thyreotropin, Erythropoeitin, Gonadotropine (FSH, LH, hCG), Lipocaline, insbesondere Retinol-Bindungsprotein, ß-2 Glycoprotein, Tamm-Horsfall Protein, Renin, Natriuretisches Peptid, Transforming growth factor-ß (TGF-ß), Granulozyten/Makrophagen colony stimulating factor (GM-CSF), platelet-derived growth factor (PDGF) und/oder Prolaktin.
Bei dem körpereigenem Material handelt es sich bevorzugt um Material, daß von einem lebenden Organismus entnommen wurde, aber auch die ex mortem Entnahme ist erfindungsgemäß vorgesehen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den körpereigenen Materialien um Körperflüssigkeiten, Gewebe und/oder Organe. Dabei können die Körperflüssigkeiten Blut, Serum, Plasma, Harn, Milch, Schweiß, Speichel und/oder Liquor sowie alle anderen Körperflüssigkeiten sein. Blut kann z. B. durch Punktion von Blutgefäßen (Venenpunktion) gewonnen werden. Aufgrund des sehr geringen Volumens, daß für die Analyse benötigt wird, kann Blut auch durch die Punktion von Blutkapillaren (beispielsweise der Fingerbeere) gewonnen werden. Die Blutentnahme bzw. die Plasma-/Serumgewinnung sowie die Gewinnung anderer Körperflüssigkeiten erfolgt nach etablierten Verfahren. Sie beinhalten die Punktion der Gefäße, Trennung der Blutbestandteile, vorzugsweise durch Zentrifugation, und die Lagerung, vorzugsweise bei -80°C. Im Fall einer unmittelbaren Analyse ist die Probe vorzugsweise bis zur Analyse bei 4°C zu lagern. Gewebe und Organe werden durch etablierte Biopsieverfahren oder post mortem entnommen und entsprechend etablierten Verfahren gelagert. Vor der Analyse müssen die Organe und Gewebe zunächst homogenisiert werden, beispielsweise nach etablierten Verfahren in entsprechenden Puffern. So kann z. B. die Homogenisierung eines geeigneten Gewebes - z. B Gehirn - in 320 mM Sucroselösung erfolgen. Die Klärung des Homogenates erfolgt dann durch Zentrifugation (7.000g/5 min.) nach der Methode von Meyer et al. (Meyer, R. K., Oesch, B., Fatzer, R., Zurbriggen, A. and Vandevelde, M. (1999). Detection of bovine spongiform encephalopathy-specific PrP(Sc) by treatment with heat and guanidine thiocyanate. J Virol 73, 9386-9392). Die Körperflüssigkeiten wie z. B. Serum, Plasma, Liquor oder Harn können in den Originalkonzentrationen, verdünnt oder aufkonzentriert auf das Trägermaterial als definiertes Volumen mittels einer Pipette aufgetragen werden. Zur Vergrößerung des Auftragsvolumens kann ein Adapter verwendet werden. Ein vergleichbares Vorgehen bietet sich für die Homogenate von Geweben und Organen an. Verdünnungsschritte und Probenvolumen (> 2 μl) sind von der Partikel-Konzentration in der jeweiligen Matrix abhängig. Eine selektive Anreicherung auf dem Trägermaterial kann beispielsweise durch selektive Fraktionierung erfolgen. Methoden für Gewebehomogenate und den Harn sind bekannt (Maissen, M., Roeckl, C, Glatzel, M., Goldmann, W. and Aguzzi, A. (2001 ). Plasminogen binds to disease-associated prion protein of multiple species. Lancet 357, 2026-2028; Shaked, G. M., Fridlander, G., Meiner, Z., Taraboulos, A. and Gabizon, R. (1999). Protease-resistant and detergent-insoluble prion protein is not necessarily associated with prion infectivity. No increase in mortality found among occupations exposed to BSE. J Bio! Chem 27 '4, 17981-17986).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Trägermaterial um ein chromatographisches Trägermaterial. Dieses chromatographische Trägermaterial kann ein hydrophobes, hydrophiles, kationenaustauschendes, anionenaustauschendes und/oder metallionenbindendes Trägermaterial sein, aber auch alle anderen chromatographischen Trägermaterialien werden von den erfindungsgemäßen Verfahren beansprucht. Diese chromatographischen Trägermaterialien können zur selektiven Anreicherung von apathogenen und pathogenen Partikel genutzt werden. So ist z. B. eine spezifische Bindungsaffinität der Prionen für Kupfer beschrieben worden (Brown, D. R., Qin, K., Herms, J. W., Madlung, A., Manson, J., Strome, R., Fräser, P. E., Kruck, T., von Bohlen, A., Schulz-Schaeffer, W. et al. (1997). The cellular prion protein binds copper in vivo. Nature 390, 684-687). Die Bindung der Partikel erfolgt während einer Inkubationsperiode, deren Parameter (Dauer, Temperatur etc.) von der Matrix bzw. dem Trägermaterial und der Konzentration des jeweils zu untersuchenden Partikels abhängig sind. In einem weiteren Schritt (Waschschritt) kann dann die selektive Entfernung möglichst vieler Bestandteile des körpereigenen Materials (z. B. Proteine und Peptide) von dem Trägermaterial erfolgen, die nicht von Interesse sind. Als Differenzierungskriterien zwischen apathogenen und pathogenen und/oder pathognostischen Partikeln können beispielsweise spezielle Bindungen an bestimmte chromatographische Oberflächen, Unterschiede in der Bindungsintensität an diese Oberflächen in Abhängigkeit von der Stringens des Waschpuffers etc. dienen. Als Trägermaterial kann aber auch ein immobilisiertes Trägermaterial genutzt werden, welches in einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens beansprucht wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist dieses immobilisierte Trägermaterial mit Antikörpern, Aptameren, Bindungsproteinen und/oder Rezeptoren sowie anderen funktionellen Gruppen, die eine selektive Anreicherung der zu analysierenden Substanz erlauben, immobilisiert worden. Dabei kann das Trägermaterial bzw. die Oberfläche des Trägermaterials vor Immobilisierung aktiviert werden. Auf diesen aktivierten/inaktivierten Trägermaterialien wird entsprechend publizierten Standardverfahren entweder ein Antikörper (monoklonal/polyklonal), Aptamer, Bindungsproteine und/oder Rezeptoren immobilisiert, die in der Lage sind, apathogene und pathogene und/oder pathognostische Partikel zu binden und so zusammen mit Fragmenten oder Varianten aus komplexen Matrizes, z. B. Lösungen, zu fischen. Die Kopplung des Antikörpers, Aptamers, Bindungsproteins und/oder Rezeptors kann entweder direkt oder über einen Spacer erfolgen. Durch die Verwendung eines Spacers kann die Orientierung des Antikörpers, Bindungsproteins und/oder Rezeptors kontrolliert werden. Die Kopplung von Antikörpern, Bindungsproteinen und/oder Rezeptoren erfolgt in üblicher Weise während einer Inkubationsperiode, deren Parameter (Dauer, Temperatur etc.) von der Matrix und der Konzentration der jeweils zu untersuchenden pathogenen und/oder pathognostischen und apathogenen Partikel (Speziespezifität oder Variante) abhängig sind (Kuczius, T. and Groschup, M. H. (1999). Differences in proteinase K resistance and neuronal deposition of abnormal prion proteins characterize bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie strains. Mol Med 5, 406-418). In einem weiteren Schritt (Waschschritt) erfolgt dann die Entfernung aller in der Matrix vorhandenen Substanzen, die nicht auf dem Trägermaterial gebunden wurden bzw. nicht von Interesse sind. Bei dem Trägermaterial kann es sich z. B. um einen Chip, vorzugsweise einen Proteinchip, handeln. Auf oder an diesem Chip kann die Anreicherung, der Nachweis und ggf. eine notwendige Modifizierung erfolgen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die apathogenen Partikel und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten vor deren Nachweis voneinander abgetrennt. Diese Abtrennung der apathogenen und pathogenen und/oder pathognostischen Partikel kann vor oder nach der Anreicherung auf einem geeigneten Trägermaterial, erfolgen. Desweiteren kann die Abtrennung nach erfolgter Modifizierung, insbesondere Fraktionierung und/oder Markierung, erfolgen. So lassen sich z. B. geeignete Modifikationen der Partikel, wie beispielsweise Glykosylierung oder Phosphorylierung durch die enzymatische Vorbehandlung der auf dem Trägermaterial (eventuell zuvor angereicherten) gereinigten apathogenen und pathogenen und/oder pathognostischen Partikel mit beispielsweise Glykosidasen oder Phosphorylasen nachweisen (Kuczius, T. and Groschup, M. H. (1999). Differences in proteinase K resistance and neuronal deposition of abnormal prion proteins characterize bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie strains. Mol Med 5, 406-418). Hierbei wird die spezifisch auf dem Trägermaterial (angereicherte) Probe entsprechend üblicher Methoden mit spezifischen Enzymen versetzt, die eine vollständige oder selektive Abspaltung von Zucker- oder Phosphatresten erlauben. Als Enzyme eignen sich beispielsweise die Glykosidasen PNGase-F oder Phosphorylasen wie die alkalische Phosphatase und ähnliche. Durch den Einsatz von verschiedenen Glykosidasen kann zwischen N- bzw. O- Verknüpfungen der Zuckerreste unterschieden werden. Eine weitere Möglichkeit stellt die chemische Abspaltung von Zuckerresten dar. Dabei findet Hydrazin Anwendung. Die analytischen Schritte erfolgen in Volumen, Zeit und Temperatur an die Trägermaterialien angepaßt entsprechend bekannter Verfahren (Kuczius, T. and Groschup, M. H. (1999). Differences in proteinase K resistance and neuronal deposition of abnormal prion proteins characterize bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie strains. Mol Med 5, 406-418; Savage, A. (1997). Glycosylation: A post-translational modification: In Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production, (ed. H. Hauser and R. Wagner), pp. 231-276. Berlin, New York: Walter de Gryter). Weitere Möglichkeiten der Partikelmodifikation, die einer Verbesserung der Unterscheidung zwischen pathogenen und/oder pathognostischen und apathogenen Partikel unter den beschriebenen Anreicherungs- und Meßbedingungen ermöglichen können, stellen verschiedene bekannte und künftige Möglichkeiten zur selektiven Markierung von Aminosäuren oder kovalenten Modifikationen dar, die zu Massenveränderungen führen und so massenspektroskopisch nachgewiesen werden können bzw. nach erfolgter Modifikation zur Abtrennung der apathogenen von den pathogenen und/oder pathognostischen Partikeln führen können. Diese Abtrennung kann dann nach bekannten Trennverfahren erfolgen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die apathogenen Partikel und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten über ihre unterschiedlichen Molekulargewichte nachgewiesen. So stellt z. B. das sogenannte SELDI (für surface enhanced laser desorption/ionization)-Verfahren ein geeignetes Verfahren zum Nachweis von apathogenen Partikeln und deren pathogenen und/oder pathognostischen Varianten anhand des unterschiedlichen Molekulargewichts dar. Auch kann eine Analyse über z. B. Flugzeitmassenspektrometer (TOF [time-of-flight]-
MS[Massenspektrometrie]-Analysator) oder in vergleichbaren Apparaturen erfolgen, die eine Differenzierung auf der Basis der Molekülmasse oder beispielsweise anderen Selektionsmethoden erlauben. Die Partikel werden dabei nach Zugabe einer energieabsorbierenden Matrix mit Hilfe eines Laserstrahls ionisiert und anschließend in einem elektrischen Feld beschleunigt. Die Schußfrequenz des Laserstrahls beträgt dabei im Durchschnitt 50 bis 100 Schüsse. Aus der Flugzeit der Partikel vom Probenträger bis zum Detektor am Ende des Flugtunnels wird die Molekülmasse der gebundenen Partikel und ihrer eventuell vorhandenen Fragmente bestimmt. Die Differenzierung zwischen apathogenen und pathogenen und/oder pathognostischen Partikeln erfolgt in der Regel auf der Basis des Unterschieds des Molekulargewichts der Partikel und/oder ihrer eventuell - nach Spaltung - vorhandenen Fragmente. Die Genauigkeit des Systems in Bezug auf die Aussage über das Molekulargewicht (in Abhängigkeit von der Molekülgröße) beträgt ca. 0,1 bis 0,01 Prozent.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die apathogenen Partikel und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten quantifiziert. Diese Quantifizierung kann dabei über Standards von apathogenen Partikeln und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten erfolgen.
Zusammenfassend ist das erfindungsgemässe Verfahren zunächst dadurch gekennzeichnet, dass es zur Diagnose pathologischer Veränderungen dienen kann. Neben den bereits beschriebenen pathologischen Veränderungen können hiermit u.a. Störungen im Bereich der Reproduktion, insbesondere Erkrankungen in der Schwangerschaft erfasst werden. Weiterhin können auch Alkoholismus, Diabetes und Störungen der Glykosylierung diagnostiziert werden. Das erfindungsgemässe Verfahren kann jedoch auch zur Beurteilung physiologischer Funktionszustände herangezogen werden.
Insbesondere kann es sich bei den physiologischen Funktionszuständen um die Definition der Geschlechtsreife bei männlichen und weiblichen Organismen, der Charakterisierung des Zyklus und/oder dem Verlauf der Menopause bei weiblichen Organismen handeln. Schließlich umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung der Bedeutung von mikroheterogenitätsbedingten Unterschieden auf die Wechselwirkungen bzw. Bindungsfähigkeiten der betreffenden Stoffe mit beispielsweise Antikörpern, Bindungsproteinen, Transportproteinen und/oder Rezeptoren. Hierdurch kann der Einfluss von Peptid- oder Proteinmodifikationen auf die Bindungsfähigkeit an beispielsweise Transportproteinen oder Rezeptoren beurteilt werden. Weiterhin kann mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens die Spezifität von polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörpern getestet werden. Hierbei ist insbesondere die Validierung von Antikörpern, beispielsweise hinsichtlich ihrer Spezifität, vor allem auch hinsichtlich ihrer Bindung von spezifischen Proteinvarianten, die durch postranslationale Modifikationen entstehen können, von Interesse. Die Testung von Antikörpern spielt beispielsweise bei der Entwicklung von immunologischen Detektionsverfahren, wie ELISA oder diversen Methoden der Immunohistochemie, eine große Rolle. Bezüglich weiterer Merkmale dieses Aspektes der Erfindung wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
Weitere Einzelheiten und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens und von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweiligen Merkmale für sich allein oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
Experiment 1
Spezifische monoklonale bzw. polyklonale Antikörper gegen die zu untersuchenden Partikel sowie eine IgG-KontroIle in einer Konzentration zwischen 0,01 und 0,09 mg/ml werden in einem Volumen von 20 μl auf die voraktivierten Oberflächen eines Trägermaterials aufgetragen. Anschließend erfolgt die Inkubation in einer wasserdampfgesättigten Kammer (Inkubationskammer) für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4°C über Nacht (14-16 Stunden). Während dieser Inkubationsperiode werden die Antikörper kovalent an die aktivierten Trägermaterialoberflächen gebunden. Die verbleibenden freien Stellen des Trägermaterials werden durch die nun anschließende Zugabe von 20 μl Glyzerinlösung (0,1 M, pH 7,8) blockiert. Es erfolgt eine weitere Inkubation für 20 Minuten bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer. Anschließend wird die Antikörperlösung durch mehrmaliges Waschen entfernt. Im ersten Schritt werden die punktförmigen Flächen mit 50 mM Tris-HCI (pH 7,8)-Lösung (50-100 μl) gewaschen. Anschließend erfolgt eine zweimalige Waschung mit jeweils 300 μl PBS-Lösung, die 0,5 % (v/v) Triton X-100 enthält. Die Inkubationsdauer bei Raumtemperatur beträgt dabei jeweils 20 Minuten in der Inkubationskammer. Anschließend erfolgen zwei weitere Waschschritte mit jeweils 300 μl PBS (ohne Triton X-100) für 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer.
Die Aufgabe des Probenmaterials erfolgt entweder direkt auf das voraktivierte und immobilisierte Trägermaterial bei geringem
Probenmaterial (Volumen < 5 μl) oder über einen Adapter (Volumen > 5 μl). Die Inkubation erfolgt für 1 -2 Stunden bei Raumtemperatur in der
Inkubationskammer. Anschließend wird das Probenmaterial mittels einer
Pipette entfernt, und das beladene Trägermaterial wird zweimal mit jeweils 300 μl PBS-Lösung, die 0,5 % (v/v) Triton X-100 enthält, gewaschen. Die Inkubationsdauer bei Raumtemperatur beträgt dabei jeweils 10 Minuten in der Inkubationskammer. Anschließend erfolgen zwei weitere Waschschritte mit jeweils 300 μl PBS (ohne Triton X-100) für 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer. Die letzten beiden Waschschritte erfolgen mit Wasser (300 μl) für jeweils 10
Minuten. Anschließend wird das Trägermaterial getrocknet. Als energieabsorbierende Substanz wird beispielsweise alpha-Cyano-4- hydroxy Zimtsäure (2 mg/ml) in 50 % (v/v) Acetonitril und 0,2 % (v/v) Tri- flouressigsäure zugegeben. Die Analyse der apathogenen Partikel und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten erfolgt anschließend mit Hilfe eines Flugzeitmassenspektrometers.
Durch diese Erfindung ist es möglich, aus einem komplexen Substanzgemisch sehr ähnliche (mikroheterogene) Varianten von Partikeln anzureichern und nachzuweisen. Der Gegenstand der Erfindung vereinigt unter anderem die Selektivität von Antikörpern oder anderen Affinitätsschritten mit einer hohen Genauigkeit der Bestimmung des Molekulargewichts der angereicherten Moleküle. Nach der Aufgabe der Matrix auf die Trägermaterialoberfläche kann die Anreicherung, Modifikation (enzymatische Spaltung) und der Nachweis auf dieser erfolgen. Damit werden ferner auch Fehlerquellen und das Kontaminationsrisiko reduziert. Ein Analysedurchgang ist im allgemeinen innerhalb von 4 Stunden abgeschlossen. Der Probendurchsatz ist vom Automatisierungsgrad abhängig.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von apathogenen Partikeln und deren pathogenen und/oder pathognostischen Varianten, insbesondere zur Diagnose von Enzephalopathien, neurologischen Störungen,
Entzündungsprozessen, Tumorerkrankungen,
Nierenerkrankungen und/oder Veränderungen, insbesondere Störungen der Reproduktion oder des Stoffwechsels, dadurch gekennzeichnet, daß die in entnommenem körpereigenem Material, insbesondere von einem menschlichen oder tierischen Organismus entnommene körpereigene Material, vorhandenen apathogenen Partikel und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten auf oder an einem Trägermaterial angereichert werden, und anschließend diese Partikel über ihre unterschiedlichen Massen nachgewiesen und/oder differenziert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß vor der Anreicherung und/oder dem Nachweis der apathogenen Partikeln und deren pathogenen und/oder pathognostischen Varianten diese modifiziert, insbesondere fraktioniert und/oder markiert, werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den apathogenen Partikeln und deren pathogenen und/oder pathognostischen Varianten um Peptide, Polypeptide, Proteine, Proteohormone und/oder Prionen handelt, insbesondere um Transferrin, Alfa-Fetoprotein, Laktoferrin, Transthyretin,
Thyreotropin, Erythropoeitin, Gonadotropine (FSH, LH, hCG), Lipocaline, insbesondere Retinol-Bindungsprotein, ß-2 Glycoprotein, Tamm-Horsfall Protein, Renin, Natriuretisches Peptid, Transforming growth factor-ß (TGF-ß),
Granulozyten/Makrophagen colony stimulating factor (GM-CSF), platelet-derived growth factor (PDGF) und/oder Prolaktin.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Prionen um solche handelt, die bei der Manifestation von Kuru, Creutzfeld-Jakob-Krankeit, Gerstmann-Sträussler-Schein- ker-Syndrom, FFI (fatal familial insomnia), Scrapie, BSE (bovine spongiform encephalopathy), TME (transmissible mink encephalopathy), CWS (chronic wasting syndrome), FSE (feline spongiform encephalopathy) und/oder SE (spongiform encephalopathy) beteiligt sind.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Proteinen um solche handelt, die bei der Manifestation einer Demenz vom Alzheimer-Typ beteiligt sind.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den körpereigenen Materialien um Körperflüssigkeiten, Gewebe und/oder Organe handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Körperflüssigkeiten um Blut, Serum, Plasma, Harn, Milch, Schweiß, Speichel und/oder Liquor handelt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Trägermaterial um ein chromatographisches Trägermaterial handelt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem chromatographischen Trägermaterial um ein hydrophobes, hydrophiles, kationenaustauschendes, anionenaustauschendes und/oder metallionenbindendes
Trägermaterial handelt.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Trägermaterial um ein immobilisiertes Trägermaterial handelt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem immobilisierten Trägermaterial um ein mit
Antikörpern, Aptameren, Bindungsproteinen und/oder Rezeptoren immobilisiertes Trägermaterial handelt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apathogenen Partikel und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten vor deren Nachweis voneinander abgetrennt werden.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apathogenen Partikel und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten mit der SELDI- und/oder TOF-MS-Methode nachgewiesen werden.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apathogenen Partikel und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten quantifiziert werden.
15. Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von apathogenen Partikeln und deren pathogenen und/oder pathognostischen Varianten, insbesondere zur Beurteilung des Einflusses von Peptid- und/oder Proteinmodifikationen auf die Bindungsfähigkeit an Bindungsproteine, Transportproteine, Rezeptoren und/oder Antikörper, vorzugsweise zur Testung der Spezifität von polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, dass die in Proben material vorhandenen apathogenen Partikel und deren pathogene und/oder pathognostische Varianten auf oder an einem Trägermaterial angereichert werden, und anschließend diese Partikel über ihre unterschiedlichen Massen nachgewiesen und/oder differenziert werden.
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