SK67897A3 - Spongiform encephalopathy detection methods - Google Patents

Description

Spôsob in vitro stanovenia chorobného stavu spongiformnej encefalopatie u živočícha

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu in vitro stanovenia chorobného stavu spongiformnej encefalopatie u živočícha, predovšetkým stanovenia hovädzej spongiformnej encefalopatie (BSE) u hovädzieho dobytka.

Doterajší stav techniky

Spongiformné encefalopatie sú triedou chorôb, ktorá zahrnuje scrapie u oviec a Creutzfeld-Jakobovú chorobu (CJD) u ľudí. BSE je fetálna neurodegeneratívna choroba vyskytujúca sa u dobytka, ktorá podlieha ohlasovacej povinnosti. BSE je velmi dôležitá pre britský farmársky priemysel.

V súčasnosti sú prípady BSE identifikované na základe klinických prejavov u zvierat. Prípady sú potvrdené posmrtnou analýzou mozgového tkaniva, napríklad histopatológiou, detekciou fibríl asociovaných so scrapie alebo proteináza K rezistentného proteínu.

Tieto metódy majú tu nevýhodu, že vyžadujú porážku potenciálne infikovaných zvierat, u ktorých sa môže ukázať, že nie sú choré. Alternatívne môžu byť klinické známky neprítomné alebo nedetegovateíné a potom sa ponechajú infikované zvieratá v stáde.

Herrington et al. (New England Journal of Medicíne (1986), zv. 315, č. 5, str. 279 až 283) objavili pomocou vysokorozlišovacej dvojrozmernej elektroforézy na polyakrylamidovom géle (2DPAGE) prítomnosť štyroch abnormálnych proteínov v mozgovomiechovom moku íudských pacientov postihnutých CJD. Presná totožnosť týchto proteínov však nebola zistená.

Existuje teda potreba predsmrtného testu na BSE, ktorý môže byt použitý pri diagnostikácii potenciálne infikovaných zvierat.

Podstata vynálezu

Ďalej popísaný vynález poskytuje spôsob detekcie spongiformnej encefalopatie u zvierat, ktorý rieši niektoré, a v prednostnej realizácii všetky, tieto problémy.

Podlá jedného aspektu je predmetom vynálezu spôsob detekcie prítomnosti spongiformnej encefalopatie u zvierat, ktorého podstata spočíva v tom, že sa v telesnej tekutine živočícha stanoví prítomnosť a/alebo množstvo činidla, ktoré skrížené reaguje s protilátkou vypestovanou proti apolipoproteínu E a výsledok tohoto stanovenia sa uvedie do vzťahu so stavom infekcie u živočícha.

Prednostne sa výsledok stanovenia porovnáva s kontrolnou hodnotou a jej vzťah je korelovaný s infekčným stavom zvieraťa.

Prednostne sa tento spôsob používa na detekciu BSE.

Apolipoproteín E je proteín transportujúci cholesterol, ktorý je produkovaný v periférnom a centrálnom nervovom systéme. V mozgovomiechovom moku alebo sére bola odlíšená jeho jednoduchá alebo násobná forma.

Objav, že infekcia zvieraťa spongiformnou encefalopatiou môže byť korelovaná s prítomnosťou alebo so zvýšením koncentrácie jedného alebo viacerých činidiel v zvieraťa vytvára teda základ pre vynálezu.

telesných tekutinách tohoto spôsoby podlá predloženého

Činidlo alebo činidlá, ktoré sú skrížené reaktívne s anti-apolipoproteínom E, majú molekulovú hmotnosť asi 34 až 38 kDa a hodnotu pi asi 5,4 až 5,7. To je konzistentné s ich identifikáciou ako apolipoproteín E. Pojem činidlo ApoE, ktoré sa ďalej používa, zahrnuje akékolvek činidlo, ktoré má tieto vlastnosti (vrátane apolipoproteínu E samotného a jeho izoforiem alebo násobných foriem).

Malo by byť zdôraznené, že neexistuje žiadna požiadavka na presné určenie koncentrácie činidla ApoE, pretože spongiformná encefalopatia môže byt detegovaná porovnaním s kontrolou.

Kontrolná hodnota môže byť odvodená od koncentrácie činidla ApoE v rôznych zvieratách (pre ktoré je infekčný stav známy) a ktoré sú analyzované paralelne s testovaným zvieraťom. Alternatívne môže kontrolná hodnota pochádzať od rovnakého zvieraťa, alebo ňou môže byť známy štandard.

Kontrolná hodnota môže byť stanovená použitím rovnakej metódy, aká bola použitá na testovanie zvieraťa alebo použitím odlišnej analytickej metódy.

Výsledky od kontrolného zvieraťa môžu byť použité na získanie štandardnej pozitívnej alebo negatívnej kontrolnej hodnoty alebo na kalibráciu výsledkov testovaného zvieraťa.

Prednostnou telesnou tekutinou, analyzovanou spôsobom podlá vynálezu, je mozgovomiechový mok (CSF), kedfže hlavným apolipoproteinom, ktorý sa v tejto tekutine nachádza, je autentický apolipoproteín E. Okrem toho, tesný kontakt CSF s mozgom znamená, že neurologické choroby, ktoré produkujú zmeny v zložení proteínov mozgu, môžu byť manifestované v CSF. Metódy na extrakciu vzoriek CSF sú odborníkom dobre známe.

Vynález zahrnuje akýkolvek spôsob analýzy koncentrácie činidla ApoE v telesnej tekutine zvieraťa, ktorý je teraz v obore známy, a akýkolvek spôsob, ktorý sa neskôr stane dostupným.

Prednostne sa prítomnosť a/alebo množstvo činidla ApoE v telesnej tekutine zvieraťa stanovuje metódou PAGE alebo 2DPAGE, pričom sa činidlo ApoE oddelí od iných činidiel v telesnej tekutine a potom sa gél ofarbí a uskutočnia sa denzitometrické merania v oblasti gélu, ktorá je predmetom záujmu, s cieľom stanovenia prítomnosti a/alebo množstva činidla ApoE.

Prednostne sa totožnosť činidla ApoE potvrdí pri použití imunogénnej činidlu ApoE Techniky na látky, napríklad protilátky vypestovanej proti alebo syntetickému peptidu na báze jeho sekvencie. identifikáciu prítomnosti skrížené reagujúcich činidiel, založené na imunogéne, sú v tomto obore dobre známe;

ide napríklad o stanovenie ELISA alebo Western blotting.

V alternatívnej realizácii vynálezu môžu byť tieto imunogénne techniky použité ako na identifikáciu činidla ApoE, tak aj na odhad jeho koncentrácie.

Vynález teda poskytuje spôsoby detekcie prítomnosti spongiformnej encefalopatie u testovaných zvierat, ktoré môžu vyriešiť mnohé, a v prednostnej forme všetky, problémy predchádzajúcich metód. Rovnováha medzi spoľahlivosťou testu a jeho jednoduchým použitím bude závisieť od konkrétnej metódy analýzy činidla ApoE, ktorá bude pre spôsob podľa predkladaného vynálezu zvolená. V každom prípade, predsmrtná diagnóza BSE u hovädzieho dobytka otvára možnosť masového testovania stád a tak zníženia pravdepodobnosti porážky neinfikovaných zvierat alebo premeškania porážky infikovaných zvierat.

Spôsob podľa vynálezu bude teraz popísaný len pre názornosť, prostredníctvom nasledujúceho príkladu a obrázkov. Iné realizácie, patriace do rozsahu vynálezu, budú odborníkom zrejmé v svetle týchto príkladov.

Príklady realizácie vynálezu

Identifikácie BSE u hovädzieho dobytka

Príprava vzorky: Boli zhromaždené vzorky CSF od BSE pozitívneho hovädzieho dobytka a od BSE negatívneho hovädzieho dobytka. V každom prípade bola diagnóza potvrdená posmrtnou histopatológiou a elektrónovou mikroskopiou. Vzorky CSF boli odobrané punkciou cisterna magna po smrti a boli koncentrované 10 - 15 krát. Objemy CSF obsahujúce celkovo 40 μ9 proteínu boli zmiešané v pomere 4:1 s denaturačným roztokom (1 g dodecylsulfátu sodného (SDS) a 0,232 g titiotreitolu v 10 ml vody) a boli zahriate na 95 °C počas 5 minút. Potom boli vzorky podrobené pulznej centrifugácii.

Elektroforéza: Pripravené vzorky boli dvojrozmerne (2D) elektroforezované použitím elektroforetického systému Millipore Investigator 2D podlá metódy popísanej v manuále. Jednorozmerná izoelektrická fokusácia prvého rozmeru bola uskutočnená v 26 cm sklenených skúmavkách s vnútorným priemerom 1 mm, vybavených závitom, v pH gradiente 3-10 pri použití 18 000 volthodín po prefokusácii gélu počas 1 hodiny pri 1 500 V. SDS-PAGE v druhom rozmere bola uskutočnená použitím 1 mm hrubých gélov veľkého formátu (23 cm x 23 cm) s 12,5% akrylamidu bez zvislého gélu.

Farbenie a analýza obrazu: 2D gély boli farbené striebrom podlá manuálu Millipore. Gély boli snímané pomocou Omnimedia scanner XRS a analyzované použitím Bioimage software a programu Investigator Database (Millipore) pri použití počítača sunSPARC station.

Potvrdenie identity činidla ApoE: 2D gély boli elektroblotované na membrány Immobilon-P cez noc pri 30 V pri použití cely Bio-Rad Trans-Blot. Bloty boli blokované pri použití namáčadla Tween 80 počas 1 hodiny a potom inkubované počas 90 minút s ovčím antisérom, obsahujúcim polyklonálnu protilátku vypestovanú proti autentickému apolipoproteínu E. Väzba ovčích protilátok bola detegovaná priu použití králičieho anti-ovčieho IgG a detekčného systému chrenovej peroxidázy. Počet činidiel v oblasti záujmu (približne rozmedzie molekulovej hmotnosti 34 až 38kDa a pi 5,4 až 5,7), ktoré skrížené reagujú s anti-apolipoproteín E protilátkou, je značný.

Porovnanie BSE negatívneho a BSE pozitívneho hovädzieho dobytka: Porovnanie farbených gélov pochádzajúcich z typicky BSE pozitívnej a typicky BSE negatívnej vzorky je ukázané na obr. la a obr. Ib. Ako je vidieť, počet a intenzita strieborne zafarbených škvŕn v oblasti zodpovedajúcej činidlám s približnou molekulovou hmotnosťou 34 - 38 kDa a pi okolo 5,4 - 5,7 (značný ApoE) sú vyššie u BSE pozitívnej vzorky.

Porovnanie strednej optickej denzity tých striebrom vyfarbených škvŕn na géloch, ktoré tiež skrížené reagujú s anti-apolipoproteín E protilátkou, je uvedené ďalej:

činidlo č.	BSE - negatívny	BSE- pozitívny
1	0,13	0,47
2	0,42	0,84
3	0,45	0,64
4	0,45	0,99
5	0,46	1,02
6	0,41	0,69
7	0,87	1,12

Z porovnania dvoch súborov hodnôt optickej denzity je zrejmé, že každé činidlo je konzistentne prítomné vo vyššom množstvo u

BSE - pozitívnych zvierat (n=31) ako u BSE negatívnych zvierat (n=27), množstvo týchto činidiel čo ukazuje, že prítomnosť alebo môže byť použité na detekciu pravdepodobnosti prítomnosti BSE v potenciálne infikovaných zvieratách.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob in vitro stanovenia chorobného stavu spongiformnej encefalopatie u živočícha, vyznačujúci sa tým, sa

   a) stanoví množstvo apolipoproteínu E v mozgovomiechovom moku živočícha,

   b) výsledok tohoto stanovenia porovná s kontrolnou hodnotou a a

   B

   c) zvýšená koncentrácia apolipoproteínu E koreluje s pozitívnym chorobným stavom živočícha.
2. 2. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že spongiformnou encefalopatiou je hovädzia spongiformná encefalopatia.
3. 3. Spôsob podlá nároku 1 alebo 2,vyznačujúci sa t ý m, že množstvo apolipoproteínu E v mozgovomiechovom moku živočícha sa stanoví odhadom množstva činidla skrížené reagujúceho s protilátkou vypestovanou proti apolipoproteínu E obsiahnutého v mozgovomiechovom moku živočícha.
4. 4. Spôsob podlá nároku 1 alebo 2,vyznačujúci sa t ý m, že množstvo apolipoproteínu E v mozgovomiechovom moku _Λ živočícha sa stanoví tak, že sa apolipoproteín E oddelí od iných látok prítomných v mozgovomiechovom moku elektroforézou na « polyakrylamidovom géle, gél sa ofarbí, identifikuje sa apolipoproteín E a jeho množstvo sa odhadne z denzity vyfarbenia.
5. 5. Spôsob podlá nároku 4,vyznačujúci sa tým, že množstvo apolipoproteínu E sa stanoví na základe odhadu množstva činidla s molekulovou hmotnostou v rozmedzí od 34 do 38 kDa a hodnotou pi v rozmedzí od 5,4 do 5,7 obsiahnutého v mozgovomiechovom moku.
6. 6. Spôsob podľa nároku 5,vyznačujúci sa tým, že totožnosť apollpoproteínu E na géle sa potvrdí použitím protilátky vypestovanej proti apolipoproteínu E.
7. 7. Spôsob podľa niektorého z nárokov 4 až 6,vyznačujú c i sa t ý m, že sa elektroforéza na polyakrylamidovom géle uskutočňuje ako dvojrozmerná elektroforéza.
8. 8. Spôsob podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa kontrolná hodnota získa rovnakým spôsobom, aký sa používa pri stanovení u vyšetrovaného živočícha, ale pri použití iného živočícha, o ktorom sa vie, že je buď negatívny alebo pozitívny na spongiformnú encefalopatiu.