DE69932597T2

DE69932597T2 - Verfahren zur reinigung von prpres aus einem biologischen muster und dessen verwendung

Info

Publication number: DE69932597T2
Application number: DE69932597T
Authority: DE
Inventors: Jean-Philippe Deslys
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1998-02-16
Filing date: 1999-02-16
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2019-02-17
Also published as: DE69932597D1; FR2774988B1; JP2006321819A; JP2002503675A; WO1999041280A1; AU761641B2; CA2319687A1; CA2319687C; US6780979B1; EP1054897A1; EP1054897B1; PT1054897E; DK1054897T3; NZ506225A; JP4327187B2; FR2774988A1; ATE335004T1; AU2430099A; ES2270582T3; JP3913473B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Reinigung von PrPres aus einer biologischen Probe für dessen Verwendung zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweisen von PrPres in dieser Probe.
Die transmissiblen spongiformen subakuten Encephalopathien werden von unkonventionellen transmissiblen Agenzien (NCTA), auch Prionen genannt, verursacht, deren genaue Natur zurzeit noch unbekannt ist. Die TSSE umfassen im Wesentlichen Kreutzfeld-Jakob-Erkrankungen beim Menschen (MCJ oder CJD für Kreutzfeld-Jakob-Disease), Scrapie bei Schafen und Ziegen und bovine spongiforme Encephalopathie (ESB oder BSE für bovine spongiform encephalopathy) bei Rindern; andere Encephalopathien wurden beim Nerz oder bestimmten wilden Tieren wie Hirsch und Elch gefunden.
Diese Krankheiten verlaufen immer tödlich und es gibt zurzeit keine wirksame Behandlung.
Bei transmissiblen spongiformen subakuten Encephalopathien kommt es zu Akkumulation eines Wirtsproteins, PrP (oder Prion-Protein), in einer abnormen Form (PrPres), und zwar hauptsächlich im Zentralnervensystem; PrPres wird mit der Infektiösität reiner und seine Akkumulation geht dem Auftreten histologischer Läsionen voraus. In vitro ist es für Neuronenkulturen toxisch.
Zwei biochemische Eigenschaften machen es gewöhnlich möglich, zwischen PrPres und normalem PrP zu unterscheiden. PrPres ist gegen Proteasen partiell resistent und ist in anionischen Tensiden unlöslich.
Um PrPres in einer Probe nachweisen zu können, ist es notwendig, diese verschiedenen Arbeitsschritten zu unterziehen, um die Probe an PrPres anzureichern und gleichzeitig normales PrP zu eliminieren, so dass das PrPres dann mit irgendeinem geeigneten spezifischen Verfahren nachgewiesen werden kann, ohne dass es

– als Folge der Anwesenheit von normalem PrP oder anderen Verunreinigungen zu Falsch-Positiven, oder
– aufgrund einer unzureichenden Konzentration an PrPres in der letztlichen biologischen Probe zu Falsch-Negativen

Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von Verfahren zur Isolierung und/oder Reinigung von PrPres vorgeschlagen. Sie basieren im Wesentlichen auf dem von Hilmert und Diringer entwickelten Verfahren (Nature, 1983, 306, 476–478) und umfassen generell eine Extraktion mit einem Detergens, differenzierte Ultrazentrifugationen und eine Behandlung mit proteolytischen Enzymen (Multhaup G. et al., EMBO J., 1985, 4, 6, 1495–1501; Takahashi K. et al., Microbiol. Imunol., 1986, 30, 2, 123–131; Hope J. et al., EMBO J., 1986, 5, 10, 2591–2597; Grathwohl KUD et al., Arch. Virol., 1996, 141, 1863–1874; Kascsak RJ et al., Immunol. Investig., 1997, 26, 259–268 R.E. Race et al., J. Gen. Virol., 1992, 73, 3319–3323; Doi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 955–960; T. Muramoto et al., Am. J. Pathol., 1993, 143, 5 1470–1479; Farquhar C.F. et al., Gen. Virol., 1994, 75, 495–504 et J. Gen. Virol., 1996, 77, 1941–1946). Die Druckschrift Nature Medicine, Band 3, Nr. 9, 1996, Chen et al, Seite 1009–1015 beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von PrPres, das mehrere Extraktionszyklen mit einem Detergens (Sarkosyl) umfasst, gefolgt von einer Differentialzentrifugation, einer Ultrazentrifugation und einer Behandlung mit einem proteolytischen Enzym. Die Druckschrift Cell, Band 86, 1996, Thuret et al, S. 565–576 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von PrPres, das eine Extraktion mit einem Detergens und eine Ultrazentrifugation umfasst. Diese Verfahren haben den Nachteil, dass sie eine große Anzahl von Schritten einschließlich mehrerer Ultrazentrifugationen umfassen, die mühselig durchzuführen sind und zu zunehmendem PrPres-Verlust führen, was wiederum zu einer ungenügenden Empfindlichkeit führt, um eine ausreichende Nachweisgrenze und Quantifizierung von PrPres zu erreichen.
Diese verschiedenen Verfahren erfordern Apparaturen für ein Untersuchungslabor und Zeit zur Durchführung, was mit einer Verwendung an Ort und Stelle, insbesondere in Schlachthöfen, nicht vereinbar ist.
Es besteht also Bedarf für eine rasche Verifizierung der Ab- oder Anwesenheit einer transmissiblen spongiformen subakuten Encephalopathie, wenn das Tier geschlachtet wird.
Folglich hat sich der Erfinder die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur Reinigung einer biologischen Probe und dessen Verwendung für einen raschen und verlässlichen Nachweis für PrPres bereitzustellen, dass so einfach durchgeführt werden kann, dass es an Ort und Stelle und insbesondere in Schlachthöfen durchgeführt werden kann und deshalb den praktischen Bedürfnissen besser entspricht als die Verfahren des Standes der Technik.
Tatsächlich ist das erfindungsgemäße Verfahren

– leicht umzusetzen,
– zuverlässig
– leicht zu interpretieren: es erhöht die Nachweisempfindlichkeitsgrenze für PrPres, indem es Falsch-Positive (normales PrP und andere Verunreinigungen) eliminiert,

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von PrPres aus einer biologischen Probe, das dadurch gekennzeichnet ist dass es im Wesentlichen umfasst:

(1) Inkubation der biologischen Probe für 30 Sekunden bis 2 Stunden, vorzugsweise 30 Sekunden bis 10 Minuten, bei einer Temperatur unter 80°C mit einem Puffer A, der wenigstens ein Tensid in einer Menge zwischen einem Viertel und dem Vierfachen, vorzugsweise zwischen einem Viertel und dem Eineinhalbfachen des Gewichtes der biologischen Probe und gegebenenfalls vorheriger, nachfolgender oder gleichzeitiger Inkubation mit einer Protease umfasst, unter Bildung einer opaleszierenden bis trüben mizellaren oder lamellaren Suspension S1; egal welches Tensid oder welche Mischung von Tensiden verwendet wird, unter den oben genannten Temperatur- und Quantitätsbedingungen wird der größte Teil des PrPres nicht solubilisiert sondern bleibt in Suspension, während normales PrP solubilisiert oder sogar zerstört wird, wenn Protease zugegeben wird; die Inkubation erfolgt vorzugsweise bei eine Temperatur unter 50°C in Gegenwart einer Menge Tensid, die zwischen einem Viertel und dem Eineindhalbfachen des Gewichts der biologischen Probe liegt; erfindungsgemäß kann die Protease entweder vor, nach oder gleichzeitig mit dem Tensid zugegeben werden;
(2) Zugabe eines Puffers B zu der in (1) erhaltenen mizellaren oder lamellaren Suspension S1 in einer Menge, die geeignet ist, diese Suspension klar zu machen (beispielsweise Bildung einer Mikroemulsion oder einer Mikrosuspension), wobei der Puffer B aus einem Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung besteht, die das PrPres nicht solubilisieren und eine Dielektriziätskonstante zwischen 10 und 25 haben; man erhält auf diese Weise eine für das bloße Auge klare Suspension S2;
(3) Zentrifugation der in Schritt (2) erhaltenen Suspension S2; diese Zentrifugation erfolgt beispielweise 2 bis 10 Minuten bei einer Geschwindigkeit unter 20 000 g, vorzugsweise bei einer Geschwindigkeit zwischen 3 500 g und 17 500 g; das PrPres findet sich im Zentrifugationspellet, mit Reinigungsausbeute für PrPres von überraschenderweise zwischen 80 und 100%; vorteilhaft können Zentrifugationszeit und -Geschwindigkeit so eingestellt werden, dass sich das gleiche Resultat ergibt, nämlich eine Reinigungsausbeute für PrPres zwischen 80 und 100%; und
(4) Solubilisierung des Pellets in einem Puffer C, der wenigstens ein Tensid umfasst, wie es in Schritt (1) definiert ist, in einer Konzentration zwischen 0,1 % und 5 %, vorzugsweise zwischen 0,25 % und 1 %, bezogen auf das Volumen von Puffer C (w/v), und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel in einer Konzentration zwischen 0,1 M und 8 M und einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 100°C, vorzugsweise gleich oder über 80°C ist; unter solchen Temperaturbedingungen solubilisieren die oben genannten Tenside, vorzugsweise die ionischen Tenside, und/oder die chaotropen Mittel das PrPres.

Die Schritte (1) und (2) können gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden; vorzugsweise werden sie nacheinander durchgeführt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die biologische Probe, wenn sie ein Gewebe oder ein Organ ist, vor dem Schritt (1) homogenisiert, zum Beispiel durch mechanisches Vermahlen in einem Homogenisierungspuffer, der aus einem neutralen Puffer, wie Wasser, oder einem isotonischen Puffer, wie 5%-ige Glucose besteht.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens liegt die Temperatur in Schritt (1) zwischen Raumtemperatur und 50°C; vorzugsweise beträgt sie 37°C.
Vorzugsweise umfasst Puffer A ein Tensid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

– anionischen Tensiden wie SDS (Natriumdodecylsulfat), Sarkosyl (Lauroylsarcosin), Natriumcholat, Natriumdesoxycholat, Natriumtaurocholat,
– zwitterionischen Tensiden, wie SB 3–10 (Decyl-Sulfobetain), SB 3–2 (Dodecyl-Sulfobetain), SB 3–14, SB 3–16 (Hexadecyl-Sulfobetain), CHAPS und DeoxyCHAPS,
– nichtionischen Tensiden wie C12E8 (Dodecyloctaethylenglycol), Triton X100, Triton X114, Tween 20, Tween 80, MEGA 9 (Nonanoylmethylglucamin) Octylglucosid, LDAO (Dodecyldimethylaminoxid) oder NP40, oder
– Mischungen von Tensiden, wie eine Mischung aus einem ionischen Tensid und einem nichtionischen Tensid und insbesondere die Mischung SDS-Tween 80 oder die Mischung Sarkosyl-Triton X 100 oder die Mischung aus zwei ionischen Tensiden, wie die Mischung SDS-Desoxycholat oder eine Mischung aus einem ionischen Tensid und einem zwitterionischen Tensid.

Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens ist Puffer B vorzugsweise ausgewählt aus C₃-C₆-Alkoholen und Akoholmischungen, deren mittlere theoretische Dielektrizitätskonstante zwischen 10 und 25 liegt. Die folgenden Alkohole oder Alkoholmischungen sind besonders bevorzugt: 1- Butanol, 2-Butanol, 2-Methyl-1-propanol, Isopropanol, Isopropanol + Pentanol, Ethanol + Hexanol, Butanol + Pentanol, usw.
Unter Dielektrizitätskonstante im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die statische Dielektrizitätskonstante ε verstanden, gemessen in statischen Feldern oder Feldern mit relativ niedriger Frequenz; sie entspricht dem Verhältnis elektrischer Verschiebung D zu elektrischer Feldstärke E, wenn an eine Lösung ein elektrisches Feld angelegt wird, bei einer Temperatur zwischen 293,15 und 298,15 K.
Die Dielektrizitätskonstante von Flüssigkeiten, wie sie oben definiert ist, ist insbesondere in CRC Handbook of Chemistry and Physics (Hrsg. David R. Lide, 75. Auflage, 1994, CRC Press) beschrieben.
Für eine Mischung von Lösungsmitteln wird unter mittlerer theoretischer Dielektrizitätskonstante das Mittel der Dielektrizitätskonstanten von jedem Lösungsmittel verstanden, gewichtet nach seinem Anteil in der Mischung.
Die Zugabe von Puffer B in Schritt (2) erlaubt überraschenderweise, unter Zentrifuationsbedingungen geringer Geschwindigkeit, Reinigungsausbeuten über 90% zu erhalten; sie erlaubt es, die Rückstandsmenge am Ende signifikant zu reduzieren und gleichzeitig eine hohe Ausbeute zu behalten; Vorteilhaft ist die Rückstandsmenge am Ende weniger als 10% des Anfangsgewichts der biologischen Probe, so dass sie effektiv in einem Immunoassay verwendet werden kann, wohingegen wenn nur Puffer A zugegeben wird die resultierenden Bedingungen denen des Standes der Technik entsprechen, die eine Ultrazentrifugation erforderlich machen, um eine zum Nachweis ausreichende Menge PrPres zu erhalten.
Es ist zu beachten, dass Reinigungsausbeuten über 80% auch erhalten werden können, indem man Zentrifugationszeit und -Geschwindigkeit variiert: 2 bis 10 Minuten bei einer Geschwindigkeit unter 20 000 g oder eine im Verhältnis zur Zunahme der g-Zahl geringere Zeit.
Vorzugsweise ist das Verhältnis der Ausbeute an PrPres in der festen Phase zu der Menge an Rückstand erhalten nach Zentrifugation der Suspension S2 mehr als 10, wenn die Anfangsprobe 100 mg Hirn entspricht. Ebenfalls bevorzugt umfasst der in Schritt (4) eingesetzte Puffer C ein chaotropes Mittel, das insbesondere aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Harnstoff und Guanidin oder einer Mischung daraus besteht; es kann auch jedes andere chaotrope Mittel verwendet werden.
Vorteilhaft liegt der Harnstoff in einer Konzentration zwischen 0,25 und 8 M vor und das Guanidin liegt in einer Konzentration zwischen 0,1 und 6 M vor.
Wenn Puffer C eine Mischung aus wenigstens einem Tensid und wenigstens einem chaotropen Mittel ist, wird er vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus den folgenden Mischungen besteht:
Mischung aus SDS und Harnstoff, Mischung aus Sarkosyl und Harnstoff, Mischung aus Desoxycholat und Harnstoff oder Mischung aus Sarkosyl und Guanidin und Mischung aus Sarkosyl, Guanidin und Harnstoff. In der Mischung aus SDS und Harnstoff liegt das SDS vorzugsweise in einer Konzentration von 0,25 bis 1% und der Harnstoff in einer Konzentration von 0,25 bis 6 M vor; in der Mischung aus Sarkosyl und Harnstoff liegt das Sarkosyl in einer Konzentration zwischen 0,25 und 1 % und der Harnstoff in einer Konzentration zwischen 0,25 und 8 M vor; in der Mischung aus Sarkosyl und Guanidin liegt das Sarkosyl in einer Konzentration zwischen 0,25 und 1 % und das Guanidin in einer Konzentration zwischen 0,5 M und 3 M vor, und in der Mischung aus Sarkosyl, Guanidin und Harnstoff liegt das Sarkosyl in einer Konzentration zwischen 0,25 und 1 %, das Guanidin in einer Konzentration zwischen 0,5 M und 3 M und der Harnstoff in einer Konzentration zwischen 2 und 6 M vor.
Laemmli-Puffer (4 % SDS, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 % Sucrose und 2 % (β-Mercaptoethanol) können ebenfalls verwendet werden, insbesondere zum Westernblot.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Nachweis von PrPres in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

– Behandlung der Probe wie oben definiert,
– Verdünnung der erhaltenen Probe falls notwendig, und
– Nachweis von PrPres mit einem geeigneten Analyseverfahren, wie einem immunologischen Verfahren (ELISA, Westernblot), das ein spezifisches Signal liefert.

Der obige Verdünnungsschritt ermöglicht erst, Puffer C zu neutralisieren, so dass das PrPres in einem ELISA-Test nachgewiesen werden kann; er erfolgt beispielsweise mit einem Puffer, der Albumin umfasst, so dass sich eine Endkonzentration an Albumin zwischen 2 und 10 % (w/v) ergibt, oder mit einem Puffer auf Basis von beispielsweise 1% Desoxycholat.
Die auf diese Weise behandelte biologische Probe enthält eine effektive Konzentration an PrPres, so dass letzteres mit einem Analyseverfahren, insbesondere einem immunologischen Verfahren, direkt in der Probe nachgewiesen werden kann.
In einer Variante ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von PrPres aus einer biologischen Probe, das dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

(1) Inkubation der biologischen Probe für 30 Sekunden bis 2 Stunden, vorzugsweise 30 Sekunden bis 10 Minuten, bei einer Temperatur unter 80 °C mit einem Puffer A, der wenigstens ein Tensid in einer Menge zwischen einem Viertel und dem Vierfachen, vorzugsweise zwischen einem Viertel und dem Eineindhalbfachen, des Gewichts der biologischen Probe umfasst, und gegebenenfalls vorheriger, nachfolgender oder gleichzeitiger Inkubation mit einer Protease, unter Bildung einer klaren oder trüben mizellaren oder lamellaren Suspension S1; erfindungsgemäß wird die Protease tatsächlich entweder vor, nach oder gleichzeitig mit dem Tensid zugegeben;
(2) Zugabe eines Puffers B zu der in (1) erhaltenen mizellaren oder lamellaren Suspension S1 in einer Menge, die geeignet ist, eine Phasentrennung herbeizuführen, wobei der Puffer B aus einem Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung besteht, die das PrPres nicht solubilisieren und eine Dielektriziätskonstante zwischen 10 und 25 haben;
(3) Zentrifugation der in Schritt (2) erhaltenen Suspension; die Zentrifugation erfolgt beispielsweise 2 bis 10 Minuten bei einer Geschwindigkeit unter 20 000 g, bevorzugt bei einer Geschwindigkeit zwischen 3 500 g und 17 500 g; das PrPres befindet sich an der Phasengrenzfläche;
(4) Gewinnung des an der Phasengrenzfläche vorliegenden Films;
(5) Resolubilisierung des Films mit einem Puffer A ohne Protease,
(6) Zentrifugation der in Schritt (5) erhaltenen Suspension für 2 bis 10 Minuten bei einer Geschwindigkeit unter 20 000 g, bevorzugt bei einer Geschwindigkeit zwischen 3 500 g und 17 500 g; das PrPres befindet sich im Zentrifugationspellet, mit einer Reinigungsausbeute an PrPres zwischen überraschenderweise 70 bis 100%; vorteilhaft können Zentrifugationszeit und -Geschwindigkeit angepasst werden, dass sie das gleiche Ergebnis liefern, nämlich eine Reinigungsausbeute von PrPres zwischen 70 und 100%; und
(7) Solubilisierung des Pellets in einem Puffer C, der wenigstens ein Tensid, wie es in Schritt (1) definiert ist, in einer Konzentration zwischen 0,1 % und 5 %, vorzugsweise zwischen 0,25 % und 1 %, bezogen auf das Volumen von Puffer C (w/v), und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel in einer Konzentration zwischen 0,1 M und 8 M umfasst, und bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 100°C, vorzugsweise gleich oder über 80°C; unter solchen Temperaturbedingungen solubilisieren die oben genannten Tenside, vorzugsweise ionische Tenside, und/oder die chaotropen Mittel das PrPres.

Die Mengen an Puffer B, die zugegeben werden müssen, um eine Mikroemulsion, eine Mikrosuspension oder eine Phasentrennung zu erhalten, werden mit Hilfe einer Reihe von Puffern B ermittelt, wie in 1 für 1-Butanol veranschaulicht wird; sie können abhängig von Puffer A und den für Puffer B ausgewählten Bestandteilen variieren.
In einer Variante umfasst der Solubilisierungsschritt (Schritt (4) des ersten Verfahrens oder Schritt (7) des zweiten Verfahrens in Puffer C das Erwärmen für 5 bis 10 Minuten auf eine Temperatur gleich oder höher 80°C, gefolgt von einer Zentrifugation von vorzugsweise 2 bis 10 Minuten bei einer Geschwindigkeit unter 20 000 g, vorzugsweise bei einer Geschwindigkeit zwischen 3 500 g und 17 500 g; in diesem Fall wird das PrPres resolubilisiert und findet sich im Überstand; unter solchen Bedingungen eignet sich die Probe besonders zum Test des PrPres mit einem ELISA-Verfahren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Kit zur Behandlung einer biologischen Probe, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er neben einem Puffer zur Homogenisierung der biologischen Probe geeignete Mengen von wie oben definiertem Puffer A, Puffer B und Puffer C umfasst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Kit zum Nachweis von PrPres, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er geeignete Mengen an Puffer zur Homogenisierung der biologischen Probe, in der das PrPres nachgewiesen werden soll, geeignete Mengen von wie oben definiertem Puffer A, Puffer B und Puffer C und wenigstens einen geeigneten anti-PrPres-Antikörper umfasst.
Neben den vorhergehenden Vorschriften umfasst die Erfindung auch andere Vorschriften, die sich aus der folgenden Beschreibung ergeben, die sich auf Beispiele zur Durchführung des den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildenden Verfahrens und die anliegenden Zeichnungen bezieht, wobei:
1 den Einfluss der Menge von Puffer B (Butanol) auf die Reinigungsausbeute an PrPres (in %) und die nach der Zentrifugation erhaltene Pelletmenge zeigt;
2 den Einfluss verschiedener Puffer B auf die Reinigungsausbeute an PrPres (in %) und die nach der Zentrifugation erhaltene Pelletmenge zeigt;
3 die Rolle der mittleren theoretischen Dielektrizitätskonstante, wie oben definiert, zum Vergleich verschiedener als Puffer B verwendeter Alkoholmischungen zeigt;
4 ein Beispiel zum Nachweis von PrPres durch Westernblot zeigt;
5 die Empfindlichkeit und die Ausbeute des ELISA-Tests auf verschiedene Verdünnungen erfindungsgemäß behandelter Proben zeigt;
6 einen direkt an Homogenaten durchgeführten ELISA-Test zeigt; und
7 einen Vergleich verschiedener Puffer C zeigt.
Es versteht sich natürlich, dass diese Beispiele lediglich der Erläuterung des Gegenstandes der Erfindung dienen, ohne diesen in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiel 1
Behandlung einer Probe von Rinderhirn zum Test auf PrPres an Ort und Stelle: Auswahl der geeigneten Menge an Puffer B.
500 mg Rinderhirn werden entnommen, zerkleinert und in einer 5%-igen Glucoselösung zu einer Konzentration von 25% (w/v) homogenisiert.
Zur Durchführung der Homogenisierung werden die Gehirnprobe (500 mg) und 1 ml Glucose unter Agitation in Röhrchen eingebracht, die Keramikkügelchen umfassen. Der Überstand (etwa 1,5 ml) wird abgenommen; die Kügelchen werden in 500 μl einer Glucosesuspension gewaschen und bewegt; der erhaltene Überstand wird zurückgewonnen und mit dem vorigen Überstand (2 ml) vermischt.

– 400 μl des oben gewonnenen Homogenats (entsprechend 100 mg Gehirn) werden 10 Minuten lang (2 Mal 5 Minuten) bei 37°C (Schritt (1)) mit 400 μl Puffer A inkubiert, der eine Mischung aus gleichen Teilen von 25% (w/v) SDS und 25% (v/v) Tween 80 im Verhältnis von 1/1 (v/v) und Proteinase K (0,1 mg/ml Puffer A, d.h. 0,4 mg/g Gewebe) umfasst. Alternativ umfasst der Puffer A vorteilhafterweise 10% Sarkosyl und 10% Triton X100; letzterer Puffer A, der kein SDS umfasst, ist besonders bevorzugt, da er keine Störung der Detektion von PrPres durch einen ELISA-Test durch spezifische Antikörper verursacht.
– 0 bis 1000 μl Butanol (Puffer B) werden hinzugefügt (Schritt (2)).

1 zeigt die Reinigungsausbeute für PrPres (%), quantifiziert nach dem Western-Blot-Verfahren, und die Rückstandsmenge (in mg) als Funktion der Menge an hinzugefügtem Puffer B.
Diese Funktion zeigt, dass das PrPres zwischen 10 und 53% Butanol in Suspension gehalten wird und dass zwischen 30 und 50% eine Reinigungsausbeute im Bereich von 100% und ein Rückstand von weniger als 10 mg erhalten werden.

– 10-minütiges Zentrifugieren bei 3 800 g (4 000 RPM, JOUAN-Zentrifuge) (Schritt (3)); Eliminieren des Überstandes und Auflösen des erhaltenen Überstandes, der das PrPres umfasst, für 5 Minuten bei 100°C in 80-100 μl Puffer C (Schritt (4)) umfassend: entweder 0,5% SDS und 0,5 M Harnstoff, oder Laemmli-Puffer, oder 0,5% Sarkosyl und 6 M Harnstoff.

Durch diese Behandlung wird das PrPres aufgelöst, die Probe ist für die direkte Verwendung in einem Assay wie einem immunologischen Verfahren wie zum Beispiel ELISA oder Westernblot bereit.
Zur Durchführung eines ELISA-Verfahrens wird der Rückstand vorzugsweise im Puffer C, der Sarkosyl (0,25%–1%) und Harstoff (0,25–8M) oder SDS (0,25–1 %) und Harnstoff (0,25–1 M) umfasst, aufgelöst; nach dem Erhitzen wird die erhaltene Probe aufgelöst (zu ¼ oder ½), vorzugsweise mit einem Albumin-enthaltenden Puffer, oder mit einem Puffer, der 1% Desoxycholat umfasst, um eine Endalbuminkonzentration zwischen 1 und 10% (w/v) zu erhalten.
Alternativ wird die aufgelöste Probe 5 bis 10 Minuten bei 100°C erhitzt und dann 2 bis 10 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit unter 20 000 g zentrifugiert, vorzugsweise bei einer Geschwindigkeit zwischen 3 500 g und 17 500 g; der Überstand wird mit einem ELISA-Puffer auf ¼ bis ½ verdünnt.
Im vorliegenden Fall wird die PrPres-Quantifizierung durch Westernblot vorgenommen, wobei mit einem gleichen Volumen Laemmli-Puffer gemischt wird; die aufgelöste Probe wird dann zur Detektion mittels Westernblot auf Gel angeordnet; die detektierten Mengen an PrPres werden mit einem linearen Bereich von PrPres-Lösungen, die unter denselben Bedingungen wie oben aus dem selben Rinderhirnhomogenat, das durch BSE im Endstadium der Krankheit geschädigt wurde (Positivkontrolle), verglichen.
Die Proben, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurden, weist keinen Hintergrund auf und erlauben ein sicheres, spezifisches und quantitatives Testen von PrPres.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine signifikante Steigerung der Reinigungsausbeute für PrPres:

– Tatsächlich beträgt die Ausbeute für PrPres nur etwa 40%, wenn nur Puffer A hinzugefügt wird, daher ist ein Verlust von etwa 60% des PrPres zu beobachten, insbesondere aufgrund der Trennung der festen und der flüssigen Phase; überdies gibt es eine substantielle Menge an Rückstand. Das erklärt, weshalb die Dokumente, die im Stand der Technik erläutert werden, Sarkosyl verwenden, das zum Erhalt von geringeren Rückständen führt, aber bei der mühsamen Ultrazentrifugationen zum Erhalt einer ausreichenden Ausbeute notwendig sind
– Schritt (2) ermöglicht die Erhöhung der Ausbeute für PrPres in der festen Phase: es wird eine Ausbeute im Bereich von 80–100% in der festen Phase der Suspension S2 erhalten, und die Rückstandsmenge wird gleichzeitig, wie oben beschrieben, reduziert.

Beispiel 2
Behandlung einer Probe von Rinderhirn zum Test auf PrPres an Ort und Stelle: Variante des Schrittes (1) und des Schrittes (2).

– Der Homogenisierungsschritt ist identisch mit demjenigen, der in Beispiel 1 beschrieben wurde.
– Danach werden die 2 ml Homogenat, die aus den 500 mg Rinderhirn erhalten wurden, mit 2 ml Puffer A unter denselben Bedingungen wie denjenigen, die in Beispiel 1 (Schritt 1) beschrieben wurden, inkubiert.
– Es werden 3 ml Puffer B unter denselben Bedingungen wie denjenigen, die in Beispiel 1 (Schritt 2) beschrieben wurden, hinzugefügt.
– Der Rest des Verfahrens entspricht demjenigen des Beispiels 1.

Beispiel 3
Behandlung einer Probe von Rinderhirn zum Test auf PrPres an Ort und Stelle: Variante des Homogenisierungsschrittes.

– Eine Probe von 250 mg Rinderhirn wird entnommen, zerkleinert und in einer 5%-igen Glucoselösung in einer Konzentration von 25% (w/v) homogenisiert.

Zur Durchführung der Homogenisierung werden die Gehirnprobe (250 mg) und 750 μl Glucose in Röhrchen, die Keramikkügelchen enthalten, mit einer Agitation von 40 Sekunden (RIBOLYSER-HYBAID-Apparat), eingebracht.
Beispiel 4
Vergleich des Einflusses von verschiedenen Puffern B auf das Verhältnis der Reinigungsausbeute für PrPres zur Rückstandsmenge.
Die Probe wird unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, dass die Menge an Puffer B 600 μl beträgt.
2 zeigt die Verhältnisse, die durch das Western-Blot-Verfahren mit verschiedenen Puffern B: Pentanol, Butanol, Mischung aus Isopropanol + Pentanol, Mischung aus Ethanol + Hexanol, Isopropanol und Ethanol erhalten wurden; die Mischungen sind volumenbezogen angegeben.
Beispiel 5
Vergleich der Dielektrizitätskonstanten von verschiedenen Mischungen und deren Einfluss auf die Reinigungsausbeute für PrPres und die Rückstandsmenge.
Das Verfahren wird unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
3 zeigt die erhaltenen Resultate: In dem Fall, bei dem der Puffer B eine Alkoholmischung ist, wird das Volumen von jedem Alkohol als Funktion von dessen Dielektrizitätskonstante und der erwünschten theoretischen Dieletrizitätskonstaten der Mischung (zum Beispiel 17) berechnet und basiert auf dem Gesamtvolumen an Alkohol von 600 μl. Die folgende Formel wird zum Beispiel für die Hexanol/Ethanol-Mischung erhalten. 13·y + 25(1 – y) = 17wobei y der Prozentsatz an Hexanol, 13 die Dielektrizitätskonstante von Hexanol, und 25 die Dielektizitätskonstante von Ethanol ist.
Für eine mittlere theoretische Konstante von 15 oder niedriger wird die Phasentrennung beobachtet.
Beispiel 6: Nachweis von PrPres durch Westernblot.
• Protokoll:

1) Zwei Mal 5 Minuten Inkubation bei 37°C von 400 mg Rinderhirnhomogenat in einer Konzentration von 25% (Gewicht/Volumen) und 400 μl Puffer A, umfassend 400 μl einer Mischung aus gleichen Teilen (v/v), zu 25% SDS (w/v) und 25% Tween 80 (v/v) (50/50) und Proteinase K (PK) in einer Konzentration von 0,1 mg/ml Puffer A.
2) Zugabe von 600 μl Puffer B (ausgenommen Proben der Spuren 7 und 8: 1000 μl Puffer B), bestehend aus 1-Butanol.
3) 5 Minuten Zentrifugation bei 15 000 U/min (etwa 17 000 g).
4) Aufnehmen des Zentrifugationspellets in 100 μl Laemmli-Puffer mit 4% SDS und 5 Minuten erwärmen auf 100°C.

• Westernblot:
Die erhaltenen Proben werden zur Durchführung einer SDS-PAGE-Elektrophorese verwendet und unter den von Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1979, 76, 4350–4354) oder von C.I. Lasmézas et al. (J. Gen. Virol., 1996, siehe oben) beschriebenen Bedingungen auf eine Nitrozellulosemembran transferiert.
Vor dem Auftragen auf das Elektrophoresegel wurden die Proben wegen der Stärke der Signale in einer negativen Kontrolle, die unter den gleichen Bedingungen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind, aus einem gesunden Rinderhomogenat hergestellt worden war, verdünnt (12-iges Polyacrylamidgel mit dem Äquivalent von 10 mg (10) Hirn, entsprechend 9,5 mg gesundem Rinderhirn und 0,5 mg infiziertem Rinderhirn).
Der Immunnachweis von PrPres erfolgte mit JB007-Antiserum (R. Demaimay et al., J. Virol, 1997, 71, 12, 9685–9689) zu 1/5000 und per oxidasekonjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen-Ig (1/2500). Die Immunreaktivität ergibt sich aus der Chemilumineszenz (ECL, Amersham), die wie in 4 dargestellt auf Autoradiographiefilmen quantifiziert und visualisiert wird.
4 zeigt die erhaltenen Ergebnisse und entspricht der Propanol/Hexanol-Kurve von 3A.
In dieser Figur entsprechen die Spuren 1 bis 6 Proben, die mit verschiedenen Propanol/Hexanol-Mischungen als Puffer B behandelt worden waren, was zu verschiedenen mittleren theoretischen Dielektrizitätskonstanten führte; die Spuren 8 und 9 entsprechen biologischen Proben, die einem Verfahren mit 1000 μl Butanol als Puffer B unterzogen worden waren (53% auf der Abszesse von 1) In diesem Fall ist zu beobachten, dass sich das gesamte PrPres an der Phasengrenzfläche findet; die Spuren 9 und 10 entsprechen biologischen Proben, die einem Verfahren mit 600 μl Butanol als Puffer B unterzogen worden waren (43 % auf der Abszisse von 1); in diesem Fall beobachtet man, dass sich das gesamte PrPres im Pellet findet (Spur 10) während man in einer negativen Kontrolle, die unter den gleichen Bedingungen behandelt wurde (Spur 9) kein Signal beobachtet.
Beispiel 7
ELISA-Test von PrPres von einer erfindungsgemäß erhaltenen Probe
Eine Probe wird unter den folgenden Bedingungen hergestellt:

– Eine Probe aus 400 mg Rinderhirn wird gemahlen und unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben in 5 %-iger Glucoselösung (1,6 ml) zu einer Konzentration von 20% homogenisiert.
– 500 μl des erhaltenen Homogenats werden 10 Minuten lang bei 37° (2 Mal 5 Minuten mit dazwischenliegender Agitation) mit 500 μl Puffer A umfassend 10% Sarkosyl und 10% Triton X100, mit Proteinase K (80 μg/ml) inkubiert.
– 500 μl Puffer B (Butanol) werden hinzugefügt.
– Die Mischung wird 5 Minuten lang bei 15 000 U/min mit einem Rotor, der in der Lage ist 17.608 g zu erzeugen, zentrifugiert; dieselben Ergebnisse werden mit einer Zentrifugationszeit von 4 Minuten bei 20627g erhalten.
– Der Überstand wird abgenommen und der erhaltene Rückstand, der PrPres enthält, wird 5 Minuten lang bei 10°C in 100 μl Puffer C umfassend 6 M Harnstoff und 0,5 % Sarkosyl aufgebst.
– Die Mischung wird 5 Minuten lang bei 15 000 U/min mit einem Rotor, der in der Lage ist, 17.608 g zu erzeugen, zentrifugiert; mit einer Zentrifugationszeit von 4 Minuten bei 20 627 g werden dieselben Ergebnisse erhalten. Der Überstand wird in EIA-Puffer (Phosphatpuffer mit 0,5% Deosycholat) auf 1/3 verdünnt.

Zur Durchführung des ELISA-Tests wird die erhaltene Probe bei einer Geschwindigkeit von 100 μl pro Well, doppelt, auf einer Platte, die mit einem ersten Anti-PrP-Antikörper (8G8, vgl. Kraseman et al, Molecular Medicine, 1996) bedeckt ist, abgelegt; danach folgt die Inkubation, das Waschen und das Entwickeln mit einem zweiten anti-PrP-Antikörper (12F10), vgl. Kraseman et al, 1996) gekoppelt mit Acteylcholinesterase (vgl. Grassi et al., J. Immunol. Methods, 1989). Nach der Inkubation mit dem Substrat für Acteylcholinesterase werden die Ergebnisse 15 Minuten oder 30 Minuten nach dem Hinzugeben des Substrats (Ellmann-Reagenz) bei 415 nm gelesen.
Die in 5 gezeigten Ergebnisse betreffen ein 20%-iges (Gewicht/Volumen) Homogenat von klinisch BSE-geschädigtem Rinderhirn, verdünnt in einem 20%-igen (Gewicht/Volumen) Homogenat von gesundem Rinderhirn zu 1/10, 1/100, 1/1000 oder 1/10 000.
Die Proben werden dann unter den oben beschriebenen Bedingungen behandelt und mit EIA mit 8G8 als Fänger-Antikörper und 12F10 als detektierender Antikörper getestet.
Die Proben werden aufgelöst in dem EIA-Depotpuffer (Auflösungen zu 1/3, dann mit den Faktoren 3) getestet.
5 zeigt die erhaltenen Ergebnisse (optische Dichte des Signals als eine Funktion der finalen Lösung des Homogenats, d.h. Auflösung in der negativen Homogenat*-Lösung im EIA-Puffer): die semilogarithmische Kurve weist eine S-förmige Form auf, die gewöhnlich bei allen Assays der EIA-Art beobachtet wird. Ferner wird darauf hingewiesen, dass es eine gute Überlagerung der Kurven, die von den Homogenaten, die zu 1/10, 1/100, und 1/1000 gelöst sind. Schließlich ermöglicht es die Sensibilität des Testes, das positive Gehirn, das zu 1/10 000 verdünnt wurde, zu detektieren.
In 6 wurde ein anderes auf 1/100 verdünntes Homogenat durch das EIA-Verfahren getestet, entweder nach der oben beschriebenen Behandlung mit einer PK Konzentration von 400 ng/mg, oder nach der Direktbehandlung der Homogenate mit unterschiedlichen PK-Konzentrationen. Es wurde herausgefunden, dass die Direktbehandlung der Homogenate mit PK, ohne Reinigung, entweder starke Signale der negativen Kontrolle hinsichtlich geringer PK-Konzentrationen (unvollständige Zerstörung von PrPc), oder geringe Signale hinsichtlich der positiven Kühe mit hohen PK-Konzentrationen, ergibt. Dieses Beispiel betont daher, dass es zur korrekten Detektion des PrPres essentiell ist, die Homogenate in der oben beschriebenen Art und Weise zu behandeln.
Beispiel 8
Vergleich der verschiedenen Puffer C
Das verwendete Probenbehandlungsprotokoll ist dasjenige von Beispiel 7.
7 zeigt die erhaltenen Ergebnisse.
Guanidin scheint vorteilhaft zu sein und die Harnstoff-Guanidin-Kombination scheint am geeignetsten zu sein (in Anbetracht der Tatsache, dass Harnstoff im ELISA-Test besser toleriert wird).

Claims

Verfahren zur Reinigung einer abnormen Form des Prion-Proteins (PrPres) aus einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (1) Inkubation der biologischen Probe für 30 Sekunden bis 2 Stunden bei einer Temperatur unter 80 °C mit einem Puffer A, der wenigstens ein Tensid in einer Menge zwischen einem Viertel und dem Vierfachen des Gewichts der biologischen Probe umfasst, unter Bildung einer Suspension S1; (2) Zugabe eines Puffers B zu der in (1) erhaltenen Suspension S1 in einer Menge, die geeignet ist, diese Suspension durch Bildung einer Mikroemulsion oder einer Mikrosuspension klar zu machen, wobei der Puffer B aus einem Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung besteht, die das PrPres nicht solubilisieren und eine Dielektrizitätskonstante zwischen 10 und 25 haben; (3) Zentrifugation der in Schritt (2) erhaltenen Suspension S2; und (4) Solubilisierung des Pellets in einem Puffer C, der wenigstens ein Tensid des gleichen Typs wie in Schritt (1) in einer Konzentration zwischen 0,1 % und 5 %, vorzugsweise zwischen 0,25 % und 1 %, bezogen auf das Volumen von Puffer C (w/v), und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel in einer Konzentration zwischen 0,1 M und 8 M umfasst, und bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 100 °C, vorzugsweise gleich oder über 80 °C.
Verfahren zur Reinigung der abnormen Form des Prion-Proteins (PrPres) aus einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (1) Inkubation der biologischen Probe für 30 Sekunden bis 2 Stunden bei einer Temperatur unter 80 °C mit einem Puffer A, der wenigstens ein Tensid in einer Menge zwischen einem Viertel und dem Vierfachen des Gewichts der biologischen Probe umfasst, unter Bildung einer Suspension S1; (2) Zugabe eines Puffers B zu der in (1) erhaltenen Suspension S1 in einer Menge, die geeignet ist, eine Phasentrennung herbeizuführen, wobei der Puffer B aus einem Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung besteht, die das PrPres nicht solubilisieren und eine Dielektrizitätskonstante zwischen 10 und 25 haben; (3) Zentrifugation der in Schritt (2) erhaltenen Suspension; (4) Gewinnung des an der Phasengrenzfläche vorliegenden Films; (5) Resolubilisierung des Films mit einem Puffer A ohne Protease; (6) Zentrifugation der in Schritt (5) erhaltenen Suspension; und (7) Solubilisierung des Pellets in einem Puffer C, der wenigstens ein Tensid des gleichen Typs wie in Schritt (1) in einer Konzentration zwischen 0,1 % und 5 %, vorzugsweise zwischen 0,25 % und 1 %, bezogen auf das Volumen von Puffer C (w/v), und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel in einer Konzentration zwischen 0,1 M und 8 M umfasst, und bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 100 °C, vorzugsweise gleich oder über 80 °C.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass wenn diebiologische Probe ein Gewebe oder ein Organ ist, letzteres vor Schritt (1) in einem Homogenisierungspuffer homogenisiert wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus neutralen Puffern und isotonischen Puffern.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationsdauer vorzugsweise zwischen 30 Sekunden und 10 Minuten liegt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer A und/oder der Puffer C ein Tensid umfassen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: – anionischen Tensiden wie SDS (Natriumdodecylsulfat), Sarkosyl (Lauroylsarcosin), Natriumcholat, Natriumdesoxycholat, Natriumtaurocholat, – zwitterionischen Tensiden wie SB 3–10 (Decyl-Sulfobetain), SB 3–12 (Dodecyl-Sulfobetain), SB 3–14, SB 2–16 (Hexadecyl-Sulfobetain), CHAPS und DeoxyCHAPS, – nichtionischen Tensiden wie C12E8 (Dodecyloctaethylenglycol), TritonX100, Triton X114, Tween 20, Tween 80, MEGA 9 (Nonanoylmethylglucamin) Octylglucosid, LDAO (Dodecyldimethylaminoxid) oder NP40, oder – Mischungen von Tensiden, wie eine Mischung aus einem ionischen Tensid und einem nichtionischen Tensid, eine Mischung aus zwei ionischen Tensiden oder eine Mischung aus einem ionischen Tensid und einem zwitterionischen Tensid.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt (1) angewandte Temperatur zwischen Raumtemperatur und 50°C, vorzugsweise bei 37 °C liegt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (1) die Menge an Tensid in Puffer A vorzugsweise zwischen einem Viertel und dem Eineinhalbfachen des Gewichts der biologischen Probe liegt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es in Schritt (1) vor, nach oder gleichzeitig mit der Inkubation der biologischen Probe mit Puffer A die Inkubation der biologischen Probe mit einer Protease beinhaltet.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass Puffer B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C₃-C₆-Alkoholen und Alkoholmischungen mit einer mittleren theoretischen Dielektrizitätskonstante zwischen 10 und 25.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Alkohole oder Alkoholmischungen besonders bevorzugt sind: 1-Butanol, 2-Butanol, 2-Methyl-1-propanol, Isopropanol, Isopropanol + Pentanol, Ethanol + Hexanol, Butanol + Pentanol.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugation in Schritt (3) und in Schritt (5) 2 bis 10 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit unter 20.000g, vorzugsweise bei einer Geschwindigkeit zwischen 3.500g und 17.500 g durchgeführt wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer C als chaotropes Mittel ein Mittel umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Harnstoff und Guanidin oder einer Mischung davon.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Solubilisierungsschritt (Schritt (4) des Verfahrens nach Anspruch 1 oder Schritt (7) des Verfahrens nach Anspruch 2) in Puffer C das Erwärmen für 5 bis 10 Minuten auf eine Temperatur gleich oder höher 80 °C umfasst, gefolgt von einer Zentrifugation.
Verfahren zum Nachweis von PrPres in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – Behandlung der Probe gemäß irgendeinem der Ansprüche l bis 13 und – Nachweis von PrPres mit einem geeigneten Analyseverfahren.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Verdünnungsschritt für die biologische Probe umfasst.
Kit zur Behandlung einer biologischen Probe zur Reinigung von PrPres aus dieser Probe, dadurch gekennzeichnet, dass er neben einem neutralen Puffer in einer die Homogenisierung der biologischen Probe ermöglichenden Menge umfasst: – einen Puffer A, der wenigstens ein Tensid in einer Menge zwischen einem Viertel und dem Vierfachen des Gewichts der biologischen Probe umfasst, – einen Puffer B, der aus einem Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung besteht, die das PrPres nicht solubilisieren und eine Dielektrizitätskonstante zwischen 10 und 25 haben, in einer Menge, die geeignet ist, eine bei der Inkubation der biologischen Probe in Puffer A entstandene Suspension klar zu machen, – einen Puffer C, der wenigstens ein Tensid des gleichen Typs wie in Puffer A in einer Konzentration zwischen 0,1 % und 5 %, vorzugsweise zwischen 0,25 % und 1 %, bezogen auf das Volumen von Puffer C (w/v), und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel in einer Konzentration zwischen 0,1 M und 8 M umfasst, in einer für die Solubilisierung des PrPres ausreichenden Menge.
Kit zum Nachweis von PrPres, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst: – einen neutralen Puffer in einer Menge, die die Homogenisierung der biologischen Probe erlaubt, in der das PrPres nachgewiesen werden soll, – einen Puffer A, der wenigstens ein Tensid in einer Menge zwischen einem Viertel und dem Vierfachen des Gewichts der biologischen Probe umfasst, – einen Puffer B, der aus einem Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung besteht, die das PrPres nicht solubilisieren und eine Dielektrizitätskonstante zwischen 10 und 25 haben, in einer Menge, die geeignet ist, eine bei der Inkubation der biologischen Probe in Puffer A entstandene Suspension klar zu machen, – einen Puffer C, der wenigstens ein Tensid des gleichen Typs wie in Puffer A in einer Konzentration zwischen 0,1 % und 5 %, vorzugsweise zwischen 0,25 % und 1 %, bezogen auf das Volumen von Puffer C (w/v), und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel in einer Konzentration zwischen 0,1 M und 8 M umfasst, in einer für die Solubilisierung des PrPres ausreichenden Menge, – wenigstens einen anti-PrPres-Antikörper, der den Nachweis des PrPres erlaubt.