JP2002503675A - 生物試料からＰｒＰｒｅｓを精製する方法とその応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生物試料に含まれるＰｒＰｒｅｓの定性的及び／又は定量的測定に使用するために、その試料からＰｒＰｒｅｓを精製する方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、(1)前記生物試料を、30秒から２時間の間、80℃より低い温度において、その生物試料の重量の1/4倍と４倍の間の量の少なくとも１種類の界面活性剤と場合によりプロテアーゼを含むバッファＡを用いてインキュベーションすることにより、懸濁液Ｓ１を形成する工程と、(2)かかる(1)で得られた懸濁液Ｓ１に、その懸濁液Ｓ１を薄めるために充分な量の、ＰｒＰｒｅｓを可溶化せず且つ10〜25の一定の誘電率を有する溶媒または複数の溶媒の混合物からなるバッファＢを加える工程と、 (3)該(2)で得られた懸濁液Ｓ２を遠心分離する工程と、(4)得られたペレットを、少なくとも１種類の界面活性剤及び／又は少なくとも１種類のカオトロピック剤を含むバッファＣに、室温と100℃との間の温度において、可溶化させる工程とを必須的に含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本発明は、生物試料に含まれるＰｒＰｒｅｓの定性的及び／又は定量的検出に
使用するために、その試料からＰｒＰｒｅｓを精製する新規な方法に関する。

【０００２】

【背景技術】

伝播性亜急性海綿状脳症（transmissible subacute spongiform encephalopat
hies：ＴＳＳＥ）は、その詳細な性質が今日なお未解明のままである非通常伝播
性エージェント( non-conventional transmissible agents ：ＮＣＴＡ) −所謂
プリオン−によって惹き起こされる。ＴＳＳＥには、主として、ヒトにおけるク
ロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ヒツジやヤギにおけるスクレーピ、ウシ
におけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）が含まれ、他の脳症が、ミンクや、アカシカ
、エラジカ等の一定の種類の野生動物において確認されている。 これらの疾病の結果は常に死であり、現在、有効な治療法はない。

【０００３】 伝播性亜急性海綿状脳症においては、主として中枢神経系において、宿主タン
パク質：ＰｒＰ（ Prion protein：プリオンタンパク質）の異常な形態（ＰｒＰ
ｒｅｓ）における蓄積が見られる。ＰｒＰｒｅｓは精製によっても感染性を失う
ことはなく、その蓄積は、組織学的な病変に先行して現れる。インビトロにおい
て、ＰｒＰｒｅｓは神経細胞カルチャーに対して毒性を示す。

【０００４】 ＰｒＰｒｅｓと正常ＰｒＰとは、通常、２つの生化学的特徴によって区別され
る。ＰｒＰｒｅｓは、プロテアーゼに対して部分的な耐性を有し、また陰イオン
性界面活性剤に不溶性を示す。 ある試料中に存在するＰｒＰｒｅｓを検出可能とするためには、その試料から
正常ＰｒＰを除く一方、ＰｒＰｒｅｓを豊富に含むものとするために、その試料
に対して複数の操作を行なうことが必要であり、そのようにして初めて、 ・正常ＰｒＰ又は他の不純物の存在によって擬陽性（ false positives）を示 すことや、 ・最終的な生物試料に含まれるＰｒＰｒｅｓの濃度が不充分であるために擬陰 性（ false nagatives）を示すこと を惹起することなく、何れの適当な特異的方法によっても検出され得るようにな
る。

【０００５】 上記の目的のために、ＰｒＰｒｅｓを分離及び／又は精製するための多くの方
法が提案されている。それらの方法は、本質的に、ヒルマート（Hilmert ）とデ
ィリンジャー（Diringer）（ Nature 、１９８３、３０６、４７６‐４７８）に
よって開発された方法に基づいており、一般に、洗浄剤による抽出と、分画超遠
心分離と、タンパク質分解酵素による処理とを含む［マルトープ（ Multhaup G.
）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８５、４、６、１４９５−１５０１；タカハシ（ T
akahashi K. ）ら、Microbiol. Immunol. 、１９８６、３０，２，１２３−１３
１；ホープ（ Hope J.）ら、EMBO J. 、１９８６、５、１０、２５９１−２５９
７；グラスボール（ Grathwohl K.U.D. ）ら、Arch. Virol.、１９９６、１４１
、１８６３−１８７４；カスチャク（ Kascsak R.J. ）ら、Immunol. Investig.
、１９９７、２６，２５９−２６８；レイス（ R.E. Race）ら、J. Gen. Virol.
、１９９２、７３、３３１９−３３２３；ドイ（ Doi）ら、J. Gen. Virol.、１
９８８，６９，９５５−９６０；ムラモト（ T. Muramoto）ら、Am. J. Pathol.
、１９９３，１４３，５，１４７０−１４７９；ファルクハル（ Farquhar C.F.
）ら、 Gen. Virol.、１９９４，７５，４９５−５０４及び J. Gen. Virol.、
１９９６，７７，１９４１−１９４６］。それらの方法は、複数回の超遠心分離
を含む多数の工程からなり、そのため、実施することが面倒であって、なお且つ
ＰｒＰｒｅｓの累積的な損失につながるという問題点を有する。その結果、感度
が不充分となって、ＰｒＰｒｅｓの高い精度での検出閾値や定量を得ることが困
難となる。

【０００６】 上記の諸々の方法は研究実験設備と相当な実施時間を必要とすることから、堵
殺場等の現場で使用することが困難である。 このように、動物の堵殺に際して伝播性亜急性海綿状脳症の存在／不存在を迅
速に証明する必要性が存在する。

【０００７】

【解決課題】

そこで、本発明者は、生物試料を精製して、それをＰｒＰｒｅｓの迅速且つ信
頼性の高い検出のために使用する方法を提供することを企図した。この方法は、
実施が容易で、堵殺場等の現場においても使用することが可能であり、そのため
に、従来の方法よりも実際上の必要性をより良く満足させるものである。

【０００８】 事実、本発明に係る方法は、 −実施が容易であり、 −信頼性が高く、 −解釈が容易である。即ち、擬陽性（正常ＰｒＰ及び他の不純物）をなくすこ
とによってＰｒＰｒｅｓの検出感度閾値を高め、また、大量の生物試料を８０％
を超える精製歩留まりで処理することが出来るので、絶対的な意味での実質的な
量のＰｒＰｒｅｓの取得を可能とすることによって擬陰性をなくことが出来る。
このことは、堵殺場において特に価値あることであり、簡易な診断テストでＰｒ
Ｐｒｅｓが容易に検出され得る試料を提供する。

【０００９】

【解決手段】

本発明は、生物試料からＰｒＰｒｅｓを精製する方法であって、 （１）前記生物試料を、３０秒から２時間の間、好ましくは３０秒から１０分
の間、８０℃よりも低い温度において、その生物試料の重量の１／４〜４倍の間
の量の、好ましくは１／４倍〜１．５倍の間の量の少なくとも１種類の界面活性
剤を含むバッファ（ buffer ）Ａを用いてインキュベーションし、また場合によ
り、それに先立ち、その後に、またはそれと同時に、プロテアーゼを用いてイン
キュベーションすることによって、オパール様乃至は濁った状態のミセル状又は
層状（ラメラ）の懸濁液Ｓ１を得る工程と；上記の温度及び量的条件の下では、
如何なる界面活性剤又は界面活性剤混合物であっても、それは殆どＰｒＰｒｅｓ
を可溶化せず、ＰｒＰｒｅｓは懸濁液中に留まるが、他方、正常ＰｒＰは可溶化
され、プロテアーゼが添加されれば、破壊されさえする；本インキュベーション
は、前記生物試料の重量の１／４倍と１．５倍との間の量の界面活性剤の存在下
では、５０℃より低い温度で行なわれる；本発明によれば、前記プロテアーゼは
、前記界面活性剤よりも前、若しくは後、またはそれと同時に添加される、 （２）上記の（１）で得られたミセル状又は層状の懸濁液Ｓ１に、その懸濁液
Ｓ１を清澄化させる［例えば、マイクロエマルジョン（ microemulsion）又はマ
イクロサスペンション（ microsuspension）とすることによって］ために適当な
量の、前記ＰｒＰｒｅｓを可溶化せず且つ誘電率が１０〜２５の溶媒又は溶媒混
合物からなるバッファＢを加える工程と；これにより、肉眼には透明な懸濁液Ｓ
２が得られる、 （３）かかる（２) の工程で得られた懸濁液Ｓ２を遠心分離する工程と；この
遠心分離は、例えば２分間〜１０分間、２０，０００ｇより低い速度、好ましく
は３，５００ｇと１７，５００ｇの間の速度で行なわれる；その結果得られる遠
心分離残渣に含まれるＰｒＰｒｅｓの精製歩留まりは、驚くべきことに、８０〜
１００％に達する；この遠心分離の時間と速度は、同じ結果、即ち、精製歩留ま
り８０〜１００％のＰｒＰｒｅｓを得ることが出来るように、調整され得る、 （４）得られた残渣を、０．１％と５％との間の濃度、好ましくは０．２５％と
１％との間の濃度［バッファＣの体積に基づく（ｗ／ｖ）］の、前記（１) で定
義された少なくとも１種類の界面活性剤、及び／又は０．１Ｍと８Ｍの間の濃度
の少なくとも１種類のカオトロピック剤（ chaotropic agent ）を含むバッファ
Ｃに、室温と１００℃の間の温度、好ましくは８０℃以上の温度において、可溶
化させる工程と；それらの温度条件下においては、前記界面活性剤、好ましくは
イオン性界面活性剤及び／又は前記カオトロピック剤がＰｒＰｒｅｓを可溶化す
る、 を必須的に含むことを特徴とする方法に関する。 上記の工程（１）と工程（２）は、同時に行なってもよく、あるいは、連続的
に行なってもよいが、連続的に行なうほうが好ましい。

【００１０】 上記方法を実施するための好ましい態様においては、前記生物試料が組織又は
器官である場合に、その試料が、水等の中性バッファと５％グルコース等の等張
性バッファからなる群から選択された均質化バッファ中において、工程（１）の
前に、例えば機械的なすり潰しによって、均質化される。

【００１１】 上記方法を実施するための好ましい態様においては、工程（１）で採用される
温度が、室温と５０℃の間の温度であり、好ましくは３７℃である。

【００１２】 前記バッファＡは、好ましくは、 −ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、サルコシル（ラウロイルサルコシン）
、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウ
ム等の陰イオン性界面活性剤と、 −ＳＢ３−１０（デシルスルホベタイン）、ＳＢ３−１２（ドデシルスルホベ
タイン）、ＳＢ３−１４、ＳＢ３−１６（ヘキサデシルスルホベタイン）、ＣＨ
ＡＰＳ、デオキシ（deoxy ）ＣＨＡＰＳ等の両性界面活性剤Ａ、 −Ｃ１２Ｅ８（ドデシルオクタエチレングリコール）、トリトン（Triton）Ｘ
１００、トリトンＸ１１４、トイーン（Tween ）２０、トイーン８０、ＭＥＧＡ
９（ノナノイルメチルグルカミン）、オクチルグリコシド、ＬＤＡＯ（酸化ドデ
シルジメチルアミン）、ＮＰ４０等の非イオン性界面活性剤と、 −ＳＤＳ／トイーン８０混合物、サルコシル／トリトンＸ１００混合物等のイ
オン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤との混合物、ＳＤＳ／デオキシコール
酸塩混合物等の２種類のイオン性界面活性剤の混合物、イオン性界面活性剤と両
性（ zwitterionic ）界面活性剤との混合物等の界面活性剤混合物と、 からなる群から選択された界面活性剤を含む。

【００１３】 上記方法を実施するための好ましい態様においては、前記バッファＢが、好ま
しくは、Ｃ₃ −Ｃ₆ アルコールと平均理論誘電率が１０と２５の間であるアルコ
ール混合物とからなる群から選択される。前記アルコール又はアルコール混合物
としては、 ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチルプロパン−１
−オール、イソプロパノール、（イソプロパノール＋ペンタノール）、（エタノ
ール＋ヘキサノール）、（ブタノール＋ペンタノール）が、特に好ましい。

【００１４】 本発明の用語において、誘電率とは、静的な乃至比較的低周波数の場において
測定される静的誘電率εを意味するものと理解され、この誘電率は、電界が２９
３．１５Ｋと２９８．１５Ｋの間の温度において溶液に適用される時の、電気移
動（ electric displacement）Ｄの電界強度（ electric field strength）Ｅに
対する比率に相当する。 このように定義された液体の誘電率は、『化学と物理学のＣＲＣハンドブック
』（ David R. Lide 著、７５版、１９９４、ＣＲＣ出版）に詳細に記述されて
いる。 溶媒混合物の場合、平均理論誘電率とは、複数の溶媒のそれぞれの誘電率を混
合物中のそれぞれの割合で重み付けして得られる平均値を意味する。

【００１５】 驚くべきことに、工程（２）においてバッファＢを添加することによって、低
速遠心分離条件下において、９０％を超える精製歩留まりを得ることが出来る。
即ち、バッファＢは、高い精製歩留まりを維持しつつ、最終残渣の量を有意に減
少させる。有利なことに、最終残渣の量は、生物試料の最初の重量の１０％を超
えない量とすることが出来、それにより、その残渣を免疫検定に有効に使用する
ことが出来る。バッファＡのみが添加される場合に得られる条件は従来技術の条
件であり、ＰｒＰｒｅｓの検出のために充分な精製度を得るためには、超遠心分
離を行なう必要がある。

【００１６】 ８０％を超える精製歩留まりは遠心分離の時間と速度を変更しても得られこと
が、留意されてよい。即ち、２０，０００ｇより低い速度での２分間から１０分
間の遠心分離でもよいし、『ｇ』の数値の増加に比例して『時間』を減少させて
もよい。 有利なことに、前記懸濁液Ｓ２の遠心分離の後に回収される残渣の量に対する
その固体相に含まれるＰｒＰｒｅｓの精製歩留まりの比率は、最初の試料が１０
０ｍｇの脳に相当する場合に、１０より大きくすることが出来る。

【００１７】 他の有利な態様においては、工程（４）において使用される前記バッファＣが
、尿素及びグアニジン又はその混合物からなる群の中から選択されたカオトロピ
ック剤（ chaotropic agent ）を含む。尤も、他の何れのカオトロピック剤を使
用してもよい。 尿素の濃度は、好ましくは、０．２５Ｍと８Ｍの間であり、グアニジンの濃度
は、好ましくは、０．１Ｍと６Ｍの間である。

【００１８】 バッファＣが少なくとも１種類の界面活性剤と少なくとも１種類のカオトロピ
ック剤との混合物である場合は、バッファＣは、好ましくは、ＳＤＳと尿素の混
合物、サルコシルと尿素の混合物、デオキシコール酸塩（ deoxycholate ）と尿
素の混合物、サルコシルとグアニジンの混合物、サルコシルとグアニジンと尿素
の混合物からなる群から選択される。ＳＤＳと尿素の混合物が選択される場合に
、ＳＤＳの濃度は、好ましくは、０．２５〜１％であり、尿素の濃度は、好まし
くは、０．２５〜６Ｍである。サルコシルと尿素の混合物が選択される場合に、
サルコシルの濃度は、好ましくは、０．２５％と１％の間であり、尿素の濃度は
、好ましくは、０．２５Ｍと８Ｍの間である。サルコシルとグアニジンの混合物
が選択される場合に、サルコシルの濃度は、好ましくは、０．２５％と１％の間
であり、グアニジンの濃度は、好ましくは、０．５Ｍと３Ｍの間である。サルコ
シルとグアニジンと尿素の混合物が選択される場合に、サルコシルの濃度は、好
ましくは、０．２５％と１％の間であり、グアニジンの濃度は、好ましくは、０
．５Ｍと３Ｍの間であり、尿素の濃度は、好ましくは、０．２５Ｍと６Ｍの間で
ある。

【００１９】 特にウェスタン・ブロッティング法のためには、レムリ（ Laemmli）・バッフ
ァ［４％ＳＤＳ、０．１Ｍトリス（Tris）−ＨＣｌｐＨ８、５％ショ糖、及び２
％β−メルカプトエタノール］を使用することが出来る。

【００２０】 本発明は、また、生物試料においてＰｒＰｒｅｓを検出する方法であって、 −上記のように定義された前記試料を処理する工程と、 −得られた試料を、必要に応じて、希釈する工程と、 −前記ＰｒＰｒｅｓを、特異的な信号を発生させる、免疫検定法（ＥＬＩＳＡ 法、ウェスタン・ブロッティング法等）等の何れかの適当な分析法を用いて 検出する工程と を含むことを特徴とする方法に関する。 上記の希釈工程は、ＥＬＩＳＡ法によるＰｒＰｒｅｓの検出を可能にするため
のバッファＣの中和を可能にする。この希釈は、例えば、最終アルブミン濃度が
２％と１０％（ｗ／ｖ）の間の値となるようなアルブミンを含むバッファ、また
は、１％デオキシコール酸等に基づくバッファを用いて、実施される。

【００２１】 このように処理された生物試料は有効な濃度のＰｒＰｒｅｓを含むので、その
ＰｒＰｒｅｓは、免疫学的方法等の何れの分析法によっても、その試料中におい
て直接検出され得る。

【００２２】 派生例として、本発明は、また、生物試料からＰｒＰｒｅｓを精製する方法で
あって、 （１）前記生物試料を、３０秒から２時間の間、好ましくは３０秒から１０分
の間、８０℃よりも低い温度において、その生物試料の重量の１／４倍と４倍と
の間の量の、好ましくは１／４倍と１．５倍の間の量の少なくとも１種類の界面
活性剤を含むバッファＡを用いてインキュベーションし、また場合により、それ
に先立ち、その後に、またはそれと同時に、プロテアーゼを用いてインキュベー
ションすることによって、オパール様乃至は濁った状態のミセル状又は層状の懸
濁液Ｓ１を得る工程と；本発明によれば、前記プロテアーゼは、実際には、前記
界面活性剤よりも前、若しくは後、またはそれと同時に添加される、 （２）かかる（１) で得られたミセル状又は層状の懸濁液Ｓ１に、相分離を生
じさせるために適当な量の、前記ＰｒＰｒｅｓを可溶化せず且つ誘電率が１０〜
２５の溶媒又は溶媒混合物からなるバッファＢを加える工程と、 （３）この（２) の工程で得られた懸濁液を遠心分離する工程と；この遠心分
離は、例えば２分間〜１０分間、２０，０００ｇより低い速度、好ましくは３，
５００ｇと１７，５００ｇの間の速度で行なわれる；前記ＰｒＰｒｅｓは、最終
的に界面に現れる、 （４）その界面に存在する薄膜を回収する工程と、 （５）プロテアーゼを加えないバッファＡで、前記薄膜を再可溶化させる工程
と、 （６）該工程（５) で得られた懸濁液を遠心分離する工程と；この遠心分離は
、例えば２分間〜１０分間、２０，０００ｇより低い速度、好ましくは３，５０
０ｇと１７，５００ｇの間の速度で行なわれる；その結果得られる遠心分離残渣
に含まれるＰｒＰｒｅｓの精製歩留まりは、驚くべきことに、７０〜１００％と
なる；この遠心分離の時間と速度は、同じ結果、即ち、精製歩留まり７０〜１０
０％のＰｒＰｒｅｓを得ることが出来るように、調整され得る、 （７）得られた残渣を、０．１％と５％の間の濃度、好ましくは０．２５％と１
％の間の濃度［バッファＣの体積に基づく（ｗ／ｖ）］の、前記（１) で定義さ
れた少なくとも１種類の界面活性剤及び／又は０．１Ｍと８Ｍの間の濃度の少な
くとも１種類のカオトロピック剤を含むバッファＣに、室温と１００℃の間の温
度、好ましくは８０℃以上の温度において、可溶化させる工程と；それらの温度
条件下においては、前記界面活性剤、好ましくはイオン性界面活性剤及び／又は
前記カオトロピック剤がＰｒＰｒｅｓを可溶化する、 を必須的に含むことを特徴とする方法に関する。

【００２３】 マイクロエマルジョン、マイクロサスペンション、または、相分離を形成する
ために加えられるべきバッファＢの量は、図１にブタン−１−オールについて示
されたバッファＢの範囲に基づいて確定される。それらの量は、バッファＡとバ
ッファＢのために選択された成分との関数として変化し得る。

【００２４】 派生例として、前記バッファＣ中における前記可溶化工程［前記第１方法の工
程（４）又は前記第２方法の工程（７）］は、５分間〜１０分間、８０℃以上の
温度で加熱し、その後、例えば、２分間〜１０分間、２０，０００ｇより低い速
度、好ましくは３，５００ｇと１７，５００ｇの間の速度での遠心分離を行なう
ものである。この場合には、ＰｒＰｒｅｓは再可溶化され、最終的に上澄み中に
現れる。この条件下で得られた試料は、特に、ＥＬＩＳＡ法によるＰｒＰｒｅｓ
の検定に適している。

【００２５】 本発明は、更に、生物試料を処理するためのキットであって、その試料を均質
化するためのバッファに加えて、上記のように定義された、それぞれ適当な量の
バッファＡ、バッファＢ、及びバッファＣを含むことを特徴とするキットに関す
る。

【００２６】 本発明は、更に、ＰｒＰｒｅｓを検出するためのキットであって、ＰｒＰｒｅ
ｓが検出されるべき生物試料を均質化するための適当な量のバッファと、上記の
ように定義された、それぞれ適当な量のバッファＡ、バッファＢ、及びバッファ
Ｃと、少なくとも１種類の抗ＰｒＰｒｅｓ抗体（ anti-PrPres antibody ）とを
含むことを特徴とするキットに関する。

【００２７】 以上に記載された態様に加え、本発明は、その主題を構成する方法の実施に関
する具体例及び添付の図面についての以下の記載から明らかとなる他の態様をも
含むものである。

【００２８】

【発明の実施の形態】

以下、本発明の具体例を図面を参照しながら説明するが、それらの具体例は本
発明の主題を説明するための例示に過ぎず、本発明が以下の記載に何ら限定され
るものではないことが、理解されるべきである。

【００２９】実施例１ ：現場においてＰｒＰｒｅｓを検定するためのウシの脳の試料の処理： バッファＢの適当な量の選択 −ウシの脳５００ｍｇの試料をすり潰し、５％グルコース溶液中の濃度が２５
％（ｗ／ｖ）となるように均質化する。 この均質化を行なうために、先ず、脳試料（５００ｍｇ）とグルコース１ｍｌ
とをセラミック・ビーズを入れた試験管に投入して、攪拌する。その上澄み（約
１．５ｍｌ）を回収した後、ビーズを５００μｌのグルコースに懸濁させて濯ぎ
、攪拌する。この得られた上澄みを回収し、先に得られた上澄みと混合する（２
ｍｌ）。

【００３０】 −こうして得られたホモジネートの４００μｌ（脳１００ｍｇに対応する）を
、２５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと２５％（ｖ／ｖ）トイーン８０とをそれぞれ等部づ
つ１対１の比率（ｖ／ｖ）で含む混合物と、プロテアーゼＫ（０．１ｍｇ／ｍｌ
バッファＡ、即ち、０．４ｍｇ／ｇ組織）とを含むバッファＡの４００μｌを用
いて、１０分間（５分間を２回）、３７℃の温度で、インキュベートする［工程
（１）］。ある変更例において、バッファＡとして、１０％サルコシルと１０％
トリトンＸ１００とを含むものが、有利に使用される。後者のバッファＡはＳＤ
Ｓを含まないものであり、ＥＬＩＳＡ型の方法を使用し、特異的な抗体によって
ＰｒＰｒｅｓを検出する場合に動揺を起こさないので、より有利である。 −０〜１０００μｌのブタノール（バッファＢ）を添加せしめる［工程（２）
］。

【００３１】 図１は、ウェスタン・ブロッティング法によって定量化されたＰｒＰｒｅｓの
精製歩留まり（％）と、添加されたバッファＢの量の関数としての残渣の量（ｍ
ｇ）とを示す。 この図によれば、ブタノールが１０％と５３％の間ではＰｒＰｒｅｓは懸濁状
態に維持され、３０％と５０％の間では１００％に近い精製歩留まりと１０ｍｇ
より少ない残渣が得られる。

【００３２】 −３，８００ｇ（４，０００ｒｐｍ、JOUAN 遠心分離機）での遠心分離を１０
分間行なった後［工程（３）］、上澄みを捨て、ＰｒＰｒｅｓを含む残渣を回収
し、その残渣を、 ・０．５％ＳＤＳと０．５Ｍ尿素、若しくは、 ・レムリ・バッファ、若しくは、 ・０．５％サルコシルと６Ｍ尿素 を含むバッファＣの８０〜１００μｌに、５分間、１００℃において、溶解させ
る［工程（４）］。

【００３３】 ＰｒＰｒｅｓは、この処理によって、溶解される。この試料は、ＥＬＩＳＡ法
やウェスタン・ブロッティング法等の免疫学的検定法にすぐに使用することが出
来る。

【００３４】 ＥＬＩＳＡ法を行なうためには、先ず、残渣を、サルコシル（０．２５〜１％
）と尿素（０．２５〜８Ｍ）、若しくは、ＳＤＳ（０．２５〜１％）と尿素（０
．２５〜１Ｍ）を含むバッファＣに溶解させる。加熱の後、得られた試料を、最
終的なアルブミン濃度が２％と１０％の間（ｗ／ｖ）となる量のアルブミンを含
むバッファ、または、１％のデオキシコール酸塩を含むバッファで希釈する（４
分の１又は２分の１に）。

【００３５】 ある変更例において、希釈された試料は、１００℃において、５〜１０分間、
加熱され、その後、２０，０００ｇより低い速度、好ましくは３，５００ｇと１
７，５００ｇの間の速度で、２〜１０分間、遠心分離される。得られた上澄みを
、ＥＬＩＳＡバッファを用いて、４分の１〜２分の１に希釈する。

【００３６】 本例では、ＰｒＰｒｅｓは、ウェスタン・ブロッティング法によって定量され
る。先ず、同体積のレムリ・バッファと混合される。その後、希釈試料を、ウェ
スタン・ブロッティング法による検出のためにゲル上に置く。検出されたＰｒＰ
ｒｅｓの量が、ＢＳＥに冒されて疾病の最終段階にあるウシの脳から得た一つの
ホモジネートから上記の条件と同一の条件下で精製されたＰｒＰｒｅｓの希釈物
の線形範囲（正のコントロール）と比較される。

【００３７】 本発明に従う方法によって処理された試料は、バックグランドの影響を受けず
、ＰｒＰｒｅｓの、信頼性に富み、特異性の高い、定量的な検定を可能にする。

【００３８】 本発明に従う方法は、ＰｒＰｒｅｓの精製歩留まりの有意の増加を可能にする
： ・実際に、バッファＡのみが加えられた場合には、ＰｒＰｒｅｓの歩留まりは
４０％程度に過ぎず、固体相と液体相との分離等の理由によって、ＰｒＰｒｅｓ
の６０％程度の損失が観察される。また、実質的な量の残渣が観察される。この
ことは、従来技術に記載されたプロトコールがサルコシルを使用する理由となっ
ている。サルコシルは、残渣の量を減少させるが、充分な歩留まりを得るために
は、面倒な超遠心分離を必要とする。 ・工程（２）によって、固体相中のＰｒＰｒｅｓの歩留まりが増加する。上記
のごとく、懸濁液Ｓ２の固体相において８０〜１００％程度の歩留まりが得られ
ると同時に、残渣の量が減少する。

【００３９】実施例２ ：現場においてＰｒＰｒｅｓを検定するためのウシの脳の試料の処理： 工程（１）と工程（２）の変更例 −均質化工程は、実施例１で記載された工程と同じである。 −その後、５００ｍｇのウシの脳から得られたホモジネートの２ｍｌを、実施
例１で記載された条件と同一の条件下でバッファＡの２ｍｌを用いてインキュベ
ートする［工程（１）］。 −さらに、実施例１で記載された条件と同一の条件下でバッファＢの３ｍｌを
添加する［工程（２）］。 −残りの工程は、実施例１と同じである。

【００４０】実施例３ ：現場においてＰｒＰｒｅｓを検定するためのウシの脳の試料の処理： 均質化工程の変更例 −ウシの脳の２５０ｍｇの試料をすり潰し、５％グルコース溶液中の濃度が２
５％（ｗ／ｖ）となるように均質化する。

【００４１】 この均質化を行なうために、先ず、脳試料（２５０ｍｇ）と７５０μｌのグル
コースとをセラミック・ビーズを入れた試験管に投入し、４０秒間、攪拌する（
ＲＩＢＯＬＹＳＥＲ−ＨＹＢＡＩＤ装置）。４００μｌの上澄み（約１．５ｍｌ
）を回収する。残りの工程は、実施例１と同じである。

【００４２】実施例４ ：ＰｒＰｒｅｓの精製歩留まりと残渣の量との比率に対する異なるバッ ファＢの影響の比較 試料は、バッファＢの量が６００μｌであることを除いて、実施例１で記載さ
れた条件と同一の条件下で処理される。

【００４３】 図２は、異なるバッファＢを用いて、ウェスタン・ブロッティング法によって
得られた比率を示す。異なるバッファＢは、ペンタノール、ブタノール、イソプ
ロパノール／ペンタノール混合物、エタノール／ヘキサノール混合物、イソプロ
パノール、及びエタノールであり、混合物は体積に基づいて調製されている。

【００４４】実施例５ ：異なる混合物のそれぞれの誘電率の比較とそれらのＰｒＰｒｅｓの精 製歩留まりと残渣の量とに対する影響 本方法は、実施例４に記載された条件下で行なわれる。

【００４５】 図３は、得られた結果を示す。バッファＢが複数のアルコールの混合物の場合
、各アルコールの体積は、その誘電率と混合物に要求される理論的誘電率（例え
ば、１７）の関数として、アルコールの全体の体積である６００μｌに基づいて
計算される。例えば、ヘキサノール／エタノール混合物の場合には、以下の式が
得られる。 １３ｙ＋２５（１−ｙ）＝１７ 但し、ｙはヘキサノールの百分率であり、１３はヘキサノールの誘電率で あり、２５はエタノールの誘電率である。

【００４６】 平均理論誘電率が１５以下の場合は、相分離が観察される。

【００４７】実施例６ ：ウェスタン・ブロッティング法によるＰｒＰｒｅｓの検出 ＊プロトコル： １）ウシの脳の２５％（重量／体積）ホモジネートの４００ｍｇを、２５％（
ｗ／ｖ）ＳＤＳと２５％（ｖ／ｖ）トイーン８０の等部（５０／５０）づつ（ｖ
／ｖ）の混合物の４００μｌと、プロテアーゼＫ（ＰＫ：濃度−０．１ｍｇ／ｍ
ｌバッファＡ）とを含むバッファＡの４００μｌを用いて、５分間を２回、３７
℃で、インキュベートする。 ２）ブタノール−１−オールからなるバッファＢの６００μｌ（レーン７と８
の試料についてのみバッファＢの１、０００μｌ）を、添加する。 ３）この混合物を、１５，０００ｒｐｍ（約１７，０００ｇ）で、５分間、遠
心分離する。 ４）遠心分離によって得られる残渣を、４％のＳＤＳを含むレムリ・バッファ
の１００μｌに取り、１００℃で、５分間、加熱する。

【００４８】 ＊ウェスタン・ブロッティング法： 得られた試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なうために使用され、トービン（Towb
in）ら（ Proc. Natl. Acad. Sci. 、ＵＳＡ、１９７９，７６，４３５０−４３
５４）又は C.I. ラスメサス（ Lasmeszas）ら（J. Gen. Virol.、１９９６、前
掲）によって記載された条件下で、ニトロセルロース膜に移される。

【００４９】 健康なウシのホモジネートから実施例１で記載された条件と同じ条件下で得ら
れた負のコントロールにおいて、試料は、信号の強度の理由から、電気泳動ゲル
上に置かれる前に、２０分の１に希釈される［９．５ｍｇの健康なウシの脳と０
．５ｍｇの感染したウシの脳に対応する１０ｍｇ（１０μｌ）の脳の等価物で負
荷された１２％ポリアクリルアミド］。

【００５０】 ＰｒＰｒｅｓの免疫検出を、抗血清ＪＢ００７［Ｒ．デマイメイ（ Demaimay
）ら、J. Virol. 、１９９７、７１、１２、９６８５−９６８９] （１／５００
０）とペルオキシダーゼに結合させた抗ウサギヤギＩｇ（１／２５００）で行な
った。免疫活性は、図４に示されるように、ケミルミネッセンス［ＥＣＬ，アマ
ーシャム（Amersham）］によって検出され、定量化され、オートラジオグラフ・
フィルム上に視覚化される。

【００５１】 図４は、得られた結果を示し、図３Ａのプロパノール／ヘキサノール曲線に対
応する。 図４において、レーン１〜６は、バッファＢとして異なるプロパノール／ヘキ
サノール混合物を使用して処理された試料に対応し、異なる平均理論誘電率に対
応する。レーン８と９は、バッファＢとして１０００μｌのブタノールを使用す
る方法に従った生物試料に対応する（図１の横軸上の５３％）。この場合には、
すべてのＰｒＰｒｅｓが最終的に界面に現れることが観察される。レーン９と１
０は、バッファＢとして６００μｌのブタノールを使用する方法に従った生物試
料に対応する（図１の横軸上の４３％）。この場合には、すべてのＰｒＰｒｅｓ
が最終的に残渣に現れることが観察される（レーン１０）が、他方、同じ条件下
で処理された負のコントロールでは如何なる信号も検出されなかった（レーン９
）。

【００５２】実施例７ ：本発明に従って得られた試料からのＰｒＰｒｅｓのＥＬＩＳＡ法 以下の条件下で試料が調製される： −実施例１に記載された条件と同じ条件下において、ウシの脳４００ｍｇの試
料をすり潰し、５％グルコース溶液（１．６ｍｌ）中の濃度が2 ０％となるよう
に均質化する。 −こうして得られたホモジネートの５００μｌを、１０％のサルコシルと１０
％のトリトンＸ１００及びプロテナーゼＫ（８０μｇ／ｍｌ）を含むバッファＡ
の５００μｌを用いて、３７℃で、１０分間（５分間を２回行ない、その中間に
攪拌を行なう）、インキュベートする。 −５００μｌのバッファＢ（ブタノール）を添加する。 −この混合物を、１７，６０８ｇを適用することが可能なロータを用いて、１
５，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離する。２０，６２７ｇで４分間遠心分離す
ることによっても、同じ結果が得られる。 −上澄みを捨て、ＰｒＰｒｅｓを含む残渣を回収し、その残渣を、６Ｍ尿素と
０．５％サルコシルを含むバッファＣの１００μｌに、５分間、１００℃におい
て、溶解させる。 −この混合物を、１７，６０８ｇを適用することが可能なロータを用いて、１
５，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離する。２０，６２７ｇで４分間遠心分離す
ることによっても、同じ結果が得られる。この上澄みを、ＥＩＡバッファ（０．
５％デオキシコール酸塩を含む燐酸塩バッファ）を用いて、３分の１に希釈する
。

【００５３】 ＥＬＩＳＡ法を行なうために、得られた試料は、１ウェルあたり１００μｌの
割合で、２ウェルずつ、第１抗ＰｒＰ抗体［８Ｇ８、クレースマン（Kraseman）
ら、Molecular Medicine、１９９６、参照］で覆われたプレート上に置かれる。
インキュベーションと洗浄の後、アセチルコリンエステラーゼ［グラッシ（Gras
si）ら、J. Immunol. Methods 、１９８９、参照］に結合させた第２抗ＰｒＰ抗
体（１２Ｆ１０、クレースマンら、１９９６、参照）に反応させる。アセチルコ
リンエステラーゼのための基質を用いてインキュベーションし、基質［エルマン
（Ellmann ）の試薬］の添加後１５分又は３０分の時点で、４１５ｎｍで、その
結果を読む。

【００５４】 図５に示された結果は、ＢＳＥに臨床的に冒されたウシの脳の２０％（重量／
体積）ホモジネートであって、健康なウシの脳の２０％（重量／体積）ホモジネ
ート中に、１０分の１、１００分の１、１，０００分の１、１０，０００分の１
に希釈されたものに関する。

【００５５】 その後、試料は、前記の条件下で処理され、補足抗体としての８Ｇ８と検出抗
体としての１２Ｆ１０とを用いたＥＩＡ法によって、検査される。 検査される試料は、ＥＩＡデポー（depot ）バッファ中に希釈される（３分の
１の希釈であり、因数３である）。

【００５６】 図５は、得られた結果を示す（ホモジネートの最終希釈度、即ち、負のホモジ
ネートによる希釈度ｘＥＩＡバッファによる希釈度の関数としての信号の吸光度
）。半対数曲線は、ＥＩＡ法のすべての検定において従来観察されてきたシグモ
イド型を有する。また、１０分の１、１００分の１、１，０００分の１に希釈さ
れたホモジネートから得られた曲線に良好な重なり合いがあることが注目される
。最後に、本試験の感度のレベルは、１０，０００分の１に希釈された陽性の脳
の検出を可能にするものである。

【００５７】 図６においては、１００分の１に希釈された他のホモジネートが、４００ｎｇ
／ｍｇの濃度のＰＫによる前記の処理の後に、又は、異なる濃度のＰＫによるホ
モジネートの直接的な処理の後に、ＥＩＡ法によって試験された。その結果、精
製されていないホモジネートのＰＫによる直接的な処理では、低いＰＫ濃度（Pr
Pcの不完全な破壊）の負のコントロールについては高い信号を示すか、または、
高いＰＫ濃度では陽性のウシについて低い信号を示すことが見出される。従って
、本例は、ＰｒＰｒｅｓを正しく検出しようとすれば、前記の方法でホモジネー
トを処理することが必須の要件であることを示している。

【００５８】実施例８ ：異なるバッファＣの比較 採用された試料処理プロトコルは、実施例７のものと同じである。 図７は、得られた結果を示す。

【００５９】 グアニジンが有効のように思われ、また、（尿素がＥＬＩＳＡ法についてより
寛容であることから）尿素／グアニジンの組合わせが最も価値が高いように思わ
れる。

【００６０】 上記の記載から明らかなように、本発明は、本明細書中で明示的に記載された
実施の態様、具体例、適用の態様に何ら限定されず、本発明の枠組み又は範囲を
逸脱しない限りにおいて当業者に自明なすべての変更を包含するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 バッファＢ（ブタノール）の量の、ＰｒＰｒｅｓの精製歩留まり（％）と遠心
分離後に得られる残渣の量に対する影響を示す図である。

【図２】 異なるバッファＢの、ＰｒＰｒｅｓの精製歩留まり（％）と遠心分離後に得ら
れる残渣の量に対する影響を示すグラフである。

【図３】 バッファＢとして使用される異なるアルコール混合物の比較による、上記記載
において定義された平均理論誘電率の役割を示す図である。

【図４】 ウェスタン・ブロッティング法によってＰｒＰｒｅｓを検出する具体例を示す
図である。

【図５】 本発明に従う処理試料の異なる希釈物に関する、ＥＬＩＳＡ法の感度と精製歩
留まりを示す図である。

【図６】 ホモジネート上で直接行なわれるＥＬＩＳＡ法を示す図である。

【図７】 異なるバッファＣの比較を示す図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年４月２５日（２０００．４．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，Ｉ Ｌ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物試料からＰｒＰｒｅｓを精製する方法であって、 （１）前記生物試料を、３０秒から２時間の間、８０℃よりも低い温度において 、該生物試料の重量の１／４〜４倍の量で少なくとも１種類の界面活性剤を 含むバッファＡを用いてインキュベーションし、また場合により、それに先 立ち、その後に、またはそれと同時に、プロテアーゼを用いてインキュベー ションすることによって、懸濁液Ｓ１を得る工程と、 （２）かかる（１）で得られた懸濁液Ｓ１に、その懸濁液Ｓ１をマイクロエマル ジョン又はマイクロサスペンションとすることによって清澄化させるために 適当な量の、前記ＰｒＰｒｅｓを可溶化せず且つ誘電率が１０〜２５の溶媒 又は溶媒混合物からなるバッファＢを加える工程と、 （３）この（２）の工程で得られた懸濁液Ｓ２を遠心分離する工程と、 （４）得られた残渣を、０．１％〜５％の間の濃度、好ましくは０．２５％〜１ ％の間の濃度［バッファＣの体積に基づく（ｗ／ｖ）］の、前記（１）で定 義された少なくとも１種類の界面活性剤、及び／又は少なくとも１種類のカ オトロピック剤を含むバッファＣに、８０℃以上の温度において、可溶化さ せる工程と、 を必須的に含むことを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 生物試料からＰｒＰｒｅｓを精製する方法であって、 （１）前記生物試料を、３０秒から２時間の間、８０℃よりも低い温度において 、該生物試料の重量の１／４〜４倍の量で少なくとも１種類の界面活性剤を 含むバッファＡを用いてインキュベーションし、また場合により、それに先 立ち、その後に、またはそれと同時に、プロテアーゼを用いてインキュベー ションすることによって、懸濁液Ｓ１を得る工程と、 （２）かかる（１) で得られた懸濁液Ｓ１に、相分離を生じさせるに適当な量の 、前記ＰｒＰｒｅｓを可溶化せず且つ誘電率が１０〜２５の溶媒又は溶媒混 合物からなるバッファＢを加える工程と、 （３）該（２) の工程で得られた懸濁液を遠心分離する工程と、 （４）その界面に存在する薄膜を回収する工程と、 （５）プロテアーゼを加えることなくバッファＡで前記薄膜を再可溶化させる工 程と、 （６）かかる工程（５) で得られた懸濁液を遠心分離する工程と、 （７）得られた残渣を、０．１％〜５％の間の濃度、好ましくは０．２５％〜１ ％の間の濃度［バッファＣの体積に基づく（ｗ／ｖ）］の、前記（１) で定 義された少なくとも１種類の界面活性剤、及び／又は少なくとも１種類のカ オトロピック剤を含むバッファＣに、室温〜１００℃の間の温度、好ましく は８０℃以上の温度において、可溶化させる工程と、 を必須的に含むことを特徴とする方法。
3. 【請求項３】 前記生物試料が組織又は器官である場合に、かかる試料が、
   中性バッファと等張性バッファからなる群から選択された均質化バッファ中にお
   いて、前記工程（１）の前に、均質化されることを特徴とする請求項１又は請求
   項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記インキュベーションの時間が、好ましくは、３０秒〜１
   ０分の間であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１つに記載の方法。
5. 【請求項５】 前記バッファＡ及び／又は前記バッファＣが、 −ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、サルコシル（ラウロイルサルコシン） 、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナト リウム等の陰イオン性界面活性剤と、 −ＳＢ３−１０（デシルスルホベタイン）、ＳＢ３−１２（ドデシルスルホベ タイン）、ＳＢ３−１４、ＳＢ３−１６（ヘキサデシルスルホベタイン）、 ＣＨＡＰＳ、デオキシＣＨＡＰＳ等の両性界面活性剤と、 −Ｃ１２Ｅ８（ドデシルオクタエチレングリコール）、トリトンＸ１００、ト リトンＸ１１４、トイーン２０、トイーン８０、ＭＥＧＡ９（ノナノイルメ チルグルカミン）、オクチルグリコシド、ＬＤＡＯ（ドデシルジメチルアミ ンオキシド）、ＮＰ４０等の非イオン性界面活性剤と、 −イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤の混合物、２種類のイオン性界 面活性剤の混合物、イオン性界面活性剤と両性界面活性剤の混合物等の界面 活性剤混合物と、 からなる群から選択された界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１乃至４の
   何れか１つに記載の方法。
6. 【請求項６】 前記工程（１）で採用される温度が、室温〜５０℃の間の温
   度であり、好ましくは、３７℃であることを特徴とする請求項１乃至５の何れか
   １つに記載の方法。
7. 【請求項７】 前記工程（１）において、バッファＡ中に存在する界面活性
   剤の量が、好ましくは、前記生物試料の重量の１／４〜１．５倍の間であること
   を特徴とする請求項１乃至５の何れか１つに記載の方法。
8. 【請求項８】 前記バッファＢが、Ｃ₃ −Ｃ₆ アルコールと平均理論誘電率
   が１０〜２５の間であるアルコール混合物とからなる群から選択されることを特
   徴とする請求項１乃至７の何れか１つに記載の方法。
9. 【請求項９】 前記アルコール又はアルコール混合物として、 ブタン−１−
   オール、ブタン−２−オール、２−メチルプロパン−１−オール、イソプロパノ
   ール、（イソプロパノール＋ペンタノール）、（エタノール＋ヘキサノール）、
   （ブタノール＋ペンタノール）が、特に好ましいことを特徴とする請求項８に記
   載の方法。
10. 【請求項１０】 前記工程（３）と前記工程（５）の遠心分離が、２分間〜
    １０分間、２０，０００ｇ以下の速度、好ましくは、３，５００ｇ〜１７，５０
    ０ｇの間の速度で行なわれることを特徴とする請求項１乃至９の何れか１つに記
    載の方法。
11. 【請求項１１】 前記バッファＣが、尿素及びグアニジン又はそれらの混合
    物からなる群の中から選択されたカオトロピック剤を含むことを特徴とする請求
    項１乃至１０の何れか１つに記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記バッファＣ中における前記可溶化工程（請求項１に記
    載の方法の工程（４）又は請求項２に記載の方法の工程（７））が、５分間〜１
    ０分間、８０℃以上の温度で加熱し、その後、遠心分離を行なうことを特徴とす
    る請求項１乃至１１の何れか１つに記載の方法。
13. 【請求項１３】 生物試料においてＰｒＰｒｅｓを検出する方法であって、 −請求項１乃至１２の何れか１つに従って前記試料を処理する工程と、 −得られた試料を、必要に応じて、希釈する工程と、 −前記ＰｒＰｒｅｓを何らかの適当な分析法を用いて検出する工程と を含むことを特徴とする方法。
14. 【請求項１４】 生物試料を処理するためのキットであって、該試料を均質
    化するためのバッファに加えて、請求項１乃至１２において定義された、それぞ
    れ適当な量のバッファＡ、バッファＢ、及びバッファＣを含むことを特徴とする
    キット。
15. 【請求項１５】 ＰｒＰｒｅｓを検出するためのキットであって、ＰｒＰｒ
    ｅｓが検出されるべき生物試料を均質化するための適当な量のバッファと、請求
    項１乃至１２において定義された、それぞれ適当な量のバッファＡ、バッファＢ
    、及びバッファＣと、少なくとも１種類の抗ＰｒＰｒｅｓ抗体とを含むことを特
    徴とするキット。