SU909634A1

SU909634A1 - Способ разделени арилэстеразы и альбумина сыворотки крови

Info

Publication number: SU909634A1
Application number: SU782640625A
Authority: SU
Inventors: Борис Павлович Суринов
Original assignee: Научно-Исследовательский Институт Медицинской Радиологии Академии Медицинских Наук Ссср
Priority date: 1978-06-30
Filing date: 1978-06-30
Publication date: 1982-02-28

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к способам выделения белков и ферментов методом электрофореза.

Известен способ разделения арилэстераэы и альбумина сыворотки крови путем проведения электрофореза в геле [1]. *

Однако при осуществлении известного способа затруднена идентификация фракции арилэстеразы, определение ее содержания в сыворотке крови, так как фракция арилэстеразы обладает относительной ¹⁰электрофоретической подвижностью, близкой к подвижности альбумина, что снижает точность получаемых результатов и не позволяет использовать электрофорез для выделения арилэстеразы в чистом виде. ⁵

Цель изобретения — повышение точности способа.

Указавшая цель достигается тем, что _мпри осуществлении способа разделения арилэстеразы и альбумина сыворотки крови путем проведения электрофореза в геле, сыворотку предварительно эмуль2 гируют олеиновой кислотой, взятой до конечной концентрации 0,001-0,002 М.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед электрофорезом к сыворотке крови добавляют жирную кислоту, например олеиновую, в концентрации 0,0010,002 М. При этом арипэстераза образует комплекс с жирной кислотой, обладающей более высокой электрофоретической подвижностью, чем фракция альбумина или арилэстераза до прибавления жирной кислоты. За счет этого арилэстераза передвигается к аноду с большей скоростью., что позволяет выделять ее в первой фракции в практически чистом от других белков виде. Выявление локализации арилэстеразы на электрофореграмме и ее элюирование производят известным методом.

П р и м е р. К сыворотке крови человека добавляют олеиновую кислоту из расчета 0,5 мг/мл и тщательно перемешивают в пробирке стеклянной палочкой в те*

009634 4 чение 4-5 мин до получения эмульсин. Пробу полученной таким образом эмульсии вносят в стартовую лунку в 1,01,5%~ом агаровом геле с мединаловым буфером pH 2-8,4. К электродам под- ₅ключают напряжение от источника постоянного тока и проводят электрофорез. По истечении времени, достаточного для оптимального разделения (1,0-1,2 ч) арилэстеразы и альбумина, электрофорез _t0прекращают. От основного агарового бло— 'ка, в котором проводился электрофорез, отрезают контрольную электрофореграмму и в ней вьивляют локализацию фракций арилэстераз. С этой целью ее инкубиру- ₁₅ют в 0,01-0,02%-ом растворе 2-нафтилацетата с 0,03-0,04% прочного синего Б в О,Г. н, фосфатном буфере pH 7,ΟΥ,8. Из основной части блока агарового геля вырезают участок, соответствующий локализации арилэстеразы. Этот участок помещают в центрифужную пробирку, замораживают при 20—30° С, размораживают и центрифугируют при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, диализуют .в целлофановом мешке против дистиллированной воды при 4-5 С и высушивают лиофильной сушкой. Полученный препарат арилэстеразы является практически чистым, так как при повторном электрофорезе образует одну белковую. зону, обладающую ферментативными свойствами арилэстеразы (индекс 3.1.1.2 по Международной классификации и но менклатуре ферментов j , гидролизует 2—нафтилацетат, активируется Са²⁺, угнетается тяжелыми металлами и комплексоо бразовате лями.

Предлагаемый способ позволяет повысить точность полученных результатов за счет повышения электрофоретической подвижности арилэстеразы сыворотки крови при эмульгировании с олеиновой кислотой с 1,0-1,1 до 1,5-1,6 по отношению к подвижности альбумина, при этом арилэстеразу выделяют в чистом виде· в первой фракции.

Claims

(54) СПСХЮБ РАЗДЕЛЕНИЯ АРИЛЭСТЕРАЗЫ И АЛЬБУМИНА СЫВОРОТКИ КРОВИ Изобретение относитс к медицине, а именно к способам выделени белков и ферментов методом электрофореза. Известен способ разделени арилэстеразы и альбумина сыворотки крови путем проведени электрофореза в геле ij Однако при осуществлении известного способа затруднена идентификаци фракции арилэстеразы, определение ее содержани в сыворотке крови, так как фракци арилэстеразы обладает относительной электрофоретической подвижностью, близкой к подвижности альбумина, чго снижает точность получаемых результатов и не позвол ет использовать электрофорез дл выделени арилэстеразы в чистом виде. Цель изофетенн - повышение точности способа. Указаш1а цель достигаетс тем, что при осуществлении способа разделени арилэстеразы и альбумина сыворотки крови путем проведени электрофореза в геле, сыворотку предварительно эмуль гируют олеиновой кислотой, вз той до конечной концентрации 0,ОО1-0,ОО2 М. Способ осуществл етс следующим образом . Перед электрофорезом к сыворотке крови Добавл ют жирную кислоту, например олеиновую, в концентрации О,ОО10 ,002 М. При этом арилэстераза офазует комплен; с жирной кислотой, обладающей более высокой электрофоретической подвижностью, чем фракци альбумина или арилэстераза до прибавлени жирной кислоты. За счет этого арилэстераза передвигаетс к аноду с большей скоростью ., что позвол ет выдел ть ее в первой фракции в практически чистом от других белков виде. Вы вление локализации арилэстеразы на электрофореграмме и ее элюироваиие производ т известным мето-цом . П р и м е р. к сьторотке крови человека добавл ют олеиновую кислоту из расчета 0,5 мг/мл и тщательно перемещивают в пробирке стекл нной палочкой в те- чение 4-5 мил до получени эмульсин. Пробу получетшой Tajott-i офазом эмульсии внос т в стартовую лунку в 1,01 , агаровом гепе с медшшловым фером рН 8у 2-8,4, К электродам подключают напр жение от источника посто нного тока и провод т электрофорез. По истечении времени, достаточного дл оптимального разделени (1,0-1,2 ч) арилэстеразы и альбумина, электрофорез прекращают. От основного агарового бло- ка, в котором проводилс электрофорез, отрезают контрольную электрофореграмму и в ней вы вл ют локапизацию фракций арилэстераз. С этой целью ее инкубируют в 0,01-0,02%-ом растворе 2-нафтил ацетата с 0,03-0,04% прочного синего Б в ОД: и, фосфатном буфере рН 7,07 ,8. Из основной части блока агарового гел вырезают участок, соответствующий локализации арилэстеразы. Этот участок помещают в центрифужную пробирку, замораживают при 2 0-3 о С, размораживают и центрифугируют при 1ООО об/мин. Надосадочную жидкость сливают, диали- зуют .в целлофановом мешке против дистиллированной воды при 4-5 С и высуплгаают лиофильной сушкой. Полученный препарат арилэстеразы вл етс практи- чески чистым, так как при повторном электрофорезе образует одну белковую . , , , .. зону, обладагаи то ферментативными свой ствами арилэстеразы (индекс ЗД.1.2 no Международной классификации и номенклатуре ферментов J , гидролизует 2-}1афггилацетат , активируетс Са) угнетаетс т желыми металлами и комплексоо браэовате л ми, Предлагаемый способ позвол ет повысить точность полученных результатов за счет повьпиени электрог юретической подвижности арилэстеразы сыворотки крови при эмульгировании с олеиновой кислотой с 1,О-1Д до 1,5-1,6 по отношению к подвижности альбумина, при этом ари - эстеразу выдел ют в шстом виде в первой фракции. Формула изобретени Способ разделени арилэстеразы и альбумина сыворотки крови путем проведени электрофореза в геле, о т л и ч а ю ш и и с тем, что, с полью повышени точности способа, сыворотку крови предварительно эмульгируют олеиновой кислотой, вз той до конечной концентрации 0 001-г... О,ОО2 М. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе l.Ur-iee D.Cliaracterisaiion des ifioEinesterases etdautres esterci es. |Cartiox. apres ef-ectropbgrese let iTYimuvioe.E.ectvopbore5e. en o ePose. JD.AppEica-tioM q Ee-tude des estev ases dU -buwiOH у огтоС. Ann UnStPa teuv , V.-101,1961, p. 104.