MXPA06011402A - Reactivos para pruebas de encefalopatia espongiforme transmisible y metodos de uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona metodos y composiciones mejorados para unir selectivamente y/o detectar una forma anormal de agregacion de una proteina (prion) en presencia de una forma normal de no agregacion de la proteina (prion), usando un material poliionico que tiene una avidez de union para la forma de agregacion anormal de la proteina (prion), un agente zwitterionico (un ZWITTERGENT(r) o un EMPIGEN(r) por ejemplo), y un agente discriminador (tal como laurilsarcosina).

Description

REACTIVOS PARA PRUEBAS DE ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME TRANSMISIBLE Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS Antecedentes de la invención Las encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs) causan la degeneración esponjosa del cerebro con síntomas neurológicos severos y fatales en humanos y animales. Las TSEs incluyen scrapie, que afecta a borregos y cabras; la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) , la cual afecta al ganado; encefalopatía de visón transmisible, encefalopatía espongiforme felina; enfermedad de desperdicio crónico (CWD) de ciervos incluyendo corzo, venado cola blanca, venado cola negra y alce; y kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Gerstmann-Straussler, insomnio familiar fatal y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob variante (vCJD) , los cuales afectan humanos . El único componente identificado del agente que causa TSEs es PrPSc, una isoforma de agregación anormal de PrPc. Los métodos actuales para detectar PrPSc someten una muestra a proteólisís con proteinasa K para destruir PrPc. La presencia de PrPSc sobreviviente luego se determina por un inmunoensayo usando un anticuerpo que no sea selectivo para PrPSc en presencia de PrPc. Véase Serban et al . , Neurology, 40:110 1990. Esta metodología excluye el uso de un anticuerpo para la captura o detección durante la etapa de REF.: 175409 proteólisis. La proteinasa K debe ser removida o desactivada antes de que cualquier anticuerpo pueda introducirse en el ensayo. Se requieren métodos que puedan identificar rápidamente muestras que contengan TSE con un mínimo manejo de muestras, discriminar entre el conformador normal y asociado a enfermedad de Prp independiente de la digestión con proteinasa K y que puedan ser automatizados para aplicaciones de alta producción.

Breve descripción de la invención Una modalidad de la invención proporciona un método para la unión selectiva de una forma anormal de agregación de una proteína en presencia de una forma normal de no agregación de la proteína. El método comprende poner en contacto, bajo condiciones de unión selectiva, tejido cerebral sospechoso de comprender la forma anormal de agregación y la forma normal de no agregación de la proteína con un material poliiónico que tenga una avidez de unión para la forma de agregación anormal de la proteína, un agente zwitteriónico y un agente discriminador, en donde la forma anormal de agregación .de la proteína se une selectivamente al material poliiónico. El material poliiónico puede ser resistente a proteasas. El material poliíónico puede ser un material polianiónico que tenga una multiplicidad de grupos aniónicos o un material policatiónico que tenga una multiplicidad de grupos catiónicos. El material poliiónico puede tener una multiplicidad de grupos aniónicos que sean grupos sulfato, carboxilo o fosfato, o una multiplicidad de grupos catiónicos que sean grupos amino, grupos imina o grupos de amonio cuaternario. El agente discriminador puede tener una menor densidad de grupos aniónicos que el material poliiónico. El agente discriminador puede ser un detergente aniónico o una amida de aminoácido de un ácido graso tal como laurilsarcosina. La forma anormal agregada de la proteína que se une selectivamente al material poliiónico puede ser capturada con un agente de captura inmovilizado. El agente de captura puede ser un anticuerpo específico para la forma anormal agregada de la proteína. El material poliiónico que se une selectivamente a la forma anormal agregada de la proteína puede ser capturado con un agente de captura inmovilizado. El agente de captura puede ser una lectina o un anticuerpo. Las condiciones de unión selectiva pueden comprender un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 9 o alrededor de 8.2 a aproximadamente 8.6. El material poliiónico puede comprender una porción - marcadora que pueda unirse selectivamente y el agente de captura puede unirse selectivamente a la porción marcadora. La forma anormal agregada de la proteína comprende una •porción marcadora que se puede unir selectivamente y el agente de captura se une selectivamente a la porción- marcadora. La porción marcadora que puede unirse puede ser biotina, fluoresceína, dinitrofenol, digoxirrenina, un ácido nucleico o secuencia análoga de ácido nucleico o (His) 6. El material poliiónico puede ser inmovilizado a un material de soporte sólido antes de ponerlo en contacto con tejido cerebral. El material de soporte sólido puede tener al material poliiónico recubierto sobre el mismo. El material poliiónico puede ser inmovilizado sobre el soporte sólido a través de su adsorción directa al soporte. El material poliiónico puede comprender una porción marcadora de unión selectiva y puede ser inmovilizado en el material de soporte sólido por medio de la porción marcadora. La porción marcadora que puede unirse puede ser biotina, fluoresceína, dinitrofenol, digoxirrenina, un ácido nucleico o secuencia análoga de ácido nucleico o (His) 6. El material poliiónico puede ser un sólido que proporcione una superficie que tenga la avidez de unión. El agente zwitteriónico puede comprender un detergente zwitteriónico. El agente zwitteriónico puede comprender 3- (N,N-dimetilocil-amonio)propansulfonato, 3- (decildimetilamonio) propansulfonato, 3- (dodecildimetilamonio) propansulfonato, 3- (N,N- dimetilmiristilamonio) propansulfonato, 3- (N,N~ dimetilpalmitilamonio) propansulfonato, n-octil-N, N-dimetil-3- amonio-1-propansulfonato, n-decil-N,N-dimetil-3-amonio-l- propansulfonato, n-dodecil-N, N-dimetil-3-amonio-l- propansulfonato, n-tetradecil-N, -dimetil-3-amonio-l- 'propansulfonato, n-hexadecil-N, N-dimetil-3-amonio-l- propansulfonato, una sulfobetaína, 3- (1-piridino) -1-propansulfonato, dimetil-2-hidroxietil-l-propansulfonato, 3- (1-metilpiperidinio) -1-propansulfonato, dimetilbencilamonio- 1-propansulfonato, dimetiletilamonio-1-propansulfonato, n-dodecil-N, -dimetilglicina, óxido de laurildimetilamina o combinaciones de los mismos. El agente zwitteriónico puede comprender una sulfobetaína. El agente zwitteriónico puede comprender un grupo sulfonato o un grupo carboxilo. La forma agregada anormal de la proteína puede ser PrPSc y la forma normal no agregada de la proteína puede ser PrPc. Otra modalidad de la invención proporciona un método para determinar la presencia o aus'encia de una forma de agregación anormal de una proteína en una muestra de tejido cerebral en presencia de la forma normal de no agregación de la proteína. El método comprende poner en contacto, bajo condiciones de unión selectiva, tejido cerebral sospechoso de comprender la forma anormal de agregación de la proteína y la forma normal de no agregación de la proteína con un material poliiónico que tenga una avidez de unión para la forma de agregación anormal de la proteína, un agente discriminador y un agente zwitteriónico; y determinar la presencia o ausencia de la forma de agregación anormal de la proteína unida al material poliiónico. Puede determinarse la cantidad de la forma de agregación anormal de una proteína. La determinación de la presencia o ausencia de la forma de agregación anormal de la proteína unida al material poliiónico puede determinarse cualitativamente o cuantitativamente al llevar a cabo un inmunoensayo para la forma de agregación de la proteína. La forma agregada anormal de la proteína puede ser PrPSc y la forma normal no agregada de la proteína puede ser PrPc. El agente zwitteriónico puede comprender un detergente zwitteriónico. El agente zwitteriónico puede comprender 3- (N,N-dimetilocil-amonio) propansulfonato, 3- (decildimetilamonio) propansulfonato, 3- (dodecildimetilamonio) propansulfonato, 3- (N,N-dimetilmiristilamonio) propansulfonato, 3- (N,N-dimetilpalmitilamonio)propansulfonato, n-octil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propansulfonato, n-decil-N, -dimetil-3-amonio-l-propansulfonato, ,n-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio~l- propansulfonato, n-tetradecil-N, N-dimetil-3-amonio-l- propansulfonato, r¡-hexadecil-N,N-dimetil-3~amonio-l~ propansulfonato, una sulfobetaína, 3- (1-piridíno) -1- propansulfonato, dimetil-2-hidroxietil-l-propansulfonato, 3- (1-metilpiperidinio) -1-propansulfonato, di etilbencilamonio- 1-propansulfonato, dimetiletilamonio-1-propansulfonato, n- dodecil-N,N-dimetilglicina, óxido de laurildi etilamina o combinaciones de los mismos. El agente zwitteriónico puede comprender una sulfobetaína. El agente zwitteriónico puede comprender un grupo sulfonato o un grupo carboxilo.

Breve descripción de las figuras La figura 1 demuestra que la adición de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, N-aimetil-3-amonio-l-propansulfonato) al diluyente de la placa de trabajo mejora la detección de PrPSc de cerebro ovino. La figura 2 demuestra que la adición de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) al diluyente en la placa de trabajo mejora la detección de BSE. La figura 3 demuestra la composición detergente diluyente en la placa de trabajo requerida para la detección mejorada de PrPSc. La figura 4 demuestra la sensibilidad a ELISA en una serie de diluciones de muestra.

La figura 5 muestra el efecto de ZWITTERGENT® 3-8 en el diluyente de placa 1 sobre un EIA de scrapie. La figura 6 muestra el efecto de ZWITTERGENT® 3-12 en el diluyente de placa 1 sobre un EIA de scrapie. La figura 7 muestra el efecto de ZWITTERGENT® 3-140 en diluyente de placa 1 sobre una muestra de EIA de scrapie. La figura 8 muestra el efecto de ZWITTERGENT® 3-14 en diluyente de placa 1 sobre una muestra de EIA de scrapie. La figura 9 muestra el efecto de ZWITTERGENT® 3-16 en el diluyente de placa 1 sobre una muestra de EIA de scrapie. La figura 10 muestra el efecto de EMPIGEN® OB en el diluyente de placa 1 sobre una muestra de EIA de scrapie. La figura 11 muestra el efecto de EMPIGEN® BB en el diluyente de placa 1 sobre una muestra de EIA de scrapie. La figura 12 muestra el efecto de NDSB-195 ' en diluyente de placa 1 sobre una muestra de EIA de scrapie. La figura 13 muestra el .efecto de NDSB-201 en diluyente de placa 1 sobre una muestra de EIA de scrapie. . La figura 14 muestra el efecto de NDSB-221 en diluyente de placa 1 sobre una muestra de EIA de scrapie. La figura 15 muestra el efecto de NDSB-256 en diluyente de placa 1 sobre una muestra de EIA de scrapie. La figura 16 muestra el efecto de ZWITTERGENT® 3-8 en el diluyente de placa 1 sobre un EIA de BSE.

La figura 17 muestra el efecto de ZWITTERGENT® 3-12 en el diluyente de placa 1 sobre un EIA de BSE. La figura 18 muestra el efecto de ZWITTERGENT® 3-10 en el diluyente de placa 1 sobre un EIA de BSE. La figura 19 muestra el efecto de ZWITTERGENT® 3-14 en el diluyente de placa 1 sobre un EIA de BSE. La figura 20 muestra el efecto de ZWITTERGENT® 3-16 en el diluyente de placa 1 sobre u EIA de BSE. La figura 21 muestra el efecto de EMPIGEN® OB en diluyente de placa 1 sobre un EIA de BSE. La figura 22 muestra el efecto de EMPIGEN® BB en diluyente de placa 1 sobre un EIA de BSE. La figura 23 muestra el efecto de NDSB-195 en diluyente de placa 1 sobre un EIA de BSE. La figura 24 muestra el efecto de NDSB-201 en diluyente de placa 1 sobre un EIA de BSE. La figura 25 muestra el efecto de NDSB-221 en diluyente de placa 1 sobre un EIA de BSE. La figura 26 muestra el efecto de NDSB-256 en diluyente de placa 1 sobre un EIA de BSE.

Descripción detallada de la invención Se ha descubierto recientemente que la unión selectiva de una forma anormal de agregación de una proteína puede lograrse al poner en contacto una muestra que contenga tanto formas anormales de agregación de una proteína como formas normales de no agregación de la proteína, bajo condiciones de unión selectiva, por un material poliiónico que tenga una avidez de unión para la forma anormal de agregación de la proteína. Véase WO 03/073106 A2 (La e et al . , "Binding of Pathological forms of Prion Proteins"), la cual se incorpora a manera de referencia en la presente en su totalidad. Las condiciones de unión pueden incluir un agente discriminador tal como laurilsarcosina. Entre las ventajas "de este método está el .hecho de que se elimina la etapa de proteólisis. Por lo tanto, anticuerpos u otras proteínas pueden añadirse a las condiciones de unión selectiva en cualquier momento. Los materiales poliiónicos, condiciones de unión selectiva, otras condiciones, otros materiales, métodos de ensayo y otros métodos descritos en WO 03/073106 se .pueden usar en los métodos actualmente descritos ' y se incorporan específicamente a manera de referencia en su totalidad en la presente. La presente invención proporciona una mejora a las composiciones y métodos descritos en WO 03/073106. La mejora comprende la adición de un agente cargado, tal como un agente detergente cargado, por ejemplo, un agente zwitteriónico a las condiciones de unión selectiva. Por ejemplo, tejido cerebral que comprenda una forma anormal de agregación de una proteína y una forma normal de no agregación de una proteína puede ponerse en contacto, bajo condiciones de unión selectiva, con un material poliiónico que tenga una avidez de unión para la forma de agregación anormal de la proteína, un agente zwitteriónico y un agente discriminador tal como laurilsarcosina. Unión selectiva significa que una forma anormal de agregación de una proteína se une a un material poliiónico que tiene una avidez de unión para la forma anormal de agregación de la proteína, mientras que lá forma anormal de no agregación de la proteína no se une sustancialmente al material poliiónico. Las condiciones de unión selectiva proporcionan condiciones bajo las cuales los materiales poliiónicos se unen a formas de proteínas anormales agregadas, por ejemplo, PrPSc, pero no se unen sustancialmente a la ' forma normal no agregada de la proteína, por ejemplo PrPc. Las condiciones • de unión selectiva proporcionan una unión que es lo suficientemente fuerte y selectiva como para ser útil en ensayos para la presencia de la forma anormal agregada de la proteína. Las condiciones de unión selectiva pueden determinarse por alguien capacitado en la técnica y pueden obtenerse mediante, por ejemplo, el ajuste adecuado de las condiciones de reacción, particularmente la presencia y concentración de un agente discriminador, un agente cargado tal como un -agente zwitteriónico, el pH y la detergencia.

Las condiciones de unión selectiva adecuadas se describen, por ejemplo, en WO 03/073106 y en los ejemplos abajo. En una modalidad de la invención las condiciones de unión selectiva comprenden un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 9, y más particularmente un pH de alrededor de 8.2 a aproximadamente 8.6. Avidez de unión significa la fuerza de unión general de una molécula con muchos sitios de unión con un agente de unión multivalente (por ejemplo, el material poliiónico) , lo cual contrasta con "afinidad", que es la fuerza de unión entre cada sitio de unión individual de la molécula y el agente de unión (por ejemplo, el material poliiónico) . Los materiales poliiónicos adecuados que tienen una avidez de unión por la forma anormal de agregación de la proteína se describen en WO 03/073106, la cual se incorpora a manera de referencia en la presente en su totalidad. Un material poliiónico puede ser resistente a proteasas. El material poliiónico puede ser un material polianiónico que tenga una multiplicidad de grupos aniónicos o un material policatiónico que tenga una multiplicidad de grupos catiónicos. Los grupos aniónicos pueden ser, por ejemplo, grupos sulfato, carboxilo o fosfato. Los grupos catiónicos pueden ser, por ejemplo, grupos amino, grupos imina o grupos de amonio cuaternario.

En una modalidad de la invención, un detergente es parte de las condiciones de unión selectiva y promueve la unión selectiva ya sea en virtud de la- detergencia o al actuar como un agente discri'minador .

Formas anormal de agregación y normal de no agregación de las proteínas Los métodos de la invención pueden detectar o unirse selectivamente a una forma anormal de agregación de una proteína en presencia de la forma normal de no agregación de la proteína. En particular, los métodos de la invención pueden detectar o unirse selectivamente a una forma anormal de agregación de una proteína en presencia de una forma normal de no agregación de la proteína, en donde las proteínas estén presentes en o se derivan de tejido cerebral. Los métodos de la invención comprenden poner en contacto, bajo condiciones de unión selectiva, una muestra, tal como tejido cerebral, que se sospeche comprenda la forma anormal de agregación y la forma normal de no agregación de la proteína, con un material poliiónico que tenga una avidez de unión para la forma de agregación anormal de la proteína, un agente zwitteriónico y un agente discriminador tal como laurilsarcosina . Un ejemplo de una proteína que tiene formas anormales de agregación y formas normales de no agregación es PrP. El único componente identificado del agente que causa encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs) es PrPSc, la cual es una isoforma de agregación anormal de la forma normal de no agregación de PrPc. Por lo tanto, en una modalidad de la invención, los métodos descritos pueden usarse -para detectar o unir selectivamente PrPsp en presencia de PrPc. Un ejemplo de formas anormales de agregación de proteínas son los agregados de proteínas anormales dominados por estructuras de lámina beta tales como beta-péptidos que forman depósitos amiloides en enfermedad de Alzheimer, proteína de alfa-sinucleína que produce depósitos tipo amiloide en cuerpos de Lewy de pacientes de Alzheimer y Parkinson, y el péptido ABri que forma depósitos amiloides en demencia británica familiar (FBD) . Las muestras de prueba pueden ser, por ejemplo, tejido cerebral de mamífero. En- una modalidad de la invención se usa el óbex. Los métodos de la invención pueden detectar o unirse selectivamente a TSEs en muestras sospechosas de comprender TSEs que causen scrapie, BSE, encefalopatía de visón transmisible, encefalopatía espongiforme felina, CWD, kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Gerstmann-Straussler, insomnio familiar fatal y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob variante (vCJD) .

Agentes detergentes cargados Un detergente cargado o agente tipo detergente puede agregarse a las condiciones de unión selectiva de los métodos de la invención para mejorar la sensibilidad y detección de una forma anormal de agregación de una proteína. Un detergente cargado o agente tipo detergente puede ser un detergente o agente tipo detergente aniónico, catiónico o zwitteriónico. Un agente zwitteriónico es una molécula que porta tanto una carga positiva- como una negativa. Cualquier agente zwitteriónico puede usarse en los métodos de la invención, por ejemplo, un agente zwitteriónico puede ser, por ejemplo, ZWITTERGENT® 3-08 (n-octil-N,N-dimetil-3-amonio- 1-propansulfonato) , ZWITTERGENT® 3-10 (n-decil-N, N-dimetil-3-amonio-1-propansulfonato) , ZWITTERGENT® 3-12 (ii~dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) , ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, -dimetil-3-amonio-l-propánsulfonato) , ZWITTERGENT® 3-16 (n-h'exadecil-N, N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) . En una modalidad de la invención el compuesto zwitteriónico es un detergente zwitteriónico.. Otros agentes zwitteriónicos son sulfobetaínas, incluyendo, por ejemplo, ' 3- (1-piridino) -1-propansulfonato, dimetil-2-hidroxietil-l-propansulfonato, 3- (1-metilpiperidinio) -1-propansulfonato, dimetilbencilamonio-1-propansulfonato, dimetiletilamonio-1-propansulfonato. Otros agentes zwitteriónicos incluyen n-dodecil-N,N-dimetilglicina, y óxido de laurildimetilamina. Véanse también los agentes zwitteriónicos listados en los ejemplos 2 y 3. Alrededor de 0.1% a aproximadamente 10% de un agente cargado, tal como un agente zwitteriónico, se añaden a la solución de abastecimiento de unión selectiva o al diluyente de la placa de trabajo. Por- lo tanto, alrededor de 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10, 15 ó 20% de un agente zwitteriónico está presente en una reacción de unión selectiva.

Agentes discri inadores Un agente discriminador es un agente que permite la unión selectiva de PrPSc a un material poliiónico, como el descrito arriba, y/o previene que PrPc se una al material poliiónico. El agente discriminador puede- tener una menor densidad de grupos aniónicos que el material poliiónico. El agente discriminador puede ser un detergente aniónico, una amida de aminoácido de un ácido graso, o laurilsarcosina. Un agente discriminador puede comprender alrededor de 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 ó 10% de las condiciones de unión selectiva.

Detección de las formas anormales de agregación' de una proteína Una vez que la forma anormal de agregación de la proteína se ha unido selectivamente al material poliiónico y opcionalmente después de que la forma normal de la proteína ha sido removida, la presencia o ausencia y/o cantidad de la forma anormal de agregación de la proteína pueden ser determinadas. Véase por ejemplo WO 03/073106. Se puede usar cualquier tipo de ensayo para detectar la forma anormal unida selectivamente de la proteína. Por ejemplo, pueden usarse un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) , western blot, ensayo de anticuerpos fluorescentes directo (IFA) , radioinmunoensayo (RÍA) , hemaglutinación (HA) e inmunoensayo de polarización por fluorescencia (FPIA) . Cualquier anticuerpo específico para PrP se puede usar en estos ensayos. Varios de estos anticuerpos se conocen en la técnica. En algunos casos, un desnaturalizante, tal como tiocianato de guanidina (GuSCN) , se usa para exponer epítopes de PrP antes o durante la adición de un anticuerpo específico para PrP al ensayo. El material poliiónico puede ser inmovilizado en un material de soporte sólido ya sea antes o después de haber sido puesto en contacto con una muestra. La separación de la muestra del material de soporte sólido se puede usar entonces para remover la forma normal de no agregación de la proteína del ensayo, dejando únicamente la forma anormal agregada de la proteína. Los materiales de soporte sólidos se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, placas de microtitulación, varillas de inmersión, dispositivos de flujo laminar, microesferas y microesferas superparamagnéticas . Biotina u otros marcadores pueden conjugarse al material poliónico mediante métodos bien conocidos en la técnica. La biotina es una porción marcadora de unión que se puede usar para unir el material poliónico a un material de soporte sólido derivado con avidina o un material con propiedades de unión a avidina tal como estreptavidina, Neutravidina o Captavidina. Otras moléculas pueden usarse como porciones marcadoras . de unión e incluyen aquellas que son fácilmente conjugadas a un material poliiónico y que pueden ser capturadas o unidas por un agente de captura adecuado, tal como dinitrofenol de fluoresceína DNP, digoxigenina, ácido nucleico o secuencias análogas de ácido nucleico, y (His) 6. Puede usarse un agente de captura que se una selectivamente al propio material poliiónico en lugar de a través de una porción marcadora. Por ejemplo, los poliglucósidos pueden unirse por medio de una lectina adecuada o por medio de un anticuerpo adecuado. La forma anormal de agregación capturada de la proteína puede ser, si es necesario, eluida del material poliiónico antes del' ensayo. Dodeciisulfato de sodio (SDS) es adecuado para este propósito y se usa de preferencia a una concentración de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1% en peso, de preferencia más de alrededor de 0.75%. La invención descrita en forma ilustrativa en la presente puede llevarse a la práctica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se describan específicamente en la presente. Así, por ejemplo, en cada caso en la presente cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" pueden ser reemplazados con cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones que han sido empleados se usan como términos de descripción y no de limitación, y no existe la intención de que en el uso de estos términos y expresiones se excluya de cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, sino que se reconoce que varias modificaciones son posibles dentro del alcance de la -invención reclamada. De esta manera, se debe entender que aunque la presente invención ha sido descrita específicamente por modalidades preferidas, características, modificaciones y variaciones opcionales de los conceptos de la presente descritos pueden hacerse por aquellos expertos en la técnica, y que estas modificaciones y variaciones se consideran como estando dentro del alcance de esta invención definido por la descripción en las reivindicaciones anexas. Además, cuando características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos de Markush u otro agrupamiento de alternativas, los expertos en la técnica reconocerán que la invención también se describe por lo tanto en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush u otro grupo. Lo siguiente se proporciona por motivos de ejemplificación únicamente y no está destinado a limitar el alcance de la invención descrito arriba en términos amplios. Todas las referencias citadas en esta descripción se incorporan en la presente a manera de referencia.

Ejemplos Ejemplo 1 Se tomaron muestras de cerebro (ovino o bovino) de animales negativos o TSE-positivos conocidos y se homogeneizaron para preparar Usados de 10-20% en agua.

Antes de aplicar el homogenado a una placa de ensayo de ELISA, la muestra se diluyó en un diluyente de placa de trabajo, el cual está compuesto del componente diluyente de placa 1 y componente diluyente de placa 2. El componente diluyente de laca 1 contiene TrisHCl 250 mM, pH 8.3, 5% de albúmina de suero bovino, 5% de laurilsarcosina y 5% de TRITÓN® X-100. El componente diluyente de placa 2 (1 mg/ml de DNAsa I y 2.5 mg/ml de tripsina) se mezcló cuidadosamente con el componente 1, y 25 µl del diluyente de placa de trabajo final se mezclaron con 100 µl de un homogenado dé cerebro para preparar la muestra para el ensayo. Se llevaron a cabo ensayos ELISA usando placas de captura de antígenos que estaban recubiertas con un polímero poliiónico cargado. Véase WO 03/073106. Cien microlitros de mezcla de homogenado de cerebro-diluyente de placa de trabajo se aplicaron a cada pocilio y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente sin agitación. Después de dos horas, los usados ' se aspiraron de las placas, y las placas se lavaron 6 veces con solución de lavado IX. El último lavado fue aspirado, secado sobre una almohadilla absorbente y 100 µl de regulador de pH de acondicionamiento que contenía tiocianato de guanidina 4M se añadieron a los pocilios. Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, las placas fueron aspiradas y lavadas tres veces con solución de lavado IX. Para detectar PrPSc unida, las placas se incubaron con 100 µl de solución de anticuerpo anti-PrP conjugado a HRPO durante una hora a temperatura ambiente. Después de la aspiración de la solución de anticuerpos de detección, las placas se lavaron 5 veces con solución de lavado IX. Las placas después se secaron sobre una almohadilla absorbente, 100 µl de substrato TMB se añadieron, y las placas se incubaron durante 15 minutos para permitir el desarrollo de color. El ensayo se detuvo entonces con una solución de detención de HCl y la absorbancia de los micropocillos .se leyó a 450 nm y 650 nm (para compensación de fondo) . Para determinar si la adición de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, -dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) al diluyente de placa de trabajo podría mejorar el rendimiento del ensayo TSE, 5% o 0.5% de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil- N,N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) se añadieron a la formulación para el componente diluyente de placa de trabajo 1. Se llevaron a cabo ensayos usando homogenado de cerebro de borrego normal, o cerebro de borrego con scrapie, el cual se diluyó en homogenado de cerebro normal a relaciones ya sea de 1:25 ó 1:100; el protocolo de ensayo ELISA usado fue aquél descrito arriba. Los resultados se muestran . en la figura 1. En la figura 1, control se refiere a muestras que fueron tratadas usando un diluyente de placa de trabajo formulado con TRITÓN® X-100 (alcohol alquilarilpolietérico) y laurilsarcosina; 0.1% o 1% de Zwitt 3-14 se refiere a formulaciones en las que ya sea 0.5% o 5% de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) (respectivamente) ' fueron añadidos junto con TRITÓN® X-10 (alcohol alquilarilpolietérico) y laurilsarcosina al diluyente de placa de trabajo. La figura 1 muestra que la adición de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, -dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) al diluyente de placa de trabajo no afecta la señal observada con muestras de cerebro normales, pero con muestras de cerebro con scrapie, la señal observada casi se duplicó cuando ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, N-dimetil-3-amonio- 1-propansulfonato) se usó a 5% como un complemento para el diluyente de placa de trabajo. Estos datos sugieren que la presencia de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, -dimetil-3- amonio-1-propansulfonato) a concentraciones de más de 0.5% en el diluyente de la placa de trabajo aumentan la señal específica de PrPSc capturada de homogenados de cerebro ovino usando placas recubiertas con un polímero poliiónico cargado. La figura 2 ilustra que ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, -dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) es igualmente efectivo para incrementar la detección de PrPSc derivada de cerebros de bovinos afectados por BSE. Para el experimento mostrado en la figura 2, ya sea 5% o 0.1% de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, N-dimetil-3-amonio~l-propansulfonato) fueron añadidos a la formulación para el componente diluyente de placa de trabajo 1. Se llevaron a cabo ensayos usando varios homogenados de cerebro con BSE (n = 24); el protocolo de ensayo usado es el descrito arriba. En la figura 2, no Zwitt se refiere a muestras que fueron tratadas usando un diluyente de placa de trabajo formulado con TRITÓN® X-100 (alcohol alquilarilpolietérico) y laurilsarcosina; 0.1% o 5% se refiere a concentraciones de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, -dimetil-3-amonio~l- propansulfonato) añadido junto con TRITÓN® X-100 (alcohol alquilarilpolietérico) y laurilsarcosina al diluyente de placa de trabajo. Como se observa con las muestras de cerebro ovino, ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, N-dimetil-3- amonio-1-propansulfonato) fue efectivo para incrementar la señal capturada usando placas recubiertas • con polímero poliiónico en todas menos cuatro muestras de BSE (cuya OD50- 650 se acercó al límite del ensayo) . Los experimentos resumidos en la figura 3 investigan las condiciones que se requieren para la detección mejorada de PrPSc en ensayos ELISA. En estos ejemplos, componente diluyente de placa 1 se preparó usando TrisHCl 250 mM, pH 8.3 y 5% de albúmina de suero bovino junto con las siguientes composiciones: a) 5% de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) y 5% de laurilsarcosina, b) 5% de . ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) solo, o c) 5% de laurilsarcosina y 5% de TRITÓN® X-100 (alcohol alquilarilpolietérico) . En este estudio, homogenados de cerebro de BSE se probaron usando estas formulaciones de componente diluyente de placa 1 en el ensayo ELISA descrito arriba. Por lo tanto, en este experimento, un diluyente de placa de trabajo efectivo requiere tanto de laurilsarcosina como de agente zwitteriónico para mostrar sensibilidad de ensayo mejorada.

Los datos de la figura 3 muestran claramente que usar un detergente zwitteriónico tal como ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, -dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) solo en el diluyente de placa de trabajo es inefectivo. El reemplazo de TRITÓN® X-100 (alcohol alquilarilpolietérico) con ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, -dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) en presencia de laurilsarcosina, por otro lado, da como resultado una mayor sensibilidad de ensayo que TRITÓN® X-100 (alcohol alquilarilpolietérico) y laurilsarcosina, con muchas- de las muestras duplicando su OD5o-65o- con este tratamiento. Para determinar cómo la adición de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, -imetil-3-amonio-l-propansulfonato) al diluyente de placa de trabajo influencia la sensibilidad de un ensayo de ELISA de BSE, una serie de diluciones de homogenado de cerebro con BSE en homogenados de cerebro bovino normal se prepararon y se probaron con el diluyente de placa de trabajo. En la figura 4, la curva #1 representa una corrida de dilución de muestra con el diluyente de placa de trabajo formulado con regulador de pH Tris, albúmina de suero bovino, 5% de TRITÓN® X-100 (alcohol alquilarilpolietérico) y 5% de laurilsarcosina. La curva #2 representa la corrida de dilución de muestra con diluyente de placa de trabajo en el cual TRITÓN® X-100 (alcohol alquilarilpolietérico) fue sustituido por 5% de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N,N- dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) . Los datos ilustran que sustituir ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, -dimetil-3- amonio-1-propansulfonato) en el diluyente ?e placa de trabajo da como resultado casi una unidad logarítmica de incremento en la sensibilidad. Para el diluyente TRITÓN® X-100 (alcohol alquilarilpolietérico) , la última dilución detectada sobre el límite de ensayo fue 1:288, mientras que para la formulación de ZWITTERGENT® 3-14 (n-tetradecil-N, N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato) , la última dilución detectada sobre el límite estuvo entre 1:576 y 1:1152.

Ejemplo 2 Evaluación de diferentes detergentes zwitteriónicos en diluyente de placa La adición de detergentes zwitteriónicos a Diluyente de Placa de EIA de TSE se investigó para verificar la capacidad para incrementar la habilidad para detectar PrPSc en homogenado de cerebro en comparación con el detergente no iónico TRITÓN® X-100. La solución base de diluyente de placa 1 comprende, Base TRIZMA® (pH 8.3), detergente de N-lauroilsarcosina, solución de albúmina de suero bovino y agua desionizada. Los detergentes zwitteriónicos usados en el experimento incluyen: • ZWITTERGENT® 3-8 (Zwitt 3-8): 3- (N,N-dimetilocil-amonio) propansulfonato • ZWITTERGENT® 3-10 (Zwitt 3-10) : 3- (Decildimetilamonio) propansulfonato • ZWITTERGENT® - 3-12 (Zwitt 3-12) : 3- (dodecildimetilamonio) propansulfonato • ZWITTERGENT® 3-14 (Zwitt 3-14): 3-(N,N- dimetilmiristilamonio) propansulfonato • ZWITTERGENT® 3-16 (Zwitt 3-16): 3-(N,N- dimetilpalm.itilamonio) propansulfonato • EMPIGEN® BB: n-dodecil-N, -dimetilglicina • EMPIGEN® OB: óxido de laurildimetila ina • NDSB 195: dimetiletilamonio-1-propansulfonato • NDSB 201: 3- (1-piridino) -1-propansulfonato • NDSB 221: 3- (1-metilpiperidio) -1-propansulfonato ß NDSB 256: dimetilbencilamonio-1-propansulfonato El control fue un aditivo detergente no iónico: Tritón X-100: alcohol alquilarilpolietérico.

Ensayo TSE - EIA Componentes de equipo de prueba BSE EIA aprobados Homogenado de cerebro de borrego normal (20% p/v) Homogenado de cerebro con scrapie diluido en homogenado de cerebro de borrego normal @ 1:1500 Homogenado de cerebro con scrapie diluido en homogenado de cerebro de borrego normal @ 1:300 Homogenado de cerebro con scrapie diluido en homogenado de cerebro de borrego normal @ 1:40 Once detergentes zwitteriónicos se añadieron a una solución base de diluyente de placa 1 a concentraciones de 0.1%, 1.0% y 10%. Un detergente no iónico de control (TRITÓN® X-100) también se añadió a la base de diluyente de placa a 5%, la cantidad previamente determinada como la concentración óptima para este detergente. Cada formulación de diluyente de placa 1 se mezcló con el diluyente de placa 2 estándar (2.5 mg/mL de Tripsina; 1 mg/mL de Dnasa 1; 250 mM de Tris HCl (pH 8.3) (concentración final en diluyente de placa de trabajo)) y luego se añadió a las muestras de homogenado de cerebro al 20% (100 ul de homogenado de cerebro a 25 ul de diluyente de placa de trabajo) . La mezcla muestra/diluyente se añadió a una placa de microtitulación de captura poliiónica. Se llevaron a cabo ensayos de acuerdo con protocolo de ensayo BSE estándar usando cuatro muestras como indicadores: homogenado de cerebro ovino normal y homogenado de cerebro ovino con scrapie que fue diluido en homogenado de cerebro de borrego normal a diluciones de 1:1500, 1:300 y 1:40 veces. Se usó un protocolo de ensayo EIA de BSE estándar. La muestra se mezcló con el diluyente de trabajo evitando cualquier burbuja. La muestra diluida se añadió a la microplaca de captura poliiónica junto con los controles. La placa se cubrió e incubó durante 2-3 horas. Las placas se lavaron seis veces con solución de lavado IX 1 (2.2 g/L de fosfato de sodio monobásico, anhidro; 11.9 g/L de fosfato de sodio dibásico, anhidro; 85 g/L de cloruro de sodio; 10 g/L de N-lauroilsarcosina; agua desionizada) . Se añade un regulador de pH de acondicionamiento y las placas se cubren y se incuban durante 10 minutos. Las placas se lavan 3 veces con solución -de lavado IX 2 (2.2 g/L de fosfato de sodio monobásico, anhidro; 11.9 g/L de fosfato de sodio dibásico, anhidro; 85 g/L de -cloruro de sodio; 10 mL/L de TWEEN® 20; agua desionizada) . Conjugado (diluyente conjugado: 17.55 g/L de cloruro de sodio; 0.22 g/L de fosfato de sodio monobásico, anhidro; 1.19 g/L de fosfato de sodio dibásico, anhidro; 0.5 mL/L de Igepal CA-720; 2 mL/L de EDTA 500 mM; 0.1% de albúmina de suero bovino; 3 mL/L de colorante azul; agua desionizada. Existencia de concentrado conjugado: 12F10: conjugado HRPO (concentración de trabajo final: 0.1 -1 ug/ml) ; estabilizador del conjugado Stabilzy e) se añade a la placa. La placa se cubre y se incuba durante 15 minutos. La reacción se detiene con solución de HCl. La placa se lee a 450 nm (longitud de onda de referencia AKEF = 620-650 nm) . El límite es NC medio + 0.120. Para interpretación: si las muestras A450-AREF son menores que el límite el resultado es negativo. Si las muestras A45O- REF son mayores que o iguales al límite el resultado es inicialmente reactivo (prueba adicional duplicada) . Si la media de la prueba adicional duplicada 45O- REF es mayor o igual al límite, la muestra es positiva. Las figuras 1-11 demuestran que en todos los casos, la adición de un detergente zwitteriónico al componente diluyente de placa 1 a una o más concentraciones duplicó la señal positiva en las tres muestras de scrapie sin un incremento marcado en señal para la muestra negativa. En el caso de los ZWITTERGENTS® (3-8, 3-12, 3-10, 3-14 y 3-16, figuras 5-9) y los NDSB' s (195, 201, 221 y 256, figuras 12- 15) , la señal fue casi duplicada en todos los casos no obstante la concentración de detergente usada. En el caso de los dos detergentes EMPIGEN® (EMPIGEN® OB y EMPIGEN® BB, figuras 10 y 11) , los resultados óptimos se obtuvieron a la concentración de detergente más baja (0.1%). A concentraciones de EMPIGEN® de 1% y 10%, la señal de scrapie positiva declinó en relación a la concentración de 0.1%. Las concentraciones de detergente EMPIGEN® de 10% fueron las más bajas con una señal de scrapie casi equivalente o ligeramente más baja que la formulación del diluyente de placa de control 1. La tabla 1 ilustra los valores de densidad óptica reales (OD) para probar muestras ovinas de scrapie y normales con las diferentes formulaciones de diluyente de placa. Los valores OD del detergente de prueba en relación al valor OD del detergente de control para las pruebas de la muestra de scrapie 1:300 se listan como un ejemplo de la señal incrementada obtenida para los diferentes detergentes zwitteriónicos evaluados en este estudio. Con sólo pocas excepciones, los detergentes zwitteriónicos "resultan en un incremento de 2 a 2.8 veces en la densidad óptica para una muestra positiva sin incrementar la señal en muestras negativas.

Tabla 1 Los once detergentes zwitteriónicos evaluados en el diluyente de placa 1 del TSE-EIA a una concentración de entre 0.1 - 10% incrementaron la señal específica de PrPSc en al menos 2 veces en comparación con la formulación diluyente de placa TRITÓN® X-100 no iónica. Estos datos demuestran que una variedad de detergentes zwitteriónicos pueden sustituirse en la formulación diluyente de placa 1 de TSE y dar como resultado una • unión selectiva incrementada de PrPSc por el material de captura poliiónico.

Ejemplo 3 Se repitió la metodología del ejemplo 2 usando muestras de BSE. Los resultados se muestran en la tabla 2 y figuras 16-16.

Tabla 2 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la - presente descripción de la invención.

Claims (9)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para la unión selectiva de una forma anormal de agregación de una proteína en presencia de una forma normal de no agregación de la proteína, caracterizado porque comprende poner en contacto, bajo ccndiciones de unión selectiva, tejido cerebral sospechoso de comprender la forma anormal de agregación y la forma normal de no agregación de la proteína, con un material poliiónico que tenga una avidez de unión para la forma de agregación anormal de la proteína, un agente zwitteriónico. y un agente discriminador, en donde la forma anormal - de agregación de la proteína se une selectivamente al material poliiónico.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el material poliiónico es resistente a proteasas .

3. El método de conformidad con la reivindicación -1, caracterizado porque el material poliiónico es un material polianiónico que tiene una multiplicidad de grupos aniónicos o un material policatiónico que tiene una multiplicidad de grupos catiónicos. . El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el material poliiónico tiene una multiplicidad de grupos aniónicos que son grupos sulfato, carboxilo o fosfato, o una multiplicidad de grupos catiónicos que son grupos amino, grupos imina o grupos de amonio cuaternario. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el agente discriminador tiene una menor densidad de grupos aniónicos que el material poliiónico. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente discriminador es un detergente aniónico. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue el agente discriminador es una amida de aminoácido de un ácido graso. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente discriminador es laurilsarcosina . 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la forma anormal agregada de la proteína que se une selectivamente al material poliiónico es capturada con un agente de captura inmovilizado. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el agente de captura es un anticuerpo específico para la forma anormal agregada de la 'proteína. 11. El método de 'conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque el material poliiónico que se une selectivamente a la forma anormal agregada de la proteína es capturado con un agente de captura inmovilizado. 12. El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque el agente de captura es una lectina o un anticuerpo. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las condiciones de unión selectiva comprenden un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 9. 1

4. El método de conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque las condiciones de unión selectiva comprenden un pH de alrededor de 8.2 a aproximadamente 8.6. 1

5. El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque el material poliiónico comprende una porción marcadora que puede unirse selectivamente, y el agente de captura se une selectivamente a la porción marcadora. 1

6. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la forma anormal agregada de la proteína comprende una porción marcadora que se puede unir selectivamente, y el agente de captura se une selectivamente a la porción marcadora. 1

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el material poliiónico es inmovilizado en un material de soporte sólido antes de hacer contacto con el tejido cerebral. 1

8. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el material de soporte sólido tiene al material poliiónico recubierto sobre el mismo. 1

9. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el material poliiónico comprende, una porción marcadora que puede unirse selectivamente y es inmovilizada al material de soporte sólido por medio de la porción marcadora. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la porción marcadora que puede unirse es biotina, fluoresceína, dinitrofenol, digoxirrenina, un ácido nucleico o secuencia análoga de ácido nucleico o (His) 6. 21. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la porción marcadora que puede unirse es biotina, fluoresceína, dinitrofenol, digoxirrenina, un ácido nucleico o secuencia análoga de ácido nucleico o (His) 6. 22. Ei método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el material poliiónico es un sólido que proporciona una superficie que tiene la avidez de unión. 23. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente zwitteriónico comprende un detergente zwitteriónico. 24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente zwitteriónico se selecciona de un grupo que consiste esencialmente en 3- (N,N-dimetilocil- amonio) propansulfonato, • 3- (decildimetilamonio) propansulfonato, 3- (dodecildimetilamonio) propansulfonato, 3-(N,N- dimetilmiristilamonio) propansulfonato, 3- (N,N-dimetilpalmitilamonio) propansulfonato, p-octil-N,N-dimetil-3- amonio-1-propansulfonato, O-decil-N,N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato, n-dodecil-N, -dimetil-3-amonio-l-propansulfonato, n-tetradecil-N, -dimetil-3-amonio-l-propansulfonato, n~hexadecil-N,N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato, una sulfobetaína, 3- (1-piridino) -1-propansulfonato, dimetil-2-hidroxietil-l-propansulfonato, 3- (1-metilpiperidinio) -1-propansulfonato, dimetilbencilamonio- 1-propansulfonato, dimetiletilamonio-1-propansulfonato, n-dodecil-N,N-dimetilglicina, óxido de laurildimetilamina, y combinaciones de los mismos. 25. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente zwitteriónico comprende una sulfobetaína. 26. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente zwitteriónico comprende un grupo sulfonato o un grupo carboxilo. 27. Un método para determinar la presencia o ausencia de una forma • de agregación anormal de una proteína en una muestra de tejido cerebral en presencia de la forma normal de no agregación de la proteína, caracterizado porque comprende poner en contacto, bajo condiciones de unión selectiva, tejido cerebral sospechoso de comprender la forma anormal de agregación de la proteína y la forma normal de no agregación de la proteína con un material poliiónico que tenga una avidez de unión para la forma de agregación anormal de la proteína, un agente discriminador y un agente zwitteriónico; y determinar la presencia o ausencia de la forma de agregación anormal de la proteína unida al material poliiónico. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque se determina una cantidad de la forma de agregación anormal de una proteína. 29. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la determinación de la presencia o ausencia de la forma de agregación anormal de la proteína unida al material poliiónico se hace cualitativamente o cuantitativamente al llevar a cabo un inmunoensayo para la forma de agregación de la proteína. 30. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la forma agregada anormal de la proteína es PrPSc, y la forma normal no agregada de la proteína es PrPc. 31. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la forma agregada anormal de la proteína es PrPSc, y la forma normal no agregada de la proteína es PrPc. 32. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el agente zwitteriónico comprende un detergente zwitteriónico. 33. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el agente zwitteriónico se selecciona de un grupo que consiste esencialmente en 3-(N,N-dimetilocil-amonio) propansulfonato, 3- (decildimetilamonio) propansulfonato, 3- (dodecildimetilamonio) propansulfonato, 3-(N,N~ dimetilmiristilamonio) propansulfonato, 3- (N,N-dimetilpalmitilamonio) ropansulfonato, p-octil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propansulfonato, n-decil-N,N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato, r¡~dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato, n-tetradecil-N, -dimetil-3-amonio-l-propansulfonato, 22-hexadecil-N,N-?imetil-3-amonio-l-propansulfonato, una sulfobetaína, 3- (1-piridino) -1-propansulfonato, dimetil-2-hidroxietil-l-propansulfonato, 3-(1-metilpiperidinio) -1-propansulfonato, dimetilbencilamonio-1-propansulfonato, dimetiletilamonio-1-propansulfonato, n-dodecil-N,N-dimetilglicina, óxido de laurildimetilamina, y combinaciones de los mismos. 34. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente zwitteriónico comprende una sulfobetaína. 35. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente zwitteriónico comprende un grupo sulfonato o un grupo -carboxilo.