DE69836317T2

DE69836317T2 - Verfahren zur Durchmusterung von Substanzen mit therapeutischer Wirkung bei der Behandlung von subakuten, übertragbaren, spongiformen Encephalopathien

Info

Publication number: DE69836317T2
Application number: DE69836317T
Authority: DE
Inventors: Jean-Philippe Deslys; Vincent Beringue; Corinne Lasmezas
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1997-01-14
Filing date: 1998-01-14
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2018-01-15
Also published as: US6806077B1; FR2758337B1; EP0958501B1; DE69836317D1; JP3868004B2; FR2758337A1; JP2001508541A; WO1998030909A1; EP0958501A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Durchmusterung von Substanzen, von denen angenommen wird, dass sie eine therapeutische Wirkung bei der Behandlung von subakuten, spongiformen, übertragbaren Encephalopathien [encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissible (ESST)] oder Krankheiten, die durch Prionen verursacht werden, haben, wobei das Verfahren eine Stufe der Isolierung des PrPres aus der Milz umfasst; die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zur Isolierung des PrPres, die insbesondere an das Verfahren zur Durchmusterung angepasst sind, sowie auf ihre Anwendungen, insbesondere bei der Detektion des PrPres.
Die subakuten, spongiformen, übertragbaren Encephalopathien werden durch nicht konventionelle übertragbare Agenzien [agents transmissibles non conventionnels (ANTC)], die auch Prionen genannt werden, deren genaue Natur bis heute unbekannt bleibt, hervorgerufen. Die ESST umfassen im Wesentlichen die Creutzfeld-Jakob-Krankheit bei Menschen (MCJ für maladie de Creutzfeld-Jakob oder CJD für Creutzfeld-Jakob disease), die enzootische Zitterkrankheit beim Schaf und der Ziege und die spongiforme Rinderencephalopathie (ESB für encéphalopathie spongiforme bovine oder BSE für bovine spongiform encephalopathy) bei Rindern; andere Encephalopathien wurden beim Nerz oder bestimmten wilden Tieren wie dem Hirsch und dem Elch bewiesen.
Diese Krankheiten sind in der Entwicklung immer fatal und bis heute existiert keine wirksame Behandlung.
In den subakuten, spongiformen, übertragbaren Encephalopathien existiert eine Akkumulation eines Proteins des Wirts, des PrP (oder Protein des Prions), in anormaler Form (PrPres) hauptsächlich im zentralen Nervensystem. Das PrPres reinigt sich mit der Infektiosität auf und seine Akkumulation schreitet mit dem Auftreten histologischer Läsionen fort. In vitro ist es für Neuronenkulturen toxisch.
Zwei biochemische Eigenschaften erlauben es, PrPres von normalen PrP zu unterscheiden: PrPres ist gegenüber Proteasen partiell resistent und ist in nicht-ionischen Detergenzien wie zum Beispiel Triton-X100 unlöslich.
Der Artikel von D. McKenzie et al., Journal of Virology, 68, 11, 1994, 7534-7536, bezieht sich auf die Untersuchung der Wirkung von Amphotericin B auf die subakuten, spongiformen, übertragbaren Encephalopathien (ESST). Die Wirkung von Amphotericin B auf das Gehirn von Hamstern wird untersucht, die 4, 5, 6, 8 und 10 Wochen nach der Infektion getötet wurden.
Das Patent US 5,276,059 untersucht die Wirkung von Kongorot auf die Akkumulation von PrPres, wobei als Modell Mäuse verwendet wurden, die mit der enzootischen Zitterkrankheit infiziert waren. Die Milz der Mäuse wurde mehreren sukzessiven und wiederholten Ultraschall-Verdau- und Zentrifugations-Behandlungen unterzogen.
Die Suche nach neuen Molekülen, von denen angenommen wird, dass sie in der Behandlung dieser Encephalopathien wirksam sind, stößt auf das Fehlen sowohl von leistungsfähigen Invitro-Modellen wie auch die Länge der experimentellen Modelle in vivo, wie zum Beispiel das experimentell enzootische Zittern des Hamsters (80 bis 365 Tage) oder das experimentell enzootische Zittern der Maus (180 bis 550 Tage).
Als Folge setzten sich die Erfinder das Ziel, ein wirksames und zuverlässiges Verfahren zur Durchmusterung bereitzustellen, das die Unzulänglichkeiten der experimentellen Modelle, die derzeit verwendet werden, nicht aufweist und das besser auf die Erfordernisse der Praxis reagiert, insbesondere dahingehend, dass die Evaluierung der Wirkung der zu testenden Substanzen in weniger als zwei Monaten verwirklicht werden kann.
Dazu haben die Erfinder einen zuverlässigen Marker gefunden und ein reproduzierbares Protokoll veröffentlicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Durchmusterung von Substanzen, von denen angenommen wird, dass sie eine therapeutische Wirkung bei der Behandlung von subakuten, spongiformen, übertragbaren Encephalopathien (ESST oder Krankheiten, die durch Prionen verursacht werden) haben, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst:

a) Inokulation zum Zeitpunkt t_A wenigstens eines Labortiers, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Nagern (vorzugsweise mehreren, in Gruppen aufgeteilten), auf jedem geeigneten Weg mit einem übertragbaren nicht herkömmlichen Agens (ATNC) oder einem Prion;
b) Verabreichung an das Labortier auf jedem geeigneten Weg einer zu durchmusternden Substanz (Tiertest) oder eines Placebos (negative Tierkontrollle) in einem Zeitraum zwischen t_A – 15 Tagen und t_C, das dem Zeitpunkt entspricht, an dem der Wert für PrPres in der Milz des Labortiers maximal ist, oder in einem Zeitraum zwischen t_B, das dem Zeitpunkt der ersten Detektion von PrPres in der Milz des Labortiers entspricht, und t_C; wobei t_B zwischen t_A und t_A + 15 liegt und t_C zwischen t_A + 20 und t_A + 30, vorzugsweise zwischen t_A + 25 und t_A + 30 liegt;
c) Töten der Tiere in einem Zeitraum zwischen t_B und t_C, vorzugsweise zum Zeitpunkt t_C, und Entnahme der Milz, wobei t_A, t_B und t_C in Tagen ausgedrückt werden;
d) Isolierung des PrPres aus jeder entnommenen Milz nach dem Verfahren zur Isolierung, wie es nachfolgend definiert ist, das eine Homogenisierung der Milz, gefolgt von einer spezifischen Extraktion des PrPres, die eine einzelne Trennungsstufe umfasst, ausgehend von dem erhaltenen Homogenat, und gegebenenfalls Reinigung des PrPres;
e) halbquantitative Bestimmung des PrPres, das in der Stufe (d) erhalten wurde, durch Detektion des PrPres durch jedes geeignete Verfahren, das ein spezifisches Signal liefert, gefolgt von einem Vergleich des erhaltenen Signals mit einer Standardskala von Verdünnungen einer positiven Kontrolle, die aus einem Gehirnhomogenisat eines Tiers im Endstadium der Krankheit besteht; und
f) Auswahl der durchgemusterten Substanz als Kandidat zur Behandlung von subakuten, spongiformen, übertragbaren Encephalopathien, wenn der Wert für PrPres, der in der Milz des Testtiers in der Stufe e) erhalten wurde, um wenigstens einen Faktor 2 im Vergleich zu dem Wert verringert ist, der unter denselben Bedingungen mit dem Tier als negative Kontrolle erhalten wurde.

Die Zeiten t_A, t_B und t_C werden in Tagen ausgedrückt; t_A = J0, (J = Tag).
In der Tat haben die Erfinder in unerwarteter Weise gefunden, dass die Substanzen, die das Überleben von infizierten Tieren erhöhen, wie auch immer der Inokulationsweg ist (peripher oder intrazerebral), auch eine Verzögerung in der Akkumulation des PrPres auf dem Niveau der Milz mit sich ziehen, was unter standardisierten Bedingungen detektiert wird.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter standardisierten Bedingungen Bedingungen, bei denen die folgenden Parameter ausgewählt sind:

– selektioniertes ATNC,
– Verabreichungsweg des ATNC,
– Isolierungsverfahren des PrPres aus der Milz.

Für einen ausgewählten Stamm in einem gegebenen Tier ist der Infektionstiter im Endstadium der Krankheit konstant.
Die Detektion des PrPres in der Milz erlaubt es, die Wirkungen der zu testenden Moleküle viel schneller zu beobachten, insbesondere die Inhibierung der Akkumulation des PrPres, entweder in den Stunden, die auf die Inokulation folgen (Aufnahme des Inoculums durch die Milz und Detektion eines Peaks von PrPres zwischen t_A und t_A + 1-2 Tage) oder zwischen 5 und 15 Tagen nach der Infektion; t_B entspricht auch der Detektion des Peaks zum Zeitpunkt der Aufnahme bzw. des Fangens des Inoculums sowie der Detektion des neu synthetisierten PrPres; dies ist der Grund, warum t_B zwischen t_A und t_A + 15 liegt; diese Werte für t_B und t_C können in der oben definierten Spanne variieren, und zwar in Funktion des ATNC und des Labortiers (Maus), die aus gewählt wurden; wenn zum Beispiel ATNC dem murinen Stamm C506M3 entspricht, der auf intraperitonealem Weg der Maus C57BL/6 inokuliert wurde, kann das neu synthetisierte PrPres in 100 der Fälle ab dem 5. Tag nach Infektion (post-infection = p.i.) (t_B) detektiert werden und ab dem 30. Tag p.i. (t_C) wird ein Plateau beobachtet.
Eine derartige Methode erlaubt es demnach, Moleküle zu selektionieren, die fähig sind, die Akkumulation von PrPres zu verhindern; von derartigen Molekülen wird angenommen, dass sie eine therapeutische Wirkung in der Behandlung der ESST zeigen können.
Erfindungsgemäß gilt:

• für die Stufe a)
– ATNC entspricht einem Stamm, der bei dem Wirtstier stabilisiert wurde, d.h. der nach mehreren Passagen stabile Merkmale bei dem Wirtstier zeigt und insbesondere die folgenden Merkmale zeigt: Verzögerung des Auftretens der identischen Krankheit und eines identischen Läsionsprofils im Verlauf der Passagen bei allen Tieren (Vakuolisierungsgrad unterschiedlicher Teile des Gehirns); es entspricht einem beliebigen derartigen Stamm, der unter den vorgenannten Bedingungen stabilisiert ist, der eine vorzeitige Akkumulation von PrPres in der Milz des Wirtstieres induziert, insbesondere die Stämme der enzootischen Zitterkrankheit oder Stämme der Rinderencephalopathie, insbesondere die Stämme der enzootischen Zitterkrankheit, die Chandler, ME7, 139A (M. E. Bruce et al., Scrapie strain variation and its implication in Current topics in Microbiology and Immunology: Transmissible Spongiform Encephalopathies, Scrapie, BSE and related Disorders, 1991, 172, 125-138), C506M3 (C. I. Lasmézas et al., J. Gen. Virol., 1996, 77, 1601-1609) oder 263K (R. H. Kimberlin et al., J. Gen. Virol., 1977, 34, 295-304 und 1978, 39, 487-496) genannt werden oder die Stämme von BSE, die 4PB1 (C. I. Lasmézas et al., 1996, vorher zitiert) und 301V (C. F. Farquhar et al., J. Gen. Virol., 1996, 77, 1941-1946) genannt werden;
– das genannte ATNC wird vorzugsweise in einem Puffer, der an den ausgewählten Verabreichungsweg angepasst ist, in Form eines Geweberohhomogenats, vorzugsweise des Gehirns, oder eines PrPres-Bodensatzes, erhalten durch herkömmliche Zentrifugation, ausgehend von einem Geweberohhomogenat, vorzugsweise des Gehirns, verabreicht.
– das genannte ATNC kann auf einem beliebigen Weg verabreicht werden (auf oralem Weg, auf parenteralem Weg), vorzusgweise auf intraperitonealem Weg, in einer Dosis, die einem Inoculum von ATNC entspricht, die zwischen 0,001% und 10% (Gewicht/Volumen) liegt (DL₅₀ liegt zwischen 10³ und 10⁷);
– das genannte Labortier ist vorzugsweise ein Nager (zum Beispiel eine Maus oder ein Hamster).
• für die Stufe b)
– die durchzumusternde Substanz wird auf oralem oder parenteralem Weg verabreicht;
– wenn die Behandlung zwischen t_B und t_C begonnen wird (d.h. wenn das PrPres konstant in der Milz detektierbar ist), ermöglicht das Modell gemäß der Erfindung in einzigartiger Weise die Wirkung der durchzumusternden Substanz auf das inokulierte ATNC im Verlauf der Replikation auf dem Niveau der Replikationsstellen (Zielzellen) zu studieren; wenn es vor t_B, zum Beispiel bei t_A, verabreicht wird, ermöglicht das Modell gemäß der Erfindung es darüber hinaus, die Wirkung der durchzumusternden Substanz zu untersuchen, bevor ATNC seine Zielzellen in der Milz erreicht hat.
• für die Stufe c)
– Das Töten des Tiers wird zum Zeitpunkt t_C durchgeführt.
• für die Stufe d):
– entsprechend der Folge von Stufen, die unter den bekannten Techniken zur Isolierung von Proteinen ausgewählt sind, d.h. die Verfahren, die auf der Molekülgröße basieren, wie die Zentrifugation, die Verfahren, die auf den Löslichkeitsunterschieden basieren, wie die Auflösung durch Salze (salting-in) und das Ausfällen (salting-out) oder die Fraktionierung durch Lösungsmittel, oder die Verfahren, die auf der elektrischen Ladung basieren, werden der Reinigungsgrad und die Ausbeute verschieden sein. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es notwendig, ein Verfahren auszuwählen, das zuverlässig und empfindlich ist, das es ermöglicht, eine Detektionsschwelle zu erreichen, derart, dass das Verhältnis des maximalen Werts, der in der Milz detektierbar ist/Schwellenwert (cut off) möglichst hoch ist, vorzugsweise 2 ist, oder derart, dass man, wenn man eine Verdünnung zu ½ der erhaltenen Endprobe durchführt, noch ein Detektionssignal erhält;
– die bevorzugten Stufenfolgen werden nachfolgend beschrieben: Sie haben bei den vorstehend beschriebenen Isolierungsverfahren den Vorteil, eine große Zuverlässigkeit und eine große Empfindlichkeit zu bieten, und zwar aufgrund der Tatsache, dass die genannte Extraktion nur eine einzige Trennstufe umfasst, und aufgrund der Tatsache der besonderen Wahl der Stufenfolge, während in den früher betriebenen Verfahren (R. E. Race et al., J. Gen. Virol., 1992, 73, 3319-3323; Doi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 955-960; T. Muramoto et al., Am. J. Pathol., 1993, 143, 5, 1470-1479; Farquhar C. F. et al., Gen. Virol., 1994, 75, 495-504 und J. Gen. Virol., 1996, 77, 1941-1946) die Extraktion mehrere Trennstufen umfasst und zu einer Ungenauigkeit führt, und zwar was die Quantifizierung betrifft, und/oder diese Verfahren weisen eine unzureichende Empfindlichkeit auf, um eine Detektionsschwelle und eine genaue Quantifizierung zu erreichen und insbesondere um eine bedeutende Schwankung des Werts für PrPres zu detektieren.
• für die Stufe e):
– PrPres wird insbesondere durch Immunoassay (zum Beispiel Western Blot) detektiert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Isolierung des PrPres, in dem die Extraktion eine einzige Stufe für die Abtrennung des PrPres umfasst und keine Ultrazentrifugation benötigt; ein derartiges Isolierungsverfahren für PrPres aus einem Organ oder einem Gewebe, insbesondere der Milz oder dem Gehirn, ist dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen aus den folgenden Stufen besteht:

(i) Homogenisierung eines Organs oder Gewebes, das nach dem Töten des Tiers entnommen worden war, durch mechanische Zerkleinerung in einem Homogenisierungspuffer, dann Versetzen des erhaltenen Homogenisats mit einem Salz, das erhöhte Ionenstärke hat und geeignet ist, die Aggregation des PrPres zu fördern, zum Beispiel 10-30%-iges NaCl, in einem Verhältnis 1:1 (V/V), gefolgt von einem Einstellen des Homogenisats, um ein Homogenisat zu erhalten, das, als Gewicht/Volumen, 5 bis 50% des Organs oder Gewebes enthält;
(ii) Spezifische Extraktion des PrPres durch Behandlung des in Stufe (i) erhaltenen Homogenisats durch Inkubation der erhaltenen Suspension mit einer Lösung, die eine Protease und ein anionisches Detergenz, geeignet die Aggregation des PrPres zu begünstigen, zum Beispiel 10 bis 30% Sarkosyl, und eine einzige Stufe der Abtrennung des PrPres durch Zentrifugation mit 25000-60000 g, zum Beispiel 25000-30000 g, während 1-2 Stunden, vorzugsweise bei 16-22°C, der erhaltenen Suspension, abgeschieden auf einem Pufferkissen mit einer Dichte zwischen 1,02 und 1,08 bei 20°C und Gewinnung des Zentrifugationsrückstands, der das PrPres enthält; und, falls erforderlich
(iii) Reinigung des PrPres durch In-Suspension-Bringen des in (ii) erhaltenen Zentrifugationsrückstands in einem Laemmli-Puffer, der 1-5% SDS enthält, Inkubation in diesem Puffer bei 100°C während 2-10 Minuten und Zentrifugation bei 12000-15000 g während 10-15 Minuten bei 16-22°C.

Das so gereinigte PrPres kann dann durch jede geeignete Technik wie zum Beispiel Elektrophorese (zum Beispiel Elektrophorese an Polyacrylamidgel) oder Immuncapture aus dem Zentrifugationsüberstand abgetrennt werden.
Gemäß diesem Verfahren ist der Homogenisierungspuffer der Stufe (i) ein neutraler Puffer wie Wasser oder ein isotonischer Puffer wie 5%-ige Glucoselösung.
Erfindungsgemäß gilt ebenfalls:

– Während der Stufe (ii) der Extraktion umfasst die zur Extraktion verwendete Lösung ein anionisches Detergenz, geeignet, die Aggregation des PrPres zu begünstigen, und ein Detergenz, das Eigenschaften zur Renaturierung der Proteine hat, wie zum Beispiel ein zwitterionisches Detergenz wie Sulfobetain, vorzugsweise 1-2%-iges Sulfobetain SB 3-14, und zwar im Verhältnis 1:1 (V/V);
– während der Stufe (ii) der Extraktion, aber vor der Zentrifugation wird wenigstens ein Inhibitor von Proteasen zugesetzt;
– die Zentrifugation gemäß der Stufe (ii) der Extraktion wird vorzugsweise nach Abscheidung der Suspension, die das PrPres enthält, auf einem 6-20%-igen Saccharosekissen oder einem Kissen aus 6-20% Saccharose und einem Sulfobetain durchgeführt.

Das PrPres kann dann durch jedes geeignete spezifische Verfahren detektiert werden.
In überraschender Weise bringen diese Isolierungsverfahren für PrPres aus der Milz, die eine Extraktion in einer einzelnen Stufe umfassen, keinen kumulativen Verlust an PrPres mit sich und sind direkt ohne Modifikation verwendbar, um PrPres aus irgendeinem anderen Gewebe zu extrahieren.
1 stellt das Protokoll dar, das in einem Durchmusterungsverfahren verwendet wurde;
2 stellt ein Polyacrylamidgel dar, das die Inhibierung der Akkumulation des PrPres in der Milz von Mäusen zeigt, die mit dem Stamm C506M3 infiziert waren und mit Amphotericin B (AmB) behandelt wurden (die Skala der Molekulargewichte wurde mit vorgefärbten Markern von Amersham aufgestellt);
3 veranschaulicht in Form eines Histogramms die Inhibierung der Akkumulation von PrPres bei derselben Maus nach Behandlung mit Amphotericin B oder ABLC^® (AmB Lipid Complex) im Vergleich zu einem negativen Kontrolltier, das mit Placebo behandelt wurde und bei dem es keine Inhibierung der genannten Akkumulation gibt;
die 4 und 5 stellen die Kinetik der Akkumulation des PrPres in der Milz von C57BL/6-Mäusen dar, die i.p. mit dem Stamm C506M3 inokuliert waren (0-28 Tage nach Inokulation);
6 stellt die Rolle der Zusammensetzung des Extraktionspuffers bei der Ausbeute der Reinigung von PrPres dar;
7 stellt das Behandlungsprotokoll dar, das zum Testen von Dextransulfat (DS500) verwendet wurde;
8 stellt die Akkumulation des PrPres in der Milz von C57BL/6-Mäusen dar, die auf intraperitonealem Weg durch den Stamm C506M3 infiziert worden waren und zwei Stunden vor der Inokulation durch Dextransulfat DS500 behandelt worden waren.
Es ist selbstverständlich, dass diese Beispiele lediglich zur Erläuterung des Gegenstands der Erfindung angegeben sind, jedoch in keiner Weise eine Beschränkung darstellen.
BEISPIEL 1:
Untersuchung der Akkumulation des PrPres in der Milz von C57BL/6-Mäusen, die auf intraperitonealem Weg (ip) durch den Stamm C506M3 infiziert worden waren und während 1 oder 2 Wochen (6 Tage/Woche) ab t_A + 15 nach Inokulation mit Amphotericin B (AmB) und seinen Derivaten behandelt wurden; Isolierung des in der Milz vorliegenden PrPres durch das Isolierungsverfahren, das eine Ultrazentrifugation umfasst, wie es unten beschrieben wird.

– Stufe a) des Verfahrens zur Durchmusterung: Inokulation
Zum Zeitpunkt t_A werden C57BL/6-Mäuse auf intraperitonealem Weg mit 100 μl 2%-iges Gehirnhomogenat in 5%-iger Glucose einer infizierten Maus im Endstadium experimentellen enzootischen Zitterns (Stamm C506M3) inokuliert.
– Stufe b) des Verfahrens zur Durchmusterung Verabreichung einer Substanz, von der angenommen wird, dass sie eine therapeutische Wirkung hat, oder Verabreichung eines Placebos;
Bei t_A + 15 Tagen (→ Verzögerung zwischen t_B und t_C) werden die C57BL/6-Mäuse in verschiedene Gruppen aufgeteilt und behandelt:
– mit Amphotericin B in einer Dosis von 1 mg/kg (AmB) oder
– mit ABLC^® in einer Dosis von 10 mg/kg während 6 Tagen (1) oder 12 Tagen (2) entsprechend 1 oder
– mit einem Placebo.
– Stufe c) des Verfahrens zur Durchmusterung: Töten der Tiere
Bei t_A + 21 Tage (→ Verzögerung zwischen t_B und t_C) oder bei t_A + 28 Tage (→ bei t_C) werden die Mäuse durch Brechen der Halswirbel getötet; die Milz wird unverzüglich entnommen, und zwar entsprechend 1 und entweder bei -80°C gelagert oder extemporär verwendet.
– Stufe d) des Verfahrens zur Durchmusterung: Isolierung von PrPres
Die entnommenen Milzorgane werden zerkleinert und zu 10% (Gewicht/Volumen) in einer 5%-igen Glucoselösung homogenisiert. Das erhaltene Homogenat wird durch Passage in einer zweckdienlichen Spritze kalibriert.

Das 10%-ige Homogenat (200 μl) wird dann bei 37°C während einer Stunde mit Proteinase K (10 μg/ml) behandelt; der Verdau wird mit Hilfe von 5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) blockiert. Nach Zusatz von 20%-igem Sarkosyl in 10 mM Tris, pH 7,4, werden die Proben 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Sie werden dann mit 245000 g während 4 Stunden bei 20°C auf einem 10%-igem Saccharosekissen (100-300 μl) (Ultrazentifuge Beckman TL100) zentrifugiert.
Die Rückstände werden in einem Laemmli-Puffer wieder in Suspension gebracht, 5 Minuten bei 100°C inkubiert, dann werden die erhaltenen Proben während 15 Minuten bei 16°C einer Zentrifugation mit 15000 g unterzogen.

– Stufe e) des Verfahrens zur Durchmusterung: Detektion des PrPres in den Proben
Die erhaltenen Proben werden verwendet, um eine SDS-PAGE-Elektrophorese (12% Polyacrylamidgel, Beladen mit einem Äquivalent von 10 mg Milz) durchzuführen und werden auf Nitrozellulosemembran unter den Bedingungen übertragen, die von Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 4350-4354) oder von C. I. Lasmézas et al. (J. Gen. Virol., 1996, vorher zitiert) beschrieben wurden. Die Immundetektion von PrPres wurde mit dem Antiserum 007 JB (R. Demaimay et al., Journal of Virology, 1997, 71, 12, 9685-9689), gerichtet gegen das Peptid 90-108 des murinen PrP mit 1/2500, und Ziegen-Ig gegen Kaninchen, konjugiert an Peroxidase, (1/2500) durchgeführt. Die Immunreaktivität wird durch Chimiolumineszenz (ECL, Amersham) entwickelt, quantitativ bestimmt und auf autoradiografischem Film sichtbar gemacht, wie es in 2 dargestellt ist, und zwar für die nicht-behandelten Tiere und die Tiere, die während 6 Tagen mit 1 mg/kg AmB behandelt wurden und zur Zeit t_A + 28 Tage getötet wurden, d.h. eine Woche nach Ende der Behandlung.

Die Antikörper werden durch Kopplung des genannten Peptids (Néosystem, Straßburg) an KLH, dann subkutane Injektion einer Emulsion, die das genannte gekoppelte Peptid und vollständiges Freund-Adjuvans enthielt, in den dorsalen Bereich von Neuseeland-Kaninchen erhalten (R. Demaimay et al., Journal of Virology, 1997, 71, 12, 9685-9689).

– Stufe f) des Verfahrens zur Durchmusterung: Selektion der durchgemusterten Substanz

3 stellt die Resultate dar, die für die nicht behandelten Tiere, die Tiere, die mit 1 mg/kg AmB behandelt wurden und bei t_A + 21 oder t_A + 28 getötet wurden, und die Tiere, die 6 Tage (1) oder 12 Tage (2) mit ABLC^® behandelt wurden und bei t_A + 21 oder t_A + 28 getötet wurden, erhalten wurden: Sowohl für die mit AmB als auch mit ABLC^® behandelten Tieren beobachtet man eine signifikante Inhibierung der Akkumulation von PrPres; um das Histogramm zu konstruieren, werden die in der Milz detektierten Mengen an PrPres an einer linearen Skala von Verdünnungen von PrPres, gereinigt nach denselben Verfahren wie das oben beschriebene, ausgehend von einem Homogenat des Gehirns von Tieren im Endstadium der Krankheit (positive Kontrolle), aufgetragen.
Die 4 und 5 stellen die Kinetik der Akkumulation des PrPres in der Milz von C57BL/6-Mäusen, die mit dem Stamm C506M3 bei t_A inokuliert worden waren, unter denselben Bedingungen wie oben während 28 Stunden und ohne Behandlung dar: Man beobachtet eine progressive Erhöhung des t_A + 30 (→ bei t_C); ab t_A + 30 wird ein Plateau beobachtet.
Beispiel 2:
Untersuchung der Akkumulation des PrPres in der Milz von C57BL/6 von Mäusen, die auf intraperitonealem Weg (ip) durch den Stamm C506M3 infiziert worden waren und 1 oder 2 Wochen (6 Tage/Woche) behandelt wurden, und zwar ausgehend von t_A + 15 nach Inokulation mit Amphotericin B (AmB) und seinen Derivaten; Isolierung des PrPres durch das Verfahren, das keine Ultrazentifugation umfasst.
Die Stufen a), b), c), e) und f) sind identisch mit denen des Beispiels 1.
Die Stufe d) der Isolierung des PrPres aus der Milz von Mäusen wird wie folgt durchgeführt:
Die entnommenen Milzen werden zerkleinert und mit 20% (Gewicht/Volumen) in einer Lösung, die 5% Glucose enthält, homogenisiert. Zu 200 μl Homogenat gibt man 200 μl 20%-ige NaCl (1:1, V/V). Das erhaltene Homogenat wird durch Passage in einer zweckdienlichen Spritze kalibriert.
Zu 200 μl Homogenat mit 20% gibt man 200 μl Detergens (20%-iges Sarkosyl und 2%-iges Sulfobetain (SB3.14 Calbiochem)) und 10 μg/ml Proteinase K, dann inkubiert man bei 37°C während einer Stunde.
Die Proben werden dann bei 30000 g während 2 Stunden bei 22°C auf 200 μl eines Kissens, das 10% Saccharose und 0,1% Sulfobetain als Endkonzentrationen, umfasst, zentrifugiert (Rotor Eppendorf, Zentrifuge ALC 4239R).
6 veranschaulicht die Ausbeuten der Reinigung, die mit verschiedenen Zusammensetzungen der Extraktionspuffer erhalten werden (Darstellung in Form eines Histogramms und eines Western Blots): 1: Vergleich der Ausbeute (Gesamthomogenat); 2: Sarkosyl mit 10%/NaCl mit 10%/Tris 10 mM/SB3-14 mit 1%; 3: Sarkosyl mit 10%/NaCl mit 10%/Tris 10 mM; 4: Sarkosyl mit 10%/NaCl mit 10%; 5: Sarkosyl mit 10%.
Die Rückstände werden in Laemmli-Puffer wieder in Suspension gebracht, 5 Minuten bei 100°C inkubiert, dann werden die erhaltenen Proben einer zweiten Zentrifugation mit 15000 g während 15 Minuten bei 16°C unterworfen.
Beispiel 3:
Untersuchung der Akkumulation des PrPres in der Milz von C57BL/6-Mäusen, die auf intraperitonealem Weg durch den Stamm C506M3 infiziert worden waren und mit Dextransulfat (DS500) bei t_A – 2 Stunden behandelt wurden.
Das Behandlungsprotokoll ist in 7 zusammengefasst.

– Stufe b) des Verfahrens zur Durchmusterung: Verabreichung einer Substanz, von der angenommen wird, dass sie eine therapeutische Wirkung hat;
Zur Zeit t_A – 2 Stunden (d.h. 2 Stunden vor Inokulation des infizierenden Stamms) werden C57BL/6-Mäuse in verschiedene Gruppen aufgeteilt:
– nicht behandelte Mäuse,
– und Mäuse, die mit 25 mg/kg Dextransulfat (DS500) behandelt wurden (einzige Injektion bei t_A – 2 Stunden).
– Stufe a) des Verfahrens zur Durchmusterung: Inokulation
Zur Zeit t_A werden die C57BL/6-Mäuse auf intraperitonealem Weg mit 100 μl 2%-igem Gehirnhomogenat in 5%-iger Glucose von einer infizierten Maus im Endstadium der experimentellen enzootischen Zitterkrankheit [Stamm C506M3] inokuliert.
– Stufe c) des Verfahrens zur Durchmusterung: Töten der Tiere
Zur Zeit t_A + 2 Stunden, t_A + 7 Tage und t_A + 22 Tage werden die Mäuse durch Brechen der Halswirbel getötet; die Milzen werden unverzüglich entnommen.
– Stufe d) des Verfahrens zur Durchmusterung: Isolierung des PrPres identisch zur Stufe d) von Beispiel 2.
– Stufe e) des Verfahrens zur Durchmusterung gemäß der Erfindung: Detektion des PrPres in den Proben
Die erhaltenen Proben werden verwendet, um eine SDS-PAGE-Elektrophorese (12% Polyacrylamidgel geladen mit einem Äquivalent von 40 mg Milz für 2 h und 7 Tage und 10 mg Milz für 22 Tage) und eine Übertragung auf Nitrozellulose-Membran unter den Bedingungen, die von Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 4350-4354) oder von C. I. Lasmézas et al. (J. Gen. Virol., 1996, vorher zitiert) beschrieben wurden, durchzuführen. Die Immundetektion des PrPres wurde mit dem Antiserum 007JB (R. Demaimay et al., J. Virol., 1997, 71, 12, 9685-9689) mit 1/5000 und Ziegen-Ig gegen Kaninchen, konjugiert an Peroxidase, (1/2500) durchgeführt. Die Immunreaktivität wird durch Chimiolumineszenz (ECL, Amersham) entwickelt, quantitativ bestimmt und visualisiert mit Autoradiografiefilmen, wie es in 8 dargestellt ist, und zwar für die nicht behandelten Tiere und die Tiere, die 2 h vor Inokulation durch DS500 behandelt worden waren und zur Zeit t_A + 2 h, t_A + 7 Tage und t_A + 22 Tage getötet wurden.
– Stufe f) des Verfahrens zur Durchmusterung gemäß der Erfindung: Selektion der durchgemusterten Substanz

8 veranschaulicht die erhaltenen Resultate; bei den behandelten Tieren beobachtet man eine signifikante Inhibierung der PrPres-Akkumulation.
Was das vorstehend beschriebene Gebiet angeht, so beschränkt sich die Erfindung keineswegs auf seine Verwendungs-, Durchführungs- und Anwendungsmodi, die expliziter beschrieben wurden.

Claims

Verfahren zur Isolierung von PrPres aus einem Organ oder einem Gewebe, dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen aus den folgenden Stufen besteht: (i) Homogenisierung eines Organs oder Gewebes, das nach Töten des Tieres entnommen worden war, durch mechanische Zerkleinerung in einem Homogenisierungspuffer, dann Versetzen des erhaltenen Homogenisats mit einem Salz, das erhöhte Ionenstärke hat und geeignet ist, die Aggregation des PrPres zu fördern, in einem Verhältnis von 1:1 (V/V), gefolgt von einem Einstellen des Homogenisats, um ein Homogenisat zu erhalten, das, als Gewicht/Volumen, 5 bis 50% des Organs oder Gewebes enthält; (ii) Spezifische Extraktion des PrPres durch Behandlung des in Stufe (i) erhaltenen Homogenisats durch Inkubation der erhaltenen Suspension mit einer Lösung, die eine Protease und ein anionisches Detergens, geeignet die Aggregation des PrPres zu begünstigen, enthält, und eine einzige Stufe der Abtrennung des PrPres durch Zentrifugation der erhaltenen Suspension, abgeschieden auf einem Pufferkissen mit einer Dichte zwischen 1,02 und 1,08, bei 20°C mit 25.000 bis 60.000 g und Gewinnung des Zentrifugationsrückstands, der das PrPres enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem eine Stufe der Reinigung des PrPres durch in Suspension Bringen des in (ii) erhaltenen Zentrifugationsrückstands in einem Laemmli-Puffer, der 1 bis 5% SDS enthält, Inkubation in diesem Puffer bei 100°C während 2 bis 10 Minuten und Zentrifugation bei 12.000 bis 15.000 g während 10 bis 15 Minuten bei 16 bis 22°C umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Homogenisierungspuffer der Stufe (i) ein neutraler Puffer oder ein isotonischer Puffer ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Homogenisierungspuffer unter Wasser und Glucose mit 5% ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in der Stufe (ii) vor der Zentrifugation wenigstens ein Inhibitor von Proteasen zugesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugation in der Stufe (ii) nach Abscheidung der Suspension, die das PrPres enthält, auf einem Kissen aus Saccharose mit 6 bis 20% durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die während der Stufe (ii) der Extraktion zur Extraktion verwendete Lösung ein anionisches Detergens, geeignet, die Aggregation des PrPres zu begünstigen, und ein zwitterionisches Detergens wie zum Beispiel ein Sulfobetain in einem Verhältnis von 1:1 (V/V) enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugation in der Stufe der Extraktion (ii) nach Abscheidung der Suspension, die das PrPres enthält, auf einem Kissen, das ein Gemisch aus der Saccharose mit 6 bis 20% und einem Sulfobetain enthält, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Organ oder Gewebe unter der Milz und dem Gehirn ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugation in der Stufe (ii) während 1 bis 2 Stunden bei einer Temperatur von 16 bis 22°C mit 25.000 bis 30.000 g durchgeführt wird.
Verfahren zur Durchmusterung von Substanzen, von denen angenommen wird, dass sie eine therapeutische Wirkung bei der Behandlung von subakuten, spongiformen, übertragbaren Encephalopathien [encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles (ESST) ] haben, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst: a) Inoculation zum Zeitpunkt t_A wenigstens eines Labortiers, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Nagern, auf jedem geeigneten Weg mit einem übertragbaren nichtherkömmlichen Agens (ATNC); b) Verabreichung an das Labortier auf jedem geeigneten Weg einer zu durchmusternden Substanz (Tiertest) oder eines Placebos (negative Tierkontrolle) in einem Zeitraum zwischen t_A-15 Tagen und t_C, das dem Zeitpunkt entspricht, an dem PrPres in der Milz des La bortiers maximal ist, oder in einem Zeitraum zwischen t_B, das dem Zeitpunkt der ersten Detektion von PrPres in der Milz des Labortiers entspricht, und t_C; wobei t_B zwischen t_A und t_A+15 liegt und t_C zwischen t_A+25 und t_A+30 liegt; c) Töten der Tiere in einem Zeitraum zwischen t_B und t_C und Entnahme der Milz, wobei t_A, t_B und t_C in Tagen ausgedrückt werden. d) Isolierung des PrPres aus jeder entnommenen Milz nach einem Verfahren zur Isolierung nach einem der Ansprüche 1 bis 10; e) Halbquantitative Bestimmung des PrPres, das in der Stufe d) erhalten wurde, durch Detektion des PrPres durch jedes geeignete Verfahren, das ein spezifisches Signal liefert, gefolgt von einem Vergleich des erhaltenen Signals mit einer Standardskala von Verdünnungen einer positiven Kontrolle, die aus einem Gehirnhomogenisat eines Tiers im Endstadium der Krankheit besteht; f) Auswahl der durchgemusterten Substanz als Kandidat zur Behandlung von subakuten, spongiformen, übertragbaren Encephalopathien, wenn der Wert für PrPres, der in der Milz des Testtiers in der Stufe e) erhalten wurde, um wenigstens einen Faktor 2 im Vergleich zu dem Wert verringert ist, der unter den selben Bedingungen mit dem Tier als negative Kontrolle erhalten wurde.
Verfahren zur Durchmusterung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das ATNC in Stufe a) in einem Puffer, der für den gewählten Verabreichungsweg ange passt ist, in Form eines Geweberohhomogenisats oder eines PrPres-Rückstands, erhalten durch zweckmäßige Zentrifugation, aus einem Geweberohhomogenisat, verabreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Geweberohhomogenisat ein Gehirnhomogenisat ist.
Verfahren zur Durchmusterung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das ATNC in der Stufe a) auf intraperitonealem Weg mit einer Dosis, die einem ATNC-Inoculum entspricht und zwischen 0,001% und 10%, als Gewicht/Volumen, umfasst, wobei die LD₅₀ zwischen 10^-3 und 10^-7 ist.
Verfahren zur Durchmusterung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zur Isolierung des PrPres in Stufe d) eine Abtrennung in einer einzigen Stufe umfasst.
Verfahren zur Durchmusterung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das PrPres in Stufe e) durch Immunoassay detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Tötung in Stufe c) zum Zeitpunkt t_C durchgeführt wird.