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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion des
basischen Myelinproteins aus Myelin-enthaltendem Gewebe, wie z.
B. Gewebe des zentralen Nervensystems, wobei das Verfahren hochgereinigtes
basisches Myelinprotein in kurzer Zeit liefert. Das gewonnene Proteinprodukt
umfasst zusätzlich
zu den Hauptisoformen des basischen Myelinproteins auch mehrere
Nebenisoformen, die durch andere Verfahren im Allgemeinen nicht
erhalten werden (Mastronardi, F. G. et al., J. Neurochem. (1993)
60, 153–160).
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Hintergrund der Erfindung
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Myelin
ist eine einzigartige multilamellare Membranstruktur, die Axonen
umgibt und sie elektrisch isoliert, um die Leitung von Nervenimpulsen
zu erleichtern. Diese komplizierte Struktur wird von Oligodendrozyten im
zentralen Nervensystem (ZNS) und von Schwannschen Zellen im peripheren
Nervensystem (PNS) synthetisiert und aufgebaut (de Ferra, F. et
al., Cell 43, Teil 2, (1985) 721–727; Nakajima, K. et al.,
I Neurochemistry, 60 (1993) 1554–1563). Bei dem basischen Myelinprotein
(MBP; engl.: myelin basic protein) handelt es sich um einen der
Hauptbestandteile des Myelins des zentralen Nervensystems, da es
etwa 30% von dessen Myelinproteinen darstellt.
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Von
Maus-MBP ist bekannt, dass es mindestens vier Isoformen als translatierte
Proteine aufweist (Barbarese, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 74 (1977) 0–3364).
Das Molekulargewicht dieser Proteine beträgt 21,5, 18,5, 17 bzw. 14 kDa.
Kürzlich
wurden einzelne mRNA für
21,5, 20,2, 18,5, 17 (zwei Isoformen), eine Isoform zwischen 17
und 14 kDa und unter 14 kDa beschrieben (siehe 3 der
Literaturstelle Nakajima, K. et al., ibid.).
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Die
experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) ist ein weitverbreitet
verwendetes Tiermodell für
Multiple Sklerose (MS), bei dem MBP als ein mögliches Autoantigen angesehen wird.
EAE kann in Nagetieren durch Immunisieren der Tiere mit MBP in starkem
Adjuvans ausgelöst
werden. Andererseits wurde gezeigt, dass orale Verabreichung von
reinem MBP bei Tieren eine Toleranz gegen MBP bewirkt, wobei das
Auslösen
von EAE gehemmt wird (Miller, A. et al., FASEB, 5 (1991) 2569–2566; Miller,
A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 421–425). Gegenwärtig finden
in den USA Versuche statt, bei denen Rinder-MBP an MS-Patienten oral verabreicht
wird (Weiner und Hafler, unveröffentlicht).
Ferner kann MBP mit der Pathogenese anderer neurologischer Störungen verbunden
sein (Carnegie P. R. und Moore, Proteins of the Nervous System,
Raven Press (1980) 2. Auflage, Seiten 119–143).
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Es
sind verschiedene Verfahren zur Reinigung von MBP entwickelt worden.
Die meisten davon stehen auf der Grundlage der primären Extraktion
von Lipiden aus dem Hirngewebe und nachfolgendem Abtrennen der Hauptisoform
des basischen Myelinproteins oder von Isoformen anderer Komponenten,
die in wässrigen Puffern
löslich
sind (Deibler G. E. et al., Prep. Biochem., 2 (1971) 139–165; Eylar
E. H. et al., Methods Enzymol., 32 (1974) 323–341; Bellini, T. et al., J.
Neurochemistry, 46 (1986) 1644–1646;
Giegerich, G. et al., J. Chromatogr., 528 (1990) 79–90). Es
wurde auch die Extraktion unter Verwendung von Detergenzien beschrieben (Riccio,
P. et al., Mol. Chem. Neuropathol., 13 (1990) 185–194). Im
Allgemeinen hemmen Detergenzien immunologische Tests. Allen Verfahren
ist gemein, dass sie mehrfache Schritte der Extraktion von Lipiden
umfassen, gefolgt von Abtrennen des verbleibenden Proteins unter
Verwendung verschiedener chromatographischer Schritte. Diese sind
jedoch zeitaufwändig
und setzen daher das MBP einem proteolytischen Abbau aus, der bekanntlich
auf Grund der hohen Aktivitäten
von neutralen und sauren Proteasen in dem Gewebe des zentralen Nervensystems
stattfindet.
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Die
Verfahren, die am weitesten verbreitet sind (Eylar, E. H. et al.,
ibid.; Deibler, G. E. et al., ibid.), beginnen mit der Extraktion
von MBP-enthaltendem Gewebe mit einem Chloroform/Methanol-Gemisch,
durch welches das MBP wasserlöslich
gemacht wird. Das MBP liegt daher gemeinsam mit verschiedenen anderen Proteinen
des ZNS vor, von denen es abgetrennt werden muss.
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Bei
einem bekannten Reinigungsverfahren wurde das MBP aus unlöslichem
Material von Chloroform/Methanol- und Aceton-behandeltem ZNS-Gewebe
oder aus durch einen Sucrosegradienten isoliertem Myelin aus dem
Hirn oder dem Rückenmark
von Ratten gereinigt. Der Reststoff von Lösungsmittelbehandlungen oder
gereinigtes Myelin wurde mit Wasser mit einem pH-Wert von 3,0 gewaschen,
anschließend
wurde das MBP mit 0,1 M HCl aus der Ablagerung extrahiert (Martenson,
R. E., J. Biol. Chem., 244 (16) (1969) 4268–4272). Diese Untersuchung
bestätigte
frühere
Beobachtungen, dass Ratten-MBP aus mehreren elektrophoretischen
Formen besteht.
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Bei
einem weiteren bekannten Reinigungsverfahren von MBP wurden Extrakte
von Hunde- und Schweinehirn der Reihe nach mit Chloroform/Methanol
(2:1 Vol./Vol.), Aceton und entionisiertem Wasser behandelt (Pitts,
O. M. et al., Prep. Biochem. (USA), 06 (04) (1976) 239–164). Dies
wurde von Präzipitieren
des Extrakts bei einem pH-Wert von 9,0 und Gelfiltration des Überstands
in verdünnter
Salzsäure
gefolgt.
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Keines
der vorstehend genannten Verfahren resultiert in einer gleichzeitigen
Reinigung von verschiedenen Isoformen des MBP im Hirn, wie es das
Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielt. Einige dieser Isoformen
werden als mögliche
Autoantigene mit der Multiplen Sklerose in Verbindung gebracht (Voskuhl,
R. R. et al., J. Neuroimmunology, 42 (1993) 187–192; Voskuhl, R. R. et al.,
J. Immunology, 153 (1994) 4834–4844).
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wurde ein einfaches Extraktionsverfahren entwickelt, das
hochgereinigtes MBP in kurzer Zeit liefert. Das Proteinprodukt gemäß dem Verfahren
umfasst zusätzlich
zu den MBP-Hauptisoformen auch mehrere Nebenisoformen von basischen
Myelinproteinen, die im Allgemeinen von den früheren Verfahren nicht erhalten
werden. Darüber
hinaus können
Isoformen, die auf der Grundlage des Vorhandenseins von mRNA im
Gewebe des zentralen Nervensystems nur vorausgesagt worden sind
(Nakajima, K. et al., J. Neurochemistry, 60 (1993) 1554–1563),
in dem gemäß unserer
Erfindung hergestellten basischen Myelinprotein durch Analyse mit
einem spezifischen Antiserum nachgewiesen werden.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Der
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur
Extraktion von basischem Myelinprotein aus Myelin-enthaltendem Gewebe,
wie z. B. Gewebe des zentralen Nervensystems, wobei das Verfahren
folgende Schritte umfasst:
- – Extrahieren des basischen
Myelinproteins aus dem Myelin-enthaltenden Gewebe mit einem organischen Lösungsmittel,
ausgewählt
aus Chloroform und Verbindungen mit einer Polarität, die der
von Chloroform ähnlich
ist;
- – Inkubieren
der organischen Phase in Gegenwart eines niederaliphatischen Alkohols
oder von Propylenglykol;
- – Überführen des
basischen Myelinproteins von der organischen Phase in eine wässrige Phase
mit der Hilfe von Wasserstoff-Ionen (Protonen); und
- – Gewinnen
der gereinigten basischen Myelinproteine.
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Verweis auf
die Abbildungen
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Für die anhängenden
Abbildungen wurden die Coomassie-Färbungen mit 0,75 mm dickem
DSD-PAGE-Minigel durchgeführt,
wobei 4 μg
Protein gemäß der Bradford-Analyse
als Probe verwendet wurde. Zur Immunoblot-Analyse wurden ähnliche
Gele verwendet. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose-Filter elektrotransferiert.
Als primärer
Antikörper
wurde polyklonales anti-Meerschweinchen-MBP-Serum verwendet, das
in Kaninchen durch Meerschweinchen-MBP, das durch das Verfahren von Eylar
et al. (1971, ibid.) gereinigt worden war, erzeugt wurde. Als sekundärer Antikörper wurde
das Konjugat von mit Meerrettich-Peroxidase konjugierter Ziegen-anti-Kaninchen-IgG
verwendet. Die Immunoreaktionen wurden durch verstärkte Chemolumineszenz
(Amersham) sichtbar gemacht.
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1 zeigt
A) eine Coomassie-Färbung
des basischen Myelinprotein-Endprodukts von verschiedenen Spezies,
und B) und C) Immunoblots von ähnlichen
Gelen (15 Sekunden bzw. 40 Sekunden Exposition bei der verstärkten Chemolumineszenz).
Bahn 1: Promega-Marker mit niedrigem Molekulargewicht; Bahn 2: Rinder-MBP;
Bahn 3: menschliches MBP; Bahn 4: Schweine-MBP; Bahn 5: Kaninchen-MBP;
Bahn 6: Hühner-MBP;
Bahn 7: Meerschweinchen-MBP;
Bahn 8: Ratten-MBP; Bahn 9: Mäuse-MBP;
Bahn 10: Fisch (Lota lota)-MBP.
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2:
MBP-Isoformen, die durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht (A)
oder durch Immunoblot mit verstärkter
Chemolumineszenz nachgewiesen worden sind (B). Bahn st: Promega-Marker
für den
mittleren Molekulargewichtsbereich; Bahn 1: Homogenisat aus Mäusehirn
(500 μg);
Bahn 2: MBP aus Mäusehirn
(8 μg); Bahn
3, Homogenisat aus Rückenmark
(500 μg);
Bahn 4: MBP aus Mäuse-Rückenmark
(5 μg).
Die exonischen mRNA-Elemente,
die den einzelnen Isoformen entsprechen, sind gemäß Nakajima
et al. (1993) dargestellt. Es ist zu beachten, dass die relative
Beweglichkeit der MBP im Vergleich zu Standardproteinen ähnlicher
Größe verringert
ist.
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In 3 werden Ergebnisse einer matrixunterstützten Laserdesorptions-Massenspektrometrie
(LASERMAT) von A) Mäuse-MBP
und B) menschlichem MBP dargestellt. Die Untersuchung wurde in einem
Finnigan-MAT-Gerät
unter Verwendung einer 100 pmol-Proteinprobe, die in Sinapinsäure gemischt
war, durchgeführt.
Bei dem menschlichen MBP ist auch der m + 2H+ – Peak (9,3
kDa) erkennbar.
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4 zeigt
eine Peptidgrad-SDS-PAGE-Analyse des Produkts. Die Analyse wurde
mit menschlichem MBP und Mäuse-MBP
mittels eines Pharmacia Phast System-Geräts durchgeführt. A: Coomassie-Färbung, B: Immunoblot-Analyse.
Bahn 1: menschliches MBP; Bahn 2: Mäuse-MBP; Bahn 3: durch Thrombin
teilweise verdautes Meerschweinchen-MBP. Die beiden Hauptbanden
des Thrombin-Aufschlussprodukts weisen Molekulargewichte von 10,5
kDa und 8 kDa auf. Unter Verwendung einer Belichtung von 3 min bei
dem Nachweis der Chemolumineszenzreaktion (Amersham) können keine
anfärbbaren
oder immunoreaktiven Abbauprodukte mit niedrigem Molekulargewicht
beobachtet werden.
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5.
Ergebnis des Waschens der organischen Phase mit neutralem Wasser.
A: Coomassie-Färbung; B:
Immunoblot-Analyse. Bahn 1: Wasserphase zum Waschen; Bahn 2: Endprodukt
nach dem Waschen der organischen Phase mit neutralem Wasser; Bahn
3: Endprodukt ohne Waschen. Die gewaschenen Proteine stellen etwa
2 bis 5% der Proteine in der organischen Phase dar.
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6:
Stabilität
des Produkts. Bahn 1: gefrorenes gefriergetrocknetes Produkt; Bahn
2: Produkt, das eine Woche lang in einer Wasserlösung bei Raumtemperatur aufbewahrt
worden ist; Bahn 3: Produkt, das eine Woche lang bei +4°C aufbewahrt
worden ist. Alle MBP-Proben waren aus Schweinehirn hergestellt.
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7.
Aus Mäusehirn,
das post mortem bei +4°C
gehalten worden ist, hergestellte MBP-Produkte. Bahn 1: frisches Hirn; Bahn
2: 4 h Inkubation; Bahn 3: 1 Tag Inkubation; Bahn 4: 4 Tage Inkubation;
Bahn 5: 8 Tage Inkubation.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
basiert auf der Extraktion von Myelin-enthaltendem Gewebe, wie z.
B. Hirngewebe, mit einem Überschuss
eines organischen Lösungsmittels.
Dadurch werden die Isoformen des basischen Myelinproteins beinahe
ausschließlich
in das organische Lösungsmittel überführt.
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Mit
dem Begriff „Myelin-enthaltendes
Gewebe" ist solches
im zentralen Nervensystems und solches im peripheren Nervensystem
gemeint. Das Gewebe kann frisch oder gefroren sein.
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Der
Begriff „organisches
Lösungsmittel" bezeichnet in diesem
Zusammenhang ein organisches Lösungsmittel
mit einer Polarität,
die der von Chloroform ähnlich
ist (E2: Al2O3 = 0,38 – 0,42), wie z. B. Chloroform, Methylenchlorid
und Diethylether.
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Das
Mengenverhältnis
von organischem Lösungsmittel
zu Gewebe ist nicht kritisch, ein bevorzugter Bereich beträgt jedoch
3 bis 8 ml organisches Lösungsmittel
pro 1 g Myelinenthaltendes Gewebe. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
wird Chloroform in einem Verhältnis
von insgesamt 7,5 ml Lösungsmittel – in Einzelmengen
von 5 ml und 2,5 ml – pro
1 g Myelin-enthaltendes Gewebe verwendet. Das bedeutet, dass pro mg
reinem basischen Myelinprotein etwa 1,5 ml (Rückenmark) bis 5 ml (gefrorenes
Hirn) organisches Lösungsmittel
verwendet wird. Eine vorläufige
Untersuchung zeigt, dass das organische Lösungsmittel wieder verwendet
werden kann, d. h. dass die organische Lösungmittelfraktion, die bereits
zum Extrahieren von basischen Myelinproteinen verwendet worden ist,
zum Extrahieren von weiteren davon aus einer weiteren Probe von
Myelin-enthaltendem Gewebe verwendet werden kann. Nach der Extraktion
wird die organische Phase vorzugsweise mit neutralem Wasser gewaschen,
um die bei neutralem pH-Wert löslichen
Proteine zu entfernen. Solche Proteine stellen im Allgemeinen etwa
2 bis 5% der in der organischen Phase enthaltenen Proteine dar.
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Im
nächsten
Schritt des Verfahrens werden die in das organische Lösungsmittel
extrahierten Isoformen des basischen Myelinproteins wasserlöslich gemacht.
Dies wird unter Verwendung eines niederaliphatischen Alkohols oder
von Pyopylenglycol und von Wasserstoff-Ionen durchgeführt. Die
organische Phase wird in Gegenwart eines niederaliphatischen Alkohols
oder von Propylenglycol bei Raumtemperatur inkubiert. Der bevorzugte
Bereich des niederaliphatischen Alkohols oder von Propylenglycol
beträgt
1 ml pro 2 ml des basisches Myelinprotein-enthaltenden organischen
Lösungsmittels.
Dieser Schritt ist notwendig, um das basische Myelinprotein in der
organischen Phase in die wässrige
Phase überführbar zu
machen.
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In
diesem Zusammenhang sind mit dem Begriff „niederaliphatischer Alkohol" folgende Alkohole
gemeint:
Alkohol | Ausbeute |
Methanol | +++ |
Ethanol | +++ |
Propanol | +++ |
2-Propanol | +++ |
Butanol | ++ |
2-Butanol | ++ |
iso-Amylalkohol | + |
tert-Amylalkohol | ++ |
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Ferner
ist die Ausbeute, die mit Propylenglycol erhalten wird, mit der
Ausbeute vergleichbar, die mit Methanol erhalten wird.
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Nach
der Inkubation mit einem niederaliphatischen Alkohol/Propylenglycol
werden die Isoformen des basischen Myelinproteins aus dem Gemisch
aus dem organischen Lösungsmittel
und dem niederaliphatischen Alkohol/Propylenglycol quantitativ in
saures Wasser, das vorzugsweise in einem Verhältnis von 1 ml Wasser pro 6
ml des Gemischs aus organischem Lösungsmittel und niederaliphatischem
Alkohol/Propylenglycol verwendet wird, überführt.
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Wasserstoff-Ionen
(Protonen) werden verwendet, um durch Ansäuern der wässrigen Phase mit beispielsweise
Salzsäure
die basischen Myelinproteine in die wässrige Phase zu überführen.
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Solange
das Lösungsmittel,
das basisches Myelinprotein enthält,
ein Puffervermögen
aufweist, so dass der pH-Wert der angesäuerten wässrigen Phase ansteigt, wenn
sie mit dem Gemisch aus organischem Lösungsmittel und niederaliphatischem
Alkohol/Propylenglycol gemischt wird, kann mehr basisches Myelinprotein
aus dem Gemisch aus organischem Lösungsmittel und niederaliphatischem
Alkohol/Propylenglycol in die wässrige
Phase überführt werden.
Der pH-Wert wird
vorzugsweise bei einem Wert von etwa 2 gehalten. Die basischen Myelinproteine
werden aus der so erhaltenen wässrigen
Phase gewonnen. Dies kann beispielsweise durch zweifach durchgeführtes Gefriertrocknen
des Produkts oder durch Gelfiltration und Gefriertrocknen durchgeführt werden.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
wird das Produkt gelfiltriert und gefriergetrocknet.
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Bei
dem Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung geht das basische
Myelinprotein sehr wahrscheinlich umgehend in die organische Phase über. Dies
führt dazu,
dass das Ausmaß einer
möglichen
Proteolyse des basischen Myelinproteins minimiert wird.
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Obwohl
noch nicht bekannt ist, ob das basische Myelinprotein in dem organischen
Lösungsmittel
in löslicher
Form oder in der Form von Lipid-assoziierten Micellen vorliegt,
haben wir durch Dünnschicht-Chromatographie
gezeigt, dass das basische Myelinprotein in dem gefriergetrockneten
Präparat
Lipid-gebunden vorliegt. Die Beschaffenheit dieses Lipids bzw. dieser
Lipide ist nicht bekannt.
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Die
Erfindung wird nachstehend anhand eines Beispiels ausführlicher
beschrieben.
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Beispiel
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Präparation
des basischen Myelinprotein-Produkts
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3,08
g gefrorenes Mäusehirn
wurden bei Raumtemperatur (RT) in 15 ml Chloroform mittels eines
Sorvall Omni-Mixer 17220-Homogenisators homogenisiert, wobei vier
30 Sekunden-Stöße mit voller
Geschwindigkeit verwendet wurden, die von 30 Sekunden-Pausen unterbrochen
waren, um eine Überhitzung
zu vermeiden. Die organische Phase wurde durch 5 min Zentrifugieren
bei RT mit 4500 Rcf unter Verwendung eines Sorvall SA 600-Rotors
von den Gewebetrümmern
und der intrazellulären/zytosolischen
Flüssigkeit
getrennt. Die intrazelluläre/zytosolische
Flüssigkeit
wurde verworfen und die Trümmer
mit 7,5 ml Chloroform erneut extrahiert, wobei zwei Stöße in dem
Homogenisator verwendet wurden und die organische Phase wie vorstehend beschrieben
abgetrennt wurde. Die Chloroformfraktionen wurden vereinigt und
das Volumen zu 18,2 ml gemessen.
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Die
organische Phase wurde durch Zusetzen von 4,5 ml neutralem Wasser
und 15 Sekunden behutsames Verwirbeln in einem konischen 50 ml-Röhrchen gewaschen.
Die Wasserphase wurde durch 5 Minuten Zentrifugieren mit 2000 Upm
bei RT unter Verwendung eines Sorvall H5094-Rotors abgetrennt. Die
Wasserphase wurde sorgfältig
vom oberen Ende der organischen Phase abgetrennt.
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Der
Chloroformphase wurden 9 ml Methanol zugesetzt und das Gemisch 30
Sekunden verwirbelt. Anschließend
wurden 4,5 ml Wasser und 120 μl
1 M HCl zugesetzt. Das Gemisch wurde verwirbelt, wobei der pH-Wert
der abgetrennten wässrigen
Phase regelmäßig durch
Acilit (Merck) pH-Wert-Papier überprüft wurde. So
lange der pH-Wert während
des Verwirbelns zunahm, wurde weitere 1 M HCl zugesetzt. Nach dem
Zusetzen von 140 μl
1 M HCl blieb der pH-Wert der wässrigen
Phase bei einem Wert von 1,5–2,0.
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Die
saure wässrige
Phase wurde durch 10 min Zentrifugieren mit 2000 Upm bei RT unter
Verwendung eines Sorvall H5094-Rotors von der organischen Phase
abgetrennt. Es wurden insgesamt 9 ml saure wässrige Phase gewonnen, in einem
Büchi Rotavapor-Vakuumkonzentrator
auf 3 ml konzentriert, in einer Pharmacia PD 10-Säule gelfiltriert
und anschließend
gefriergetrocknet. Das Endprodukt erschien als ein weißes Pulver, wobei
die Gesamtausbeute an Protein gemäß einer Bradford-Analyse 4,3
mg betrug.
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Analyse der
durch das Verfahren erhaltenen basischen Myelinproteine
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Bei
Verwendung von 4 μg-Proteinproben
aus verschiedenen Spezies setzen sich alle Proteine, die in dem
0,75 mm dicken, Coomassie-gefärbten
SDS-PAGE sichtbar sind, mit dem polyklonalen für basisches Myelinprotein spezifischen
Antiserum um. Das Serum wurde in Kaninchen durch Immunisieren mit
basischem Myelinprotein aus Meerschweinchen, das durch das Verfahren
von Eylar et al. (1974) gereinigt worden war, erzeugt.
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In
allen untersuchten Proben des basischen Myelinproteins aus Säugern konnten
immunoreaktive Banden nachgewiesen werden, die beinahe allen Isoformen
entsprachen, die durch mRNA-Analyse
für Mäuse vorhergesagt
aber für
andere Spezies nicht untersucht worden waren (siehe 1A,
B und C, sowie Tabelle 1). Darüber
hinaus wurden auch immunoreaktive Banden nachgewiesen, die bei der
Coomassie-Färbung
nicht sichtbar sind, deren Größe jedoch
mit der Größe der durch
mRNA-Analyse vorhergesagten Isoformen des basischen Myelinproteins übereinstimmt
(siehe 1 und Tabelle 1).
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Alle
MBP-Isoformen, die in Hirn- und Rückenmarkshomogenisaten nachgewiesen
wurden, waren auch in dem Endprodukt vorhanden (2).
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Reinheit und
Löslichkeit
des Produkts
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Das
fertige Präparat
des basischen Myelinproteins ist in wässrigen Lösungsmitteln, wie z. B. destilliertem
Wasser und Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung(PBS) leicht löslich. Nach
zwei Schritten der Gefriertrocknung oder nach Gelfiltration und
Gefriertrocknung erscheint das Protein als ein weißes Pulver.
Durch Coomassie-Färbung,
Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie(RP-HPLC)
oder Immunoblot-Analyse wurden keine verunreinigenden Proteine nachgewiesen.
Die Molekulargewichtsanalyse durch matrixunterstützte Laserdesorptions-Massenspektrometrie(LASERMAT)
der Präparate
des basischen Myelinproteins des Menschen und der Maus zeigten,
dass wenigstens die Molekulargewichte der Hauptisoformen (nur die
Gewichte der Hauptisoformen waren durch LASERMAT messbar) den aus
den mRNA vorhergesagten Molekulargewichten entsprachen, wodurch
bestätigt
wurde, dass wenigstens diese Isoformen nicht abgebaut waren (siehe 3). Eine Peptidgrad-SDS-PAGE-Analyse durch
ein Pharmacia Phast-System zeigte keine Banden unterhalb von etwa
10 kDa, wodurch weiter erhärtet
wurde, dass die Proteinprodukte intakt sind (siehe 4).
Ferner ergab ein teilweiser Verdau des basisches Myelinprotein-Präparats durch
Thrombin (Law, M. J., et al., J. Neurochem., 42 (1984) 559–568) das
typische Peptidmuster.
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Die
Bedeutung des Waschens der organischen Phase mit neutralem Wasser
ist unklar, da bei gewaschener und nicht gewaschener organischer
Phase kein Unterschied des Proteingehalts des Endprodukts gezeigt
werden konnte. In der Wasserphase, die zum Waschen der organischen
Phase verwendet worden war, konnten jedoch geringe Mengen an Proteinen,
die mit den basischen Myelinproteinen nicht verwandt sind, beobachtet
werden (siehe 5).
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Ausbeute
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Ein
Gramm frisches Hirn ergibt etwa 1,5 (gefrorenes Hirn) bis 5 Milligramm
(Rückenmark)
eines hochgereinigten Gemischs von Isoformen des basischen Myelinproteins.
Diese Ausbeute liegt im gleichen Bereich wie er bei anderen veröffentlichten
Verfahren erhalten wird (siehe Tabelle 2).
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Die
Extraktion des basischen Myelinproteins scheint bei allen untersuchten
Spezies gleich gut zu funktionieren (siehe 1 und Tabelle
1), und sowohl Hirn- als auch Rückenmarksgewebe (2)
stellen geeignete Ausgangsmaterialien zur Reinigung von basischem
Myelinprotein aus dem zentralen Nervensystem dar. Das Verfahren
ist auch zum Reinigen von basischem Myelinprotein aus dem peripheren
Nervensystem geeignet.
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Isoformen
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Die
bezüglich
der mRNA-Expression für
das basische Myelinprotein am besten charakterisierte Spezies ist
die Maus. Nachgewiesene Messenger-RNA von basischem Myelinprotein
der Maus codieren Polypeptide mit 13,0, 14,2, 16,0, 17 (zwei Isoformen),
18,5, 20,2 und 21,5 kDa (deFerra, F. et al., 1985, ibid.; Nakajima, K.
et al., 1993, ibid.). Ein Protein, das den 21,5 kDAund 16 kDa-Isoformen
des basischen Myelinproteins entspricht, ist in den Präparaten
aus allen Spezies mit der Ausnahme von Fisch enthalten. Beim Menschen
ist die 21,5 kDa-Isoform, die nun durch Immunoreaktion in dem gereinigten
Präparat
nachgewiesen wurde (1C, Bahn 3), zuvor
durch mRNA-Analyse von myelinisiertem und remyelinisiertem Hirngewebe
lediglich vorhergesagt worden (Kamholz, J. et al., (1986) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83, 4962–4966).
Die in dem Präparat
von menschlichem basischen Myelinprotein ebenfalls vorhandene 16
kDa-Isoform ist – gemäß der Literatur – für den Menschen
durch mRNA-Analyse nicht vorhergesagt worden. Diese Isoformen umfassen
eine Aminosäure-Sequenz,
die von dem Exon-2 des Gens des basischen Myelinproteins codiert
wird. Von diesem Bereich des MBP ist gezeigt worden, dass er von
basisches Myelinprotein-spezifischen T-Zell-Linien von MS-Patienten erkannt
wird (Voskuhl, R. R. et al., (1993), ibid.), weshalb ihm möglicherweise
eine Schlüsselbedeutung
bei der Planung der Behandlung von MS-Patienten hinsichtlich einer
Toleranzbildung gegen basisches Myelinprotein zufällt. Diese
Exon-2-enthaltenden Isoformen waren in Präparaten des basischen Myelinproteins
aus Rind und Schwein in wesentlichen Mengen vorhanden – in Spezies,
die als Quellen zur Proteinreinigung von basischem Myelinprotein
in großem
Maßstab
geeignet sind.
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Die
14,2-kDa-Bande, die das Haupt-Polypeptid des Mäuse-MBP und des Ratten-MBP
darstellt, war auch bei allen anderen Spezies vorhanden. Kürzlich wurde
Messenger-RNA, die eine Isoform mit etwa 13 kDa codiert, für mMBP gefunden
(Mathisen, P. M., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10125–10129).
Ein Protein mit einer entsprechenden Größe wurde durch das MBP-spezifische
Antiserum in extrahierten Mäuse- und
Rattenproben gefunden, und nach verlängerter Exposition geringfügig auch
für andere
Säuger-Spezies (1C).
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Außerdem wurde
bei rMBP und mMBP bei der Immunoreaktion ein Polypeptid mit etwa
10 kDa sichtbar (1C, Bahnen 8 und
9).
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Stabilität
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Das
Präparat
des basischen Myelinproteins ist als Pulver bei –20°C mindestens zwei Jahre lang
stabil. In wässriger
Lösung
wurde nach einer Woche Lagerung bei Raumtemperatur oder bei +4°C durch Coomassie-Färbung oder
Immunoreaktion kein Abbau beobachtet (6). Die
Stabilität
kann aus der hohen Selektivität
der Überführung der
basischen Myelinproteine in die organische Phase und weiter in die
wässrige
Phase, sowie aus der denaturierenden Wirkung von Chloroform und
einem sauren pH-Wert für
Proteasen folgen.
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Wir
haben gefunden, dass basische Myelinproteine aus Hirn, das eine
Woche bei +4°C
gelagert worden ist, noch in wesentlichen Mengen extrahiert werden
können
(siehe 7). Daher ist keine kostspielige Tiefkühlkette
für die
Handhabung und den Transport des Ausgangsmaterials notwendig. Wenn
das Gewebe gefroren und wieder aufgetaut wird, sind die Myelinprotein-Ausbeuten wesentlich
erniedrigt.
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Zeitbetrachtungen
und Übertragbarkeit
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Im
Labormaßstab,
was in diesem Zusammenhang die Reinigung von basischem Myelinprotein
aus 100 mg bis 100 g ZNS-Gewebe bedeutet, beträgt die benötigte Zeit vom Beginn der Reinigung
aus Gewebe bis zu einem zum Gefriertrocknen bereiten Präparat etwa
drei Stunden. Dies ist bedeutend schneller als der ganze Tag, der
bei Verwendung des kürzesten
publizierten Verfahrens nötig
ist (Bellini et al., ibid.) und die 5 Tage, die bei den üblicherweise
verwendeten Verfahren von Deibler G. E. et al., (1971) und Eylar
E. H. et al., (1974) verwendet werden.
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Bisher
wurde gezeigt, dass das Verfahren für kleine Gewebeproben von 100
mg bis zum präparativen Labormaßstab unter
Verwendung von 100 g Gewebe als Ausgangsmaterial funktioniert. Es
ist keine Ursache aufgetreten, die das Übertragen des Verfahrens auf
einen großen
industriellen Maßstab
behindern würde.
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Verwendungen
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Es
ist gezeigt worden, dass das Myelinprotein-Produkt als Substrat
für Proteinkinasen
wirkt, wobei es sich um eine der möglichen Anwendungen von basischen
Myelinproteinen handelt (Yang, S. D. et al., J. Biol. Chem., 269
(1994) 29855–29859;
Moriyama, T., et al., FEBS Lett., 353 (1994) 305–308). Darüber hinaus haben wir gezeigt,
dass dieses basische Myelinprotein-Produkt in Immunospot-Tests und T-Zell-Proliferationstests
zum Nachweisen des Vorhandenseins von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten
verwendet werden kann. Ferner wurde gezeigt, dass das basische Myelinprotein-Produkt
auch beim Auslösen
von EAE in SJL-Mäusen wirksam
ist.
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Gemäß dem vorstehend
Dargelegten kann das basische Myelinprotein-Produkt der vorliegenden
Erfindung für
immunologische Untersuchungen mit dem Ziel des Verständnisses
der Pathogenese von entzündlichen
entmyelinisierenden Erkrankungen, wie z. B. Multiple Sklerose, bei
Menschen verwendet werden, und vermutlich auch bei der Entwicklung
von Behandlungsverfahren dieser Erkrankungen durch orale Toleranzbildung.
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Tabelle
1. Expression von MBP-Isoformen im ZNS verschiedener Spezies Molekulargewicht,
kDa
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Die 17,2-kDa-Form besteht aus zwei eng benachbart wandernden Formen.
- # Die 14,0 kDa-Form erschien als Dublette,
und eine Bande bei etwa 10 kDa war in der Coomassie-Färbung sichtbar,
nicht jedoch in dem Immunoblot (siehe 1).
- ° Die
Bande war in der Coomassie-Färbung
sichtbar, wurde jedoch von dem polyklonalen anti-Meerschweinchen-MBP-Serum nicht erkannt.
- (–)
Nicht nachgewiesen; (+) im Immunoblot nach verlängerter Exposition sichtbar;
(++) im Immunoblot sichtbar, jedoch nicht in der Coomassie-Färbung; (+++)
sowohl in der Coomassie-Färbung als
auch in der Immunofärbung
sichtbar; (++++) starke Coomassie- und Immunofärbung.
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Tabelle
2. MBP-Ausbeute und Zeit zum Isolieren im Labormaßstab vor
der Gefriertrocknung bei Verwendung verschiedenenr Verfahren