KR20010096318A

KR20010096318A - 가축 혈액단백질로부터 제조된 항암성 펩타이드 및 그제조방법

Info

Publication number: KR20010096318A
Application number: KR1020000020396A
Authority: KR
Inventors: 현창기; 신현길; 주육현
Original assignee: 현창기; 신현길; 주육현; 주식회사 아미노젠
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2000-04-18
Publication date: 2001-11-07

Abstract

본 발명은 도축시 발생되는 가축의 폐혈액내 단백질 성분으로부터 제조된 항유전독성을 나타내는 항암성 펩타이드 및 그 제조방법에 관한 것으로 소의 혈장단백질 또는 알부민, 글로블린, 글로빈 단백질 각각의 효소가수분해물내 펩타이드는 세포 또는 핵체와의 상호작용을 통하여 MNNG의 손상을 저해함으로써 항유전독성을 나타내는 효과가 있고 항유전독성은 암의 발생 및 진행을 억제하는 항암성을 나타내는 뛰어난 효과가 있다.

Description

가축 혈액단백질로부터 제조된 항암성 펩타이드 및 그 제조방법{Anti-cancer peptides produced from animal blood proteins and the processes for preparation thereof}

본 발명은 가축 혈액단백질로부터 제조된 항암성 펩타이드 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 도축시 발생되는 가축의 폐혈액내 단백질 성분으로부터 제조된 항유전독성을 나타내는 항암성 펩타이드 및 그 제조방법에 관한 것이다.

가축혈액은 도축장으로부터 생산되는 축산부산물로서 혈장부분에는 알부민과 글로블린이 약 8, 혈구부분에는 글로빈이 28까지 함유되어 있어 각종 단백질이 풍부하여 유용가치가 높은 자원이다. 그러나 우리나라에서는 이 가축혈액이 자원으로 이용되는 것이 아니라 거의 대부분 폐기되고 있기 때문에 유용자원의 낭비는 물론 환경의 주요 오염원으로서도 문제를 낳고 있다. 우리나라에서 연간 도축되는 가축의 두수는 1997년에 소가 1,125,000두, 돼지가 약 10,738,000두로서 그로부터 방혈되는 도축혈액은 각각 17,000여톤, 53,000여톤으로서 약 70,000톤 이상의 가축혈액이 폐기되고 있다. 뿐만아니라 이러한 도축혈액의 폐기는 1973년을 기준할 때 1980년까지 7년간 1.1배 정도밖에 늘지 않았으나 85년에는 1.9배, 90년, 92년, 94년, 96년에는 각각 2.1배, 2.5배, 2.9배, 3.2배로 늘어나 그 증가율이 계속 상승하고 있어 상황은 더욱 심각해지고 있는 실정이다. 한편 선진국에서는 이 가축 폐혈액을 이용하여 각종 유용물질을 생산하는 연구를 계속하여 왔고 또한 몇가지는 상품화되어 제품으로 공급되고 있으며, 우리나라에서는 오히려 이들을 다량 수입하고 있는 실정이다. 현재 가축혈액이 주로 이용되고 있는 것은 동물성 단백질 농후사료로서, 도축장의 가축의 피를 모아 건조, 분말화한 혈분(Blood meal)으로 공급되고 있으며, 일부분이기는 하나 혈액내의 헤모글로빈 등 특정 성분을 분리해내어 기능성 식품소재, 의약품소재 등으로 이용되고 있다. 즉 가축혈액의 이용은 혈액 자체를 간단한 처리만 거쳐 사료첨가제로 사용하고 있는 분야가 주를 이루고 있으며, 혈액내의 단백질 또는 그외 특정 유용성분을 개별적으로 추출해내어 이용하는 방법은 그동안 산발적으로 연구되어 왔으나 아직 본격적인 이용단계에는 이르지 못하고 있는실정이다. 그나마 사료첨가제로의 이용도 혈분 자체의 높은 염농도와 최종 제품에 미치는 암적색 등에 의한 악영향으로 인해 그 사용량은 감소추세에 있고, 기능성 식품소재로의 이용은 앞으로 확대 성장해 나갈 전망을 보여주고 있으나 현재로서는 응용분야가 빈약하고 제조기술이 충분히 연구되어 있지 않아 여러 가지 장애물이 앞에 놓여있는 형편이다. 따라서 엄청난 양으로 끊임없이 생산되어 버려지고 있는 가축혈액을 이용하여 여러 가지 고부가가치의 유용물질을 생산해낸다면, 자원 낭비의 차단을 물론 환경오염의 방지에 이르기까지 다방면으로의 성과를 기대할 수가 있다. 특히 최근에 위생적인 시설을 가진 도축장이 새롭게 설치되고 있어 위생적인 가축혈액의 수집이 가능해지고 있기 때문에 가축혈액을 이용하는 기능성 소재 개발의 필요성은 절실히 요구되고 있다.

일본을 중심으로 1980년대부터 관심을 모아온 기능성 펩타이드는 현재 상품화된 수십가지의 펩타이드가 주로 우유 단백질인 카제인과 유청 단백질, 대두 단백질, 난백 단백질 등으로부터 얻어내어 소화흡수, 칼슘흡수, 저알레르기 항원, 혈압강하, 기포 및 유화제 등의 기능으로 상품화되어 있는 반면, 혈액 단백질의 경우는 단 한 건 뿐으로 소화흡수기능의 글로빈 펩타이드가 전부이다. 더구나 암예방 또는 항암성을 표시하는 기능성 식품소재로서의 펩타이드는 아직 상품화된 예가 없어 조속한 개발이 필요한 상황이다. 의약품 소재로서의 기능성 펩타이드 연구 현황을 보더라도 카제인, 글루텐, 난백 알부민, 쌀 알부민 등으로부터 진통, 동맥이완, 인슐린 분비촉진 등의 기능을 갖는 기능성 펩타이드들을 분리해내었지만, 혈액 단백질로부터는 사람의 혈청 단백질에서 동맥이완 기능의 펩타이드를 얻은 예가 보고되었을 뿐 특히 가축혈액으로부터 얻어지는 기능성 펩타이드로는 최근 수년간 보고되고 있는 안지오텐신 변환효소(angiotensin Ⅰ converting enzyme) 저해 펩타이드가 전부인 실정이다. 혈액의 기능성 펩타이드로의 응용분야가 이렇게 제한되어 있다는 사실로부터도, 혈액이 다른 단백질원과 달리 고농도의 단백질 용액임을 감안할 때 상대적으로 혈액 단백질을 이용하는 연구가 시급한 것이며 선진국에 대한 선도기술을 확보할 수 있는 적절한 내용으로 볼 수 있는 것이다. 특히 가축 폐혈액 단백질을 이용함으로써 저렴하고 풍부한 원료 단백질을 확보하고 이로부터 기능성 식품소재로서의 항암활성 펩타이드를 경제적으로 생산할 수 있는 기술을 개발하여 부가가치를 높임과 동시에 유용 폐자원의 상당량을 사용하는 새로운 용도가 개발되는 것이다.

본 발명자들은 도축 소 폐혈액의 혈액 단백질을 가수분해하여 얻은 가수분해물에 대하여 코메트 분석(Comet assay)를 이용하여 항유전독성 즉, 항변이원성을 측정한 결과 높은 활성을 나타냄을 확인하였고 이러한 활성은 가수분해물 중의 펩타이드 성분이 실험세포와의 상호작용을 통해 발암원에 대해, 높은 항암활성을 나타냄을 확인하고 분리정제 과정을 통하여 활성이 높은 펩타이드 분획을 분리하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 가축의 혈액내 단백질 성분으로부터 발암물질에 대해 항유전독성을 나타내는 함암성 펩타이드를 제조하여 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항암성 펩타이드의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 도축 즉시 채취한 혈액으로부터 글로빈, 글로블린, 알부민를 분리하였다. 이어서, 전체 혈장단백질과 분리해 두었던 글로블린, 알부민 및 글로빈 단백질 분획을 효소가수분해하여 수득한 가수분해물을 세파덱스 G-25 퍼미에이션 크로마토그라피 또는 한외여과를 통해 펩타이드 분획을 얻은 후 각 가수분해물 및 상기 펩타이드 분획의 항유전독성 효과를 조사함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 설명한다.

도 1은 소혈액으로부터 알부민, 글로블린 및 글로빈 등의 혈액단백질의 분리과정을 나타낸 그림이다.

도 2는 전혈장 및 알부민의 알칼라아제 가수분해물과 분자량 1,000 및 500의 한외여과로부터 얻어진 여액의 펩타이드 분포를 확인하기 위해 Sephadex G-25 겔투과 크로마토그라피를 실시한 결과를 나타낸 그림이다.

본 발명은 도축 즉시 위생적으로 채취한 혈액에 항혈액응고제를 처리한 후 원심분리하여 혈장과 혈구를 분리하고 혈장을 차가운 에탄올의 분획별로 침전하여 침전물로부터 알부민과 글로블린을 분리하고 전기영동을 실시하여 알부민과 글로블린의 밴드를 확인하는 단계; 혈구에 증류수를 첨가하여 용혈시킨 다음 스트로마 헴을 제거하고 원심분리를 실시하여 침전시킨 단백질로부터 글로빈을 분리하고 전기영동을 실시하여 글로빈 밴드를 확인하는 단계; 전혈장단백질과 글로블린, 알부민, 글로빈 단백질을 PBS(phosphate buffered saline)에 용해하고 원심분리하여 얻은 상등액을 기질용액으로 일정농도로 희석한 후 효소를 첨가하고 반응시킨 후 펩타이드 농도를 BCA(bicinconinic acid)법으로 측정하여 효소반응정도를 비교하고 단백질이 효소에 의해 분해되는 정도를 알기 위해 전기영동을 실시하는 단계; 효소처리하여 얻은 가수분해물을 세파덱스 G-25 퍼미에이션 크로마토그라피 또는 한외여과를 통해 분획을 분리하는 단계; 상기 효소처리에 의해 얻어진 가수분해물의 펩타이드 분획을 코메트 분석법(comet assay)으로 항유전독성을 조사함으로써 항암 효과를 확인하는 단계; 발암원인 MNNG(N-methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidine)와 가수분해물을 혼합하여 전배양하거나 가수분해물만 전배양한 후 MNNG와 반응시키거나 또는 MNNG만 전배양한 후 가수분해물과 반응시키고 결과를 비교하여 본 발명 펩타이드의 항유전독성 기작을 조사하는 단계로 구성된다.

본 발명에서 항유전독성 효과를 나타내는 펩타이드는 통상의 부형제와 함께 혼합하여 캡슐, 정제, 환제 및 분말 형태의 약제로 제조될 수 있으며 식품소재로도 사용 가능하다.

본 발명은 폐기 처분되어 환경오염을 발생시키는 가축 폐혈액을 이용함으로써 환경오염 방지 효과는 물론 축산농가의 소득을 증진시키는 효과가 있다.

본 발명은 소의 폐혈액의 전체 혈장 단백질 뿐만 아니라 간단하게 분리해낸 알부민, 글로빈, 글로블린 분획에 대하여 산업용 효소를 처리하여 얻어진 가수분해물이 발암물질에 대해 높은 항암 활성을 나타냈고 특히, 알부민 가수분해물의 항유전독성 활성이 높았다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 혈액단백질의 분리

제 1 단계: 혈액시료 채취

본 실시예에서는 경북 포항시 소재 (주)명신산업 도축장으로부터 도축 즉시 위생적으로 채취한 소 혈액에 채혈 즉시 항혈액응고제[0.85NaCl, 5구연산 나트륨(sodium citrate) 용액]를 혈액부피와 동일한 양으로 첨가하여 혈액응고를 방지하였다. 채혈된 혈액은 24시간이내에 혈장과 혈구를 분리하기 위해 원심분리를 실시하였다. 원심분리는 육안에 의해 분리를 확인하여 8,000rpm/15분으로 조건을 확립하였다.

제 2 단계: 알부민, 글로블린 분리

알부민(Albumin)과 글로블린의 분리를 위하여 Cohn의 cold ethanol 침전법[Cohn,E.J., et al, Am. Chem. Soc., 68, 459-475(1946)] 을 사용하되 예비실험을 거친 후 조건을 수정하여 방법을 확립하였다. 즉 차가운 에탄올(cold ethanol)의 분획별(15, 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60) 침전물에 대해 전기영동을 이용하여 분리하고자 하는 각 단백질의 밴드(band)를 확인함으로써 적정한 침전분획조건을 결정하였다. 전기영동의 조건은 12.5SDS-polyacrylamide gel로서 pH 8.8에서 실시하였고, 염색은 쿠마시 블리리언트 블루 R-250(coomassie brilliant blue R-250)(Sigma)를 사용하였다. 마커(Marker)로서 분리 이전의 혈장과 시판되고 있는 저분자, 고분자 마커(Sigma) 그리고 BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma)를 사용하였다. 결정된 침전분획 조건에 따라 다음과 같은 방법으로 혈장 단백질을 분리하여 후속 실험에 이용하였다. 분리된 혈장 1L를 얼음수조에 넣어 냉각하고, 차가운 에탄올(cold ethanol)을 전체부피의 7.4(v/v)가 되도록 첨가하여 반응시킨후10,000rpm에서 20분간 원심분리하여 피브리노겐(fibrinogen)과 항응고인자 (antihemophilic factor) 등을 제거하였다. 얻어진 상등액에 총 25(v/v)가 되도록 차가운 에탄올(cold ethanol)을 첨가한 후 같은 조건으로 원심분리하여 나오는 침전물, 즉 글로블린을 증류수에 녹여 4℃에 보관하였다. 이때의 상등액에 총 60(v/v)가 되도록 차가운 에탄올을 더 첨가하고, 같은 조건으로 원심분리하여 얻은 침전물, 즉 알부민을 증류수에 녹여 4℃에 보관하였다. 얻어진 글로블린, 알부민시료는 예비실험에서와 같은 조건으로 전기영동을 실시하여 각 밴드를 확인하였다. 실험결과, 분자량 66,000의 알부민 밴드중 가장 진하고 뚜렷하게 나타난 차가운 에탄올 60분획을 조건으로 하였다. 그리고 분자량 150,000의 글로블린은 전기영동 시료 처리시에 첨가되는 머캅토에탄올(mercaptoethanol)과 SDS(sodium dodecyl sulfate)에 의해 두개의 중쇄(heavy chain)과 두개의 경쇄(light chain)으로 분리되어 밴드상 알부민 아래 두개의 밴드로 나타났다. 이 또한 가장 진하고, 뚜렷하게 나타난 차가운 에탄올 25분획을 조건으로 하였다. 최종적으로 확립된 분리방법은, 분리된 혈장을 얼음수조에 넣어 냉각하고, 차가운 에탄올을 전체부피의 7.4(v/v)가 되도록 첨가하여 반응시킨 후 10,000rpm에서 20분간 원심분리하여 피브리노겐(fibrinogen)과 항응고인자(antihemophilic factor) 등을 제거하였다. 얻어진 상등액에 총 25(v/v)가 되도록 차가운 에탄올을 첨가한 후 같은 조건으로 원심분리하여 나오는 침전물, 즉 글로블린을 증류수로 용해하여 얻었다. 또한 이때의 상등액에 총 60(v/v)가 되도록 차가운 에탄올을 더 첨가하고, 같은 조건으로 원심분리하여 얻은 침전물, 즉 알부민을 증류수로 용해하여 얻을 수 있었다. 이때,차가운 에탄올 침전법에 의해 단백질을 분리할 경우 알부민 분획에 비해 글로블린 분획의 순도가 다소 떨어짐을 알 수 있었으나, 두 단백질 분획 모두 높은 순도로 분리된 것임을 알 수 있었다.

제 3 단계: 글로빈의 분리

제 1 단계에서 항응고제로 처리한 소혈액을 원심분리하여 얻어진 침전층(혈구)에 같은 부피의 증류수를 첨가하여 용혈(hemolysis)시킨 다음, 용혈용액 부피의 1/4량의 클로로포름을 첨가하여 분리 깔대기(separation funnel)에 넣어 천천히 섞은 다음 10분정도 방치 후 스트로마(stroma)가 포함되어 있는 클로로포름층을 제거하였다. 스트로마를 제거한 후, 헴(heme)을 제거하기 위해서 2의 아스코르브산 용액을 시료의 2배 부피를 넣어 1시간 동안 냉장실에서 자석 교반기(magnetic stirrer)로 교반하여 헤모글로빈이 콜레글로빈(choleglobin)으로 변하도록 해주었다. 그런 다음 1HCl이 포함된 아세톤을 시료의 4배 부피만큼 천천히 혼합한 후 5분간 격하게 교반하고 냉장실에서 자석 교반기로 교반시키면서 밤새 방치해 두었다. 그 결과 헴화합물이 제거되고 단백질은 침전되었다. 원심분리(3,000rpm/15분)를 실시하여 단백질을 침전시키고, 침전물에 에테르-에탄올(3:1, v/v) 적당량을 넣어 세척한 후 다시 같은 조건으로 원심분리하여 2회 이상 반복 세척을 실시하여 잔존하고 있는 헴화합물을 제거하였다. 이렇게 얻어진 최종 침전물을 증류수에 다시 녹여 회전 증발기(rotary evaporator)를 이용하여 잔존하는 에테르-에탄올을 휘발시킨 후 글로빈 용액을 얻었다. 글로빈 또한 혈장 단백질에서와 동일하게 전기영동을 실시, 분리된 밴드를 확인하였다. 실험결과, 분획별 구성 단백질의 함유량이 월등하게 목적하는 단백질들로 이루어진 것을 전기영동상에서 확인하였다.

상기 2 단계의 알부민, 글로블린과 본 단계의 글로빈의 분리과정을 도 1에 정리하였다.

실시예 2: 전혈장 단백질 및 알부민, 글로빈, 글로블린의 효소처리에 의한 가수분해

본 실시예에서는 전 혈장 단백질 및 실시예 1에서 분리된 글로블린, 알부민 및 글로빈 단백질 분획에 대하여 효소처리 및 반응조건 확립을 위한 실험을 실시하였다. 사용된 단백분해효소는 산업적으로 이용할 때 경제성을 가질 수 있는 산업용 효소들을 실험에 이용하였는데, 알칼라아제(Alcalase) 및 뉴트라제(Neutrase)에 대하여 펩타이드 생산실험을 실시하였다. 알칼라아제와 뉴트라제는 세계적인 효소생산회사인 Novo Nordisk사(Denmark)에서 생산해내는 대표적인 산업용 단백질분해효소들로서 현재 국내 식품 산업, 사료 산업, 유가공 산업에서 가장 널리 이용되고 있는 제품들이다. 또한 이들 산업용 효소는 각각 미생물 기원의 세린 프로테아제(serine protease) 및 메탈로 프로테아제(metallo protease)계통이므로 동물유래의 트립신 및 펩신, 식물유래의 파파인 등 각기 단백질을 분해하는 펩타이드 결합의 위치를 달리하는 단백분해효소들에 대하여도 펩타이드 생산실험을 진행하였다. 기질용액으로는 전 혈장 단백질의 경우는 혈장 원액을 사용하였으며, 각각의 분리 단백질 분획의 경우는 건조분말 700 mg을 50mM PBS(pH 7.4) 10 mL에 녹인후 용해되지 않고 남은 성분들을 8,000rpm으로 20분간 원심분리하여 제거하고 얻어지는 상등액을 사용하였다. 이들 기질 용액의 단백질 농도를 측정하여 50 mg protein/mL로 일정하게 되도록 증류수로 각각 희석하였다. 기질용액 10 mL에 각 효소를 단백질 농도에 대하여 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 5(w/w)의 농도로 각각 첨가하고 효소반응온도와 pH는 각각 알칼라아제는 55^oC, 7.5, 뉴트라제는 45^oC, 6.2, 펩신과 트립신은 37^oC, 2.0 및 7.5, 파파인은 25^oC, 6.2로 하여 매 1시간마다 시료를 채취하면서 8시간까지 반응시켰다. 효소를 처리한 반응액은 시간별로 시료를 채취한 후 중탕으로 가열하고 13,000rpm에서 5분간 원심분리하여 침전되는 미분해 단백질 성분을 제거하였다. 상등액의 펩타이드 농도를 BCA법으로 측정하여 효소반응정도를 비교하였다. 한편 단백질이 효소에 의해 분해되는 정도를 알기 위한 방법으로 전기영동을 실시하였다. 시간별로 채취한 시료 100㎕를 전기영동용 2×sample treatment buffer(0.125 M Tris-Cl, 4SDS, 20glycerol, 0.2M DTT, 0.02bromophenol Blue, pH 6.8) 100㎕와 잘 섞은 후 10, 12.5, 그리고 5 ~ 15농도 기울기 폴리아크릴아미드(gradient polyacrylamide)의 분리용 겔(separating gel)과 4폴리아크릴아미드의 스택킹 겔(stacking gel)로 SDS-PAGE를 실시하였다. 전기 영동 시작 후 1시간 동안 80 V를 유지하고, 이후 150 V로 전압을 상승하여 전개하였다. 실험결과, 실험에 이용한 6가지 효소를 혈장 원액에 처리하여 각 효소의 반응조건에 따라 혈장 단백질 전체를 가수분해하였을 때 생성되는 펩타이드 용액(가열처리, 원심분리 후의 상등액)의 농도를 측정한 결과 알칼라아제 > 뉴트라제 > 파파인 > 펩신의 순서로 펩타이드 생성이 많았으며 트립신은 거의 분해작용을 나타내지 않았는데 이는 혈장에 포함되어 있는 각종 트립신 저해제(trypsin inhibitor)에 의해 저해작용이 있었기 때문이다.

또, 각 분리된 단백질 분획중 알부민 및 글로블린 분획을 각 효소로 10, 30, 60, 90, 120분 동안 분해시킨 가수분해물을 전기영동한 결과, 알칼라아제의 경우가 2시간 동안 가장 빠르게 분해하는 것을 확인하였다. 글로빈 분획의 경우는 분리된 단백질 건조분말이 낮은 pH에서만 완전히 용해되는 특성이 있었기 때문에 3차 증류수에 녹여 pH 2로 맞춘 후 펩신을 처리하여 분해패턴을 살펴보았다. 분자량 14,000대의 비교적 저분자량인 글로빈도 펩신에 의해 작은 폴리펩타이드(polypeptide)로 분해된 후 점차 분해가 진행됨을 보여주었다.

실시예 3: 겔투과 크로마토그라피에 의한 가수분해물의 펩타이드 분획 분리

상기 실시예 2에서 여러 가지 단백분해효소들에 의하여 얻어진 가수분해물은 Sephadex G-25 겔투과 크로마토그라피(Sephadex G-25 gel permeation chromatography)를 통해 분획을 나누었다. 가수분해물 시료를 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후 상등액 1 mL을 Sephadex G-25 column(2x60cm)에 로딩하여 3차 증류수로 용출시켰다. 각 분획의 크기는 4.5 mL씩 하였으며 각 분획의 280nm에서의 UV 흡광도를 측정하여 단백질 및 펩타이드가 분리되어 나온 크로마토그램을 얻을 수 있었다. 실험결과, 각 효소의 처리에 의해 얻은 단백분해물들의 크로마토그램을 앞부분의 분획에서 나오는 큰 분자량의 단백질 또는 폴리펩타이드로 추정되는 분획이 반응이 진행되면서 작아지고 뒷부분의 비교적 작은 분자량의 펩타이드 분획으로 옮아가는 경향을 공통적으로 보여주었다.

실시예 4: 한외여과에 의한 가수분해물의 펩타이드 분획 분리

본 실시예에서는 실시예 2에서 여러 가지 단백분해효소들에 의하여 얻어진 가수분해물을 한외여과에 의해 특정 분자량의 펩타이드들을 제거한 펩타이드 혼합물을 분리하였다. 한외여과는 미국 Millipore사의 Amicon PM-10(MW cutoff 10,000), Amicon YM1(MW cutoff 1,000), Amicon YC05(MW cutoff 500) 등의 한외여과막을 연쇄적으로 통과시킨 후 각각으로부터 여액을 얻어 펩타이드 분획시료로 이용하였다. 분리한 펩타이드의 분포를 확인하기 위해 Sephadex G-25 겔투과 크로마토그라피를 실시하였다. 실험결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 전혈장 및 알부민의 알칼라아제 가수분해물과 분자량 1,000 및 500의 한외여과로부터 얻어진 여액의 펩타이드 분포를 확인하였다.

실시예 5: 항암성 조사

실시예 2, 3 및 4에서 얻은 각 가수분해물 또는 펩타이드 분획을 시료로 사용하여 항유전독성을 조사함으로써 항암 효과를 측정하였다. 본 실시예에서 항유전독성 측정은 직접 동물세포에서 DNA의 변성정도를 조사하여 항암물질의 항유전독성 및 항돌연변이원성를 알아냄으로써 항암제 소재의 스크리닝에 사용되고 있는 코메트 분석을 이용하였다. 코메트 분석은 손상된 DNA 분자가 전기영동 상에서 손상으로 인해 생긴 사슬절단(strand break)들에 의해 혜성(comet)과 같은 모양으로 이동되는 특성을 이용하는 방법으로 단일 세포 마이크로-겔 전기영동(single cell micro-gel electrophoresis ;SCGE) 법이라고도 하는데, DNA 분자들로부터 형성된 코메트 이미지에 대한 말단 길이(tail length)와 말단 모멘트(tail moment)의 통계치로부터 손상정도를 측정한다. 코메트 분석의 원리를 항유전독성 물질 탐색에 응용할 경우, 실험순서는 DNA 손상유도물질(변이원)과 손상억제 추정물질의 세포처리, 세포의 도말(embedding), 세포 단백질 및 세포막의 용해, DNA의 사슬풀기(unwinding), 전기영동 및 염색과 측정으로 이어진다. 변이원에 의해 손상을 입은 DNA는 알칼리 조건하에서 뉴클레오타이드간의 디에스테르 결합의 붕괴에 의해 단편을 형성하며 인산기를 노출시키게 된다. 이로 인한 음전하성에 의해 전기영동 상에서 DNA 단편들은 양극쪽으로 이동하게 되는데, 이때 DNA 단편의 크기가 작을수록 이동거리는 길어지게 되고 단편이 많을수록 이동상에서 단편들의 농도는 높아진다. 결국 손상입은 세포의 핵 모양은 형광 염색시 마치 혜성과 같은 형태가 되며 손상을 입지 않은 경우에는 세포가 위치하는 그 자리에서 이동없이 완전한 원형의 핵체를 유지하게 된다. 따라서 유전독성을 갖는 변이원들에 의해 손상을 입은 DNA 핵체의 손상정도는 핵으로부터 뻗어나간 꼬리의 길이, 즉 DNA 단편들의 이동정도로써 측정되는 것이다. 앞에서 언급한 바와 같이 이 방법은 포유동물세포의 DNA 손상현상을 직접 관찰하여 발암의 개시여부를 쉽게 판단할 수 있기 때문에 이 방법에 의해 검색된 물질은 동물실험의 결과 일치할 확률이 높다.

따라서, 본 실시예에서는 먼저, 세포주를 준비하였다. 시험관내에서 정상 세포주인 차이니즈 햄스터 자궁세포(Chinese hamster ovary cell)을 이용하여 MNNG(N-methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidine) 처리구를 양성 대조구로 하여 펩타이드 시료를 첨가해 주었을 때의 DNA 손상도 억제정도를 기준으로 하는 항유전독성을 조사하였다. 계대배양에서 세포가 배양용기 바닥을 가득 채우면 정상 세포 배지를 버리고 PBS buffer로 깨끗이 씻어내었다. 여기에 0.4의 트립신이 함유된 0.02EDTA용액으로 처리한 후 37^oC 배양기에 2분간 놓아두었다. 이어서 신속하게 배지를 첨가하여 트립신에 의한 세포막의 파괴를 정지시킨 후 500 x g에서 5분간 원심분리하고 상층액은 버리고 무혈청배지(serum free media)로 재현탁시켜 세포농도가 2x10⁶cell/ml이 되도록 트립신 블루 배제(trypan blue exclusion) 방법에 의해 농도를 조정하여 주었다. 이렇게 하여 분리된 세포는 6 웰 마이크로타이터 플레이트에 2x10⁶cell/mL의 농도로 분주시키고 항암기능을 조사하고자 하는 단백질 가수분해물과 MNNG를 배지에 첨가한 후 이것을 배양처리구로 사용하였다. 15분이 지난 후에 세포를 회수하여 SCGE assay를 통하여 DNA의 손상정도를 조사하였다. 두 번째로 전-코팅 아가로스 슬라이드(precoated agarose slide)를 준비하였다. Fully-frosted slide glass(Objekttrager, OT)의 서리가 되어 있는 면에 0.5normal melting point agarose(NMA) 용액 35 ㎕를 전코팅(precoating)한 후에 화염건조시키고, 다시 75 ㎕의 0.5NMA 용액을 커버 클래스를 이용하여 균일하게 깐 후 아이스 배스위에서 5 분간 방치하여 겔을 형성하였다. 이와 같이 만들어진 전-코팅 아가로스 슬라이드는 슬라이드 박스(humidified slide box)에 넣어 실험전까지 4℃에 보관하였다. 이어서 라이시스(Lysis) 및 전기영동을 실시하였다. 아가로스가 깔려있는 슬라이드 글래스(slide glass)에 2 × 10⁵cells/OT의 농도로 세포를 주입시킨 후 라이시스용액(2.5M NaCl, 100mM Na₂EDTA, 10mM Tris base, 1Na-lauroylsarconinate, pH 10.0, 사용 직전에 10의 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 1Triton X-100 첨가)에 1시간동안 담가 놓아 세포벽과 핵주변에 있는 단백질을 용해시켰다. 그런 다음에 OT를 전기영동장치안에서 알칼리 용액에 20분간 방치하여 DNA의 두가닥의 구조가 전기영동에 민감하도록 한가닥의 구조로 풀리게 한 후 전기영동을 실시하였다(25V, 300mA, 20min). 전기영동 후 OT를 중성 완충액를 가지고 씻어주고 에티디움 브로마이드용액으로 염색하여 커버 글라스를 덮고 4^oC에서 하룻밤을 보관하였다. 염색된 슬라이드는 형광 현미경(fluorescence microscope)(×250)으로 관찰하면서 CCD 비디오 카메라를 통해서 전송된 이미지를 코메트 Ⅱ 이미지 분석 시스템(Comet Ⅱ image analysis system)이 장착된 컴퓨터상에서 이미지를 분석하였고, DNA 손상정도는 슬라이드당 101개의 핵체들을 측정하였다. DNA 손상정도를 정량화하는 기준에는 말단 길이(tail length), 말단에서 DNA 퍼센트(percentage DNA in tail), 말단 모멘트(tail moment)와 말단 관성(tail inertia) 등이 있으나, 본 실험에서는 말단 길이와 말단 모멘트로서 DNA 손상정도를 수치화하였다. 실험결과, 펩신과 알칼라아제에 의해 얻어진 혈장 단백질의 가수분해물이 비교적 높은 항유전독성 활성을 나타내었다. 뉴트라아제에 의한 가수분해물의 활성은 상대적으로 매우 낮았다. 표 1에 나타낸 바와 같이 펩신 가수분해물의 경우에는 10 mg/mL의 농도에서부터 DNA 손상을 억제(말단 길이가 양성 대조군에 비하여 감소)하기 시작하여 농도가 높아질수록 손상억제 효과가 증가되었다. 특히, 표 2에 나타낸 바와 같이 알칼라아제 가수분해물은 DNA 손상방지효과를 위한 최소한의 농도가 1 mg/mL 이하로서 상당히 높은 활성을 나타내었다. 50 mg/mL 이상의 농도에서는 전혀 손상을 입히지 않는 음성 대조군의 말단 길이에 근사한 값을 보여주어 거의 완전한 DNA 손상방지 효과를 나타내었다.

또 알부민, 글로블린 및 글로빈에 대한 가수분해물의 분획은 전혈장에 대하여 활성이 높은 가수분해물을 생산한 알칼라아제 및 펩신과 전혈장에 대해서는 가수분해를 일으키지 못했던 트립신을 이용하여 가수분해하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이 알부민의 알칼라아제 가수분해물이 가장 높은 활성을 나타내었다. 특히 이 가수분해물은 5 mg/mL의 낮은 농도에서 50의 항유전독성을 나타냈으며 10 mg/mL 부터는 거의 완전한 손상방지효과를 보여주었다.

소혈장 단백질 펩신 가수분해물의 코메트 말단 길이 및 모멘트 감소

샘플	말단길이	말단 모멘트	상대적 손상색인(RDI)^*
양성 대조군	56.2	10.9	1.00
음성 대조군	25.3	1.5
펩신가수분해물	50mg/mL	46.5	4.8	0.13
	25mg/mL	49.9	6.2	0.57
	10mg/mL	54.5	9.8	0.90
	5mg/mL	57.2	10.1	0.93
	1mg/mL	56.8	10.0	0.92
[주]^*

소혈장 단백질 알칼라아제 가수분해물의 코메트 말단 길이 및 모멘트 감소

샘플	말단길이	말단 모멘트	상재적 손상색인(RDI)^*
양성 대조군	84.0	22.3	1.00
음성 대조군	21.9	0.7
알칼라아제가수분해물	80mg/mL	23.3	1.3	0.06
	50mg/mL	26.5	1.4	0.06
	25mg/mL	40.6	2.5	0.11
	10mg/mL	62.6	6.5	0.29
	5mg/mL	68.0	8.9	0.40
	1mg/mL	83.2	15.3	0.68
[주]^*

소 알부민 알칼라아제 가수분해물의 코메트 말단 길이 및 모멘트 감소

샘플	말단 길이	말단 모멘트	상대적 손상색인(RDI)^*
양성 대조군	95.6	26.8	1.00
음성 대조군	31.2	2.1
알칼라아제가수분해물	18mg/mL	34.8	2.6	0.10
	10mg/mL	50.1	3.5	0.13
	5mg/mL	71.1	13.1	0.49
	2mg/mL	85.2	19.6	0.73
	1mg/mL	87.2	22.3	0.83
[주]^*

실시예 6: 항유전독성 효과의 기작

항유전독성 효과가 발암원인 MNNG에 펩타이드가 결합하여 세포내 DNA가 손상되는 것을 근본적으로 보호하는 것인지 또는 펩타이드가 세포 또는 핵체와의 상호작용을 일으켜 발암원에 대한 손상이 억제되는 것인지에 대하여 그 기작을 밝혀보기 위한 실험을 진행하였다. 즉 15분간의 반응전에 발암원인 MNNG와 가수분해물 시료를 혼합하여 15분동안 전배양(preincubation)시킨 실험구와 가수분해물만으로 전배양한 후 MNNG를 반응시키는 실험구, 그리고 MNNG로 전배양한 후 가수분해물로 반응시키는 실험구를 비교하였다. 실험결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 세포를 우선 가수분해물과 전배양한 후 MNNG를 처리한 경우가 가장 손상이 적은 것으로 나타나, 가수분해물 중의 펩타이드는 세포 또는 핵체와의 상호작용을 통하여 MNNG의 손상을 막았음을 알 수 있었다. 따라서 도축 폐혈액의 혈장 단백질로부터 고활성의 항유전독성 펩타이드를 얻을 수 있었다.

소혈장 단백질의 알칼라아제 가수분해물이 DNA 손상 방지 효과^a

샘플	말단길이	말단모멘트	상대적 손상색인(RDI)^d
전배양	말단길이	말단모멘트	상대적 손상색인(RDI)^d	배양
HBSS^b,c	HBSS	29.7	1.92
MNNG	HBSS	69.1	19.9	1.00
HBSS	MNNG	80.9	20.3	1.00
MNNG+가수분해물(25mg/mL)	HBSS	69.2	14.9	0.74
MNNG+가수분해물(50mg/mL)	HBSS	67.4	12.5	0.62
가수분해물(25mg/mL)	MNNG	59.7	11.2	0.56
가수분해물(50mg/mL)	MNNG	59.2	9.7	0.48
MNNG	가수분해물(25mg/mL)	67.6	12.4	0.62
[주]^a양성대조군; MNNG로 전배양/HBSS로 배양또는 HBSS로 전배양/MNNG로 배양^b음성대조군: HBSS로 전배양/MNNG로 배양^cHBSS: Hank's Balanced Salt Solution[PBS(10mM, pH 7.4)+HEPES(20mM)+KCl(0.4, w/v)+글루코스(1, w/v)^d

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 소의 혈액단백질과 알부민의 효소가수분해물내 펩타이드는 세포 또는 핵체와의 상호작용을 통하여 MNNG의 손상을 저해함으로써 암의 발생 및 진행을 억제하는 항암효과가 있어 본 발명은 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

가축혈액의 전혈장 단배질 또는 알부민, 글로블린, 글로빈 각각의 단백질을 단백질분해효소로 가수분해한 후 상기 가수분해물을 겔크로마토그라피 또는 한외여과하여 펩타이드를 분리하는 것을 특징으로 하는, 항유전독성에 의해 암의 발생 및 진행을 저해하는 항암성 펩타이드의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질분해효소는 미생물 기원의 세린 프로테아제 또는 메탈로 프로테아제 계통의 단백질분해효소임을 특징으로 하는 항유전독성에 의해 암의 발생 및 진행을 저해하는 항암성 펩타이드의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항의 제조방법에 의해 제조된 항유전독성에 의해 암의 발생 및 진행을 저해하는 항암성 펩타이드.