JPH08512294A

JPH08512294A - タンパク質の分離

Info

Publication number: JPH08512294A
Application number: JP7503762A
Authority: JP
Inventors: マーラーニルソン，ビルウイッテ; アーエラウストセン，マズ; ランケ−マッセン，アンデルス
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1994-06-23
Publication date: 1996-12-24
Also published as: WO1995001989A1; FI960073A; ES2168300T3; DE69429172D1; EP0707594B1; CN1054159C; BR9407047A; PT707594E; CN1126477A; AU7121494A; ATE209214T1; EP0707594A1; DE69429172T2; FI960073A0; FI112949B; DK83093D0; US5728559A; DK0707594T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、複数のタンパク質の水性混合物からタンパク質を分離する方法であって、（ａ）水溶性ポリマーが添加された1.5モル以下の濃度の塩と複数のタンパク質の水性混合物を準備し、（ｂ）タンパク質を結晶形で回収することを含んでなる。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質の分離本発明は、タンパク質の水性溶液からタンパク質、特に酵素の分離方法および結晶形で所望タンパク質の回収に関する。背景技術酵素は、工業的目的に対し液体又は非晶質物質をして通常提供される。液体として提供されないとき、酵素は非晶質物質として通常提供され、何故なら酵素の結晶化に対する公知方法は、通常余りに高価すぎ工業的規模で用いることができない。酵素結晶の高純度のため、工業的規模で容易に適用できる酵素の結晶化のための安価でかつ簡易な方法の提供は、産業において明らかに熱望されていることである。酵素の結晶化に関する文献は豊富である。特定の結晶化手順の成果に関し、一般化することは困難である。酵素の結晶化の技術は、高度に経験的であり、そして一群の酵素に対し成功であることが判明した一つの方法が他の酵素（複数）に対して成功するとは必らない。これまで公知のタンパク質の結晶化方法の特色は、非常に純度がありそして濃縮された初期溶液、低収率、非常に長期の結晶化時間、有機溶剤を含む化学薬品の高消費および劣った工業的適合性である。発明の要約本発明の目的は、結晶性タンパク質、特に酵素の回収方法を提供することにあり、この方法は多量の塩又は有機溶剤の添加を必要とせず、この方法は短い結晶化時間および高収率を可能としそして簡易かつ安価であり、そして工業的要求に適合し得る。従って、本発明は複数のタンパク質の水性混合物からタンパク質を分離する方法を提供し、この方法は（ａ）水溶性ポリマーが添加された、1.5モル以下の濃度の塩と複数のタンパク質の水性混合物を準備し、（ｂ）タンパク質を結晶形で回収することを含んでなる。図面の簡単な説明本発明を更に添付の図面により説明する。第１図は、種々のPEG4000濃度および種々のCaCl₂濃度（■１％CaCl₂；２％CaC l₂および□2.5％CaCl₂）でのペルオキシダーゼ結晶化収率を示す。第２図は、種々のpH値の結晶化収率（％）を示す。第３図は、種々の酵素およびPEG4000濃度（■３％ペルオキシダーゼおよび1.4 ％他の酵素；◆4.8％のペルオキシダーゼおよび2.3％他の酵素および▲6.7％のペルオキシダーゼおよび3.1％の他の酵素）。でのペルオキシダーゼ結晶化収率を示す。第４図は、種々のCaCl₂濃度および種々のPEG濃度（■20％PEG4000；◆22％PEG 4000；▲24％PEG4000；□26％PEG4000；◇28％PEG4000および△30％PEG4000）でのカタラーゼ結晶化収率（％）を示す。第５図は、種々のCaCl₂濃度および種々のPEG4000濃度（■20％PEG4000および ◆25％PEG4000）でのカタラーゼ結晶化収率（％）を示す。第６図は、種々のPEG1500濃度および0.2％濃度のCaCl₂でのカタラーゼ結晶化収率を示す。第７図は、種々のPEG濃度でのプロテアーゼ結晶化収率（％）を示す。第８図は、種々のPEG濃度でかつ1.1％のCaCl₂濃度でのプロテアーゼ結晶化収率（％）を示す。発明の詳細な開示本発明は、異なる結晶化特性を有する他の複数のタンパク質を含んでなる水性混合物からタンパク質又はポリペプチドを分離する方法を提供する。驚くべきことに次の内容が見出された；すなわち水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコールを添加することにより、一つのタンパク質が他の複数のタンパク質および他の不純物例えば炭水化物化合物を有するその混合物から分離できそして結晶形で沈殿する。ポリエチレングリコール（PEG）によるタンパク質の沈殿および結晶化は、結晶学に対する結晶を修飾するためPEGの使用と共に文献公知であるが、しかしタンパク質の精製のためにPEG結晶化の使用は新規である。PEGの使用は、回折分析に対し結晶を得るため唯一のものであった、例えばＡ．マクパーソンEur.J.Bioc hem.189,1990，１−23頁；Ｒ．Ｎ．ハイレ等Biopolymers vol.23（12），1984， 2761−2779頁；およびＪ．Ｃ．リー等J.Biol.Chem. 256（２），1981，625−631 頁参照。一般に以下の内容が認められている、すなわちPEGが作用する機構の一部は、塩および有機溶剤に誘発された結晶化に対するように、溶液の誘電特性の低下と組合された塩折効果である。それに加え、一定条件下でのPEGは、タンパク質の熱力学活性を増加させることにより溶液からタンパク質を排除することができると思われ、その結果無定形PEGの劣った相を生じ、そこから無定形タンパク質が可能的にタンパク質結晶に変換できる、注Ｒ．Ｎ．ハイレ篇、Biopolymers vol 23（12），1984，2761−2779頁。タンパク質結晶化のためのPEGのもう一つの使用は、PEGと高い塩濃度を用いることによる水性２−相系の創造であり、ここにおいてタンパク質はPEG相内で濃縮され、核生成が界面で発生しそして結晶成長は水相中で生じ、駆動力は高い塩濃度であり、文献としてEur.J.Biochem. 189，1990，１−23頁参照。本発明に係る研究から、異なるそして驚くべき機構が結晶化に対し説明できると思われ、基本的差異は結晶化が比較的低い塩濃度でPEG分子とタンパク質間の親和力によって推進される。その結果は、相分離であり、ここでタンパク質は、核形成および結晶成長が以下に記載する如く生起する微小滴に可溶性形で濃縮される。 PEGを、（濃度がそれ自身２相系を作らない）タンパク質に加えると、PEGに対する親和力を有するタンパク質は、PEG分子と会合し不均質溶液を形成するであろう、をしてこれは適切なPEG MW，PEG濃度で、塩濃縮およびタンパク質濃縮は、低下したタンパク質濃度および非常に高いタンパク質濃度を有する微小滴から成る系に成長できる。この系は、通常の水性２−相系とは全く異なるようである、何故なら相は伝統的低速度遠心分離により分離できない；しかし、限界濾過では（例えば例11に記載）、２相をみることが可能である。高タンパク質濃度を有しそしておそらく幾分不純物を排除した小滴において、結晶形成のための最適条件が見られる。次いで結晶は、それらが結晶化の終りに固体結晶を有する通常の一つの相の水性系を発生させる小滴から破れ開くであろう寸法にそれらが達するまで小滴内で明らかに形をとる。しかし、対象のタンパク質に応じ、系は小滴相内未だ結晶の嵩部分を存する２相系として同様に終了することができる。小滴相内および周囲溶液中の小滴の表面から発生する結晶の成長の例も又認められた。タンパク質が、水溶性ポリマーおよびタンパク質間の親和力によって作られた精製されかつ濃縮された形のタンパク質を有する２相小滴系中で結晶化されるという提案された機構は、技術が低濃度でかつ不純のタンパク質溶液に対してさえ非常に強力でありうることを示している。本発明方法は、複数のタンパク質の混合物からタンパク質の分離、特に複数のタンパク質の混合物から酵素の分離に適用できる。好ましい態様において、酵素含有溶液は、酵素生産微生物の培養によって得られる培養ブロスである。好ましくは、本発明方法は、例えば、凝集、遠心分離、濾過又は精密濾過膜により最初に固体／液体分離技術に委ねられた培養ブロスに適用される。沈殿又は結晶化前のクロマトグラフィー法の使用により精製することは有用である。より特異的態様において、本発明方法は自体公知方法により酵素含有溶液の濃縮を含んでなる。そのような方法には、限界濾過、ダイアフィルトレーション（ diafiltration）、透析又は蒸発による濃縮が含まれる。結晶化に対し行うために必須ではないけれども、タンパク質含有溶液の濃縮は、取扱いおよび収率の見地から好都合である。実際的理由に対し、酵素含有溶液は、0.1〜25％Ｗ／Ｗ、より好ましくは0.5〜15％Ｗ／Ｗ、最も好ましくは１〜10 ％Ｗ／Ｗの酵素タンパク質の含量に濃縮できる。好ましい態様において、本発明方法はオキシド、レダクターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼおよびセルラーゼの分離に適用される。「Enzyme Nomen clature 1992、アカデミック出版社、サンジエゴ」において定義されそして記載されているオキシドレダクターゼは、一つの物質から他の物質へ電子の移動（酸化−還元）を触媒する酵素の種類に属する。オキシドレダクターゼには、デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼおよびオキシゲナーゼが含まれる。より特異的例には、西洋わさびペルオキシダーゼ、リグニナーゼおよび他のペルオキシダーゼ、並びにオキシダーゼ例えばラッカラーゼが含まれる。適当なオキシドレダクターゼの還元に対し使用できる微生物の属の例は次の通りである：（トラメテス（Trametes）、リゾクトニア（Rhizoctonia）、シュードモナス（Peseudomonas ）、バシラス（Bacillus）、ストレプトマイセス（Stre ptomyces ）、ハイグロホラス（Hygrophorus）、コプリナス（Coprinus）、ポリポラス（Polyporus ）、カンジダ（Candida）、カルブラリア（Curvularia）、セルコスポラ（Cercospora ）、マイコリオフトラ（Myco-liophtora）、アスペルギルス（Asperqillus ）、およびスキタリジウム（Scytalidium）。本発明は、しかし、上記分類群から由来する酵素に制限されない。所望の性質を有するオキシドレダクターゼ生産の全ての微生物は、本発明に関連して使用できる。オキシドレダクターゼは、好ましくはラッカーゼ（EC１．10．３．２）、カタラーゼ（EC１．11．１．６）、ペルオキシダーゼ（EC１．11．１．７）、又はオキシダーゼである。好ましい態様において、本発明はペルオキシダーゼ含有溶液およびカタラーゼ含有溶液に適用される。適当なペルオキシダーゼは、植物により生産できるもの（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ）又は微生物例えば菌類又は細菌により生産できるものである。好ましい態様において、ペルオキシダーゼは、コプリナス（Coprinus）、例えばＣ．シネレウス（cinereus）又はＣ．マクロリザス（macrorhizus）から又はバシラス（Bacillus）、例えばＢ．プミラス（pumilus ）から由来し、特に国際特許出願WO91／05858に係るペルオキシダーゼである。酵素は、更に該酵素をコードするDNA配列並びに酵素のコードするDNA配列を発現させる機能をコードするDNA配列を有する組換えDNAベクターを、酵素の発現を可能にする条件の下、培地中で培養し次いで酵素を培地から回収することを含んでなる。特に組換え工学により生産されたプルオキシダーゼは、コプリナス（Coprinus ）種、特にWO92／16634に係るＣ．マクロリザス（macrorhizus）又はＣ．シネレウス（cinereus ）由来のペルオキシダーゼである。カタラーゼは動物起源（牛の肝臓）から公知であり更に多くの微生物から公知である。日本特許出願２−76579は、アスペルギルスニガー（Aspergillus niger ）菌株NFAG-２由来のカタラーゼを開示する。英国特許2,216,149は、ペニシリウム（Penicillium ）由来のカタラーゼを開示する。本発明の好ましい態様において、カタラーゼはWO92／17571に記載されるように、スシタリジウム（Scytalidi um ）およびフミコラ（Humicola）の菌株から得られる。本発明方法の他の好ましい態様において、酵素はプロテアーゼである。適当なプロテアーゼには、動物、植物又は微生物起源のプロテアーゼが含まれる。微生物起源は好ましい。化学的又は遺伝的に変性された突然変異体が含まれる。それは、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであってよい。アルカリプロテアーゼの例は、ズブチリシン、特にバシラス（Bacillus）由来のブブチリシン、例えばズブチリシンノボ、ズブチリンカルスベルクズブチリシン309、ズブチリシン 147およびズブチリシン168（WO89／06279に記載）である。商業上のズブチリシンの例は、アルカラーゼ（Alcalase）（商標）、サビナーゼ（Savinase）（商標）、エスペラーゼ（Esperase）（商標）およびデュラザイム（Durazym）（商標）（全てノボノルディスＡ／Ｓの製品）である。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば豚又は牛起源の）およびWO89／06270に記載されたフサリウム（Fusarium ）プロテアーゼである。本発明方法の他の好ましい態様において、酵素はリパーゼである。適当なリパーゼには、細菌および菌類起源のリパーゼが含まれる。化学的および遺伝的に変性された突然変異体も含まれる。特に好ましいリパーゼは、シュードモナス（Ps eudomonas ）、カンジダ（Candida）およびムコール（Mucor）、特にEP0214761に記載の如くシュードモナスセパシア（Pseudomonas cepaciae）から得られるリパーゼ、又はフミコララヌギノサ（Humicola lanuginosa）からの遺伝子をクローニングし次いでEP0258068に記載の如く遺伝子をアスペルギルスオリゼ（Aspergi llus oryzae ）中で発現することによって得られるリパーゼ（ノボノルディスクＡ／Ｓからリポラーゼ（Lipolase）（商標）のもとで入手可能）である。本発明方法の他の好ましい態様において、酵素はアミラーゼである。適当なアミラーゼには、細菌および菌類起源のアミラーゼが含まれる。化学的又は遺伝的に変性された突然変異体も含まれる。アミラーゼには、例えばバシラス（Bacill us ）、例えば英国特許1,296,839に詳しく記載されているＢ．リケンホルミス（l icheniformis）から得られるα−アミラーゼが含まれる。本発明方法の他の好ましい態様において、酵素はセルラーゼである。適当なセルラーゼには、細菌および菌類起源のセルラーゼが含まれる。化学的又は遺伝的に変性された突然変異体も含まれる。適当なセルラーゼを生産するために使用できる菌類の例は、トリコデルマ（Tricho derma ）、ファネロケテ（Phanerochaete）、フミコラ（Humicolor）、フサリウム（Fusarium ）およびマイセリオポトラ（Myceliopthora）である。本発明方法を更に水溶性ポリマーの添加を含んでなる。好ましい水溶性ポリマーはグリコール類およびアミン類例えばポリアミン類である。より好ましいものは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールである。最も好ましいものは、200〜10000の分子量（MW）を有するポリエチレングリコール類である。水溶性ポリマーは、１−50％Ｗ／Ｗ、好ましくは２−40％Ｗ／Ｗの濃度で添加できる。本発明によれば、本法は1.5モルまでの濃度、好ましくは1.0モルまでの濃度の塩を追加的に添加することを含んでなる。好ましい塩は、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、カリウムおよびアンモニウムの塩である。最も好ましい塩は、アニオンがクロリド、ホルミアート（ Formiate）、アセタートおよびスルファートから成る群から選ばれる塩である。本発明方法により、水溶性ポリマーが添加された濃縮水性溶液のpHは、結晶化の最適に調節でき；幾つかの場合において結晶化の最適は、酵素のpI付近のレベルである。好ましい態様において、pHはpH＝pI±１のレベルに調節される。 pHの調節のためには、実際的にどんな酸又は塩基でも使用できる。酸は無機又は有機であってよい。幾つかの例は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、クエン酸およびギ酸である。好ましい塩基は、水酸化ナトリウムである。本発明の特定の態様において、塩は1.5モルまでの濃度で、好ましくは1.0モルまでの濃度でタンパク質（複数）の水性混合物に添加される。本発明方法は、タンパク質特に酵素をして結晶形で沈殿せしめる。結晶性タンパク質の回収は、常法、例えば濾過次いで引き続き乾燥により、又は液体タンパク質生成物の製造のため結晶の再溶解により達成できる。次の実施例は、更に本発明を説明するが、この実施例はいかなる場合も権利要求される本発明の範囲を制限するものではない。例１水溶性ポリマーの効果ヨーロッパ特許出願505,311に記載されているようにして得られたコプリナスシネレウス（Corprinus cinereus ）ペルオキシダーゼを含有する培養ブロスを、本発明方法に委ねた。最初に、培養ブロスを遠心分離により固体／液体分離に委ねた。5.5％Ｗ／ＷD S（乾燥物質）ペルオキシダーゼタンパク質および2.4％Ｗ／ＷDS他の酵素を含有する限外濾過液を得た。ポリエチレングリコール（PEG4000）およびCaCl₂・2H₂Oを種々の量で加え（注第１図）、そしてpHをギ酸を加えて4.0に調節した。種々のPEGおよび塩濃度（■１％CaCl₂；▲２％CaCl₂および□2.5％CaCl₂）での収率を添付の第１図に示す。例２pHの効果ヨーロッパ特許出願505,311に記載したように得られた、コプリナスシネレウス（Coprinus cinereus ）ペルオキシダーゼ含有の培養ブロスを、本発明方法に委ねた。最初に、培養ブロスを遠心分離により固体／液体分離に委ねた。5.5％Ｗ／ＷD S（乾燥物質）ペルオキシダーゼタンパク質および2.4％Ｗ／ＷDS他の酵素を含有する限外濾過液を得た。この溶液に、20％Ｗ／Ｗのポリエチレングリコール（PEG4000）および1.5％Ｗ／ＷのCaCl₂・2H₂Oを加え、そしてpHをギ酸で種々のpH値に調節した。溶液を28 ℃で24時間撹拌した。種々のpHでの結晶値収率を添付の第２図に示す。例３濃縮の効果ヨーロッパ特許出願505,311に記載されているようにして得られたコプリナスシネレウス（Corprinus cinereus ）ペルオキシダーゼを含有する培養ブロスを、本発明方法に委ねた。最初に、培養ブロスを遠心分離により固体／液体分離に委ねた。ペルオキシダーゼタンパク質および他の酵素の種々の濃度を含有する限外濾過液を得た。これらの溶液の各々に、1.5％Ｗ／ＷのCaCl₂・2H₂Oを加えた。ポリエチレングリコール（PEG4000）を種々の量で加えた。pHをギ酸を加えて4.0に調節し、次いで溶液を28℃で４時間撹拌した。種々の酵素およびPEG濃度（■３％ペルオキシダーゼおよび1.4％の他の酵素； ◆4.8％ペルオキシダーゼおよび2.3％の他の酵素および▲6.7％ペルオキシダーゼおよび3.1％の他の酵素）での結晶化収率を添付の第３図に示す。例４カタラーゼの結晶化国際公開WO92／17571に記載されているようにして得られたスキタリジウムサーモフィラム（Scytalidium thermofilum ）カタラーゼを含有する培養ブロスを、本発明方法に委ねた。最初に、培養ブロスを凝集および濾過により固体／液体分離に委ねた。濃縮物を、蒸発および限界濾過／ダイアフィルトレーション（diafiltration）により濃縮した。濃縮物は、1.2％Ｗ／ＷDS（乾燥物質）カタラーゼタンパク質および5 .5％Ｗ／Ｗ合計乾燥物質を含有していた。ポリエチレングリコール（PEG4000）およびCaCl₂・2H₂Oを種々の量で加え（注第４図）、次いでpHをpH6.8に調節した。溶液を28℃で48時間撹拌した。種々のCaCl₂−濃度および種々のPEG4000−濃度（■20％PEG4000；◆22％PEG40 00；▲24PEG4000；□26％PEG4000；◇28％PEG4000および△30％PEG4000）での結晶化収率を、添付の第４図に示す。例５カタラーゼの結晶化国際公開WO92／17571に記載されているようにして得られたスキタリジウムサーモフィラム（Scytalidium thermofilum ）カタラーゼを含有する培養ブロスを、本発明方法に委ねた。最初に、培養ブロスを凝集および濾過により固体／液体分離に委ねた。引き続き、濃縮物を蒸発により濃縮した。濃縮物は、0.28％Ｗ／ＷDS（乾燥物質）カタラーゼタンパク質および9.2％Ｗ／Ｗ合計乾燥物質を含有していた。ポリエチレングリコール（PEG4000）およびCaCl₂・2H₂Oを、種々の量で加え（注第５図）、次いでpHをpH6.0−6.5に調節した。溶液を28℃で４時間撹拌した。種々のCaCl₂−濃度および種々のPEG4000−濃度（■20％PEG4000；◆22％PEG40 00；▲24％PEG4000；◆28％PEG4000および◆25％PEG4000）での結晶化収率を添付の第５図に示す。例６カタラーゼの結晶化国際公開WO92／17571に記載されているようにして得られたスキタリジウムサーモフィラム（Scytalidium thermofilum ）カタラーゼを含有する培養ブロスを、本発明方法に委ねた。最初に、培養ブロスを凝集および濾過により固体／液体分離に委ねた。引き続き、濾液を、蒸発により濃縮した。濃縮物は、0.28％Ｗ／ＷDS（乾燥物質）カタラーゼタンパク質および9.2Ｗ／Ｗ合計乾燥物質を含有していた。ポリエチレングリコール（PEG1500）およびCaCl₂・2H₂Oを種々の量で加え（注第６図）、次いでpHをpH6.5−7.0に調節した。溶液を28℃で48時間撹拌した。種々のCaCl₂−濃度および種々のPEG1500−濃度および0.2％のCaCl₂−濃度での結晶化収率を、添付の第６図に示す。例７プロテアーゼの結晶化バシラスレンタス（Bacillus lentus）由来のプロテアーゼ｛サビナーゼ（S avinase）（商標）｝｛（米国特許3,723,250）を含有する培養ブロスを、本発明方法に委ねた。最初に、培養ブロスを凝集および遠心分離により固体／液体分離に委ねた。引き続き、濃縮物を、蒸発および限界濾過により濃縮した。濃縮物は、9.2％Ｗ／ＷDS（乾燥物質）プロタアーゼタンパク質および19.6％Ｗ／Ｗ合計乾燥物質を含有していた。ポリエチレングリコール（PEG4000）を種々の量で加え（注第７図）、次いでp Hを5.6までのpHに調節した。溶液を28℃で48時間撹拌した。種々のPEG4000濃度での結晶化収率を、添付の第７図に示す。例８プロテアーゼの結晶化バシラスレンタス（Bacillus lentus）由来のプロテアーゼ｛サビナーゼ（S avinase）（商標）｝を含有する培養ブロスを、本発明方法に委ねた。最初に、培養ブロスを凝集および遠心分離により固体／液体分離に委ねた。引き続き上澄みを、限界濾過により濃縮した。濃縮物は、9.2％Ｗ／ＷDS（乾燥物質）プロテアーゼタンパク質および19.6％Ｗ／Ｗ合計乾燥物質を含有していた。導電率は、1.55mS／cmであった。ポリエチレングリコール（PEG4000）を、1.1％Ｗ／ＷCaCl₂・2H₂Oと共に種々の量で加え、次いでpHをpH5.6に調節した。種々のPEG4000濃度での結晶化収率を、添付の第８図に示す。例９リパーゼの結晶化ヨーロッパ特許0214761に記載したように得られた、シュードモナスセパシア（Pseudomonas cepaciae ）由来のリパーゼ含有濃縮物を、本発明方法に委ねた。 2.1％Ｗ／ＷDSリパーゼタンパク質および20％Ｗ／Ｗ合計DSを含有する濃縮物に、31％PEG4000をpH7.8で加えた。溶液を28℃で４時間撹拌した。次いで結晶化収率は47％であった。例10セルラーゼの結晶化国際公開WO91／17244に記載されているようにして得られたフミコラインソレンス（Humicola insolens ）セルラーゼを、発酵により生産し次いで濾過、限外濾過およびイオン交換された水を用いたダイアフィルトレーションにより回収した。濃縮されたセルラーゼ溶液は、105ｇ／ｌの酵素濃度、58％の乾燥物質の酵素純度および88％のタンパク質純度を有していた。pHは7.0でありそして導電率は6 07μＳであった。 100ｇのセルラーゼ溶液当たり39.6ｇのPEG300を撹拌下で加えた。温度は27℃ であった。20時間後、結晶を遠心分離により集め次いで0.5％NaCl溶液に再溶解した。結晶の収率は、酵素活性に基づき83％に決定されセルラーゼタンパク質純度は100％であった。例11PEG／酵素系の特性 PEGおよび塩を酵素濃縮物に加えた場合、酵素に富んだ微小滴が形成しそしてこれらの小滴内で結晶化が起こる。二相が限外濾過により分離できる。ヨーロッパ特許505311に記載したように得られた、コプリナシネレウス（Co prinus cinereus ）ペルオキシダーゼ含有培養ブロスを本発明方法に委ねた。最初に、培養ブロスを遠心分離により固体／液体分離に委ねた。5.1％DS（乾燥物質）ペルオキシダーゼタンパク質を含有する限外濾過液を得た。20％PEG400 0および1.5％Ｗ／ＷCaCl₂・2H₂Oを濃縮物に加え次いでpHをpH4.0に調節した。混合直後に、微小滴が顕微鏡の使用により液体中に観察された。限外濾過（27000 ｇで15分）により、二相が分離できた。ペルオキシダーゼ含量はＡ405として測定されそしてＡ280として測定された合計タンパク質含量と比較する。結果を表１に示す。ペルオキシダーゼは濃縮されておりそしてこれらの微小滴内で精製されていることが分かる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年８月１７日【補正内容】請求の範囲１．培養ブロスから、オキシドレダクターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよびアミラーゼから成る群から選ばれるタンパク質を分離する方法であって、（ａ）水溶性ポリマーが添加された、1.5モル以下の濃度の塩と複数のタンパク質の水性溶液を準備し、（ｂ）タンパク質を結晶形で回収することを含んでなる、前記方法。２．前記方法が、水溶性ポリマーを添加する前に溶液の精製を含んでなる、請求の範囲第１項記載の方法。３．タンパク質含有溶液を、限外濾過、ダイアフィルトレーション、透析、蒸発又は沈殿により精製する、請求の範囲第２項記載の方法。４．タンパク質含有溶液を、0.1〜25％Ｗ／Ｗ、より好ましくは0.5〜15％Ｗ／Ｗ、最も好ましくは１〜10％Ｗ／Ｗのタンパク質含量に濃縮する、請求の範囲第２又は３項記載の方法。５．水溶性ポリマーが、グリコール又は複数のグリコールの混合物である、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の方法。６．グリコールが、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールである、請求の範囲第５項記載の方法。７．ポリエチレングリコールが、200〜10000の分子量を有する、請求の範囲第６項記載の方法。８．グリコールを、１−50％Ｗ／Ｗのグリコール、好ましくは２−40％Ｗ／Ｗのグリコールの濃度で添加する、請求の範囲第５〜７項のいずれか１項に記載の方法。９．塩を、1.5モルまでの濃度で、好ましくは1.0モルまでの濃度で複数のタンパク質の水性混合物に加える、請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載の方法。 10．加えられる塩が、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、カリウム又はアンモニウムの塩である、請求の範囲第９項記載の方法。 11．塩のアニオンが、クロリド、ホルミエート、アセタートおよびスルファートから成る群から選ばれる、請求の範囲第10項記載の方法。 12．溶液のpHを、結晶化の最適に調節する、請求の範囲第１〜11項のいずれか１項に記載の方法。 13．pHをpI±１に調節する、請求の範囲第12項記載の方法。 14．塩を、1.5モルまでの濃度で、好ましくは1.0モルまでの濃度で複数のタンパク質の水性混合物に添加し、次いで溶液のpHを結晶化の最適に調節する、請求の範囲第１〜13項のいずれか１項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/00 １０１ 9359−4ＢＣ１２Ｎ 9/00 １０１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ランケ−マッセン，アンデルスデンマーク国，デーコー―2920 シャルロッテンルント，コーレギエハーベン 36

Claims

【特許請求の範囲】１．複数のタンパク質の水性混合物からタンパク質を分離する方法であって、（ａ）水溶性ポリマーが添加された、1.5モル以下の濃度の塩と複数のタンパク質の水性混合物を準備し、（ｂ）タンパク質を結晶形で回収することを含んでなる、前記方法。２．前記方法が、水溶性ポリマーを添加する前に溶液の精製を含んでなる、請求の範囲第１項記載の方法。３．タンパク質含有溶液を、限外濾過、ダイアフィルトレーション、透析、蒸発、沈殿又はクロマトグラフィー法により精製する、請求の範囲第２項記載の方法。４．タンパク質含有溶液を、0.1〜25％Ｗ／Ｗ、より好ましくは0.5〜15％Ｗ／Ｗ、最も好ましくは１〜10％Ｗ／Ｗのタンパク質含量に濃縮する、請求の範囲第２又は３項記載の方法。５．タンパク質が酵素である、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の方法。６．酵素が、オキシドレダクターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又はアミラーゼである、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の方法。７．水溶性ポリマーが、グリコール又は複数のグリコールの混合物である、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法。８．グリコールが、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールである、請求の範囲第７項記載の方法。９．ポリエチレングリコールが、200〜10000の分子量を有する、請求の範囲第８項記載の方法。 10．グリコールを、１−50％Ｗ／Ｗのグリコール、好ましくは２−40％Ｗ／Ｗのグリコールの濃度で添加する、請求の範囲第７〜９項のいずれか１項に記載の方法。 11．塩を、1.5モルまでの濃度で、好ましくは1.0モルまでの濃度で複数のタンパク質の水性混合物に加える、請求の範囲第１〜10項のいずれか１項に記載の方法。 12．加えられる塩が、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、カリウム又はアンモニウムの塩である、請求の範囲第11項記載の方法。 13．塩のアニオンが、クロリド、ホルミエート、アセタートおよびスルファートから成る群から選ばれる、請求の範囲第12項記載の方法。 14．溶液のpHを、結晶化の最適に調節する、請求の範囲第１〜13項のいずれか１項に記載の方法。 15．pHをpI±１に調節する、請求の範囲第14項記載の方法。 16．塩を、1.5モルまでの濃度で、好ましくは1.0モルまでの濃度で複数のタンパク質の水性混合物に添加し、次いで溶液のpHを結晶化の最適に調節する、請求の範囲第１〜10項のいずれか１項に記載の方法。