DE69429172T2

DE69429172T2 - Trennung von proteinen

Info

Publication number: DE69429172T2
Application number: DE69429172T
Authority: DE
Inventors: Aage Laustsen; Mahler Nilsson; Anders Rancke-Madsen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1994-06-23
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2014-06-24
Also published as: US5728559A; ES2168300T3; CN1126477A; AU7121494A; FI112949B; EP0707594A1; CN1054159C; BR9407047A; DK0707594T3; JPH08512294A; DE69429172D1; WO1995001989A1; FI960073A0; EP0707594B1; FI960073A; ATE209214T1; PT707594E; DK83093D0

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen einer Oxidoreductase, einer Protease oder einer Cellulase von einer wässrigen Lösung von Proteinen und die Gewinnung des gewünschten Proteins in kristalliner Form.

ZUGRUNDELIEGENDER STAND DER TECHNIK

Enzyme werden für industrielle Zwecke üblicherweise als Flüssigkeiten oder amorphe Materialien bereitgestellt. Wenn sie nicht als Flüssigkeiten bereitgestellt werden, werden sie üblicherweise als amorphe Materialien bereitgestellt, da die bekannten Verfahren zum Kristallisieren von Enzymen üblicherweise als zu teuer angesehen werden, um in einem industriellen Maßstab verwendet zu werden. Aufgrund der hohen Reinheit von Enzymkristallen ist die Bereitstellung eines billigen und einfachen Verfahrens zum Kristallisieren von Enzymen, das leicht an einen industriellen Maßstab anpassbar ist, eindeutig ein Desideratum in der Industrie.
Es gibt eine große Vielzahl von Literatur, die die Kristallisation von Enzymen betrifft. Es ist schwierig, hinsichtlich des Ergebnisses spezieller Kristallisierungsprozeduren eine Verallgemeinerung vorzunehmen. Die Wissenschaft der Enzymkristallisation ist hochgradig empirisch und ein Verfahren, das sich für eine Gruppe von Enzymen als erfolgreich erwiesen hat, muss nicht für andere Enzyme erfolgreich sein.
U.S. 5,244,800 offenbart ein Verfahren zum Kristallisieren von menschlichem Komplement- Faktor D durch eine "hanging drop"-Technik (Hängetropfentechnik) unter Verwendung von NaCl und Polyethylenglycol.
U.S. 4,400,471 offenbart ein Verfahren zum Kristallisieren von Ribulose-1,5- biphosphatcarboxylase unter Verwendung von Polyethylenglycol.
EP 0 121 185 offenbart ein Verfahren zum Abtrennen von Protease und Amylase von einer Fermentationsbrühe unter Verwendung von Polymeren.
Charakteristische Eigenschaften der bislang bekannten Proteinkristallisierungsprozesse sind sehr reine und konzentrierte Ausgangslösungen, geringe Ausbeute, sehr lange Kristallisierungszeit, hoher Verbrauch an Chemikalien, einschließlich organischer Lösemittel, und schlechte Anpassbarkeit an industrielle Maßstäbe.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist ein Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung von kristallinen Proteinen, insbesondere Enzymen, bereitzustellen, welches Verfahren die Zugabe von großen Mengen von Salzen oder organischen Lösemitteln nicht erfordert, das kurze Kristallisierungszeiten und hohe Ausbeuten ermöglicht und das einfach und billig und mit industriellen Anforderungen verträglich ist.
Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zum Abtrennen eines Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Oxidoreductase, einer Protease und einer Cellulase, von einer Kulturbrühe, bereit, das umfasst
(a) eine wässrige Mischung von Proteinen mit einer Salzkonzentration von oder unter 1,5 molar bereitzustellen, zu der ein Glycol zugesetzt worden ist, und der pH wird auf den Optimalwert für die Kristallisation eingestellt;
(b) das Protein in kristalliner Form zu gewinnen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Erfindung wird weitergehend durch Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen veranschaulicht. Es zeigen:
Fig. 1 die Peroxidase-Kristallisierungsausbeute (%) bei verschiedenen PEG 4000- Konzentrationen und verschiedenen CaCl&sub2;-Konzentrationen ( 1% CaCl&sub2;; 2% CaCl&sub2; und 2,5% CaCl&sub2;).
Fig. 2 die Peroxidase-Kristallisierungsausbeute (%) bei verschiedenen pH-Werten.
Fig. 3 die Peroxidase-Kristallisierungsausbeute (%) bei verschiedenen Enzym- und PEG 4000-Konzentrationen ( 3% Peroxidase und 1,4% andere Enzyme; 4,8% Peroxidase und 2,3% andere Enzyme und 6,7% Peroxidase und 3,1% andere Enzyme).
Fig. 4 die Katalase-Kristallisierungsausbeute (%) bei verschiedenen CaCl&sub2;- Konzentrationen und bei verschiedenen PEG 4000-Konzentrationen ( 20% PEG 4000; 22% PEG 4000; 24% PEG 4000; 26% PEG 4000; 28% PEG 4000 und_30% PEG 4000)
Fig. 5 die Katalase-Kristallisierungsausbeute (%) bei verschiedenen CaCl&sub2;- Konzentrationen und bei verschiedenen PEG 4000-Konzentrationen ( 20% PEG 4000; 25% PEG 4000.
Fig. 6 die Katalase-Kristallisierungsausbeute bei verschiedenen PEG 1500- Konzentrationen und einer CaCl&sub2;-Konzentration von 0.2%.
Fig. 7 die Protease-Kristallisierungsausbeute (%) bei verschiedenen PEG 4000- Konzentrationen.
Fig. 8 die Protease-Kristallisierungsausbeute (%) bei verschiedenen PEG 4000- Konzentrationen und bei einer CaCl&sub2;-Kon-zentration von 1,1%.

DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Abtrennen einer Oxidoreductase, einer Protease oder einer Cellulase von einer andere Proteine mit unterschiedlichen Kristallisierungseigenschaften umfassenden wässrigen Mischung bereit. Es ist überraschenderweise festgestellt worden, dass durch Zugeben eines Glycols, z. B. von Polyethylenglycol, das Enzym von dessen Mischung mit anderen Proteinen und anderen Verunreinigungen, wie Kohlenhydratverbindungen, abgetrennt werden und in kristalliner Form präzipitieren kann.
Die Präzipitation und Kristallisation von Proteinen mit Polyethylenglycol (PEG) ist aus der Literatur zusammen mit der Verwendung von PEG zur Modifizierung von Kristallen für die Kristallographie bekannt. Die Verwendung von PEG ist offenbart worden, um Kristalle für eine Beugungsanalyse zu erhalten, für Referenzen siehe A. McPherson in Eur. J. Biochem. 189, 1990, S. 1-23; R.N. Haire et al. in Biopolymers Band 23 (12), 1984, S. 2761-2779; und J.C. Lee et al. in J. Biol. Chem. 256 2, 1981, S. 625-631.
Es ist allgemein anerkannt, dass ein Teil des Mechanismus, durch welchen PEG wirkt, ein Aussalzungseffekt kombiniert mit einer Verringerung der dielektrischen Eigenschaften der Lösung - ähnlich wie für durch Salz und organisches Lösemittel induzierte Kristallisationen - ist. Abgesehen davon scheint PEG unter bestimmten Bedingungen in der Lage zu sein, Protein aus der Lösung auszuschließen, indem die thermodynamische Aktivität des Proteins erhöht wird, was zu einer amorphen PEG-armen Phase führt, aus der sich das amorphe Proteinpräzipitat potentiell in Proteinkristalle umwandeln kann, siehe R.N. Haire et al. in Biopolymers Band 23(12), 1984, S. 2761-2779.
Eine andere Verwendung von PEG für die Proteinkristallisierung ist die Erzeugung eines wässrigen Zwei-Phasen-Systems durch die Verwendung von PEG und hohen Salzkonzentrationen gewesen, bei der das Protein in der PEG-Phase konzentriert ist, die Kristallkeimbildung in der Interphase stattfindet und das Kristallwachstum in der Wasserphase auftritt, wobei die Antriebskraft die hohe Salzkonzentration ist; für eine Referenz siehe Eur. J. Biochem. 189, 1990, S. 1-23.
Aus Untersuchungen gemäß der Erfindung scheint ein unterschiedlicher und überraschender Mechanismus die Erklärung für die Kristallisationen zu sein, wobei der fundamentale Unterschied darin besteht, dass die Kristallisation von einer Affinität zwischen den PEG-Molekülen und dem Protein bei einer relativ niedrigen Salzkonzentration angetrieben wird. Das Ergebnis davon ist eine Phasentrennung, wo das Protein in einer löslichen Form in Mikrotröpfchen, in welchen Kristallkeimbildung und Kristallwachstum stattfinden, konzentriert ist, wie nachfolgend beschrieben:
Wenn PEG der Proteinlösung zugesetzt wird (in Konzentrationen, die an sich kein 2-Phasen- System erzeugen), wird Protein mit einer Affinität zu PEG sich mit den PEG-Molekülen assoziieren, was eine inhomogene Lösung erzeugt, die sich bei der richtigen relativen Molekülmasse des PEG, der richtigen PEG-Konzentration, der richtigen Salzkonzentration und Proteinkonzentration zu einem System entwickeln kann, das aus einer Wasserphase mit einer verringerten Proteinkonzentration und Mikrotröpfchen mit einer sehr hohen Proteinkonzentration besteht. Dieses System scheint sich recht deutlich von einem normalen wässrigen Zwei-Phasen-System zu unterscheiden, da die Phasen durch traditionelle Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit nicht voneinander getrennt werden können; jedoch ist es bei einer Ultrazentrifugation (beispielsweise wie in Beispiel 11 beschrieben) möglich, zwei Phasen zu sehen.
In den Tröpfchen mit hoher Proteinkonzentration und wahrscheinlich unter einem gewissen Ausschluss von Verunreinigungen treten optimale Bedingungen für eine Kristallbildung auf. Die Kristalle nehmen dann offensichtlich in den Tröpfchen Form an, bis sie eine Größe erreichen, wo sie aus den Tröpfchen herausplatzen könnten, was ein normales wässriges Ein- Phasen-System mit festen Kristallen am Ende der Kristallisation erzeugt. Jedoch kann das System abhängig von dem fraglichen Protein ebenfalls als Zwei-Phasen-System enden, wobei sich der Hauptteil der Kristalle nach wie vor in der Tröpfchenphase befindet. Beispiele von Kristallwachstum, das sowohl in der Tröpfchenphase als auch ausgehend von der Oberfläche der Tröpfchen hinaus in die umgebende Lösung auftritt, sind ebenfalls beobachtet worden.
Dieser vorgeschlagene Mechanismus, wo das Protein in einem Zwei-Phasen-Tröpfchen- System, wobei das Protein in einer gereinigten und konzentrierten Form vorliegt, durch die Affinität zwischen einem wasserlöslichen Polymer und dem Protein kristallisiert wird, legt nahe, dass die Technik sogar für gering konzentrierte und unreine Proteinlösungen sehr wirkungsvoll sein kann.
Das Verfahren der Erfindung kann auf die Abtrennung eines Enzyms von einer Mischung von Proteinen angewendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Enzym enthaltende Lösung eine Kulturbrühe, die durch Kultivierung eines Enzym produzierenden Mikroorganismus erhalten worden ist. Vorzugsweise wird das Verfahren der Erfindung auf eine Kulturbrühe angewendet, die zuerst Fest/Flüssig-Trenntechniken, z. B. durch Ausflocken, Zentrifugation, Filtration oder Mikrofiltration, unterworfen worden ist. Es kann auch nützlich sein, vor der Kristallisation eine Reinigung durch Präzipitation oder Verwendung von chromatographischen Verfahren vorzunehmen.
In einer spezielleren Ausführungsform umfasst das Verfahren der Erfindung die Konzentrierung der Enzym enthaltenden Lösung durch an sich bekannte Verfahren. Solche Verfahren umfassen Konzentration durch Ultrafiltration, durch Diafiltration, durch Dialysieren oder durch Eindampfen.
Eine Konzentrierung der Protein enthaltenden Lösung, obwohl sie für das Ausführen der Kristallisation nicht essentiell ist, bietet sich aus der Perspektive von Handhabung und Ausbeute an. Aus praktischen Gründen kann die Enzym enthaltende Lösung auf einen Gehalt an Enzymprotein von 0,1 bis 25% (Gew./Gew.), mehr bevorzugt von 0,5 bis 15% (Gew./Gew.), am meisten bevorzugt von 1 bis 10% (Gew./Gew.) konzentriert werden.
Das Verfahren wird auf die Abtrennung von Oxidoreductasen, Proteasen und Cellulasen angewendet. Oxidoreductasen, die in "Enzyme Nomenclature 1992, Academic press, Inc., San Diego" definiert und beschrieben werden, gehören zu einer Klasse von Enzymen, die den Transfer von Elektronen von einer Substanz zu einer anderen (Oxidation-Reduktion) katalysieren. Oxidoreductasen umfassen Dehydrogenasen, Reductasen, Oxidasen, Transhydrogenasen, Katalasen, Peroxidasen und Oxygenasen.
Speziellere Beispiele umfassen Meerrettich-Peroxidase, Ligninasen und andere Peroxidasen und Oxidasen, wie Laccasen. Diese Enzyme sind vorzugsweise von mikrobiellem Ursprung.
Beispiele von Mikroorganismen-Gattungen, die für die Produktion von geeigneten Oxidoreductasen verwendet werden können, sind: Trametes, Rhizoctonia, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Hygrophorus, Coprinus, Polyporus, Candida, Curvularia, Cercospora, Mycoliophthora, Aspergillus und Scytalidium. Die Erfindung ist jedoch nicht auf Enzyme, die von den oben erwähnten Taxa abgeleitet sind, beschränkt. Alle Mikroorganismen, die Oxidoreductasen mit den gewünschten Eigenschaften produzieren, können in Hinblick auf diese Erfindung verwendet werden.
Die Oxidoreductase ist vorzugsweise eine Laccase (EC 1.10.3.2), eine Katalase (EC 1.11.1.6), eine Peroxidase (EC 1.11.1.7) oder eine Oxidase.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren der Erfindung auf eine Peroxidase enthaltende Lösung und auf eine Katalase enthaltende Lösung angewendet.
Eine geeignete Peroxidase ist eine, die durch Pflanzen (z. B. Meerrettich-Peroxidase) oder Mikroorganismen, wie Pilze oder Bakterien, produziert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Peroxidase von Coprinus, z. B. C. cinereus oder C. macrorhizus, oder von Bacillus, z. B. B. pumilus, abgeleitet, insbesondere eine Peroxidase gemäß der Internationalen Patentanmeldung WO 91/05858.
Das Enzym kann darüber hinaus eines sein, das produziert werden kann durch ein Verfahren, das umfasst, eine Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Vektor transformiert worden ist, der eine DNA-Sequenz, die das Enzym codiert, wie auch DNA-Sequenzen, die Funktionen codieren, die die Expression der das Enzym codierenden DNA-Sequenz erlauben, enthält, in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression des Enzyms erlauben, zu kultivieren und das Enzym aus der Kultur zu gewinnen.
Insbesondere ist eine rekombinant produzierte Peroxidase eine Peroxidase gemäß WO 92/16634, die von einer Coprinus-Spezies, insbesondere C. macrorhizus oder C. cinereus, abgeleitet ist.
Katalasen sind sowohl aus tierischen Quellen (z. B. Rinderleber) als auch von vielen unterschiedlichen Mikroorganismen bekannt. JP-Patentanmeldung 2-76579 offenbart Katalase aus dem Aspergillus niger-Stamm NFAG-2. Das GB-Patent Nr. 2,216,149 offenbart Katalase aus Penicillium. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Katalase aus Stämmen von Scytalidium und Humicola erhalten, wie in WO 92/17571 beschrieben.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Enzym eine Protease. Geeignete Proteasen umfassen jene von tierischem, pflanzlichem oder mikrobiellem Ursprung. Mikrobieller Ursprung ist bevorzugt. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten werden mit umfasst. Es kann sich um eine Serinprotease, vorzugsweise eine mikrobielle alkalische Protease, oder eine Trypsin-artige Protease handeln. Beispiele von alkalischen Proteasen sind Subtilisine, speziell jene, die von Bacillus abgeleitet sind, z. B. Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin 309, Subtilisin 147 und Subtilisin 168 (beschrieben in WO 89/06279). Beispiele von kommerziell erhältlichen Bacillus-Subtilisinen sind die Alcalase®-, Savinase®-, Esperase®- und Durazym®-Produkte von Novo Nordisk A/S. Beispiele von Trypsin-artigen Proteasen sind Trypsin (z. B. von Schweine- oder Rinder- Ursprung) und die in WO 89/06270 beschriebene Fusarium-Protease.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Enzym eine Cellulase. Geeignete Cellulasen umfassen jene von bakteriellem und pilzlichem Ursprung, Cellulasen aus Pilzen sind besonders bevorzugt. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten werden mit umfasst. Beispiele von Pilzen, die für die Produktion von geeigneten Cellulasen verwendet werden können, sind: Trichoderma, Phanerochaete, Humicola, Fusarium und Myceliophthora.
Das Verfahren der Erfindung umfasst ferner die Zugabe eines Glycols. Mehr bevorzugt sind Polyethylenglycol und Polypropylenglycol. Am meisten bevorzugt sind Polyethylenglycole mit einer relativen Molekülmasse von 200 bis 10000.
Wasserlösliche Polymere können in Konzentrationen von 1-50% (Gew./Gew.), vorzugsweise 2-40% (Gew./Gew.) zugesetzt werden.
Gemäß der Erfindung kann das Verfahren zusätzlich das Zugeben eines Salzes in einer Konzentration von bis zu 1,5 molar, vorzugsweise in einer Konzentration von bis zu 1,0 molar umfassen.
Bevorzugte Salze sind Salze von Magnesium, Calcium, Natrium, Kalium und Ammonium. Am meisten bevorzugt sind Salze, bei denen das Anion aus der Gruppe, bestehend aus Chlorid, Formiat, Acetat und Sulfat, ausgewählt ist.
Durch das Verfahren der Erfindung wird der pH der konzentrierten wässrigen Lösung, zu der ein wasserlösliches Polymer zugesetzt worden ist, auf den Optimalwert für die Kristallisation eingestellt; in einigen Fällen befindet sich der Optimalwert für die Kristallisation um den pI des Enzyms herum. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der pH auf ein Niveau von pH = pI ± 1 eingestellt.
Für das Einstellen des pH kann praktisch jede Säure oder Base verwendet werden. Die Säure kann anorganisch oder organisch sein. Einige Beispiele sind Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetrigsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Citronensäure und Ameisensäure. Bevorzugte Säuren sind Ameisensäure, Citronensäure und Essigsäure. Eine bevorzugte Base ist Natriumhydroxid.
Ein Salz wird der wässrigen Mischung von Proteinen in einer Konzentration von bis zu 1,5 molar, vorzugsweise in einer Konzentration von bis zu 1,0 molar zugesetzt und der ph der Lösung wird auf den Optimalwert für die Kristallisation eingestellt.
Das Verfahren der Erfindung bewirkt, dass das Enzym in kristalliner Form präzipitiert. Die Gewinnung des kristallinen Proteins kann durch herkömmliche Methoden, z. B. durch Filtration und nachfolgendes Trocknen, oder durch erneutes Auflösen der Kristalle für die Herstellung von flüssigen Proteinprodukten bewerkstelligt werden.

BEISPIEL 1

Wirkung von wasserlöslichem Polymer

Eine wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 505,311 beschrieben erhaltene Kulturbrühe, die Coprinus cinereus-Peroxi-dase enthält, wurde dem Verfahren der Erfindung unterworfen.
Anfänglich wurde die Kulturbrühe einer Fest/Flüssig-Trennung durch Zentrifugation unterworfen. Es wurde ein Ultrafiltrat erhalten, das 5, 5% (Gew./Gew.) DS (Trockensubstanz) Peroxidaseprotein und 2,4% (Gew./Gew.) DS andere Enzyme enthält.
Polyethylenglycol (PEG 4000) und CaCl&sub2;·2H&sub2;O wurden in unterschiedlichen Mengen zugesetzt (siehe Fig. 1) und der pH wurde durch Zugabe von Ameisensäure auf pH 4,0 eingestellt. Die Lösung wurde 24 h bei 28ºC gerührt.
Die Kristallisierungsausbeuten bei verschiedenen PEG- und Salzkonzentrationen ( 1% CaCl&sub2;; 2% CaCl&sub2; und 2,5% CaCl&sub2;) sind in eigefügten Fig. 1 gezeigt.

BEISPIEL 2

Wirkung des pH

Eine wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 505,31 I beschrieben erhaltene Kulturbrühe, die Coprinus cinereus-Peroxi-dase enthält, wurde dem Verfahren der Erfindung unterworfen.
Anfänglich wurde die Kulturbrühe einer Fest/Flüssig-Trennung durch Zentrifugation unterworfen. Es wurde ein Ultrafiltrat erhalten; das 5,5% (Gew./Gew.) DS (Trockensubstanz) Peroxidaseprotein und 2,4% (Gew./Gew.) DS andere Enzyme enthält.
Zu dieser Lösung wurden 20% (Gew./Gew.) Polyethylenglycol (PEG 4000) und 1,5% (Gew./Gew.) CaCl&sub2;·2H&sub2;O zugesetzt und der pH wurde mit Ameisensäure auf verschiedene pH-Werte eingestellt. Die Lösung wurde 24 h bei 28ºC gerührt.
Die Kristallisierungsausbeuten bei verschiedenen pH-Werten sind in der beigefügten Fig. 2 gezeigt.

BEISPIEL 3

Einfluss von Konzentrationen

Eine wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 505,311 beschrieben erhaltene Kulturbrühe, die Coprinus cinereus-Peroxi-dase enthält, wurde dem Verfahren der Erfindung unterworfen.
Anfänglich wurde die Kulturbrühe einer Fest/Flüssig-Trennung durch Zentrifugation unterworfen. Nachfolgend wurden mehrere Ultrafiltrate, die unterschiedliche Konzentrationen an Peroxidaseprotein und anderen Enzymen enthielten, erhalten.
Zu jeder dieser Lösungen wurde 1,5% (Gew./Gew.) CaCl&sub2;·2H&sub2;O zugesetzt. Polyethylenglycol (PEG 4000) wurde in unterschiedlichen Mengen zugesetzt. Der pH wurde mit Ameisensäure auf pH 4,0 eingestellt und die Lösungen wurden 24 h bei 28ºC gerührt.
Die Kristallisierungsausbeuten bei verschiedenen Enzym- und PEG-Konzentrationen ( 3% Peroxidase und 1,4% andere Enzyme; 4,8% Peroxidase und 2, 3% andere Enzyme und 6, 7% Peroxidase und 3,1% andere Enzyme) sind in der beigefügten gezeigt.

BEISPIEL 4

Kristallisierung von Katalase

Eine wie in WO 92/17571 beschrieben erhaltene Kulturbrühe, die Scytalidium thermofilum- Katalase enthält, wurde dem Verfahren der Erfindung unterworfen.
Anfänglich wurde die Kulturbrühe einer Fest/Flüssig-Trennung durch Ausflockung und Filtration unterworfen. Nachfolgend wurde das Filtrat durch Eindampfen und Ultra-/Diafiltration konzentriert. Das Konzentrat enthielt 1, 2% (Gew./Gew.) DS (Trockensubstanz) Katalaseprotein und 5, 5% (Gew./Gew.) Trockensubstanz insgesamt.
Polyethylenglycol (PEG 4000) und CaCl&sub2;·2H&sub2;O wurden in unterschiedlichen Mengen zugesetzt (siehe Fig. 4) und der pH wurde auf pH 6,8 eingestellt. Die Lösung wurde 48 h bei 28ºC gerührt.
Die Kristallisierungsausbeuten bei verschiedenen CaCl&sub2;-Konzentrationen und bei verschiedenen PEG 4000-Konzentrationen sind in der beigefügten Fig. 4 gezeigt.
( 20% PEG 4000; 22% PEG 4000; 24% PEG 4000; 26% PEG 4000; % PEG 4000 und 30% F 000).

BEISPIEL 5

Kristallisierung von Katalase

Eine wie in WO 92/17571 beschrieben erhaltene Kulturbrühe, die Scytalidium thermofilum- Katalase enthält, wurde dem Verfahren der Erfindung unterworfen.
Anfänglich wurde die Kulturbrühe einer Fest/Flüssig-Trennung durch Ausflockung und Filtration unterworfen. Nachfolgend wurde das Filtrat durch Eindampfen konzentriert. Das Konzentrat enthielt 0,28% (Gew./Gew.) DS (Trockensubstanz) Katalaseprotein und 9,2% (Gew./Gew.) Trockensubstanz insgesamt.
Polyethylenglycol (PEG 4000) und CaCl&sub2;·2H&sub2;O wurden in unterschiedlichen Mengen zugesetzt (siehe Fig. 5) und der pH wurde auf pH 6,0-6,5 eingestellt. Die Lösung wurde 48 h bei 28ºC gerührt.
Die Kristallisierungsausbeuten bei verschiedenen CaCl&sub2;-Konzentrationen und bei verschiedenen PEG 4000-Konzentrationen ( 20% PEG 4000 und 25% PEG 4000) sind in der beigefügten Fig. 5 gezeigt.

BEISPIEL 6

Kristallisierung von Katalase

Eine wie in WO 92/17571 beschrieben erhaltene Kulturbrühe, die Scytalidium thermofilum- Katalase enthält, wurde dem Verfahren der Erfindung unterworfen.
Anfänglich wurde die Kulturbrühe einer Fest/Flüssig-Trennung durch Ausflockung und Filtration unterworfen. Nachfolgend wurde das Filtrat durch Eindampfen konzentriert. Das Konzentrat enthielt 0,28% (Gew./Gew.) DS (Trockensubstanz) Katalaseprotein und 9,2% (Gew./Gew.) Trockensubstanz insgesamt.
Polyethylenglycol (PEG 1500 und CaCl&sub2;·2H&sub2;O wurden in unterschiedlichen Mengen zugesetzt (siehe Fig. 6) und der pH wurde auf pH 6,5-7,0 eingestellt. Die Lösung wurde 48 h bei 28ºC gerührt.
Die Kristallisierungsausbeuten bei verschiedenen PEG 1500-Konzentrationen und einer CaCl&sub2;-Konzentration von 0,2% sind in der beigefügten Fig. 6 gezeigt.

BEISPIEL 7

Kristallisierung von Protease

Eine Protease (Savinase®) aus Bacillus lentus (U.S.-Patent Nr. 3,723,250) enthaltende Kulturbrühe wurde dem Verfahren der Erfindung unterworfen.
Anfänglich wurde die Kulturbrühe einer Fest/Flüssig-Trennung durch Ausflockung und Zentrifugation unterworfen. Nachfolgend wurde der Überstand durch Ultrafiltration konzentriert. Das Konzentrat enthielt 9,2% (Gew./Gew.) DS (Trockensubstanz) Proteaseprotein und 19,6% (Gew./Gew.) Trockensubstanz insgesamt. Die Leitfähigkeit betrug 1,55 mS/cm.
Polyethylenglycol (PEG 4000) wurde in unterschiedlichen Mengen zugesetzt (siehe Fig. 7) und der pH wurde auf pH 5,6 eingestellt. Die Lösung wurde 24 h bei 28ºC gerührt. Die Kristallisierungsausbeuten bei verschiedenen PEG-Konzentrationen sind in der beigefügten Fig. 7 gezeigt.

BEISPIEL 8

Kristallisierung von Protease

Eine Protease (Savinase®) aus Bacillus lentus (U.S.-Patent Nr. 3,723,250) enthaltende Kulturbrühe wurde dem Verfahren der Erfindung unterworfen.
Anfänglich wurde die Kulturbrühe einer Fest/Flüssig-Trennung durch Ausflockung und Zentrifugation unterworfen. Nachfolgend wurde der Überstand durch Ultrafiltration konzentriert. Das Konzentrat enthielt 9,2% (Gew./Gew.) DS (Trockensubstanz) Proteaseprotein und I9,6% (Gew./Gew.) Trockensubstanz insgesamt. Die Leitfähigkeit betrug 1,55 mS/cm.
Polyethylenglycol (PEG 4000) wurde in unterschiedlichen Mengen zusammen mit 1, 1% (Gew./Gew.) CaCl&sub2;·2H&sub2;O zugesetzt und der pH wurde auf pH 5, 6 eingestellt. Die Lösung wurde 24 h bei 28ºC gerührt.
Die Kristallisierungsausbeuten bei den verschiedenen PEG-Konzentrationen sind in der beigefügten Fig. 8 gezeigt.

BEISPIEL 9

Kristallisierung von Lipase (nur Vergleichsbeispiel)

Ein wie in EP 0 214 761 beschrieben erhaltenes Konzentrat, das Lipase aus Pseudomonas ce aciae enthielt, wurde dem Verfahren der Erfindung unterworfen.
Dem Konzentrat, das 2,1% (Gew./Gew.) DS Lipaseprotein und 20% (Gew./Gew.) DS insgesamt enthält, wurden 31% PEG 4000 bei pH 7, 8 zugesetzt. Die Lösung wurde 24 h bei 28ºC gerührt.
Die Kristallisierungsausbeute betrug dann 47%.

BEISPIEL 10

Kristallisierung von Cellulase

Wie in WO 91/17244 beschrieben erhaltene Humicola insolens-Cellulase wurde durch Fermentation produziert und durch Filtration, Ultrafiltration und Diafiltration mit Wasser, das einem Ionenaustausch unterworfen worden war, gewonnen.
Die konzentrierte Cellulaselösung hatte eine Enzymkonzentration von 105 g/l, eine Enzymreinheit von 58% des Trockenmassegehalts und eine Proteinreinheit von 88%. Der pH betrug 7,0 und die Leitfähigkeit betrug 607 uS.
39,6 g PEG 300 pro 100 g Cellulaselösung wurden unter Rühren zugesetzt. Die Temperatur betrug 27ºC. Nach 20 h wurden die Kristalle durch Zentrifugation geerntet und in 0,5% NaCl- Lösung erneut gelöst. Die Kristallausbeute betrug 83%, bestimmt anhand von Enzymaktivität, mit einer Cellulaseproteinreinheit von 100%.

BEISPIEL 11

Charakterisierung des PEG/Enzym-Systems

Wenn PEG und Salz einem Enzymkonzentrat zugesetzt werden, werden enzymreiche Mikrotröpfchen gebildet und es findet innerhalb dieser Tröpfchen eine Kristallisation statt. Die zwei Phasen können durch Ultrazentrifugation getrennt werden.
Eine wie in EP 505 311 beschrieben erhaltene Kulturbrühe, die Coprinus cinereus-Peroxidase enthält, wurde dem Verfahren der Erfindung unterworfen.
Anfänglich wurde die Kulturbrühe einer Fest/Flüssig-Trennung durch Zentrifugation unterworfen. Es wurde ein Ultrafiltrat, das 5,1% (Gew./Gew.) DS (Trockensubstanz) Peroxidaseprotein enthielt, erhalten. Dem Konzentrat wurden 20% PEG 4000 und 1,5% (Gew./Gew.) CaCl&sub2;·2H&sub2;O zugesetzt und der ph wurde auf pH 4,0 eingestellt. Unmittelbar nach dem Mischen wurden in der Flüssigkeit Mikrotröpfchen mittels eines Mikroskops beobachtet. Durch Ultrazentrifugation (27000 g in 15 min) konnten zwei Phasen getrennt werden. Der Peroxidasegehalt wird als A&sub4;&sub0;&sub5; gemessen und mit dem bei A&sub2;&sub8;&sub0; gemessenen Gesamtproteingehalt verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Es kann ersehen werden, dass die Peroxidase innerhalb dieser Mikrotröpfchen konzentriert und gereinigt ist. Tabelle 1
*)
Bestimmung der Peroxidaseaktivität (POXU): 1 Peroxidaseeinheit (POXU) ist die Menge von Enzym, die die Umwandlung von 1 umol Wasserstoffperoxid pro Minute unter den folgenden Analysebedingungen katalysiert: 2,0 mM Wasserstoffperoxid, 0,46 mM 2,2'-Azinobis(3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonat), 0,086 M Phosphatpuffer, pH 7,0, inkubiert bei 40ºC, photometrisch bei 418 nm verfolgt. 1 KPOXU = 1000 POXU.

Claims

1. Verfahren zum Abtrennen eines Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Oxidoredutase, einer Protease und einer Cellulase, von einer Kulturbrühe, das umfasst:

(a) eine wässrige Mischung von Proteinen mit einer Salzkonzentration von oder unter 1, 5 molar bereitzustellen, der ein Glycol zugesetzt worden ist, und der pH der wässrigen Mischung von Proteinen wird auf den Optimalwert für die Kristallisation eingestellt;

(b) das Protein in kristalliner Form zu gewinnen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem die wässrige Mischung von Proteinen bis zu einem Proteingehalt von 0,1 bis 25% (Gew./Gew.), mehr bevorzugt von 0,5 bis 15% (Gew./Gew.), am meisten bevorzugt von 1 bis 10% (Gew./Gew.) konzentriert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Glycol Polyethylen-glycol oder Polypropylenglycol, vorzugsweise Polyethylen-glycol ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, in dem das Polyethylenglycol eine relative Molekülmasse von 200 bis 10000 hat.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem das Glycol in Konzentrationen von 1 bis 50% (Gew./Gew.) Glycol, vorzugsweise 2 bis 40% (Gew./Gew.) Glycol zugesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in dem der wässrigen Mischung von Proteinen ein Salz in einer Konzentration von bis zu 1, 5 molar, vorzugsweise in einer Konzentration von bis zu 1,0 molar zugesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, in dem das zugesetzte Salz ein Salz von Magnesium, Calcium, Natrium, Kalium oder Ammonium ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, in dem das Anion des Salzes aus der Gruppe, bestehend aus Chlorid, Formiat, Acetat und Sulfat, ausgewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der pH auf pI ± 1 eingestellt wird.