DE69626976T2

DE69626976T2 - BEHANDLUNG EINER PROTEINLÖSUNG MIT A1/Fe UND ANSCHLIESENDE MEMBRANKONZENTRATION

Info

Publication number: DE69626976T2
Application number: DE69626976T
Authority: DE
Inventors: Torben Kjaersgaard Nielsen; Mads Aage Laustsen; Niels-Viktor Nielsen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1995-06-02
Filing date: 1996-05-31
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2016-06-01
Also published as: ATE235506T1; EP0828753A1; JPH11511118A; DE69626976D1; EP0828753B1; IN181859B; DK0828753T3; CN1114613C; AU5996996A; CN1186498A; WO1996038469A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein einfaches und effektives Verfahren zur Aufreinigung eines Proteins, insbesondere eines Enzyms, das aus einer Proteinlösung, z. B. einer Fermentationslösung, erhalten wurde.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Die Verwendung von Al-Verbindungen zur Fällung von Verunreinigungen aus Fermentationslösungen vor der Verdampfung und Fällung mit amorphem Salz ist bekannt (siehe als Referenz WO 94/01537 und US-A-3,795,586). Vakuumverdampfung ist aber vom Gesichtspunkt des Energieverbrauchs teuer. Weiterhin ist nur ein kleiner Konzentrationsfaktor in dem Verdampfungsverfahren aufgrund einer hohen Salz- und einer geringen Molekulargewichtskomponentenmenge in einer fermentierten Lösung möglich. Eine Fällung mit amorphem Salz z. B. mit Na₂SO₄ oder (NH₄)₂SO₄ verbraucht eine hohe Menge an Salz und das Verfahren ist für die Proteinaufreinigung kein effizienter Einheitsarbeitsvorgang.
Membrankonzentration, z. B. UF-Konzentration ist zur Proteinkonzentration weit verbreitet, da das Verfahren durch Auswaschen von Salzen und kleinen Komponenten möglicherweise eine wirksamere Konzentration ergeben sollte, als das, was möglich ist, wenn Vakuumverdampfung verwendet wird. Die Membranfiltration ist aber oft bzgl. der Kapazität erschwert, weshalb Ausrüstung großer Größe und daher hoher Energieverbrauch notwendig sind, und ist weiterhin oft bzgl. der Effizienz erschwert, was nur einen begrenzten Konzentrationsfaktor erlaubt. Es ist daher in der Technik ein Wunsch, Verfahrensabläufe zu entwickeln, um die oben genannten Probleme zu überwinden.
WO 90/13632 beschreibt ein Verfahren zum Aufreinigen von Enzymflüssigkonzentraten durch Zufügen eines Aluminiumsalzes zu einer Enzymlösung bei einem pH-Wert zwischen 5 und 11 und, wenn gewünscht, anderen fällenden Agenzien.
WO 92/09687 beschreibt ein Verfahren zum Abtrennen exozellulärer Proteine aus Mikroorganismen aus einer filtrierten Fermentationsflüssigkeit. Die Entfernung der Feststoffe ist verbessert, wogegen nützliche Substanzen behalten werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Überraschenderweise wurde gefunden, dass eine Fermentationslösung, die mit einer löslichen Fe- und/oder Al-Verbindung behandelt wurde, besonders gut zur Membrankonzentration geeignet ist, was in einem signifikanten Kapazitätsgewinn resultiert.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Aufreinigung eines Proteins zur Verfügung, das aus einer wässrigen Proteinlösung erhalten wurde, enthaltend

(a) Behandlung der Proteinlösung mit einer löslichen Fe- und/oder Al-Verbindung bei einem pH zwischen 4 und 9;
(b) Behandlung der Proteinlösung mit einem Salz und einem organischen Polymer;
(c) Klärung der Proteinlösung; und
(d) Membrankonzentration dieser Proteinlösung.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung ist weiter durch Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen veranschaulicht, in denen 1 zeigt eine Ultrafiltrationsdurchführung einer Proteaselösung bei drei verschiedenen Aluminatdosierungen (
: 0,8 kg NaAlO₂ pro 100 kg Fermentationslösung; +: 1,6 kg NaAlO₂ pro 100 kg Fermentationslösung; *: 2,4 kg NaAlO₂ pro 100 kg Fermentationslösung); der Versuch wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgefihrt.
2 zeigt eine Ultrafiltrationsdurchführung einer Amylaselösung bei drei verschiedenen Aluminatdosierungen (
: 0 kg NaAlO₂ por 100 kg Fermentaionslö- sung; +: 1 kg NaAlO₂ pro 100 kg Fermentationslösung; *: 4,2 kg NaAlO₂ pro 100 kg Fermentationslösung); der Versuch wurde wie in Beispiel 2 beschrieben dwchgeführt.
3 zeigt eine Ultrafiltrationsdurchführung einer Proteaselösung mit/ohne einer vorhergehenden Aluminiumsulfatbehandlung (
: 0,7 kg 30% Al₂(SO₄)₃ × 18H₂O pro 1,54 kg Fermentationslösung; ⧠: 0 kg Al₂(SO₄)₃ × 18H₂O pro 1,54 kg Fermentationslösung); der Versuch wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt.
4 zeigt eine Ultrafiltrationsdwchführiing einer Proteaselösung mit/ohne einer vorhergehenden Eisensulfatbehandlung (⧠: 0,177 kg 30% Fe₂(SO₄)₃ × 7H₂O pro 1,54 kg Fermentationslösung;
: 0 kg Fe₂(SO₄)₃ × 7H₂O pro 1,54 kg Fermentationslösung); der Versuch wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgefihrt.
AUSFÜHRLICHE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Aufreinigung eines Proteins zur Verfügung, das aus einer wässrigen Proteinlösung erhalten wurde, enthaltend

(a) Behandlung der Proteinlösung mit einer löslichen Fe- und/oder A1-Verbindung bei einem pH zwischen 4 und 9;
(b) Behandlung der Proteinlösung mit einem Salz und einem organischen Polymer;
(c) Klärung der Proteinlösung; und
(d) Membrankonzentration dieser Proteinlösung.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf die Aufreinigung eines Proteins, das aus einer wässrigen Proteinlösung erhalten wurde, insbesondere auf die Aufreinigung eines Proteins wie zum Beispiel eines Enzyms aus einer Fermentationslösung, angewandt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren angewandt auf die Aufreinigung von Proteasen, Lipasen, Amylasen, Celtuiasen und Oxidoreduktasen.
Proteasen: Geeignete Proteasen schließen solche tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs ein. Mikrobieller Ursprung ist bevorzugt. Chemisch oder genetisch veränderte Mutanten sind eingeschlossen. Die Protease kann eine Serinprotease, vorzugsweise eine basische mikrobielle Protease oder eine Trypsinähnliche Protease sein. Beispiele von basischen Proteasen sind Subtilisine, insbesondere solche hergestellt aus Bacillus, z. B. Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin 309, Subtilisin 147 und Subtilisin 168 (beschrieben in WO 89106274). Beispiele von Trypsin-ähnlichen Proteasen sind Trypsin (z. B. schweinischen oder bovinen Ursprungs) und die Fusarium-Protease, beschrieben in WO 89/06270.
Bevorzugte kommerziell erhältliche Proteaseenzyme schließen ein solche, die unter den Handelsnamen Alcalase, Savinase, Primase, Durazym und Esperase von Novo Nordisk A/S (Dänemark) verkauft werden, solche, die unter dem Handelsnamen Maxatase, Maxacal, Maxapem und Properase von Gist-Brocades verkauft werden, solche, die unter dem Handelsnamen Purafect und Furafect OXP von Genencor International vertrieben werden, und solche, die unter dem Handelsnamen Opticlean und Optimase von Solvay Enzymes vertrieben werden.
Lipasen: Geeignete Lipasen schließen solche bakteriellen oder Pilzursprungs ein. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen.
Beispiele von verwendbaren Lipasen schließen ein eine Humicola lanuginosa-Lipase, z. B. wie in EP 258 068 und EP 305 216 beschrieben, eine Rhizomucor miehei-Lipase, z. B. wie in EP 238 023 beschrieben, eine Candida-Lipase, wie z. B. eine C. antarctica-Lipase, z. B. die C. antarctica-Lipase A oder B, beschrieben in EP 214 761 , eine Pseudomonas-Lipase, wie z. B, eine P. alcaligenes- und P. pseudoalcaligenes-Lipase, z. B. wie in EP 218 272 beschrieben, eine P. cepacia-Lipase, z. B. wie in EP 331 376 beschrieben, eine P. stutzeri-Lipase, z. B. wie in GB 1,312,034 beschrieben, eine P. fluorescens-Lipase, eine Bacillus-Lipase, z. B. eine B. subtilis-Lipase (Dartois et al., (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131, 253–260), eine B. stearothermophilus-Lipase (JP 64/744992) und eine B. pumilus-Lipase (WO 91/16422).
Weiterhin kann eine Anzahl von klonierten Lipasen verwendbar sein, einschließlich der Penicillium camembertii-Lipase, beschrieben durch Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61–67), der Geotricum candidum-Lipase (Schimada, Y. et al., (1989), J. Biochem., 106, 383–388) und verschiedenen Rhizopus-Lipasen, wie z. B. einer R. delemar-Lipase (Hass, M. J. et al., (1991), Gene 109, 117–113) und einer R. niveus-Lipase (Kugimiya et al., (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716–719) und einer R. oryzae-Lipase.
Andere Typen von lipolytischen Enzymen, wie z. B. Cutinasen, können auch geeignet sein, z. B. eine Cutinase abgeleitet aus Pseudomonas mendocina wie beschrieben in WO 88/09367 oder eine Cutinase abgeleitet aus Fusarium solani pisi (z. B. beschrieben in WO 90/09446).
Besonders geeignete Lipasen sind solche wie M1 Lipase^TM, Luma fast^TM und Lipomax^TM (Gist-Brocades), Lipolase^TM und Lipolase U1tra^TM (Novo Nordisk A/S) und Lipase P „Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).
Amylasen: Geeignete Amylasen (α oder β) schließen solche bakteriellen oder Pilzursprungs ein. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind einge schlossen. Amylasen schließen zum Beispiel ein a-Amylasen erhalten aus einem speziellen Stamm von B. licheniformis, detaillierter beschreiben in GB-A-1,296,839. Kommerziell erhältliche Amylasen sind Duramyl^TM, Termamyl^TM, Fungamyl^TM und BAN^TM (erhältlich von Novo Nordisk A/S) und Rapidase^TM und Mlaxamyl P^TM (erhältlich von Gist-Brocades).
Cellulasen: Geeignete Cellulasen schließen solche bakteriellen oder Pilzursprungs ein. Chemisch oder genetisch veränderte Mutanten sind eingeschlossen. Geeignete Cellulasen sind in US 4,435,307 offenbart, welche aus Humicola insolens hergestellte Pilzcellulase offenbart. Besonders geeignete Cellulasen sind Cellulasen mit Farbpflegevorzügen. Beispiele von solchen Cellulasen sind in EP-A-0495257 beschrieben.
Kommerziell erhältliche Cellulasen sind Celluzyme^TM hergestellt aus einem Stamm von Humicola insolens (Novo Nordisk A/S) und KAC-500(B)^TM (Kao Corporation).
Oxidoreduktasen: Oxidoreduktasen sind in z. B. „Enzym Nomenclature 1992, Academic Press, Inc., San Diego" definiert und beschrieben. Sie gehören zu einer Klasse von Enzymen, die den Transfer von Elektronen von einer Substanz zur anderen (Oxidation-Reduktion) katalysieren. Oxidoreduktasen schließen Dehydrogenasen, Reduktasen, Oxidasen, Transhydrogenasen, Catalasen, Peroxidasen und Oxygenasen ein.
Spezifischere Beispiele schließen Meerrettich-Peroxidase, Ligninasen und andere Peroxidasen sowie Oxidasen wie z. B. Laccasen ein.
Beispiele von Mikroorganismen-Genera, die zur Herstellung von geeigneten Oxidoreduktasen verwendet werden können, sind: Trametes, Rhizoctonia, Pseudomorias, Bacillus, Streptomyces, Hygrophorus, Coprinus, Polyporus, Candida, Curvularia, Cercospora, Mycoliophtora, Aspergillus und Scytalidium. Die Erfindung ist aber nicht auf Enzyme beschränkt, die von den oben genannten Taxa abgeleitet sind. Alte Oxidoreduktasen-produzierenden Mikroorganismen mit den gewünschten Eigenschaften können in Verbindung mit dieser Erfindung verwendet werden.
Die Oxidoreduktase ist vorzugsweise eine Laccase (EC 1.10.3.2), eine Catalase (EC 1.11.1.6), eine Peroxidase (EC 1.11.1.7) oder eine Oxidase.
Eine geeignete Peroxidase ist eine, die aus einem Mikroorganismus wie z. B. einem Pilz oder einem Bakterium herstellbar ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Peroxidase hergestellt aus Coprinus, z. B. C. cinereus oder C. macrorhizus, oder aus Bacillus, z. B. B. pumilus, vorzugsweise eine Peroxidase gemäß der internationalen Patentanmeldung WO 91/05858.
Das Enzym kann weiterhin eines sein, das durch ein Verfahren herstellbar ist, enthaltend die Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Vektor transformiert wurde, der eine DNA-Sequenz trägt, die für das Enzym kodiert, wie auch DNA-Sequenzen, die für Funktionen kodieren, die die Expression der DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert, in einem Kulturmedium unter Bedingungen erlaubt, die die Expression des Enzyms erlauben und das Wiedergewinnen des Enzyms aus der Kultur.
Insbesondere ist eine rekombinant hergestellte Peroxidase eine Peroxidase hergestellt aus einem Coprinus sp., insbesondere C. macrorhizus oder C. cinereus gemäß WO 92/16634.
Catalasen sind sowohl aus tierischen Quellen (z. B. Rinderleber) als auch aus vielen verschiedenen Mikroorganismen bekannt. JP-A-2076579 offenbart Catalase aus Aspergillus niger Stamm NFAG-2. GB-A-2,216,149 offenbart Catalase aus Penicillium. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Catalase aus Stämmen von Scytalidium und Humicola wie in WO 92/17571 beschrieben erhalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf eine unbehandelte Fermentationslösung oder auf eine Fermentationslösung angewandt werden, die zuerst z. B. einer pH-Einstellung, einer Temperatureinstellung, einer Wasserverdünnung und/oder einer oder mehreren FestlFlüssig-Trenntechniken, wie z. B. Ausflockung, Zentrifugation, Filtration oder Mikrofiltration, unterzogen wurde.
Gemäß der Erfindung wurde gefunden, dass eine Addition einer löslichen Feund/oder Al-Verbindung zu der Proteinlösung in einer Flüssigkeit resultiert, die übenaschend gut zur Membrankonzentration geeignet ist, da sowohl der Fluss als auch die Reinheit des Proteins erhöht wird.
Die Zugabe einer löslichen Fe- und/oder Al-Verbindung zur Fermentationslösung wird ein unlösliches Präzipitat ergeben, das hauptsächlich aus Al- und/oder Fe-Hydroxid und Verunreinigungen wie z. B. Kohlenhydraten besteht, wenn der pH der Fermentationslösung zwischen 4 und 9 ist. Es ist wichtig, dass der pH der Fermentationslösung zwischen pH 4 und pH 9 gehalten wird. Normalerweise findet das Fällungsverfahren am effektivsten bei niedrigen pH-Werten statt. Viele Proteine, wie z. B. die meisten Enzyme, zeigen aber bei niedrigen pH-Werten eine geringe Stabilität. Daher muss ein Kompromiss-pH-Wert zwischen einem angemessen effizienten Verfahren und einer angemessen guten Proteinstabilität gewählt werden.
Es soll verstanden werden, dass die Zugabe einer löslichen Al/Fe-Verbindung zu der Fermentationslösung mit anschließender Fällung der Hydroxide den pH-Wert verändert, aber der pH-Wert sollte wieder auf pH 4–9 während der gesamten Fällungsphase und einer ausreichenden Zeit danach, bis der pH-Wert der Lösung sich im pH-Bereich zwischen 4–9 stabilisiert, eingestellt werden.
In manchen Fällen kann es von Vorteil sein, ein Gemisch aus sauren und basischen Al/Fe-Verbindungen zu verwenden, um die Menge von Säure/Base zu verringern, die für die pH-Einstellung benötigt wird, vorzugsweise ist überhaupt keine pH-Einstellung notwendig. Ein Beispiel für eine solche Kombination eines sauren Salzes und eines basischen Salzes ist Natriumaluminat und Aluminiumsulfat.
Wenn eine pH-Einstellung notwendig ist, kann jede Säure oder Base verwendet werden, Ameisensäure oder Essigsäure sind aber als Säuren bevorzugt.
Die minimale Menge einer Al/Fe-Verbindung, die nicht mehr als eine vernachlässigbare Menge von Verunreinigungen präzipitieren wird, hängt von der Art und der Konzentration der Verunreinigungen ab, die minimale Menge wird aber typischerweise 0,02 Mole Al und/oder Fe pro Liter Proteinlösung, vorzugsweise 0,04 Mole Al und/oder Fe pro Liter Proteinlösung, betragen.
Die maximale Menge an Al/Fe-Verbindung, die nicht mehr als eine vernachlässigbare Menge Protein präzipitieren wird, hängt von der Art und der Konzentration des Proteins ab, die maximale Menge wird aber typischerweise ca. 1,2 Mole Al und/oder Fe pro Liter Proteinlösung, vorzugsweise 1,0 Mol Al und/oder Fe pro Liter Proteinlösung, betragen.
Nach der vorliegenden Erfindung kann jede lösliche Fe- oder Al-Verbindung oder Mischung hiervon verwendet werden, insbesondere Al₂(SO₄)₃, NaAlO₂, K₂Al₂O₄, Al(NO₃)₃ _, AlCl₃, Al-Acetat, Al-Formiat, polymeres Aluminiumhydroxychlorid (z. B. EKOFLOCK erhältlich von Boliden), Fe₂(SO₄)_3, Fe(III)-Formiat, Fe(III)-Acetat, Fe(II)-Formiat und Fe(II)-Acetat.
In WO 94/01537 ist offenbart, dass in einer bevorzugten Ausführungsform das das lösliche Aluminat enthaltende Gemisch auch ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel wie z. B. einen Alkohol enthält. Wir haben gefunden, dass eine opti male Fällung durch Zugabe eines oder mehrerer Ausflockungsmittel erleichtert wird.
Gemäß der Erfindung sind verwendbare Ausflockungsmittel Salze wie z. B. Caund Mg-Salze, insbesondere Phosphate, Sulfate oder Chloride, z. B. Calciumchlorid, und anorganische und/oder organische Polymere, die kationisch, anionisch oder nicht-ionisch sein können, insbesondere eine Kombination von kationischen und anionischen Polymeren.
Bevor eine Membrankonzentration der Proteinlösung, z. B. der Fermentationslösung, stattfinden kann, sollten die Al/Fe-Präzipitate durch ein oder mehrere Klärungsverfahren entfernt werden, die typischerweise eine Zentrifugation, eine Filtration, eine Mikrofiltration oder eine Kombination hiervon sind. Die Al/Fe-Präzipitate können geeigneterweise durch Trommelfiltration gefolgt von einer Filterpressefiltration wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben entfernt werden.
Gemäß der Erfindung kann die Membrankonzentration unter Verwendung irgendeiner Membranausrüstung, die im Stand die Technik bekannt ist, durchgeführt werden, es ist aber bevorzugt, dass die Membrankonzentration unter Verwendung von Ultrafiltrationstechniken wie z. B. Hohlfaser-, Spiralwindungen- oder Plattenund Rahmeneinheiten durchgeführt wird. Die Membranen können aus einer Vielfalt von Materialien, wie z. B. Polysulfonmembranen, hergestellt sein. Bevorzugte Cut-off-Werte werden von den Eigenschaften des fraglichen Proteins abhängen, aber gewöhnlicherweise ist ein Cut-off-Wert im Bereich von 1 bis 100 kD bevorzugt.
Das gemäß der vorliegenden Erfindung erreichte Proteinkonzentrat kann weiter auf eine Vielzahl von Weisen wie z. B. durch chromatographische Verfahren, Adsorption- und/oder Kristallisationsverfahren gereinigt werden.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, von denen nicht beabsichtigt ist, den beanspruchten Bereich der Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
BEISPIEL 1
Das folgende Beispiel zeigt die einzigartige Korrelation zwischen der Verwendung von Aluminat und der Verbesserung der Kapazität (Fluss) in der folgenden Ultrafiltration über eine Polysulfonmembran bei Aufreinigung einer Protease aus einer Fermentationslösung.
Eine Fermentationslösung enthaltend Protease (Savinase^TM) aus Bacillus lentus, erhalten wie in US-A-3,723,250 beschrieben, wurde dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen.
Drei Versuche mit drei verschiedenen Mengen an Aluminat wurden in der folgenden Weise durchgeführt:
Nach der Fermentation wurden Wasser und Calciumchlorid zu der Protease zugefügt, die Lösung in den in Tabelle 1 angegebenen Mengen enthielt. Dann wurde Natriumaluminat (dosiert als eine 20%ige w/v-Lösung) zugefügt (0,8 kg pro 100 kg Lösung im Versuch A; 1,6 kg pro 100 kg Lösung im Versuch B und 2,4 kg pro 100 kg Lösung im Versuch C), wobei zur gleichen Zeit der pH der Lösung durch Zugabe von Ameisensäure bei pH 8 gehalten wurde. Schließlich wurden die Ausflockungsmittel (Superfloc C 521 und Superfloc A 130) in den in der Tabelle 1 angegebenen Mengen zugefügt: Tabelle 1
Danach wurde die so behandelte Fermentationslösung trommelgefiltert und weiter über eine Filterpresse gefiltert. Schließlich wurde die Lösung bei 7–15°C auf einer 18 m² DDS 35 L-Platte und einem Rahmensystem mit GR 61 PP-Membranen ultrafiltriert. Die Membranen waren aus Polysulfon mit einem Cut-off--Wert von ca. 20.000 D hergestellt.
Die Enzymkonzentration des Trommelfiltrats in Versuch A, B und C war auf dem gleichen Niveau.
Die Flusseigenschaften der drei Versuche sind in 1 gezeigt: (
: 0,8 kg NaAlO₂ pro 100 kg Fermentationslösung (Versuch A); +: 1,6 kg NaAlO₂ pro 100 kg Fermentationslösung (Versuch B); *: 2,4 kg NaAlO₂ pro 100 kg Fermentationslösung (Versuch C)). Der Konzentrationsfaktor (C.F.) wurde als V_An _fang/V_Konzentrat berechnet. Relevante Flussdaten sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Relevante Reinheitsdaten der konzentrierten Produkte (A, B und C) sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Die in Tabelle 3 gezeigten Reinheitsdaten zeigen deutlich, dass eine höhere Aluminatdosis eine höhere Reinheit des Enzyms pro g Trockensubstanz und eine niedrigere Konzentration an gefärbten Spezies pro Aktivitätseinheit ergibt.
BEISPIEL 2
Das folgende Beispiel zeigt die einzigartige Korrelation zwischen der Verwendung von Aluminat und der Verbesserung der Kapazität (Fluss) in der folgenden Ultrafiltration über ein Hohlfasermodul bei Aufreinigung einer Amylase aus einer Fermentationslösung.
Eine Fermentationslösung enthaltend eine Bacillus licheniformis-Amylase (Termamyl^TM) wurde dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen.
Drei Versuche wurden mit verschiedenen Mengen Aluminat auf die folgende Weise durchgeführt:
Nach der Fermentation wurden Wasser und Calciumchlorid zu der Amylase zugefügt, die Lösung in den in Tabelle 4 angegebenen Mengen enthielt. Dann wurde Natriumaluminat (dosiert als eine 20 %ige w/v-Lösung) zugefügt (0 kg pro 100 kg Lösung in Versuch A; 1 kg pro 100 kg Lösung in Versuch B und 4,2 kg pro 100 kg Lösung in Versuch C), wobei zur gleichen Zeit der pH der Lösung durch Zugabe von Ameisensäure bei pH 8 gehalten wurde. Schließlich wurden Ausflokkungsmittel (Superfloc C 521 und Superfloc A 130) in den in Tabelle 4 angegebenen Mengen zugefügt: Tabelle 4
Die Wassermenge wurde so eingestellt, dass die gleiche Enzymkonzentration in allen Ausflockungssuspensionen erhalten wurde.
Die Flocken wurden durch Trommelfiltration ohne irgendeine zusätzliche Verdünnung mit Leitungswasser von der klaren Flüssigkeit getrennt.
Nach der Trommelfiltration wurde das Produkt weiter über eine Filterpresse filtriert, um einen NTU-Wert unter 100 zu erhalten, und schließlich bei 7–15°C über ein Romicon/Koch 2,3 m² Hohlfasermodul (PM5, 1,1 mm in ID) mit einem Cutoff-Wert von 5.000 D ultrafiltriert. Das Modul war auf einen TMP-Wert von ca. 1,2 Bar und eine Durchflussgeschwindigkeit von ca. 1 m/s eingestellt. Nach 10 Stunden Betrieb wurde die Ultrafiltration gestoppt.
In 2 ist der Fluss (L/m²/Stunde) als Funktion des Konzentrationsfaktors für die drei verschiedenen Typen von Filtraten gezeigt (
: 0 kg NaAlO₂ pro 100 kg Ferrnentationslösung (Versuch A); +: 1 kg NaAlO₂ pro 100 kg Fermentationslösung (Versuch B); *: 4,2 kg NaAlO₂pro 100 kg Fermentationslösung (Versuch C)).
In Tabelle 5 sind die Flussergebnisse zusammengefasst.
Tabelle 5
Relevante Reinheitsdaten der konzentrierten Produkte sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6
Die in Tabelle 6 gezeigten Reinheitsdaten zeigen deutlich, dass eine höhere Aluminatdosis niedrigere Kohlenhydratniveaus und eine niedrige Konzentration gefärbter Spezies ergibt.
BEISPIEL 3
Das folgende Beispiel zeigt die einzigartige Korrelation zwischen der Verwendung von Aluminiumsulfat (natürliches Alunogenit) und der Verbesserung der Kapazität (Fluss) in der folgenden Ultrafiltration über Polysulfonmembran bei Aufreinigung einer Protease aus einer Fermentationslösung.
Eine Fermentationslösung enthaltend Protease (Savinase^TM) aus Bacillus lentus, erhalten wie im US-Patent Nr. 3,723,250 beschrieben, wurde dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen.
Zwei Versuche wurden durchgeführt. Der erste Versuch (Versuch A) ohne Aluminiumsulfat und der zweite Versuch (Versuch B) mit 14% w/w Al₂(SO₄)₃ × 18H₂O. Beide bei pH = 8,0.
Nach Fermentation wurden Wasser und Calciumchlorid zu der Protease zugefügt, die Lösung in den in Tabelle 7 angegebenen Mengen enthielt. Dann wurde Aluminiumsulfat (dosiert als eine 30%-ige w/w-Lösung) zugefügt (Versuch B), wo bei zur gleichen Zeit der pH der Lösung durch Zugabe von Natriumhydroxid bei pH = 8 gehalten wurde. Schließlich wurden die Ausflockungsmittel (Superfloc C 521 und Superfloc A 130) in den in Tabelle 7 angegebenen Mengen zugefügt.
Tabelle 7
Danach wurden die so behandelten Fermentationslösungen über eine Drucknutsche filtriert.
Schließlich wurden die Lösungen aus Versuch A und Versuch 8 bei 10°C über 27 cm² Amicon-Zellen mit PM10-Membranen bei 3,0 Bar ultrafiltriert. Die Membranen waren aus Polysulfon mit einem Cut-off--Wert von ca. 10.000 D hergestellt.
Die Enzymkonzentration der Filtrate in den zwei Versuchen war auf dem gleichen Niveau.
Die Flusseigenschaften der zwei Versuche sind in 3 gezeigt. Der Konzentrationsfaktor (C.F.) wurde als V_Anfang/V_Konzentrat berechnet, wobei V das Volumen ist. Der Ertrag wurde als NPU_Ende/NPU_Anfang* 100 berechnet, wobei NPU die Menge der Novo Proteaseeinheiten ist. Relevante Flussdaten sind in Tabelle 8 gezeigt.
Die Proteaseeinheiten wurden wie unten beschrieben bestimmt:
Proteolytische Aktivität
Die proteolytische Aktivität kann unter Verwendung von Kasein als Substrat bestimmt werden.
Eine Kaseinproteaseeinheit (NPU) ist als die Enzymmenge definiert, die 1 mM einer primären Aminogruppe (bestimmt durch Vergleich mit einem Serinstandard) pro Minute unter Standardbedingungen, d. h. Inkubation für 30 Minuten bei 25°C und pH 9,5, freisetzt.
Tabelle 8
Relevante Reinheitsdaten der konzentrierten Produkte (A und B) sind in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9
Die in Tabelle 9 gezeigten Reinheitsdaten zeigen deutlich, dass eine höhere Dosis Aluminiumsulfat eine höhere Reinheit des Enzyms pro g Trockensubstanz und eine niedrigere Konzentration gefärbter Spezies pro Aktivitätseinheit ergibt.
BEISPIEL 4
Das folgende Beispiel zeigt die einzigartige Korrelation zwischen der Verwendung von Eisensulfat und der Verbesserung der Kapazität (Fluss} in der folgenden Ultrafiltration über Polysulfonnembran bei Aufreinigung einer Protease aus Fermentationslösung.
Eine Fermentationslösung enthaltend Protease (Savinase^TM) aus Bacillus lentus, erhalten wie in US-Patent Nr. 3,723,250 beschrieben, wurde dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen.
Zwei Versuche wurden durchgeführt. Der erste Versuch (Versuch A) ohne Eisensulfat und der zweite Versuch (Versuch B) mit 3,45% w/w Fe₂(SO₄)₃ × 7H₂O. Beide bei pH = 8,0.
Nach Fermentation wurden Wasser und Calciumchlorid zu der Protease zugefügt, die Lösung in den in Tabelle 10 angegebenen Mengen enthielt. Dann wurde Eisensulfat (dosiert als eine 30%ige w/w-Lösung) zugefügt (Versuch B), wobei gleichzeitig der pH der Lösung durch Zugabe von Natriumhydroxid bei pH = 8 gehalten wurde. Schließlich wurden Ausflockungsmittel (Superfloc C 521 und Superfloc A 130) in den in Tabelle 10 angegebenen Mengen zugefügt.
Tabelle 10
Danach wurde die so behandelte Fermentationslösung über eine Drucknutsche filtriert. Schließlich wurden die Lösungen aus Versuch A und Versuch B bei 10 °C und 3 Bar(o) über 27 cm² Amicon-Zellen mit PM10-Membranen ultrafiltriert. Die Membranen waren aus Polysulfon mit einem Cut-off-Wert von ca. 10.000 D hergestellt.
Die Enzymkonzentration der Filtrate in den beiden Versuchen war auf demselben Niveau.
Die Flusseigenschaften der zwei Versuche sind in 4 gezeigt. Der Konzentrationsfaktor (C.F.) wurde als V_Anfang/V_Konzentrat berechnet, wobei V das Volumen ist. Der Ertrag wurde berechnet als NPU_Ende/NPU_Anfang * 100, wobei NPU die Menge an Novo Proteaseeinheiten ist. Relevante Flussdaten sind in Tabelle 11 gezeigt.
Tabelle 11
Relevante Reinheitsdaten der konzentrierten Produkte (A und B) sind in Tabelle 12 gezeigt.
Tabelle 12
Die in Tabelle 12 gezeigten Reinheitsdaten zeigen deutlich, dass eine höhere Dosis Eisensulfat eine höhere Reinheit des Produktes pro g Trockensubstanz und eine niedrigere Konzentration an gefärbter Spezies pro Aktivitätseinheit ergibt.

Claims

Verfahren zum Erhalten einer signifikanten Erhöhung des Flusses in einer Membrankonzentration einer Proteinlösung enthaltend (a) Behandlung der Proteinlösung mit einer löslichen Fe- und/oder Al-Verbindung bei einem pH zwischen 4 und 9; (b) Behandlung der Proteinlösung mit einem Salz und einem organischen Polymer; (c) Klärung der Proteinlösung; und (d) Membrankonzentration der Proteinlösung.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteinlösung eine Fermentationslösung ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Al-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Al₂(SO₄)₃, NaAlO₂, K₂Al₂O₄, AlCl₃, Al(NO₃)₃, Al-Acetat, Al-Formiat und irgendeinem Gemisch hiervon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fe-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fe₂(SO₄)₃, Fe(III)-Formiat, Fe(III)-Acetat, Fe(II)-Formiat, Fe(II)-Acetat und irgendeinem Gemisch hiervon.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Al-und/oder Fe-Verbindung in einer Konzentration von 0,02–1,2 Molen pro Liter Proteinlösung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,04–1,0 Molen pro Liter Proteinlösung zugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Klärung durch Zentrifugation, Filtration, Mikrofiltration oder eine Kombination hiervon durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Membrankonzentration Ultrafiltration ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Enzym eine Oxidoreduktase, eine Protease, eine Lipase, eine Cellulase oder eine Amylase ist.