JPH11511118A

JPH11511118A - タンパク質溶液のＡ１／Ｆｅ処理とその後の膜濃縮

Info

Publication number: JPH11511118A
Application number: JP8536117A
Authority: JP
Inventors: クエルスガールトニールセン，トーベン; アーエラウツェン，マド; ニールセン，ニールス−ビクトール
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1995-06-02
Filing date: 1996-05-31
Publication date: 1999-09-28
Also published as: AU5996996A; IN181859B; DE69626976D1; CN1114613C; EP0828753A1; EP0828753B1; ATE235506T1; DE69626976T2; CN1186498A; WO1996038469A1; DK0828753T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、水性タンパク質溶液から得られるタンパク質の精製方法であって、（ａ）pH４〜９での可溶性Ｆｅ及び／又はＡｌ化合物によるタンパク質溶液の処理；（ｂ）１つ又はそれ以上の凝集剤によるタンパク質溶液の処理；（ｃ）タンパク質溶液の静澄化；及び（ｄ）上記タンパク質溶液の膜濃縮から成る方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質溶液のＡｌ／Ｆｅ処理とその後の膜濃縮産業上の利用分野本発明はタンパク質、特にタンパク質溶液、例えば発酵ブイヨンから得られる酵素の精製のための簡単且つ有効な方法に関する。発明の背景蒸発及び非晶質塩沈殿前に発酵ブイヨンから不純物を沈殿させるためのＡｌ化合物の使用は公知である（WO 94/01537 及び米国特許第3,795,586 号参照）。しかしながら、真空蒸発は、エネルギー消費量の点から経費が掛かる。さらに、発酵溶液中の高塩及び低分子量成分レベルのために、蒸発工程で少量しか濃縮されないという可能性もある。例えばＮａ₂ＳＯ₄又は（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄による非晶質塩沈殿は塩消費量が高く、その工程はタンパク質精製に有効な単位操作ではない。膜濃縮、例えばＵＦ濃縮は、塩及び少量成分を濾し取ることによる工程が真空蒸発を用いた場合に考えられるものより有効な濃縮を生じるであろうために、タンパク質濃縮に広範に用いられる。しかしながら、膜濾過はしばしば、容量の面で、即ち大型装置及びそれによる高エネルギー消費が必要であるという理由が妨げとなり、さらにしばしば効率の点で、濃縮因子が限定されることが妨げとなる。したがって、上記の問題を克服するための方法を開発することは当業界にとって切実な要求である。本発明の要約可溶性Ｆｅ及び／又はＡｌ化合物で処理した発酵ブイヨンは膜濃縮に特によく適して、有意の容量増大を引き起こすことが、意外にも判明した。本発明は、水性タンパク質溶液から得られるタンパク質の精製方法であって、以下の：（ａ）pH４〜９での可溶性Ｆｅ及び／又はＡｌ化合物によるタンパク質溶液の処理；（ｂ）１つ又はそれ以上の凝集剤によるタンパク質溶液の処理；（ｃ）タンパク質溶液の静澄化；及び（ｄ）上記のタンパク質溶液の膜濃縮から成る方法を提供する。図面の簡単な説明添付の図面を参照しながら、本発明をさらに説明する。図１は、３つの異なるアルミン酸塩投与（■：0.8 kg ＮａＡｌＯ₂／100 kg 発酵ブイヨン；＋：1.6 kg ＮａＡｌＯ₂／100 kg発酵ブイヨン；＊：2.4 k g ＮａＡｌＯ₂／100 kg発酵ブイヨン）時のプロテアーゼ溶液の限外濾過成果を示す。試験は実施例１に記載されているように実施した。図２は、３つの異なるアルミン酸塩投与（■：０kg ＮａＡｌＯ₂／100 kg発酵ブイヨン；＋：１kg ＮａＡｌＯ₂／100 kg発酵ブイヨン；＊：4.2 kg ＮａＡｌＯ₂／100 kg発酵ブイヨン）時のアミラーゼ溶液の限外濾過成果を示す。試験は実施例２に記載されているように実施した。図３は、前硫酸アルミニウム処理（◆：0.7 kg 30％Ａｌ₂（ＳＯ₄）₃ｘ 18 Ｈ₂Ｏ／1.54 kg 発酵ブイヨン； □：０kg Ａｌ₂（ＳＯ₄）₃ｘ 18 Ｈ₂Ｏ／1.5 4 kg 発酵ブイヨン）を行なった場合／行わなかった場合のプロテアーゼ溶液の限外濾過成果を示す。試験は実施例３に記載されているように実施した。図４は、前硫酸鉄処理（□：0.177 kg 30％Ｆｅ₂（ＳＯ₄）₃ｘ７Ｈ₂Ｏ／1.54 kg 発酵ブイヨン； ◆：０kg Ｆｅ₂（ＳＯ₄）₃ｘ 18 Ｈ₂Ｏ／1.54 kg 発酵ブイヨン）を行なった場合／行わなかった場合のプロテアーゼ溶液の限外濾過成果を示す。試験は実施例４に記載されているように実施した。本発明の詳細な説明本発明は、水性タンパク質溶液から得られるタンパク質の精製方法であって、以下の：（ａ）pH４〜９での可溶性Ｆｅ及び／又はＡｌ化合物によるタンパク質溶液の処理；（ｂ）１つ又はそれ以上の凝集剤によるタンパク質溶液の処理；（ｃ）タンパク質溶液の静澄化；及び（ｄ）上記のタンパク質溶液の膜濃縮から成る方法を提供する。本発明の方法は、水性タンパク質溶液から得られるタンパク質の精製に、特に発酵ブイヨンからの酵素のようなタンパク質の精製に適用し得る。好ましい実施態様では、本方法はプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及びオキシドレダクターゼの精製に適用される。プロテアーゼ：適切なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物起源のものが挙げられる。微生物起源が好ましい。化学的又は遺伝子的修飾突然変異体が含まれる。プロテアーゼはセリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼである。アルカリ性プロテアーゼの例としては、ズブチリシン、特にバチルス属 Bacillusから得られるもの、例えばズブチリシンＮｏｖｏ、ズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、ズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７及びズブチリシン１６８が挙げられる（WO 89/06279 に記載されている）。トリプシン様プロテアーゼの例はトリプシン（例えばブタ又はウシ起源）及びフサリウム属 Fusariumプロテアーゼ（WO 89/06270 に記載）である。好ましい市販プロテアーゼ酵素としては、Novo Nordisk A/S（デンマーク）からアルカラーゼ Alcalase、サビナーゼ Savinase、プリマーゼ Primase、デュラザイム Durazyme 及びエスペラーゼ Esperase の商品名で販売されているもの、 Gist-Brocades からマキサターゼ Maxatase、マキサカル Maxacal、マキサペム Maxapem及びプロペラーゼProperase の商品名で販売されているもの、Genencor Internationalからプラフェクト Purafect 及びプラフェクト Purafect ＯＸＰの商品名で販売されているもの、並びにSolvay Enzymesからオプチクリーン Opt iclean及びオプチマーゼ Optimase の商品名で販売されているものが挙げられる。リパーゼ：適切なリパーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的又は遺伝子的修飾突然変異体が含まれる。有用なリパーゼの例としては、例えば欧州特許第258 068 号及び欧州特許第30 5 216 号に記載されているような Humicola lanuginosaリパーゼ、欧州特許第号に記載されているような Rhizomucor mieheiリパーゼ、欧州特許第214761号に記載されているようなカンジダ属 Candidaリパーゼ、例えば C．antarcticaリパーゼ、例えばCantarctica リパーゼＡ又はＢ、欧州特許第218 272 号に記載されているようなシュードモナス属 Pseudomonasリパーゼ、例えばP．pseudoalcaligen esリパーゼ、欧州特許第331 376 号に記載されているような P．cepacia リパーゼ、英国特許第1,372,034 号に開示されているような P．stutzeriリパーゼ、P．fluorescensリパーゼ、バチルス属リパーゼ、例えば B．subtilisリパーゼ（Dartois et al.,(1993); Biochemica et Biophysica acta 1131，253-260）、B．stearothermophilus リパーゼ（JP 64/ 744992）及び B．pumilus リパーゼ（WO 91/16422）が挙げられる。さらに、多数のクローン化リパーゼが有用であり、その例としては、Yamaguch i et al.，(1991)，Gene 103，61-67 に記載されているPenicilliumcamembertii リパーゼ、Geotricum candidumリパーゼ（Schimada，Y．et al.，(1989)，J．Bi ochem.，106，383-388）、及び種々のクモノスカビ属 Rhizopus リパーゼ、例えば R.delemar リパーゼ（Hass，M．J et al.，(1991)，Gene 109，117-113）、R ．niveus リパーゼ（Kugimiya et al.，(1992)，Biosci．Biotech．Biochem.，5 6，716-719）及び R.oryzae リパーゼが挙げられる。その他の種類の脂肪分解酵素、例えばクチナーゼも有用で、その例としてはWO 88/09367 に記載されているような Pseudomonas mendocinaから得られるクチナーゼ、又はFusarium solani pisiから得られるクチナーゼ（例えばWO 90/09446 記載）が挙げられる。特に適切なリパーゼは、例えばＭ１リパーゼ^TM、Luma fast^TM及び Lipomax^TM （Gist-Brocades）、リポラーゼ Lipolase ^TM及びリポラーゼウルトラ Lipola se Ultra ^TM（Novo Nordisk A/S）、並びにリパーゼＰ "Amano"（Amano Pharm aceutical Co．Ltd．）である。アミラーゼ：適切なアミラーゼ（α又はβ）としては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的又は遺伝子的突然変異体が含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第1,296,839 号により詳細に記載されているB．licheni formisの特定の菌株から得られるアミラーゼが挙げられる。市販のアミラーゼとしては、デュラミル Duramyl^TM、テルマミル Termamyl^TM、フンガミル Fungamyl^TM及びＢＡＮ^TM（Novo Nordisk A/Sから販売）、並びにラピダーゼ Rapidase^TM及びマキサミルＰ Maxamyl P^TM（Gist-Brocades から販売）がある。セルラーゼ：適切なセルラーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的又は遺伝子的突然変異体が含まれる。適切なセルラーゼは、Humico la insolens から産生される真菌セルラーゼを開示する米国特許第4,435,307 号に開示されている。特に適切なセルラーゼは、カラーケア利点を有するセルラーゼである。このようなセルラーゼの例としては、1991年11月６日提出の欧州特許出願第91202879.2号（Novo Nordisk A/S）に記載されたセルラーゼが挙げられる。市販のセルラーゼとしては、Humicola insolens の菌株により産生されるセルザイム Celluzyme^TM（Novo Nordisk A/S）及びＫＡＣ−５００（Ｂ）^TM（Kao Co rporation）がある。オキシドレダクターゼ：オキシドレダクターゼは、例えば”Enzyme Nomencl ature 1992，Academic Press，Inc.，San Diego ”に定義され、説明されている。それらはある基質から別の基質への電子の移動（酸化−還元）を触媒する種類の酵素に属する。オキシドレダクターゼとしては、デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ及びオキシゲナーゼが挙げられる。さらに特定の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、リグニナーゼ及びその他のペルオキシダーゼ、並びにラッカーゼのようなオキシダーゼが挙げられる。適切なオキシドレダクターゼの産生に用い得る微生物属の例を以下に挙げる： Trametes、Rhizoctonia、シュードモナス属 Pseudom onas、バチルス属 Bacillus、ストレプトミセス属 Streptomyces、Hygrophorus 、Coprinus、Polyporus、カンジダ属 Candida、Curvularia、Cercospora、Mycol iophtora、アスペルギルス属 Aspergillus及び Scytalidium。しかしながら、本発明は、上記の分類群から得られる酵素に限定されない。所望の特性を有するオキシドレダクターゼを産生する微生物はすべて、本発明に関連して用い得る。オキシドレダクターゼは、好ましくはラッカーゼ（ＥＣ１．１０．３．２）、カタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６）、ペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）又はオキシダーゼである。適切なペルオキシダーゼは、真菌類又は細菌類のような微生物により産生可能なものである。好ましい実施態様では、ペルオキシダーゼはCoprinus、例えば C ．cinereus又はC．macrorhizusから、あるいはバチルス属 Bacillus、例えば B ．pumilus から得られるペルオキシダーゼ、特に国際特許出願 WO 91/05858によるペルオキシダーゼである。本酵素はさらに、上記の酵素をコードするＤＮＡ配列、並びに本酵素をコードするＤＮＡ配列の発現を可能にする機能をコードするＤＮＡ配列を保有する組換え体ＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞を、本酵素の発現を可能にする条件下で培養し、培養から本酵素を回収する工程から成る方法により産生可能なものである。特に、組換え的に産生されるペルオキシダーゼは、Coprinus種、特にWO 92/16 634 による C．macrorhizus 又は C．cinereusから得られるペルオキシダーゼである。カタラーゼは、動物起源（例えばウシ肝臓）及び多数の異なる微生物からのものが公知である。日本国特許出願第2-76579 号は、黒色アスペルギルス Aspergi llus niger ＮＦＡＧ−２菌株からのカタラーゼを開示する。英国特許第2,216,149 号は、ペニシリン属Penicillium からのカタラーゼを開示する。本発明の好ましい実施態様では、カタラーゼは WO 92/17571に記載されているような Scytalidium及び Humicola の菌株から得られる。本発明の方法は、未処理発酵ブイヨンに、又は例えばpH調整、温度調整、水希釈及び／又は１つ又はそれ以上の固体／液体分離法、例えば凝集、遠心分離、濾過又は微小濾過を先ず施された発酵ブイヨンに適用し得る。本発明によれば、可溶性Ｆｅ及び／又はＡｌ化合物をタンパク質溶液に付加すると、タンパク質の流量並びに純度が増大されるので、膜濃縮に驚くほどよく適した液体を生じることが判明した。可溶性Ｆｅ及び／又はＡｌ化合物を発酵ブイヨンに付加すると、発酵ブイヨンのpHが４〜９である場合、主にＡｌ及び／又はＦｅ水酸化物及び炭水化物のような不純物から成る不溶性沈殿物を生じる。発酵ブイヨンのpHをpH４〜pH９に保持することは重要である。普通は、沈殿工程は低pH値で最も効率のよい方法で進行する。しかしながら、大半の酵素のような多数のタンパク質は、低pH値では低安定性を示す。したがって、理に適った効率のよい方法による妥協の結果のpH値及び理に適った良好なタンパク質安定性を選択しなければならない。可溶性Ａｌ／Ｆｅ化合物の発酵ブイヨンへの付加とその後の水酸化物の沈降は pHを変えるが、しかしpHは沈降相中にpH４〜９に再調整し、溶液のpHがpH４〜９の範囲に安定するまで十分な時間を置く必要がある、と理解される。いくつかの場合には、pH調整に必要な酸／塩基の量を最小にするために、酸性及びアルカリ性Ａｌ／Ｆｅ化合物の混合物を用いることが有益であり、好ましくはpH調整は全く必要ない。酸性塩とアルカリ性塩のこのような組合せの例は、アルミン酸ナトリウム及び硫酸アルミニウムである。 pH調整が必要な場合、あらゆる酸又は塩基を用い得るが、しかしギ酸又は酢酸が酸として好ましい。極微量以下の不純物を沈殿させるＡｌ／Ｆｅ化合物の最小量は、不純物の種類及び濃度に依るが、しかし最小量は典型的には 0.02mol Ａｌ及び／又はＦｅ／タンパク質溶液１ｌ、好ましくは0.01 mol Ａｌ及び／又はＦｅ／タンパク質溶液１ｌである。極微量以下のタンパク質を沈殿させるＡｌ／Ｆｅ化合物の最大量はタンパク質の種類及び濃度に依るが、しかし最大量は典型的には約1.2 mol Ａｌ及び／又はＦｅ／タンパク質溶液１ｌ、好ましくは1.0 mol Ａｌ及び／又はＦｅ／タンパク質溶液１ｌである。本発明によれば、あらゆる可溶性Ｆｅ又はＡｌ化合物あるいはあらゆるその混合物を用い得るが、特にその例としては、Ａｌ₂（ＳＯ₄）₃、ＮａＡｌＯ₂、Ｋ₂ Ａｌ₂Ｏ₄、Ａｌ（ＮＯ₃）₃、ＡｌＣｌ₃、Ａｌ−酢酸塩、Ａｌ−ギ酸塩、ポリマーアルミニウムヒドロキシクロリド（例えば、Boliden から販売されているＥＫＯＦＬＯＣＫ）、Ｆｅ₂（ＳＯ₄）₃、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ギ酸塩、Ｆｅ（ＩＩＩ） −酢酸塩、Ｆｅ（ＩＩ）−ギ酸塩及びＦｅ（ＩＩ）−酢酸塩が挙げられる。 WO 94/01537 では、好ましい実施態様において、可溶性アルミン酸塩から成る混合物は水混和性溶媒、例えばアルコールを含有することが開示されている。最適沈殿は１つ又はそれ以上の凝集剤の付加により促進される、ということを我々は見出した。本発明によれば、有用な凝集剤はＣａ−及びＭｇ塩のような塩、特にリン酸塩、硫酸塩又は塩化物、例えば塩化カルシウム、並びに陽イオン性、陰イオン性又は非イオン性である無機及び／又は有機ポリマー、特に陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの組合せである。タンパク質溶液、例えば発酵ブイヨンの膜濃縮が起きる前に、典型的には遠心分離、濾過、微小濾過又はその組合せである１つ又はそれ以上の静澄化工程により、Ａｌ／Ｆｅ沈殿物を除去する必要がある。実施例１及び２に記載されているようなドラム濾過及びその後のフィルタープレス搾濾過により、Ａｌ／Ｆｅ沈殿物を除去するのが便利である。本発明によれば、当業界で公知のあらゆる膜装置を用いて膜濃縮を実施し得るが、しかし中空繊維、螺旋環又は平板及び枠ユニットのような限外濾過技法を用いて膜濃縮を実施するのが好ましい。膜は、種々の材質、例えばポリスルホン膜から作られる。好ましい切取り値は、当該タンパク質の特性に依るが、通常、１〜100 kDの間隔の切取り値が好ましい。本発明により達成されるタンパク質濃縮物は、種々の方法で、例えばクロマトグラフィー法、吸着及び／又は結晶化工程を用いて、さらに精製し得る。以下の実施例により本発明をさらに説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。実施例１以下の実施例は、発酵ブイヨンからプロテアーゼを精製する場合の、ポリスルホン膜上での下記の限外濾過におけるアルミン酸塩の使用と容量（流量）の改良との間の独特の相関を示す。米国特許第3,723,250 号に記載されたようにして得られるBacillus lentus からのプロテアーゼ（サビナーゼ Savinase^TM）を含有する発酵ブイヨンに本発明の方法を施した。３つの異なるレベルのアルミン酸塩を用いて、以下の方法で、３つの試験を実施した：発酵後、水及び塩化カルシウムを表１に示した量でプロテアーゼ含有ブイヨンに付加した。次に、ギ酸の付加により溶液のpHをpH８に保持しながら、アルミン酸ナトリウム（20％ w/v溶液として投与）を付加した（試験Ａ：0.8 kg／ブイヨン100 kg；試験Ｂ：1.6kg ／ブイヨン 100 kg ；試験Ｃ：2.4 kg／ブイヨン 100 kg）。最後に、凝集剤（Superfloc C 521 及びSuperfloc A 130）を表１に示した量で付加した。その後、そのように処理した発酵ブイヨンをドラム濾過し、さらにフィルタープレスで濾過した。最後に、ＧＲ６１ＰＰ膜を用いて、18 m²ＤＤＳ 35L平板及び枠系上で７〜15℃で溶液を限外濾過した。膜は約20,000 Dの切取り値を有するポリスルホンから作られた。試験Ａ、Ｂ及びＣにおけるドラム濾液の酵素濃縮は、同一レベルであった。３つの試験の流量特性を図１に示す（■：0.8 kg ＮａＡｌＯ₂／100 kg発酵ブイヨン（試験Ａ）；＋：1.6 kg ＮａＡｌＯ₂／100 kg発酵ブイヨン（試験Ｂ）；＊：2.4 kg ＮａＡｌＯ₂／100kg 発酵ブイヨン（試験Ｃ））。Ｖ（初期）／Ｖ（濃縮物）として濃縮因子（Ｃ．Ｆ．）を算出した。関連流量データを表２に示す。濃縮物質（Ａ、Ｂ及びＣ）に関する関連純度データを表３に示す。表３に示した純度データは、高用量のアルミン酸塩は高純度の酵素／乾燥物質１ｇ及び低濃度の着色種／活性単位を生じる、ということを明確に示す。実施例２以下の実施例は、発酵ブイヨンからアミラーゼを精製する場合の、中空繊維モジュールでの下記の限外濾過におけるアルミン酸塩の使用と容量（流量）の改良との間の独特の相関を示す。 Bacillus licheniformisアミラーゼ（テルマミル Termamyl^TM）を含有する発酵ブイヨンに本発明の方法を施した。３つの異なるレベルのアルミン酸塩を用いて、以下の方法で、３つの試験を実施した：発酵後、水及び塩化カルシウムを表４に示した量でアミラーゼ含有ブイヨンに付加した。次に、ギ酸の付加により溶液のpHをpH８に保持しながら、アルミン酸ナトリウム（20％ w/v溶液として投与）を付加した（試験Ａ：０kg／ブイヨン100 kg；試験Ｂ：１kg／ブイヨン 100 k g ；試験Ｃ：4.2 kg／ブイヨン 100 kg）。最後に、凝集剤（Superfloc C 521 及びSuperfloc A 130）を表４に示した量で付加した。水レベルを調整して３つの凝集化懸濁液すべての酵素濃度を同一にした。さらに水道水で希釈せずに、ドラム濾過により、凝集塊を透明液から分離した。ドラム濾過後、生成物をさらにフィルタープレスで濾過して、ＮＴＵ値を100 以下とし、最後に、5000 Dの切取り値を有するRomicon/Koch 2.3 m²中空繊維モジュール（ＰＭ５、内径 1.1 mm）で、７〜15℃で溶液を限外濾過した。モジュールは約1.2 Bar のＴＭＰ値で、且つ約１m/sの直交流速で操作した。10時間操作後、限外濾過を停止した。図２において、濃縮因子の関数としての流量（L/m²/ 時間）を、３つの異なる種類の濾液に関して示す（■：０kg ＮａＡｌＯ₂／100 kg発酵ブイヨン（試験Ａ）；＋：１kg ＮａＡｌＯ₂／100 kg発酵ブイヨン（試験Ｂ）；＊：4.2 k g ＮａＡｌＯ₂／100 kg発酵ブイヨン（試験Ｃ））。表５では、流量結果を要約する。濃縮物質に関する関連純度データを表６に示す。表６に示した純度データは、高用量のアルミン酸塩は低炭水化物レベル及び低濃度着色種を生じる、ということを明確に示す。実施例３以下の実施例は、発酵ブイヨンからプロテアーゼを精製する場合の、ポリスルホン膜上での下記の限外濾過における硫酸アルミニウム（天然アルノゲナイト a lunogenite）の使用と容量（流量）の改良との間の独特の相関を示す。米国特許第3,723,250 号に記載されたようにして得られるBacillus lentus からのプロテアーゼ（サビナーゼ Savinase^TM）を含有する発酵ブイヨンに本発明の方法を施した。２つの試験を実施した。最初の試験（試験Ａ）は硫酸アルミニウムを用いず、第二の試験（試験Ｂ）は14％ w/w Ａｌ₂（ＳＯ₄）₃ｘ18Ｈ₂Ｏを用いた。ともに pH=8.0。発酵後、水及び塩化カルシウムを表７に示した量でプロテアーゼ含有ブイヨンに付加した。次に、水酸化ナトリウムの付加により溶液のpHをpH＝８に保持しながら、硫酸アルミニウム（30％ w/v溶液として投与）を付加した（試験Ｂ）。最後に、凝集剤（SuperflocC 521 及びSuperfloc A 130）を表７に示した量で付加した。その後、そのように処理した発酵ブイヨンを吸引濾過で濾過した。最後に、3.5 Bar でＰＭ１０膜を用いて、27 m²Amiconセル上で10℃で、試験Ａ及び試験Ｂからの溶液を限外濾過した。膜は約10,000 Dの切取り値を有するポリスルホンから作られた。２つの試験における濾液の酵素濃縮は、同一レベルであった。２つの試験の流量特性を図３に示す。Ｖ（初期）／Ｖ（濃縮物）（ここで、Ｖは容積）として濃縮因子（Ｃ．Ｆ．）を算出した。収率は、ＮＰＵ（最終）／ＮＰＵ（初期）100（ここで、ＮＰＵはNovoプロテアーゼ単位の量である）として算出した。関連流量データを表８に示す。プロテアーゼ単位は下記のように確定した：タンパク質分解活性基質としてカゼインを用いて、タンパク質分解活性を測定した。１カゼインプロテアーゼ単位（ＮＰＵ）は、標準条件下での、即ちpH 9.5で25 ℃で30分間インキュベーションでの、１mMの第一アミノ基を遊離する酵素の量／分（セリン基準と比較して確定）と定義される。濃縮物質（Ａ及びＢ）に関する関連純度データを表９に示す。表９に示した純度データは、高用量の硫酸アルミニウムは高純度の酵素／乾燥物質１ｇ及び低濃度の着色種／活性単位を生じる、ということを明確に示す。実施例４以下の実施例は、発酵ブイヨンからプロテアーゼを精製する場合の、ポリスルホン膜上での下記の限外濾過における硫酸鉄の使用と容量（流量）の改良との間の独特の相関を示す。米国特許第3,723,250 号に記載されたようにして得られるBacillus lentus からのプロテアーゼ（サビナーゼ Savinase^TM）を含有する発酵ブイヨンに本発明の方法を施した。２つの試験を実施した。最初の試験（試験Ａ）は硫酸鉄を用いず、第二の試験（試験Ｂ）は3.45％ w/w Ｆｅ₂（ＳＯ₄）₃ｘ 7Ｈ₂ Ｏを用いた。ともにpH=8.0 。発酵後、水及び塩化カルシウムを表１０に示した量でプロテアーゼ含有ブイヨンに付加した。次に、水酸化ナトリウムの付加により溶液のpHをpH＝８に保持しながら、硫酸鉄（30％ w/v溶液として投与）を付加した（試験Ｂ）。最後に、凝集剤（Superfloc C 521 及びSuperfloc A 130）を表１０に示した量で付加した。その後、そのように処理した発酵ブイヨンを吸引濾過で濾過した。最後に、３ bar(o)でＰＭ１０膜を用いて、27 m²Amiconセル上で10℃で、試験Ａ及び試験Ｂからの溶液を限外濾過した。膜は約10,000 Dの切取り値を有するポリスルホンから作られた。２つの試験における濾液の酵素濃縮は、同一レベルであった。２つの試験の流量特性を図４に示す。Ｖ（初期）／Ｖ（濃縮物）（ここで、Ｖは容積）として濃縮因子（Ｃ．Ｆ．）を算出した。収率は、ＮＰＵ（最終）／ＮＰＵ（初期）100（ここで、ＮＰＵはNovoプロテアーゼ単位の量である）として算出した。関連流量データを表１１に示す。濃縮物質（Ａ及びＢ）に関する関連純度データを表１２に示す。表１２に示した純度データは、高用量の硫酸鉄は高純度の生成物／乾燥物質１ｇ及び低濃度の着色種／活性単位を生じる、ということを明確に示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年６月１７日【補正内容】請求の範囲１．タンパク質溶液の膜濃縮における有意の流量増大を得るための方法であって、以下の：（ａ）pH４〜９での可溶性Ｆｅ及び／又はＡｌ化合物によるタンパク質溶液の処理；（ｂ）１つ又はそれ以上の凝集剤によるタンパク質溶液の処理；（ｃ）タンパク質溶液の静澄化；及び（ｄ）上記タンパク質溶液の膜濃縮から成る方法。２．タンパク質溶液が発酵ブイヨンである請求項１記載の方法。３．Ａｌ化合物がＡｌ₂（ＳＯ₄）₃、ＮａＡｌＯ₂、Ｋ₂Ａｌ₂Ｏ₄、ＡｌＣｌ₃、Ａｌ（ＮＯ₃）₃、Ａｌ−酢酸塩、Ａｌ−ギ酸塩及びその任意の混合物から成る群から選択される請求項１記載の方法。４．Ｆｅ化合物がＦｅ₂（ＳＯ₄）₃、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ギ酸塩、Ｆｅ（ＩＩＩ）−酢酸塩、Ｆｅ（ＩＩ）−ギ酸塩、Ｆｅ（ＩＩ）−酢酸塩及びその任意の混合から成る群から選択される請求項１記載の方法。５．Ａｌ及び／又はＦｅ化合物が0.02〜1.2 mol／タンパク質溶液１ｌ、好ましくは0.04〜1.0 mol／タンパク質溶液１ｌの濃度で付加される前記請求項のいずれかに記載の方法。６．凝集剤が塩及びポリマーから成る群から選択される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．静澄化が遠心分離、濾過、微小濾過又はその組合せにより実行される請求項１記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ニールセン，ニールス−ビクトールデンマーク国，デーコー−2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ

Claims

【特許請求の範囲】１．水性タンパク質溶液から得られるタンパク質の精製方法であって、以下の：（ａ）pH４〜９での可溶性Ｆｅ及び／又はＡｌ化合物によるタンパク質溶液の処理；（ｂ）１つ又はそれ以上の凝集剤によるタンパク質溶液の処理；（ｃ）タンパク質溶液の静澄化；及び（ｄ）上記タンパク質溶液の膜濃縮から成る方法。２．タンパク質溶液が発酵ブイヨンである請求項１記載の方法。３．Ａｌ化合物がＡｌ₂（ＳＯ₄）₃、ＮａＡｌＯ₂、Ｋ₂Ａｌ₂Ｏ₄、ＡｌＣｌ₃、Ａｌ（ＮＯ₃）₃、Ａｌ−酢酸塩、Ａｌ−ギ酸塩及びその任意の混合物から成る群から選択される請求項１記載の方法。４．Ｆｅ化合物がＦｅ₂（ＳＯ₄）₃、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ギ酸塩、Ｆｅ（ＩＩＩ）−酢酸塩、Ｆｅ（ＩＩ）−ギ酸塩、Ｆｅ（ＩＩ）−酢酸塩及びその任意の混合から成る群から選択される請求項１記載の方法。５．Ａｌ及び／又はＦｅ化合物が0.02〜1.2 mol／タンパク質溶液１ｌ、好ましくは0.04〜1.0 mol ／タンパク質溶液１ｌの濃度で付加される前記請求項のいずれかに記載の方法。６．凝集剤が塩及びポリマーから成る群から選択される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．静澄化が遠心分離、濾過、微小濾過又はその組合せにより実行される請求項１記載の方法。８．膜濃縮が限外濾過である請求項１記載の方法。９．タンパク質が酵素である請求項１記載の方法。１０．酵素がオキシドレダクターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又はアミラーゼである請求項９記載の方法。